CN101911925A - 用于评价转基因棉花安全性的一种访花昆虫棉露尾甲的人工饲养方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业昆虫学技术领域，具体涉及一种访花昆虫棉露尾甲的饲养方法，属昆虫饲养技术领域。该发明提出了用于评价转基因棉花安全性的棉露尾甲的人工饲养方法，包括：寄主植物的培育，成虫的饲养和卵的收集，幼虫的饲养和蛹的收集等步骤。成功实现了周年度和全天候的用棉花长期饲养棉露尾甲，保证了转基因安全评价试验的需要。克服了以往利用丝瓜花饲养，花源少，不能周年供应，影响棉露尾甲的大量繁殖，亦影响到转基因棉花的安全评价受试昆虫的提供。本发明主要用于转基因棉花对中性访花昆虫棉露尾甲生物学及生理生化特性影响的试验研究，同时还可用于转基因棉花对其长期累积效应的研究。

Description

用于评价转基因棉花安全性的一种访花昆虫棉露尾甲的人工饲养方法

技术领域

本发明具体涉及一种访花昆虫棉露尾甲的饲养方法，属昆虫饲养技术领域。

背景技术

在美国和欧洲的许多地方，多种环境因素造成了包括蜜蜂和甲虫类昆虫等访花生物种群和物种数量的急剧减少(Constance H.Pollinators in peril.Science，1998，279：1459.Erik S.ECOLOGY：Pollinator diversity declining in Europe.Science，2006，313：286)，影响访花昆虫种群动态的因素引起了人们的关注，比如近年来，转基因棉花在全球大面积种植，Bt毒素在花粉中表达是否影响访花昆虫的生长发育和繁殖。研究转基因棉花对访花昆虫生长发育和繁殖的影响首先需要获得大批量的、发育一致的昆虫供试，因此目前转基因棉花对访花昆虫的影响研究仅限于饲养技术成熟的蜜蜂等传粉昆虫。大部分研究表明转基因棉花对蜜蜂没有毒害作用，但转基因植物对蜜蜂有否毒害，主要取决于转基因植物转的基因类型，比如转对鳞翅目特异的Bt毒素以及葡聚糖降解酶对蜜蜂无影响，但蛋白酶抑制剂或几丁质酶抑制剂等有更广泛靶标的基因时，可能会有影响(Malone LA and Pham-Delegue MH.Effects of transgene products on honey bees(Apis mellifera)and bumblebees(Bombus sp.).Apidologie，2001，32：287-304.)。转基因棉花对访花昆虫的影响是值得关注的科学问题。但目前转基因棉花对访花昆虫的研究主要集中于蜜蜂等蜂类，而对棉田生态系统中其他专门的访花昆虫未见对其影响的研究报道，但访花昆虫除蜜蜂等膜翅目昆虫以外，还有双翅目和鞘翅目昆虫等，其中鞘翅目甲虫是最古老的一类传粉昆虫。另外转基因棉花对中性昆虫的安全性评价研究除对地下害虫中的弹尾目和原尾目有少量研究外，对其他中性昆虫未见报道。

棉露尾甲Haptoncus luteolus(Erichson)属鞘翅目露尾甲科，成虫取食棉花花粉，同时又起传粉作用，是棉田中的专门访花昆虫，由于其对棉花产量不造成影响，因此又是一种中性昆虫(罗峰，雷朝亮.棉露尾甲-种有利用前景的传粉昆虫.昆虫知识，2002，39(4)：305-306.罗峰，熊强，王健，雷朝亮.温度对传粉甲虫-棉露尾甲生长发育、存活及繁殖的影响.生态学报，2004，24(12)：2789-2793.罗峰，雷朝亮.棉露尾甲发育起点温度和有效积温的研究.昆虫知识，2004，41(3)：252-254.罗峰.设施农业传粉昆虫-棉露尾甲的基础研究[硕士学位论文].湖北：华中农业大学，2004)。棉露尾甲既是棉田中的访花昆虫同时又是中性昆虫，因此是转基因棉对访花昆虫和中性昆虫安全性评价的一种很好的指示性昆虫。

曾有前人为研究棉露尾甲的生物学和生态学特性，对棉露尾甲的人工饲养方法进行了初步研究，但其主要是以丝瓜花瓣作为棉露尾甲的食物和产卵垫，并且每天需从田间捕捉大量的成虫，让其产卵，获得一致的虫龄用于研究(罗峰.设施农业传粉昆虫-棉露尾甲的基础研究[硕士学位论文].湖北：华中农业大学，2004)，这种方法为短期饲养，并且棉露尾甲在整个生长周期中依赖丝瓜花饲养，显然这种方法不适合研究转基因棉花对棉露尾甲的影响。棉露尾甲首先需要取食棉花花粉，然后才能从生物学、生理学或分子生物学等方面研究转基因棉花对其影响；若要研究转基因棉花花粉对其的长期累积影响，棉露尾甲需要长期取食棉花花粉，经多代饲养才能研究对其的累积影响。前人饲养仅为用丝瓜花进行单代短暂的饲养，而本发明是建立一种在室内可用棉花多代饲养并可用于安评的方法，本发明绝非简单的棉花取代丝瓜花，从对花的处理、保存，以及饲养器具的选择上均有很大的改进。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种用于评价转基因棉花安全性的一种访花昆虫棉露尾甲的人工饲养方法。以适合评价转基因棉花对棉露尾甲的影响。

