CN101906444B - 酸性蛋白酶作为酮与硝基烯的Michael加成反应催化剂的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及物质的新应用，特别涉及酸性蛋白酶作为酮与硝基烯的Michael加成反应催化剂的应用，具有高效、高选择性等优点；本发明还提供了利用酸性蛋白酶催化酮与硝基烯烃的Michael加成反应的方法，产物收率高，非对映选择性好。
Description
技术领域
本发明涉及物质的新应用，特别涉及酸性蛋白酶作为酮与硝基烯的Michael加成反应催化剂的应用。
背景技术
近年来，生物催化剂如酶作为一种有效的绿色催化剂在有机合成中引起了化学家和生物学家的广泛关注。Michael加成反应是一种有效、实用、经济的形成碳碳键和碳杂键的反应。近年来，酶催化的Michael加成反应相继被报道，如脂肪酶和蛋白酶催化Michael加成反应形成碳杂键，但酶催化Michael加成反应形成碳碳键的报道较少。Berglund小组报道了脂肪酶催化1，3-二羰基化合物与α，β-不饱和羰基化合物的Michael加成反应形成碳碳键。Lin小组发现了一种来源于埃希氏菌的锌依赖性氨基转移酶能在有机介质中催化1，3-二羰基化合物与丁烯酮的Michael加成反应。但据我们所知，蛋白酶催化Michael加成反应形成碳碳键还未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供酸性蛋白酶作为酮与硝基烯的Michael加成反应催化剂的应用，具有高效、高选择性等优点；目的之二在于提供利用酸性蛋白酶催化酮与硝基烯的Michael加成反应的方法，产物收率高，非对映选择性好。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、酸性蛋白酶作为酮与硝基烯的Michael加成反应催化剂的应用。
2、利用酸性蛋白酶催化酮与硝基烯的Michael加成反应的方法，是以酸性蛋白酶为催化剂，将酮与硝基烯在含水有机溶剂中反应，水与有机溶剂的体积比为0～0.35，反应温度为30℃～55℃，酮与硝基烯的投料摩尔比为1～35∶1。
进一步，所述有机溶剂为二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃或乙醇，水与有机溶剂的体积比为0.05～0.20；所述反应温度为40～50℃；所述酮与硝基烯的投料摩尔比为10～25∶1；
进一步，所述有机溶剂为二甲亚砜，水与有机溶剂的体积比为0.15；所述反应温度为45℃；所述酮与硝基烯的投料摩尔比为20∶1；
进一步，所述酮为链状或环状脂肪酮，所述硝基烯为芳香环或杂芳香环取代的β-硝基烯。
本发明的有益效果在于：本发明提供了酸性蛋白酶作为酮与硝基烯的Michael加成反应催化剂的应用的应用，具有高效、高选择性等优点；还提供了利用该酸性蛋白酶催化酮与硝基烯的Michael加成反应的方法，产物收率高，非对映选择性好。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。
优选实施例中使用的酸性蛋白酶[来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii No537)，50U/mg，EC 3.4.23.18]购自无锡市雪梅酶制剂科技有限公司。除另有说明外，所有试剂均来源于商业渠道且未经进一步纯化。
优选实施例中采用薄层色谱法(GF254硅胶板)监测反应进程；快速柱色谱法采用100～200目硅胶加压柱，洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯的混合液；非对映异构体比例(dr)采用核磁共振氢谱(1HNMR)和高效液相色谱手性固定相法测定，1HNMR采用Bruker AMX-300型核磁共振仪(以TMS为内标)，高效液相色谱的手性固定相采用AD-H、OD-H、AS-H或OJ-H手性柱。
实施例1～10、不同酶催化的环己酮与反-β-硝基苯乙烯的Michael加成反应
