CN101857583A

CN101857583A - 异黄酮类金属配合物制备方法及抗肿瘤医药用途

Info

Publication number: CN101857583A
Application number: CN200910097363A
Authority: CN
Inventors: 仇佩虹; 陈翔; 唐丽君; 孙玉娜; 林丽
Original assignee: Wenzhou Medical College
Current assignee: Wenzhou Medical College
Priority date: 2009-04-08
Filing date: 2009-04-08
Publication date: 2010-10-13

Abstract

本发明涉及式I、II的异黄酮类金属配合物制备方法及用途：其中各基团的定义详见说明书。这些化合物及其药学上可接受的盐或它们的水合物或它们的溶剂化物药物组合物可用于治疗肿瘤、肿瘤新生血管形成或肿瘤转移药物中的用途。其结构式见摘要附图1。

Description

异黄酮类金属配合物制备方法及抗肿瘤医药用途

技术领域

本发明属于天然药物化学、药物合成及药理学技术领域，具体涉及异黄酮金属配合物，涉及它的制备方法和涉及其在制备用于诱导细胞凋亡或广谱抗肿瘤药物组合物中的用途，特别是在诱导细胞凋亡，抗新生血管形成，阻止肿瘤细胞恶性转移等药物组合物中的用途。

背景技术

Pt(II)的金属配合物(也称为顺铂)具有抗肿瘤活性，是临床上治疗癌症最广泛使用的药物之一，但它的毒副作用和交叉耐药性等缺点在一定程度上限制了这些药物的应用。较之常用的铂类抗癌药物，非铂类金属配合物抗癌药的优点有：(1)通过与不同的金属离子配位改变电荷、氧化态；(2)能选择多样的配体以改变配合物的形状、性质等等；如目前研究较多的铁、铜、钌等金属和有机配体形成的配合物具有较好的抗肿瘤活性及较低的毒性，且脂溶性好。因此寻找开发药效更好、毒副作用更小的非铂类金属抗肿瘤药物已成为药物研究的一大热点。近年来的研究表明，细胞凋亡与肿瘤发生，发展与消退有密切的关系，认为肿瘤是细胞增殖和细胞凋亡失衡所致，诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤防治的一个有效途径。肿瘤细胞的生长和转移取决于心血管的生成。一方面肿瘤通过其血管从宿主获得营养和氧气，另一方面又通过肿瘤血管源源不断地向宿主转移肿瘤细胞，并在机体的其它部位继续生长和诱导血管形成，导致肿瘤转移。由于新生血管在正常成年人中基本停止，因此，抗肿瘤血管生成药物具有良好特异性。

国外内已有大量文献报道了黄酮金属配合物合成及抗肿瘤活性研究，研究表明，黄酮金属配合物具有较强的抗肿瘤活性。异黄酮属于类黄酮化合物的一种，是从大豆等植物中提取的活性成分，毒副作用低，并且具有一定的抗肿瘤活性，同时，异黄酮结构具有较高的超离域度，完整的大π键共轭体系，强配位氧原子与合适的空间构型，可作为金属离子的良好螯合配体。

目前还没有关于异黄酮金属配合物的制备方法及抗肿瘤活性的研究报道。4’-甲氧基-5，7-二羟基异黄酮是异黄酮类化合物的代表，较易合成，选其作为实验的原料。本发明的目的在于提供能够恢复肿瘤细胞的正常凋亡途径，抑制肿瘤新生血管的形成，阻止肿瘤转移的抗肿瘤化合物。

发明内容

本发明第一方面涉及式I、II的异黄酮类金属配合物，其药学上可接受的盐，其水合物或溶剂化合物，其结构通式如下(见说明书附图1)：

图1异黄酮类金属配合物

其中：

R1为羟基，甲氧基，丙烯氧基，苯甲氧基，对氯苯甲氧基，乙氧基，乙酰氧基，丙酰氧基，丁酰氧基，苯甲酰氧基，对氯苯甲酰氧基，对甲基苯甲酰氧基，对硝基苯甲酰氧基；

R2为氢，羟基，甲氧基，硝基，氟，氯，溴，氨基。

M为铁[Fe(II)]，锰[Mn(II)]，钴[Co(II)]，镍[Ni(II)]，铜[Cu(II)]，锌[Zn(II)]，镉[Cd(II)]，汞[Hg(II)]，铅[Pb(II)]，锡[Sn(II)]，硒[Se(II)]，钪[Sc(III)]，镧[La(III)]，钕[Nd(III)]，铕[Eu(III)]，钆[Gd(III)]，铽[Tb(III)]，镝[Dy(III)]，铥[Tm(III)]，钇[Y(III)]，钌[Ru(III)]，铑[Rh(III)]。

