CN101898012A

CN101898012A - 一种增强高强度聚焦超声诱导的抗肿瘤免疫应答的方法

Info

Publication number: CN101898012A
Application number: CN2010102333190A
Authority: CN
Inventors: 胡振林; 刘芳; 丘磊; 丁力; 厉建中; 张俊平
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2010-07-22
Filing date: 2010-07-22
Publication date: 2010-12-01

Abstract

本发明属于医疗技术领域，具体为一种增强高强度聚焦超声(HIFU)诱导的抗肿瘤免疫应答的方法。本方法在不改变当前HIFU肿瘤治疗的超声强度的情况下，使用较稀疏的扫描策略，使单次HIFU治疗产生的肿瘤组织热变性斑保持适当间隔，以保留每个热变性区域的周围组织。本方法在不影响HIFU对原发肿瘤的热消融治疗效果的同时，使HIFU治疗后的肿瘤组织有更强的招募树突状细胞并使其活化的能力，能诱导出更强的抗肿瘤免疫应答，从而杀灭残存的活细胞，同时防治肿瘤的远端转移。本方法可以提高HIFU治疗肿瘤的整体效果并缩短治疗时间。

Description

一种增强高强度聚焦超声诱导的抗肿瘤免疫应答的方法

技术领域

本发明属于医疗技术领域，具体涉及一种在应用HIFU治疗肿瘤时增强机体的抗肿瘤免疫应答水平的方法。

背景技术

高强度聚焦超声（high-intensity focused ultrasound, HIFU）作为肿瘤治疗的新技术已经获得了较为广泛的临床应用。其工作原理是利用超声波穿透性、方向性、聚焦性好的特点，将体外低能量的超声聚焦于体内肿瘤组织，在焦点区域高能量的超声通过高热效应能在短时间（1~4秒）内使靶组织温度迅速升高至65℃ 以上，使靶组织发生不可逆的凝固性坏死，较精确地杀死肿瘤细胞，而不损伤周围组织。一般HIFU的焦点大小为10 × 3 × 3 mm，因此整个肿瘤的治疗需要逐点和逐层的焦点扫描或分多次治疗来完成。国内外对HIFU已进行了近十年的研究，技术日渐成熟。美国和欧洲已批准HIFU用于前列腺肥大和前列腺癌的治疗。国内亦已在肝癌、乳腺癌、前列腺癌、骨肉瘤、软组织肉瘤治疗等方面开展更广泛的临床研究，迄今已积累上万例临床病理，证明了HIFU治疗的有效性和可行性。

HIFU作为肿瘤治疗的新手段具有无创性，没有化疗和放疗本身的禁忌症和不良反应，治疗反应小，可反复多次使用而不积累全身毒副作用，综合费用低等诸多优点。当然，HIFU的临床应用尚有许多问题有待解决，比如由于不完全的组织坏死而导致的肿瘤原位复发的问题，特别是对体积较大的实体瘤，该问题尤其突出^[5]。为了尽可能完全彻底地杀灭肿瘤细胞，防止肿瘤复发，目前临床上的HIFU治疗普遍采用密集扫描的治疗策略，以在肿瘤组织内产生密集排列的热变性区域（thermal lesions）。但该策略使HIFU治疗时间极大地延长，因为目前HIFU治疗仪的焦域大小一般仅为10 × 3 × 3 mm，要在肿瘤组织内产生密集排列的可以覆盖整个肿瘤体积的热变性区域，通常需要上千个扫描点，整个过程需要超过4个小时的时间。临床实践表明：尽管采用这种密集扫描的治疗策略，仍不能完全杀灭肿瘤细胞，HIFU治疗后的原位复发率和转移率都相当高，已有报道在软组织肉瘤的HIFU治疗临床研究中有20%的原位复发率，这可能是由于肿瘤组织的热传导率不同而导致肿瘤的受热不均匀所致。另外，尽管已有几项研究报道HIFU治疗并不增加肿瘤转移的危险，但HIFU治疗后的肿瘤转移仍然是病人死亡的主要原因。显然，HIFU的总体治疗效果仍有待进一步提高。目前研究的热点主要集中在HIFU剂量学即超声剂量与治疗效应的关系、肿瘤影像学与治疗过程的实时跟踪监控及组织内的精确测温技术等方面。这些研究可以提高HIFU对原发肿瘤的治疗效果，但无法从根本上解决肿瘤转移的问题。