在圆底烧瓶中加入反-β-硝基苯乙烯(1.0mmol)、环己酮(10mmol)、DMSO(5mL)、去离子水(0.75mL)和酶(200mg)，25℃搅拌反应168小时；反应完毕后，滤过，滤饼用二氯甲烷洗涤，洗液与滤液合并，用水洗涤3次，收集有机层，用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂得粗产物，将粗产物用快速柱色谱法纯化，即得目标产物。反应条件及结果见表1。
表1不同酶催化的Michael加成反应
由表1可知，在10种测试酶中，酸性蛋白酶的催化活性最好，产物收率最高(实施例1)；胰蛋白酶、胰酶和碱性蛋白酶的催化活性次之，产物收率中等(实施例2～4)；菠萝蛋白酶、纤维素酶和核酸酶的催化活性较低，产物收率较低(实施例5～7)；木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和溶菌酶的催化活性极低，仅检测到痕量产物生成(实施例8～10)。
实施例11～41、酸性蛋白酶催化的环己酮与反-β-硝基苯乙烯的Michael加成反应
在圆底烧瓶中加入反-β-硝基苯乙烯、环己酮、有机溶剂、去离子水和酸性蛋白酶，恒温搅拌反应；反应完毕后，滤过，滤饼用二氯甲烷洗涤，洗液与滤液合并，用水洗涤3次，收集有机层，用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂得粗产物，将粗产物用快速柱色谱法纯化，即得目标产物。反应条件及结果见表2。
表2、酸性蛋白酶催化的环己酮与反-β-硝基苯乙烯的Michael加成反应
由表2可知，酸性蛋白酶催化的环己酮与反-β-硝基苯乙烯的Michael加成反应在不同条件下都可以顺利进行：反应溶剂优选由有机溶剂和水组成，有机溶剂优选DMSO、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)、乙醇、二氯甲烷、叔丁基甲醚、环己烷，更优选DMSO、DMF、THF或乙醇，最优选DMSO(实施例11～18)；水与有机溶剂的体积比优选为0～0.35，更优选为0.05～0.20，最优选为0.15(实施例19～26)；反应温度优选30～55℃，更优选40～50℃，最优选45℃(实施例27～32)；环己酮与反-β-硝基苯乙烯的投料摩尔比优选为1～35∶1，更优选为10～25∶1，最优选20∶1(实施例33～41)。
实施例42～45、酸性蛋白酶的催化活性验证实验
在圆底烧瓶中加入反-β-硝基苯乙烯(1.0mmol)、环己酮(20mmol)、DMSO(4mL)、去离子水(0.6mL)和酸性蛋白酶(200mg)，45℃搅拌反应；反应完毕后，滤过，滤饼用二氯甲烷洗涤，洗液与滤液合并，用水洗涤3次，收集有机层，用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂得粗产物，将粗产物用快速柱色谱法纯化，即得目标产物。反应条件及结果见表3。
表3、酸性蛋白酶的催化活性验证实验
由表3可知，环己酮与反-β-硝基苯乙烯的Michael加成反应，在酸性蛋白酶催化下的产物收率为80％，而在不加酶情况下未检测到产物生成，说明酸性蛋白酶对Michael加成反应具有催化活性(实施例42～43)；当用SDS预处理使酸性蛋白酶变性时，产物收率降低为23％，说明酸性蛋白酶对Michael加成反应的催化活性依赖于其三维结构。当用色氨酸和酪氨酸残基修饰剂N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)预处理使酸性蛋白酶的活性受到抑制时，产物收率仅为8％，说明色氨酸和/或酪氨酸是酸性蛋白酶必不可少的催化位点。
实施例46～61、酸性蛋白酶催化酮与硝基烯的Michael加成反应
在圆底烧瓶中加入硝基烯(1.0mmol)、酮(20mmol)、DMSO(4mL)、去离子水(0.6mL)和酸性蛋白酶(200mg)，45℃搅拌反应；反应完毕后，滤过，滤饼用二氯甲烷洗涤，洗液与滤液合并，用水洗涤3次，收集有机层，用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂得粗产物，将粗产物用快速柱色谱法纯化，即得目标产物。反应条件及结果见表4。
