CN101827608A - 冻干的免疫球蛋白制剂和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明总体来说涉及免疫球蛋白的药物制剂领域。具体地，本发明涉及稳定的、冻干的、高浓度免疫球蛋白制剂。本发明举例说明了重组人源化抗-α-4整联蛋白抗体那他珠单抗的稳定化的冻干制剂。

Description

冻干的免疫球蛋白制剂和制备方法

本申请依据35U.S.C.§119要求2007年6月14日提交的美国临时申请第60/929,133号和2008年6月12日提交的美国申请序列第12/138,075号的优先权，其完整内容通过引用以其整体明确并入本文。

发明领域

本发明总体来说涉及免疫球蛋白的药物制剂领域。具体地，本发明涉及稳定的、冻干的、高浓度免疫球蛋白制剂。本发明举例说明了重组人源化抗-α-4整联蛋白抗体那他珠单抗的稳定化的冻干制剂。

发明背景

意欲施用于人类的药物制品可能需要稳定剂以防止药物在该制品使用之前发生变化。因为蛋白质比传统有机和无机药物更大且更复杂(即蛋白质除了拥有复杂三维结构之外还拥有多种官能团)，所以蛋白质的制剂引起了特殊的问题。蛋白质的降解途径可牵涉化学不稳定性(牵涉通过键形成或切割生成新的化学实体而修饰蛋白质的任何过程)或物理不稳定性(蛋白质高级结构的变化)。化学不稳定性可由脱酰胺、外消旋化、水解、氧化、β消除或二硫化物交换造成。物理不稳定性可由例如变性、聚集、沉淀或吸附造成。许多蛋白质制品在非常稀释或高度浓缩的溶液中尤其不稳定，并且此不稳定性在储存或运送蛋白质制品时经常增加。因此，蛋白质药物领域存在的一项主要挑战是开发兼而保持蛋白质稳定性和活性的制剂。

所有抗体包括单克隆抗体在关于其在制剂中的表现和效力方面均彼此不同。例如，单克隆抗体在关于等电点、溶解度和该单克隆抗体聚集的条件方面是彼此不同的。蛋白质在关于其在制剂中的表现和效力方面彼此不同，这使得难以预测制剂是否对特定抗体稳定。蛋白质制剂中的三种常见问题包括蛋白质降解、聚集、脱酰胺和氧化。此外，影响制剂稳定性的许多不同反应可同时发生，使得难以确定哪种反应引起了哪种结果。参见Cleland等人，“The Development of Stable Protein Formulations：A Close Look at ProteinAggregation，Deamidation，and Oxidation”(稳定的蛋白质制剂的开发：近看蛋白质聚集、脱酰胺和氧化)，Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems，10(4)：307-377(1993))。

发明概述

具体地，本发明涉及稳定的、冻干的、高浓度免疫球蛋白制剂。制备本发明制剂有三个步骤，包括制备水性冻干前制剂、冻干步骤和重建步骤。

本发明是针对通过冻干水性制剂制备的稳定的冻干制剂，其中所述水性制剂包含于缓冲剂中的约40mg/ml至约50mg/ml的免疫球蛋白、聚山梨酯和蔗糖。在本发明的一优选实施方案中，水性冻干前制剂包含(a)约30mg/ml至约60mg/ml那他珠单抗；(b)具有约5.5至约6.5的pH的缓冲剂；(c)约20mg/ml至约50mg/ml蔗糖；和(d)约0.02％至约0.08％聚山梨酯。在一更优选实施方案中，水性冻干前(pre-lyopholized)制剂包含(a)约40mg/ml那他珠单抗；约6mM组氨酸，pH约6.0；约41mg/ml蔗糖；和(d)约0.04％聚山梨酯80。