特别令人感兴趣的是，动物及临床实验已经发现HIFU 除可以杀灭肿瘤细胞，破坏肿瘤组织外，还可以增加机体的系统性抗肿瘤免疫。例如，动物实验发现用HIFU治疗小鼠体表Brown-Pierce肉瘤，当将其原位瘤破坏后其播散结节也自行消失；HIFU治疗荷神经母细胞瘤1300小鼠，治愈者再次接种同种肿瘤，肿瘤增殖率降低，提示HIFU可能具有诱发肿瘤免疫的能力；临床试验中发现肿瘤病人经HIFU治疗后，循环中CD3⁺CD4⁺T细胞数量及CD4⁺/CD8⁺T细胞数量比有所上升；转移性肝癌患者经HIFU治疗后IL-12、IFN-γ明显升高，IL-6，IL-10明显降低；在HIFU治疗乳腺癌的临床试验中发现同侧腋窝淋巴结内滤泡增多，生发中心扩大，淋巴细胞数量明显增多，78%的病例淋巴结为混合免疫反应增强型。这些发现提示HIFU有增强机体局部和全身抗肿瘤免疫功能的作用。显然，如能在探明HIFU免疫调控机理的基础上进一步提高其诱导抗肿瘤免疫应答的能力，不仅可以提高HIFU对原发肿瘤的治疗效果，减少复发，亦可防止肿瘤转移，从而全面提高HIFU的总体肿瘤治疗效果。

发明人的前期研究表明，HIFU能通过损伤肿瘤细胞诱生和局部释放多种内源性树突状细胞（DC）激活因子，刺激DC活化和成熟。DC是最重要的专职抗原提呈细胞（antigen-presenting cell，APC），其最大的特点是能够刺激初始型T细胞增殖，因此是机体免疫应答的始动者，在免疫应答的诱导中具有独特的地位。DC所处的成熟阶段或活化状态一直被认为是启动免疫应答的决定性因素，处于稳态“不成熟”状态的DC被相信主要诱导T细胞失能或产生调节性T细胞（Treg）应答，导致免疫耐受，而成熟DC具备完整诱导免疫识别和激活免疫应答的能力。成熟DC表达高水平的MHC分子、协同刺激分子(CD80、CD86)、黏附分子(CD40、CD44)等，并能分泌IL-12、IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ等细胞因子，有效地将抗原提呈给初始T细胞并使之激活，促进细胞介导的免疫应答。我们在进一步研究中发现HIFU能刺激DC浸润到肿瘤组织中，活化成熟后迁移到引流淋巴结，然后诱导出肿瘤特异性CTL反应。据此我们提出HIFU增强抗肿瘤免疫的关键环节可能在于内源性危险信号的释放和DC活化，并认为优化HIFU的治疗条件可增强其诱导抗肿瘤免疫的能力。

发明内容

本发明的目的在于提出一种能够增强高强度聚焦超声诱导的抗肿瘤免疫应答的方法，从而增强HIFU诱导的抗肿瘤免疫作用，防止肿瘤转移，从而全面提高HIFU的总体肿瘤治疗效果。

本发明提出的方法，是通过优化HIFU治疗的扫描策略来更有效的刺激DC成熟。具体是采用与当前HIFU治疗肿瘤的密集扫描策略相比更为稀疏的扫描策略，使每次HIFU治疗产生的肿瘤组织热变性斑保持适当间隔，即使每个热变性区域的周围组织仅受到最高温度为55°C的热损伤，从而使该周围区域的肿瘤组织具有更强的招募树突状细胞并使其活化的能力，诱导出更强的抗肿瘤免疫应答。

具体而言，通过采用更为稀疏的扫描方式，产生具有适当间隔的热变性区域（thermal lesions）。而单次HIFU治疗可以采用目前临床使用的超声强度，使聚焦区域内的温度达到65℃-85℃，在该温度下，肿瘤细胞发生瞬间的凝固性坏死。

其中，所述的具有适当间隔的热变性区域是指通过增加相邻两次HIFU治疗的探头移动距离，结合瘤内温度测量，使两次HIFU治疗生产的两个热变性区域之间的组织温度上升至55℃。