表4酸性蛋白酶催化酮与硝基烯的Michael加成反应
由表4可知，Michael给体如环己酮、环戊酮、丙酮与Michael受体如芳香环或杂芳香环取代的β-硝基乙烯的Michael加成反应在酸性蛋白酶的催化下均可以顺利进行，得到中等至较高收率(47％～84％)的产物，并显示出较好的非对映选择性，说明酸性蛋白酶催化的酮与硝基烯的Michael加成反应具有底物普遍适用性，酮可以是环状脂肪酮如环己酮、环戊酮等或链状脂肪酮如丙酮等，硝基烯可以是芳香环或杂芳香环取代的β-硝基烯。
固定Michael受体为反-β-硝基苯乙烯，考察Michael给体对酸性蛋白酶催化的Michael加成反应的影响，结果显示，与环戊酮和丙酮相比，环己酮的产物收率和dr值均较好，环戊酮的产物收率较好但dr值较低，丙酮的产物收率较低(实施例46、60～61)。
固定Michael给体为环己酮，考察Michael受体对酸性蛋白酶催化的Michael加成反应的影响，结果显示，苯环被吸电子基取代的反-β-硝基苯乙烯具有更高的反应活性，在较短的反应时间内即可达到较好的产率(实施例53～57)，而苯环被供电子基取代的反-β-硝基苯乙烯需要较长的反应时间才能达到较好的产率(实施例47～50)；酸性蛋白酶催化的环己酮与硝基烯的Michael加成反应主要得到顺式产物，其中，反-β-硝基苯乙烯和卤素取代的反-β-硝基苯乙烯得到较多的的顺式产物(实施例46、51～54)，2，4-二氯取代的反-β-硝基苯乙烯和呋喃取代的β-硝基乙烯得到中等的顺式产物(实施例55、58)，而甲基、甲氧基、氰基或间硝基取代的反-β-硝基苯乙烯和噻吩取代的β-硝基乙烯仅得到较低的顺式产物(实施例47～50、56～57、59)。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (4)
1.酸性蛋白酶作为酮与硝基烯的Michael加成反应催化剂的应用，所述酸性蛋白酶是来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)的酸性蛋白酶，编号为EC3.4.23.18；所述酮为链状或环状脂肪酮，所述硝基烯为芳香环或杂芳香环取代的β-硝基烯。
2.利用权利要求1所述酸性蛋白酶催化酮与硝基烯的Michael加成反应的方法，其特征在于：以酸性蛋白酶为催化剂，将酮与硝基烯在溶剂中反应，所述溶剂组成为水与有机溶剂的体积比为0～0.35，反应温度为30℃～55℃，酮与硝基烯的投料摩尔比为1～35∶1；所述酸性蛋白酶是来源于宇佐美曲霉(Aspergillususamii)的酸性蛋白酶，编号为EC 3.4.23.18；所述酮为链状或环状脂肪酮，所述硝基烯为芳香环或杂芳香环取代的β-硝基烯。
3.根据权利要求2所述利用酸性蛋白酶催化酮与硝基烯的Michael加成反应的方法，其特征在于：所述有机溶剂为二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃或乙醇，水与有机溶剂的体积比为0.05～0.20；所述反应温度为40～50℃；所述酮与硝基烯的投料摩尔比为10～25∶1。
4.根据权利要求3所述利用酸性蛋白酶催化酮与硝基烯的Michael加成反应的方法，其特征在于：所述有机溶剂为二甲亚砜，水与有机溶剂的体积比为0.15；所述反应温度为45℃；所述酮与硝基烯的投料摩尔比为20∶1。
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| Cai et al..Hydrolase-catalyzed Michael addition of imidazoles to acrylic monomers in organic medium..《Journal of Biotechnology》.2006,330–337. * |
| 段新方.硝基化合物的不对称迈克尔加成反应.《有机化学》.2003,776-783. * |
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