本发明第二方面涉及药物组合物，其中包括至少一种通式I、II中的5-羟基异黄酮类金属配合物，其药学上可接受的盐或它们的水合物或它们的溶剂化物，及药用载体或药用赋型剂。

本发明第三方面涉及至少一种通式I、II中的5-羟基异黄酮类金属配合物，其药学上可接受的盐或它们的水合物或它们的溶剂化物药物组合物在用于治疗肿瘤、肿瘤新生血管形成或肿瘤细胞转移药物中的用途。本发明涉及提供对式I、II中的化合物进行细胞学功能评价方法，抗肿瘤活性的测试结果，诱导肿瘤细胞凋亡的活性测试结果。

本发明第四方面涉及制备式I、II化合物的方法。

本发明的这些目的将通过下列详细描述和说明来进一步体现和阐述。

具体实施方式

本发明可以通过下面的实施例得到说明，但这些实施例不意味着对本发明有任何限制。

1.仪器与试剂

TU-1901双光束紫外可见分光光度计；670FT-IR型智能付里叶红外光谱仪(美国Nicolet公司)；1100 series LC/MSD Trap SL型高效液相色谱-质谱联用仪(美国惠普公司)；AVANCE-300核磁共振仪(瑞士Bruke公司)；元素分析仪(意大利CARLOERBA1106)ICP-AES等离子体原子发射光谱仪(美国Thermo Elemental公司)；Forma IIWater Jacketed CO₂培养箱(美国Thermo Electron公司)；ELx808zu酶标仪(美国Bio-Tek公司)；FACSAria流式细胞仪(美国BD公司)。二氧化硒购自国药集团化学试剂有限公司，Annexin V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒购自Sigma公司，其余试剂均为分析纯。

2.化合物的制备

实施例1：4’-甲氧基-5，7-二羟基异黄酮-锌配合物(2)的制备

称取4’-甲氧基-5，7-二羟基异黄酮配体0.284g置于烧瓶中，用适量无水乙醇溶解，滴加三乙胺调pH值至7-8，40℃下搅拌1h，2000r/min离心5min，吸取上清。另称取Zn(OAc)₂·2H₂O 0.22g，用无水乙醇溶解，逐滴加入到配体溶液并不断搅拌，60℃下搅拌，直至有沉淀出现，再继续反应6h，滤出沉淀，沉淀用乙醇洗涤数次，得0.25g淡黄色4’-甲氧基-5，7-二羟基异黄酮-锌配合物，产率约为40.3％。其结构式如下(见说明书附图2)：

图2 4’-甲氧基-5，7-二羟基异黄酮-锌配合物

IR(KBr)：3369(O-H)，1645(C＝O)，1611，1578，1514，1411(C＝C)，1280(C-O-H)，1187(C-O-C)，762(Zn-O)cm^-1；¹H NMR(300MHz，DMSO-d6)：3.77(6H，s，4′，L4′-OCH₃)，6.21(2H，s，6，L6-H)，6.37(2H，s，8，L8-H)，6.98(4H，d，3′，5′，L3′，L5′-H)，7.47(4H，d，2′，6′，L2′，L6′-H)，8.35(2H，s，2，L2-H)，12.92(2H，s，7，L7-OH)ppm；EIMS m/z：631.2[M^-，100]，593.1，346.8，282.9；分子式：C₃₂H₂₂O₁₀Zn，元素分析：理论值(％)C 60.85，H 3.49，Zn 10.30；测量值(％)C 59.56，H 3.57，Zn 10.48。

实施例2：4’-甲氧基-5，7-二羟基异黄酮-锰配合物(3)的制备

4’-甲氧基-5，7-二羟基异黄酮-锰配合物的合成方法步骤与实施例1的完全一样，只是把Zn(OAc)₂·2H₂O换成了相同摩尔数的Mn(OAc)₂·2H₂O，反应完滤出棕色固体，用乙醇洗涤数次，产率约为42.1％。其结构式如下(见说明书附图3)：

