CN101928693A - 一种原代细胞的培养方法 - Google Patents

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王全新
李�杰
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Abstract

本发明提供了一种原代细胞的培养方法，所要解决的问题是：原代细胞可用于生产狂犬等大量疫苗，这些疫苗的生产需要使用大量动物，而传统的细胞培养技术不能完全排除外源因子污染的可能，质量难以控制，且制约了疫苗制品的规模化生产。本发明的要点是：使用生物反应器承载的聚酯切片作为载体培养已获取的原代细胞。本发明的积极效果是：每克聚酯切片载体相当于内表面积约1160平方厘米的三L转瓶，细胞密度可达108个/毫升，综合可比因素分析对比，本发明方法的产量比现有技术中的转瓶方法提高了100倍以上。

Description

一种原代细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及在生物制品领域中原代细胞的培养方法，具体说是一种利用生物反应器及以聚酯切片为载体培养原代动物细胞(指自组织分离后体外培养不超过5代细胞，以下称原代细胞)的方法。
背景技术
目前，国内外已有许多关于利用生物反应器，微载体培养动物细胞的报道。细胞微载体培养方法是由Van Wezel于1967年构思发明的，经过40年来人类大量的摸索，该技术已经日趋成熟和完善，并广泛应用于生物工程领域以及一些具有重要价值的细胞产品。微载体细胞培养技术具有许多传统细胞培养技术无法取代的优势，例如在生物反应器中，微载体增加了单位容积中的表面积；为细胞提供了均相的生长环境；环境条件容易测量与监控；细胞培养操作可系统化、自动化，降低了污染发生的机会。
但该技术主要用于传代细胞系的培养，用于原代细胞培养，因剪切力较大，限制了其大规模生产应用。
原代细胞可用于生产狂犬疫苗、乙脑疫苗、麻疹病毒疫苗、腮腺炎病毒疫苗和流行性出血热病毒疫苗等，这些疫苗的生产需要使用大量动物，而传统的细胞培养技术不能完全排除外源因子污染的可能，质量难以控制，且制约了疫苗制品的规模化生产。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是一种原代细胞的培养方法。
本发明的目的是这样实现的：使用生物反应器承载的聚酯切片作为载体培养已获取的原代细胞。
在本发明中，所用的生物反应器是购自New Brunswick Scientific Co.，Inc.公司的Celligen PlusTM生物反应器。总体积为5升及5升以上的生物反应器，但是本领域技术人员在阅读了本说明书的描述后可以预计到，体积更大的生物反应器也适用于本发明方法。该生物反应器是装有固定床篮式培养系统，该系统是一种用于细胞培养的搅拌系统，其特点在于：a)搅拌时形成的剪切力非常低，尤其是50-120rpm之间作用在细胞上的剪切力几乎为零；b)设计有专门的气体回路，当培养细胞过程中需要向生物反应器通入各种气体，例如空气，氧气，二氧化碳和氮气时所产生的气泡会沿着特定的回路进出，而不会像其他培养系统那样让细胞贴气泡表面，当气泡升至液面破裂时，细胞也随之死亡；c)它是唯一可使用聚酯切片载体的细胞培养系统，该聚酯切片载体可在特定的环境里提供细胞生长空间。
用到的聚酯切片载体是已成为商品化的Fibra-CelTMDisks系列产品，对与原代细胞这些具有固着生长类型的原代细胞来说，大规模培养的一个重要影响因素就是生长面积与体积的比例，比例越大细胞赖以生存的空间越多，培养的细胞密度就越高。通过细胞密度与转速较好的结合，从而使微载体培养原代细胞技术不仅为固着生长的原代细胞提供了更多的生长空间，充分利用了生物反应器里的营养成分，而且细胞所处的培养环境相同，是均相培养，使得培养的细胞质量均一。