一种适用于转基因棉花安全性评价的访花昆虫棉露尾甲的人工饲养方法，其步骤如下：

1)植物的培育：采用棉花为棉露尾甲的寄主植物，用0.3％的多菌灵胶悬剂在20-25℃下浸泡棉种过夜，然后将浸种处理的棉种于塑料大棚中培养使其开花，采集含苞待放的棉花的花或刚刚开放的棉花的花，去除花瓣，取剩下的雄蕊、雌蕊、花药和花粉作为棉露尾甲成虫饲养的食料，或将采集的去除花瓣的花于4℃下或在-80℃下保存，供应淡季之用；

2)成虫饲养和卵的收集：将棉露尾甲成虫在室内置于带盖的透明塑料瓶中，设置下光源，并在盖子上罩上黑布，避免成虫聚集在盖子上，用步骤1的食料饲养，隔天更换，收集棉露尾甲成虫产过卵的花；

3)幼虫饲养和蛹的收集：在培养皿底部覆一层含水量为20％的棉田土(预先过40目筛，去除石子、瓦片等杂质)，将棉露尾甲成虫产过卵的花置于其上，直至其卵孵化和幼虫化蛹，每天观察培养皿内化蛹情况，用镊子轻轻拨开泥土，取出棉露尾甲的蛹，将棉露尾甲的蛹转移到含水量为20％的棉田土的培养皿中培养，获得棉露尾甲成虫。

成虫的保种及单对饲养：棉露尾甲的繁殖保种采用容积为500ml带盖的塑料瓶。其单对饲养，采用容积为1.5ml的离心管。

产卵量和卵孵化率的观察；用带花瓣的花饲养成虫导致成虫将卵产于花瓣上，花瓣蔫后将无法观察到卵量和卵的孵化，本发明用去除花瓣的棉花来饲养成虫，其产卵于雄蕊或雌蕊等部分便于观察卵的情况。去除花瓣时动作要轻，以免抖落花粉。

本发明的有益效果：

1)通过本发明所提出的用于人工饲养棉露尾甲的方法，成功实现了用棉花长期饲养棉露尾甲，有助于研究转基因棉花对其影响以及累积效应，克服了以往利用丝瓜花饲养，不能研究转基因棉花对其影响，更不可能实现对其累积效应的研究；

2)本发明中所提出的饲养棉露尾甲的饲料为：成虫为花粉，幼虫为腐烂的花朵。花粉可在4℃短期保存一周，在-80℃可保存半年左右，保存的花粉有效的补充了淡季的需要。因此可实现全年度、全气候的人工饲养，保证了试验的需要。

本发明用棉花多代饲养后的孵化率、化蛹率均为90％以上，羽化率也接近80％，可见本发明可实现棉露尾甲的继代饲养。

附图说明

图1：是转基因棉花和非转基因棉花饲养棉露尾甲生存曲线比较图。

具体实施方式

实施例1：(棉露尾甲种群的建立)

从田间寄主棉花、丝瓜、南瓜等花中采集棉露尾甲，在室内置于小口带盖的透明塑料瓶中，用去除花瓣的棉花花朵(或丝瓜花)饲养，饲养条件为：恒温30士0.5℃、光照周期16L：8D、湿度80士5％。大约500ml的瓶中放置棉花约十朵(丝瓜花月4朵)，成虫约100只。成虫取食棉花花粉，并产卵于雄蕊或雌蕊或花瓣等部位。隔天更换花朵，并收集产过卵的花，直至产卵期结束。将产过卵的花置于培养皿中(玻璃或塑料材质)，培养皿底部覆一层含水量为20％的土，幼虫取食腐烂的花，一段时间后可见培养皿底部白色的蛹。将发育一致的蛹挑出，置于另外底部覆土(土壤含水量为20％)的培养皿中，2-3天后可获得大量的成虫。发育一致的成虫置于同一个塑料瓶中饲养。经多代饲养可建立棉露尾甲的实验种群。

从表1可以看出，用棉花饲养的棉露尾甲的幼虫和成虫培养周期(昆虫学称历期)比用丝瓜花饲养的要长，但孵化率和羽化率却比用丝瓜花饲养的棉露尾甲要高，可见用棉花饲养的棉露尾甲虽然延长了发育历期，却有利于其繁殖。因此用棉花饲养棉露尾甲可达到周年继代饲养的目的。