图3 4’-甲氧基-5，7-二羟基异黄酮-锰配合物

IR(KBr)：3383(O-H)，1621(C＝O)，1609，1558，1512，1417(C＝C)，1248(C-O-H)，1179(C-O-C)，732(Mn-O)cm^-1；¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)：3.71(6H，s，4′，L4′-OCH₃)，5.32(2H，s，6，L6-H)，5.88(2H，s，8，L8-H)，6.49(4H，d，3′，5′，L3′，L5′-H)，7.48(4H，d，2′，6′，L2′，L6′-H)，8.34(2H，s，2，L2-H)，11.81(2H，s，7，L7-OH)ppm；EIMS m/z：619.8[M^-，100]，589.4，336.1，282.8；分子式：C₃₂H₂₂O₁₀Mn，元素分析：理论值(％)C 61.84，H 3.54，Mn 8.86；测量值(％)C 60.56，H 3.57，Mn 9.28。

实施例3：4’-甲氧基-5，7-二羟基异黄酮-铜配合物(4)的制备

称取4’-甲氧基-5，7-二羟基异黄酮配体0.284g置于烧瓶中，用适量无水乙醇溶解，滴加三乙胺调pH值至7-8，40℃下搅拌1h。另称取CuCl₂·2H₂O 0.168g，用无水乙醇溶解，逐滴加入配体溶液并不断搅拌，立即有固体析出，40℃下继续搅拌1h，过滤，弃滤饼，滤液室温下放置数天有深绿色沉淀析出，抽滤，并用乙醇洗涤数次，得粉末状深绿色固体0.5g，产率约为80.01％。其结构式如下(见说明书附图4)：

图4 4’-甲氧基-5，7-二羟基异黄酮-铜配合物

IR(KBr)：3375(O-H)，1626(C＝O)，1611，1538，1514，1415(C＝C)，1256(C-O-H)，1179(C-O-C)，782(Cu-O)cm^-1；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：3.71(6H，s，4′，L4′-OCH₃)，5.81(2H，s，6，L6-H)，6.38(2H，s，8，L8-H)，6.98(4H，d，3′，5′，L3′，L5′-H)，7.48(4H，d，2′，6′，L2′，L6′-H)，8.45(2H，s，2，L2-H)，12.89(2H，s，7，L7-OH)ppm；EIMS m/z：628.1[M^-，100]，612.8，344.8，301.0，282.9；分子式：C₃₂H₂₂O₁₀Cu，元素分析：理论值(％)C 60.95，H 3.49，Cu 10.16；测量值(％)C59.46，H 3.58，Cu 10.28。

实施例4：4’-甲氧基-5，7-二羟基异黄酮-钴配合物(5)的制备

4’-甲氧基-5，7-二羟基异黄酮-钴配合物的合成方法步骤与实施例3完全一样，只是把CuCl₂·2H₂O换成了相同摩尔数的CoCl₂·2H₂O，过滤后弃滤饼，得棕色澄清透明溶液静置于空气中，几天后得到了棕色粉末状固体，产率约为68.21％。其结构式如下(见说明书附图5)：

图5 4’-甲氧基-5，7-二羟基异黄酮-钴配合物

1246(C-O-H)，1180(C-O-C)，783(Co-O)cm^-1；¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：3.71(9H，s，4′，L4′，C4′-OCH₃)，5.81(3H，s，6，L6，C6-H)，6.08(6H，d，3′，5′，L3′，L5′，C3′，C5′-H)，6.98(3H，s，8，L8，C8-H)，7.48(6H，d，2′，6′，L2′，L6′，C2′，C6′-H)，8.65(3H，s，2，L2，C2-H)，12.18(3H，s，7，L7，C7-OH)ppm；EIMSm/z：908.4[M^-，100]，625.7，341.7，284.9；分子式：C₄₈H₃₃O₁₅Co，元素分析：理论值(％)C 63.44，H 3.36，Co 6.50；测量值(％)C 61.46，H 3.58，Co 6.28。

实施例5：4’-甲氧基-5，7-二羟基异黄酮-镍配合物(6)的制备

4’-甲氧基-5，7-二羟基异黄酮-镍配合物的合成方法步骤也同实施例3，用NiCl₂·6H₂O代替CuCl₂·2H₂O，过滤后弃滤饼，得黄色澄清透明溶液静置于空气中，几天后得黄色粉末状固体，产率约为76.58％。其结构式如下(见说明书附图6)：