在本发明中用来培养的原代细胞是本领域技术人员所熟悉的那些原代细胞，例如猴肾细胞、地鼠肾细胞、家兔肾细胞、鸡胚细胞、沙鼠细胞、牛肾细胞等。
本发明可分为三个阶段；a)原代细胞的获取；b)原代动物细胞的反应器接种；c)原代细胞的培养。
本发明与现有原代细胞转瓶培养方式比较，每克聚酯切片载体相当于内表面积约1160平方厘米的三L转瓶，细胞密度可达108个/毫升，综合可比因素分析对比，用本发明的产量比现有技术中的转瓶方法提高了100倍以上。通过利用生物反应器和聚酯切片载体系统的优势，结合原代细胞的生长特点，建立一种生物反应器和聚酯切片载体系统培养原代细胞的方法。这种方法不仅提高了培养原代细胞单位体积的细胞培养率，还提高了原代细胞的质量，将此技术应用于疫苗制品的生产，也会提高疫苗制品的产品质量和生产规模及生产效率。
具体实施方式
以下的实施例详细说明了本发明，但不用于限制本发明的范围。本实施例采用常规实验技术，这些均是本技术领域人员所熟悉的，可以按照本实施例使用材料厂商所提供的说明书即可进行。
在本发明的实施方案中，所述细胞为原代地鼠肾细胞；采用总体积为5升的生物反应器(Celligen PlusTM生物反应器，购自New Brunswick Scientific Co.，Inc.公司)和聚酯切片载体(Fibra-CelTMDisks)，对原代地鼠肾进行培养，对细胞质量进行考察；所用的培养基是M199培养基或DMEM培养基。所用其它试剂包括牛血清、胰酶等。
实施例一：地鼠肾细胞利用生物反应器及以聚酯切片为载体培养
1、将地鼠解剖取肾细胞，用胰蛋白酶进行消化，制得原代细胞；
2、以1×104～1×107个细胞/ml的密度接种于装有聚酯切片载体的生物反应器内；
3、接种后，使搅拌速度在50-120rpm之间，在30℃-38℃下培养5-25天，培养期间补加新鲜的培养基，使培养基中葡萄糖含量保持在2-2.5克/升。调节O2，N2，CO2气体的流速，培养期进行检测。乳糖浓度，用乳糖脱氢酶法测定；葡萄糖浓度，用葡萄糖氧化酶法测定，通过葡萄糖消耗来判定原代动物细胞的生长状态。
本发明的特点是：
培养用的细胞可以为猴肾细胞、地鼠肾细胞、家兔肾细胞、鸡胚细胞、沙鼠细胞、牛肾细胞等原代动物细胞，取材广泛；
克服了传统静置培养或旋转培养原代动物细胞方法的缺点。应用生物反应器及以聚酯切片为载体培养原代动物细胞的方法培养出来的原代动物细胞，培养过程中结合了贴壁培养与悬浮培养的优势，使细胞的生长空间增大，提高了培养效率，充分利用了培养基中的营养成分；同时，又使细胞在均一的环境下生长，保证了细胞的质量，将此技术应用于疫苗制品的生产，将会提高疫苗制品的产品质量和生产规模及生产效率，既可以造福于人类，又具有巨大的商业价值。

Claims (4)

1.一种原代细胞的培养方法，其特征是：使用生物反应器承载的聚酯切片作为载体培养已获取的原代细胞。
2.按照权利要求1所述的一种原代细胞的培养方法，其特征是：所说的培养原代细胞是，将获取的细胞以1×104～1×107个细胞/ml的密度，接种于装有聚酯切片载体的生物反应器内，接种后，使搅拌速度在50-120rpm之间，在30℃-38℃下培养5-25天，培养期间补加新鲜的培养基，调节O2，N2，CO2气体的流速，所说的生物反应器的总体积大于等于5升。
3.按照权利要求1或2所述的一种原代细胞的培养方法，其特征是：所说的原代细胞的获取方法是：将地鼠解剖取肾细胞，用胰蛋白酶进行消化。
4.按照权利要求2所述的一种原代细胞的培养方法，其特征是：所说的新鲜的培养基是M199培养基或DMEM培养基；在培养期间培养基中葡萄糖含量保持在2-2.5克/升。
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