研究表面，温度上升至55℃的热变性区域之间的肿瘤组织细胞可以表达和释放更多的DC活化因子，具有更强的免疫刺激活性。

采用上述治疗方案，可以生产并保留离散的热变性区域之间的具有更强DC激活作用的肿瘤细胞，进而诱发更强的抗肿瘤免疫应答，杀灭残存的肿瘤细胞，同时防治肿瘤的远端转移。

采用上述治疗方案，可以在不影响HIFU对原发肿瘤的热消融治疗效果的同时，提高HIFU的整体治疗效果，并缩短治疗时间。

附图说明

图1. 荷瘤小鼠的HIFU治疗系统示意图。

图2. HIFU治疗在肿瘤组织内生产的热效应。采用连续波模式（continuous wave ，CW) ，超声压力为P⁺ = 19.5/P- = -7.2 (MPa) 条件下，HIFU治疗 4秒钟生产的沿焦域纵向（A）和横向分布的温度变化曲线，以及HIFU治疗不同时间（4, 3, 2 秒）生产的热变性区域的纵向（C）和横向（D）切面。

图3. HIFU治疗可以招引DC聚集于热变性区域的周围区域。染为棕色的是CD11c+的树突状细胞。

图4. HIFU体外处理的肿瘤细胞具有刺激DC成熟的免疫激活作用。(A) 55°C-HIFU 和 80°C-HIFU在肿瘤细胞悬液中生产的温度变化曲线。 (B)体外培养的骨髓衍生的DC细胞与CpG-ODN（DC激活剂阳性对照），正常B16细胞，经 55°C-HIFU和80°C-HIFU 体外处理的 B16 细胞共孵育48小时，培养上清中IL-12 和 IL-10 的水平。 (C) DC细胞表面CD80 和 CD86表达水平的流式分析结果 (D) DC细胞表面CD80 和 CD86表达水平（平均荧光强度）。

图5. 不同扫描策略HIFU的肿瘤热消融效应及其诱导的抗肿瘤免疫应答C57BL/6小鼠于右后肢皮下接种5 × 10⁵ MC-38 或 B16细胞， 9天后，分别以密集扫描和稀疏扫描策略进行HIFU治疗，同时在对侧（左后肢）皮下接种同种肿瘤细胞进行在攻击，每日检测原发肿瘤和再攻击肿瘤的生长情况，HIFU治疗14天后取小鼠脾细胞ELISpots法检测分泌干扰素-γ的细胞数目 (A) 密集扫描和稀疏扫描HIFU在MC-38肿瘤组织内生成的热变性区域。 (B-C) 不同扫描策略HIFU对所治疗的原发肿瘤生长的阻滞效应。 (D-E) 不同扫描策略HIFU对远端再攻击肿瘤生长的阻滞效应。 (F-G) HIFU治疗的小鼠脾脏分泌干扰素-γ的细胞数。

图6. HIFU治疗招募DCs 进入肿瘤组织并呈现活化成熟的表型. (A) CD45+ 的肿瘤浸润淋巴细胞的流式分析。 (B) CD45+ 的肿瘤浸润淋巴细胞中CD11c+ 的DC细胞比率及其活化成熟表面标志MHC II，CD80和 CD86表达情况的流式分析。(C) 肿瘤浸润 DC (CD11c+/MHC II+) 的百分比 (D) HIFU治疗1天后B16 和 MC-38肿瘤组织中DC细胞表面CD86 的表达水平。 (E) HIFU治疗1天后B16 和 MC-38肿瘤组织中DC细胞表面CD80 的表达水平。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例进行进一步详细说明。应当理解，下面实施例仅仅用于解释本发明，但不以任何方式限定本发明。

实施例1：HIFU治疗可以招引DC聚集于热变性区域的周围区域。

采用附图1所示的HIFU肿瘤治疗装置对接种于小鼠右后肢皮下的MC-38结肠癌肿瘤组织进行HIFU治疗，在连续波模式（continuous wave ，CW) ，超声压力为P⁺ = 19.5/P- = -7.2 (MPa) 条件下，HIFU可以在4秒的短时间内使瘤内焦点区温度快速升高至80℃（附图2A），并在治疗区域产生一个典型的的边缘清晰的热变性区域，大小为1×5 mm (transverse × longitudinal direction)（附图2B）。这与目前临床HIFU治疗产生的肿瘤组织热效应相一致。根据瘤内温度测定的结果，围绕热损伤区域的周缘组织温度也有上升，但峰值温度较低，约55℃。于HIFU治疗一天后收集肿瘤组织样本，制成6微米冰冻切片，用抗-CD11c抗体进行免疫组化染色。附图3显示的代表性的实验结果表明：HIFU治疗可以招引DC细胞向瘤内的热损伤部位聚集，而且DC主要聚集于热变性区域的周围区域。