图6 4’-甲氧基-5，7-二羟基异黄酮-镍配合物

IR(KBr)：3394(O-H)，1628(C＝O)，1609，1576，1513，1441(C＝C)，1245(C-O-H)，1179(C-O-C)，735(Ni-O)cm^-1；¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)：4.11(6H，s，4′，L4′-OCH₃)，5.31(2H，s，6，L6-H)，5.48(2H，s，8，L8-H)，7.00(4H，d，3′，5′，L3′，L5′-H)，7.48(4H，d，2′，6′，L2′，L6′-H)，8.34(2H，s，2，L2-H)，12.36(2H，s，7，L7-OH)ppm；EIMS m/z：623.4[M^-，100]，607.0，590.0，341.6，280.8，262.8；分子式：C₃₂H₂₂O₁₀Ni，元素分析：理论值(％)C 61.44，H 3.52，Ni 9.44；测量值(％)C60.46，H 3.58，Ni 9.28。

实施例6：4’-甲氧基-5，7-二羟基异黄酮-硒配合物(7)的制备

称取4’-甲氧基-5，7-二羟基异黄酮配体0.7g置于100ml三口烧瓶中，加入干燥过的吡啶15ml，溶解后40℃下搅拌1h。取二氧化硒0.28g用5ml吡啶溶解后逐滴加入配体溶液并不断搅拌，于60℃反应12h，停止反应，往反应液中加入等量的无水乙醇，有淡黄色的固体析出，静置过夜，滤出固体，用乙醇洗涤数次，真空干燥，称重得异黄酮-硒配合物0.37g。产率46.1％。其结构式如下(见说明书附图7)：

图7 4’-甲氧基-5，7-二羟基异黄酮-硒配合物

IR(KBr)：3396(O-H)，1633(C＝O)，1609，1573，1512，1427(C＝C)，1246(C-O-H)，1178(C-O-C)，754(Se-O)cm^-1；¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)：3.71(6H，s，4′，L4′-OCH₃)，6.39(2H，s，6，L6-H)，6.89(2H，s，8，L8-H)，6.95(4H，d，3′，5′，L3′，L5′-H)，7.49(4H，d，2′，6′，L2′，L6′-H)，8.45(2H，s，2，L2-H)，11.8(2H，s，7，L7-OH)ppm；EIMS m/z：645.3[M^-，100]，360.6，282.7；分子式：C₃₂H₂₂O₁₀Se，元素分析：理论值(％)C 59.53，H3.41，Se 12.25；测量值(％)C 60.48，H 3.52，Se 12.38。

3.药理试验

药理实施例1：本发明化合物对A549、SW620、Hela、MDA-MB-435和HepG2肿瘤细胞生长的抑制作用

活性评价按标准的体外MTT试验方法进行。受试化合物用DMSO溶解，基础培养液稀释，配成浓度分别为600、400、200、100、50、10、1μg/ml的溶液，受试细胞与该溶液作用48小时后，在490nm波长下运用酶标仪测定出治疗组与对照组(溶剂对照组、空自对照组、5-Fu阳性对照组)的光密度(OD)值，依据下式计算肿瘤细胞在不同浓度药物作用后的存活率。然后以同一受试化合物的不同浓度对细胞存活率作图，得到剂量反应作曲线，从中求出受试化合物的对数有效浓度(IC50值)。

存活率＝[(溶剂对照组OD值-空白对照组OD值)-(加药组OD值-空白对照组OD值)/溶剂对照组OD值]×100％

表1 4′-甲氧基-5，7-二羟基异黄酮配合物对不同肿瘤细胞的抑制作用

1：4′-甲氧基-5，7-二羟基异黄酮

表1给出了在A549、SW620、Hela、MDA-MB-435和HepG2肿瘤细胞上本发明目标化合物的肿瘤细胞生长抑制作用。表中结果显示：配合物2对Hela和HepG2的作用效果明显，其IC₅₀分别为18.65μg/ml和9.12μg/ml，低于异黄酮和5-Fu。配合物3的作用结果显示，对Hela，SW-620，HepG2和A549等四种细胞的作用效果明显。配合物7的结果显示，其活性均比配体本身强，其中对Hela的作用效果比5-Fu更强。

试验结论：本发明的化合物对A549、SW620、Hela、MDA-MB-435和HepG2肿瘤细胞具有明显的抑制活性，有可能发展成为新的具有治疗肺癌及相关肿瘤作用的药物。