表1不同寄主植物的花对棉露尾甲的生物学特性的影响

实施例2：(应用实施例)

试验材料与方法

试验种群构建：按实施例1中描述方法，分别用转基因和非转基因棉花花粉饲养棉露尾甲三代以上，构建转基因棉花和非转基因棉花棉露尾甲试验种群。

生物学特性比较：每天观察每个试验种群卵、幼虫和蛹，并记录他们的发育时间、孵化率、化蛹率和羽化率。110只幼虫和84只蛹用于非转基因棉花棉露尾甲种群的观察，101只幼虫和58只蛹用于转基因棉花棉露尾甲种群的观察，两个种群均用了84只卵用于卵期参数观察。为了观察成虫的历期和平均单雌产卵量，采用单对交配法。一对刚羽化的处女雌雌虫置于一小塑料管中(Φ1×4cm)进行交配观察。非转基因棉花棉露尾甲种群共观察了22对，转基因棉花棉露尾甲种群共观察了28对，隔天更换饲料，并观察成虫的死亡率和卵孵化率，记录成虫历期，通过卵是否孵化来检验成虫交配的成功与否。

生存曲线的观察：转基因棉花和非转基因棉花棉露尾甲试验种群，各选取100只初产的卵，置于带土的培养皿中(土壤含水量为20％)，卵孵化后幼虫取食腐烂的花并化蛹，羽化后的成虫转移至塑料管中并饲喂新鲜花粉，两天更换一次。每天观察并记录棉露尾甲的死亡数。

数据分析：在进行分析之前对试验数据需进行检验，并用SPSS软件对数据进行方差分析或非参数检验。t测验分析成虫历期和平均单雌产卵量；U测验分析卵、幼虫和蛹历期；卡方分析卵孵化率、化蛹率和羽化率；采用Kaplan-Meier程序制作生存曲线，并用Breslow测验分析两种曲线的差异性。

试验结果：生物学参数具体试验结果见表2。转基因和非转基因棉花花粉饲养的棉露尾甲卵孵化率和交配率均达100％，化蛹率和羽化率分别为95.65％和67.24％，93.75％和77.38％，但两种群间不存在显著差异。平均单雌产卵量分别为16.11和17.91粒，两种群间不存在显著差异。两种群各虫态的历期也不存在显著差异。结果表明转基因棉花在短期内没有对棉露尾甲的生长发育和繁殖造成不良影响。

生存曲线结果见图1。两个种群的生存曲线显示，转基因和非转基因棉花饲养棉露尾甲生存周期分别为45和44天。转基因棉花饲养棉露尾甲在10-30天的死亡率略高于非转基因棉花。统计分析结果显示两个曲线不存在显著性差异。

表2转基因棉花和非转基因棉花饲养棉露尾甲生物学参数比较

Claims (5)

1.一种适用于转基因棉花安全性评价的访花昆虫棉露尾甲的人工饲养方法，其步骤如下：

1)寄主植物的培育：用0.3％的多菌灵胶悬剂在20-25℃下浸泡棉种过夜，然后将浸种处理的棉种于塑料大棚中培养使其开花，采集花朵，去除花瓣，取剩下的雄蕊、雌蕊、花药和花粉作为棉露尾甲成虫饲养的食料，或将采集的去除花瓣的花于4℃下或在-80℃下保存，供应淡季之用；

2)成虫饲养和卵的收集：将棉露尾甲成虫在室内置于带盖的透明塑料瓶中，用步骤1的食料饲养，隔天更换，饲养条件为：培养温度为30士0.5℃，光/暗周期为16∶8，光照强度为3000Lux，相对湿度为80士5％，收集棉露尾甲成虫产过卵的花；

3)幼虫饲养和蛹的收集：在培养皿底部覆一层含水量为20％的棉田土，将棉露尾甲成虫产过卵的花置于其上，直至其卵的孵化和化蛹，每天观察培养皿内化蛹情况，用镊子轻轻拨开泥土，取出棉露尾甲的蛹，将棉露尾甲的蛹转移到含水量为20％的棉田土的培养皿中培养，获得棉露尾甲成虫。

2.按权利要求1所述的饲养方法，其特征在于，采花后立即用含水的脱脂棉包住花托，保持其新鲜度。

3.按权利要求1所述的饲养方法，其特征在于，棉露尾甲的繁殖保种采用容积为500ml带盖的塑料瓶。

4.按权利要求1所述的饲养方法，其特征在于，棉露尾甲的单对饲养，采用容积为1.5ml的离心管。

5.按权利要求1所述的饲养方法，其特征在于，采用含苞待放的棉花的花或刚刚开放的棉花的花。

Images