实施例2：在HIFU导致的热损伤的边缘区域的肿瘤细胞拥有较强的激活DC的免疫刺激能力。

将体外培养的肿瘤细胞用不同的HIFU处理4s，使其温度分别在处理时间内上升至55℃和80℃（分别模拟焦域周围和焦域内肿瘤的受热情况），然后与培养的小鼠骨髓衍生的DC(BMDC)共培养，检测DC成熟的标志（CD80/CD86表达水平和IL-12分泌水平），以检测焦域周围和焦域内肿瘤细胞是否有不同的刺激DC成熟的能力。附图4所示的结果表明，55℃-HIFU处理的肿瘤细胞比80℃-HIFU处理的肿瘤细胞显示出更强的诱导IL -12p70分泌和刺激DC的表面CD80和CD86表达上调的免疫刺激活性。表明HIFU治疗可以改变肿瘤细胞在DC成熟过程中的作用，使其从免疫抑制作用转变为免疫刺激作用，更重要的是，经55℃-HIFU处理的肿瘤细胞显示出了明显的比 80℃-HIFU处理的肿瘤细胞更强的免疫刺激效用。

实施例3：稀疏扫描策略HIFU可以产生与密集扫描策略类似的对原发肿瘤的治疗效果，但其诱导的特异性抗肿瘤应答远远高于密集扫描策略HIFU。

以MC-38小鼠结肠癌和B16黑色素瘤荷瘤小鼠为动物模型，采用两种不同的HIFU扫描治疗策略（即密集扫描和稀疏扫描）进行肿瘤的HIFU治疗。密集扫描策略采用每点HIFU治疗间距1mm，以产生密集排列的热变性区域，用以模拟目前临床的治疗策略；稀疏扫描采用每点HIFU治疗间距2mm，以保留每个热变性区域的周围组织。附图5A显示两种扫描策略在MC-38肿瘤上造成的密集排列和间隔一定距离的热变性区域。附图5B和C显示尽管稀疏扫描策略在肿瘤组织内产生的热变性区域较少，但对被治疗肿瘤生长的抑制作用并不低于密集扫描策略；HIFU治疗使再攻击肿瘤的生长受到明显阻滞，表明HIFU治疗诱导了特异性的系统性抗肿瘤免疫应答，而且采用稀疏扫描策略的HIFU治疗过的个体，阻碍再攻击肿瘤生长的能力更强（附图5D和E）；进一步采用ELISpots法定量测定HIFU诱导的抗肿瘤免疫应答水平，发现与肿瘤再攻击实验结果相一致，经HIFU治疗的小鼠脾脏分泌干扰素-γ的细胞与对照组相比显著增多，而且稀疏扫描HIFU诱导产生的IFN-γ分泌细胞数明显高于密集扫描HIFU，表明稀疏扫描HIFU诱导了更强的特异性抗肿瘤免疫应答（附图5F和G）。

进一步检测了不同扫描策略的HIFU治疗对肿瘤组织中DC数量及其功能状态的影响（附图6）。发现经HIFU治疗的肿瘤组织中与未处理组相比存在较高比例的浸润DC(CD11c⁺/MHC II⁺)，CD11c﹢的细胞亚群的CD80和CD86表达水平上调，表明HIFU治疗能诱导DC成熟。最重要的是，使用稀疏扫描策略HIFU能使肿瘤中浸润的DC比例更高，CD80和CD86表达水平更高，表明其促进DC向肿瘤组织浸润并刺激DC成熟的作用比密集扫描策略更强。

上述实验结果表明：稀疏扫描HIFU可以产生与当前临床普遍采用的密集扫描策略类似的对原发肿瘤的治疗效果，但其诱导的特异性抗肿瘤应答远远高于密集扫描策略HIFU，而该种效果与稀疏扫描HIFU比密集扫描策略具有更强的促进DC向肿瘤组织浸润并刺激DC成熟的作用密切相关。

Claims

1.一种增强高强度聚焦超声诱导的抗肿瘤免疫应答的方法，其特征在于，采用与当前高强度聚焦超声治疗肿瘤的密集扫描策略相比更为稀疏的扫描策略，使每次高强度聚焦超声治疗产生的肿瘤组织热变性斑保持适当间隔，使每个热变性区域的周围组织仅受到最高温度为55°C的热损伤，从而使该周围区域的肿瘤组织具有更强的招募树突状细胞并使其活化的能力，诱导出更强的抗肿瘤免疫应答。