药理实施例2：利用流式细胞仪检测受试化合物诱发肿瘤细胞凋亡的作用

收集对数生长期HepG2细胞用0.25％胰酶消化后，以5.6×10⁴/ml接种6孔板中，每孔体积7.2ml贴壁后分别加入不同浓度(10、50、100、200μg/ml)药物800μL(设细胞对照组，配体对照组，药物处理组)，培养48h后取出细胞，0.25％胰酶消化，1000r/min离心5min，去上清液；加PBS将细胞打匀，将细胞悬液转入离心管中，1000r/min离心5min，去上清液，重复此步骤一次；加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞；加入5μL Annexin V-EGFP混匀后，再加入5μL Propidium Iodide，混匀；室温、避光、反应5-15min；混合液过200目尼龙网除去杂质；进行流式细胞仪的观察和检测。

表2 受试化合物对HepG2细胞凋亡的影响

表2给出了本发明目标化合物对HepG2肿瘤细胞细胞凋亡的影响。表中结果显示：在浓度为10μg/ml和50μg/ml时，配合物组(2，3，4，5，6，7)的凋亡率与配体组(1)比较没有明显差异，稍高于空白对照组；浓度达到100μg/ml时，配合物组的凋亡率均比配体组要高，并且配合物的细胞凋亡率都随浓度的升高而增加。

试验结论：本发明的化合物对HepG2细胞凋亡有一定的影响。受试化合物是通过诱导细胞凋亡而不是坏死来抑制肿瘤细胞生长。

药理实施例3：受试化合物对BCE内皮细胞的生长抑制作用

采用药理实施例1中的实验方法。受试化合物浓度为10，50，100，200μg/ml，作用时间为72小时。

表3 受试化合物对BCE内皮细胞的生长抑制作用

表3示出了受试化合物对BEC内皮细胞的生长抑制作用，结果表明：受试化合物2、4、5、7对BEC内皮细胞具有较强的生长抑制作用，在低浓度是存在抑制强度与浓度的相关性。受试化合物能有效地抑制BEC内皮细胞生长作用，提示该类化合物具有抗肿瘤新生血管生成的作用。

Claims

1.式I、II的5-羟基异黄酮类金属配合物，包括其药学上可接受的盐，其水合物或溶剂化物，

其中

R1为羟基，C₁-C₃烃氧基，丙烯氧基，取代或未取代芳香甲氧基，C₁-C₃烷酯基，取代或未取代芳香甲酰氧基，呋喃基；

R2为氢原子，羟基，C₁-C₃烃氧基，硝基，卤素，氨基；

M为金属元素。

2.权利要求1的式I、II化合物，其中

R1是甲氧基，丙烯氧基，苯甲氧基，对氯苯甲氧基，乙氧基，乙酰氧基，丙酰氧基，丁酰氧基，苯甲酰氧基，对氯苯甲酰氧基，对甲基苯甲酰氧基，对硝基苯甲酰氧基，呋喃基；

R2是硝基；

3.权利要求1的式I、II化合物，其中

R1是羟基；

R2是氢，羟基，甲氧基，硝基，氟，氯，溴，氨基；

M是铁[Fe(II)]，锰[Mn(II)]，钴[Co(II)]，镍[Ni(II)]，铜[Cu(II)]，锌[Zn(II)]，镉[Cd(II)]，汞[Hg(II)]，铅[Pb(II)]，锡[Sn(II)]，硒[Se(II)]，钪[Sc(III)]，镧[La(III)]，钕[Nd(III)]，铕[Eu(III)]，钆[Gd(III)]，铽[Tb(III)]，镝[Dy(III)]，铥[Tm(III)]，钇[Y(III)]，钌[Ru(III)]，铑[Rh(III)]。

4.药物组合物，它包括至少一种权利要求1-3任一的式I、II化合物或其药学上可接受的盐，其水合物或溶剂化物及药用赋型剂或药用载体。

5.权利要求4涉及的药物组合物，其特征是：所述药物的制剂形式包括注射剂、片剂、胶囊剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用擦剂、软膏剂、控释或缓释剂或纳米制剂。

6.至少一种通式I、II中的5-羟基异黄酮类金属配合物，其药用盐或它们的水合物或它们的溶剂化物在制备用于治疗肿瘤、肿瘤新生血管形成或肿瘤细胞转移药物中的用途。