冻干的制剂保留免疫球蛋白的稳定性，并防止意欲施用于人类受治疗者的免疫球蛋白在最终的产物中形成聚集体和/或颗粒。此冻干的制剂在室温下稳定至少三个月、优选地6个月和更优选地一年。冻干的制剂还在2-8℃下稳定1年、优选地2年。此冻干的制剂具有小于10分钟的短重建时间，并且在重建后适于胃肠外施用诸如肌内、皮下、静脉内或腹膜内注射。

冻干的制剂用液体重建为含有约80-160mg/ml免疫球蛋白浓度的澄清溶液。在一优选的实施方案中，重建的制剂包含(i)约80mg/ml至约160mg/ml那他珠单抗；(ii)约18mM组氨酸，pH为约6.0；(iii)约123mg/ml蔗糖；和(iv)约0.12％聚山梨酯80。在一更优选实施方案中，重建的制剂包含约120mg/ml那他珠单抗。

本发明的冻干前制剂可使用适当的干燥参数冻干。下列干燥参数是优选的：温度约-25℃和压力约80mTorr至约120mTorr的第一干燥阶段；和约20℃和压力约80mTorr至120mTorr的第二干燥阶段。

本发明还提供制备和使用重建的制剂的方法。

附图简述

图1显示30℃下高分子量物类的形成。

图2显示40℃下高分子量物类的形成。

图3显示30℃下冻干前溶液中低分子量物类的形成。

图4显示40℃下冻干前溶液中低分子量物类的形成。

图5显示5℃下由于高分子量和低分子量两种物类的形成造成的单体的总损失。

图6显示30℃下由于高分子量和低分子量两种物类的形成造成的单体的总损失。

图7显示40℃下由于高分子量和低分子量两种物类的形成造成的单体的总损失。

图8显示5℃下冻干的制剂中单体随时间的损失。

图9显示30℃下冻干的制剂中单体随时间的损失。

图10显示40℃下冻干的制剂中单体随时间的损失。

图11显示30℃下各种制剂的低分子量物类的形成。

图12显示40℃下各种制剂的低分子量物类的形成。

图13显示40℃下冻干前制剂中高分子量物类的形成。

图14显示5℃下由于聚集体的形成造成的单体损失。

图15显示30℃下由于聚集体的形成造成的单体损失。

图16显示40℃下由于聚集体的形成造成的单体损失。

图17显示40℃下冻干前样品中高分子量物类的形成。

图18显示40℃下冻干前样品中低分子量物类的形成。

图19显示40℃下由于高分子量和低分子量两种物类的形成造成的单体的总损失。

图20显示40℃下的重建时间。

图21显示40℃下冻干样品中高分子量物类的形成。

图22显示40℃下冻干样品中低分子量物类的形成。

图23显示40℃下由于高分子量和低分子量两种物类的形成造成的单体的总损失。

图24A显示5℃下冻干前样品中高分子量物类的形成。图24B显示5℃下冻干前样品中低分子量物类的形成。图24C显示5℃下冻干前样品中单体的损失。

图25显示40℃下冻干样品中高分子量物类的形成。

图26A显示40℃下重建样品中高分子量物类的形成。图26B显示40℃下重建样品中低分子量物类的形成。图26C显示40℃下重建样品中单体的损失。图26D显示重建时间。

发明实施方案详述

1.定义

如本文所用，术语“免疫球蛋白”包括但不限于抗体和抗体片段(诸如scFv、Fab、Fc、(Fab′)2)和抗体的其他遗传修饰的部分。取决于它们重链的恒定区的氨基酸序列，可将免疫球蛋白指定为不同的类别。有五大类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些中的一些可进一步划分为亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；IgA1和IgA2。

术语“抗体”是广义上的概念，并具体涵盖单克隆抗体(包括激动剂和拮抗剂抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物和抗体片段(如，Fab、(Fab′)2、scFv和Fv)，只要它们展现所需的生物活性。“抗体”意指包括多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人类抗体、灵长类源化(primatized)抗体和经由遗传工程产生的其他抗体。

本文所用的术语“单克隆抗体”指从基本均一的抗体群体获得的抗体，即除了以少量存在的可能的自然发生的修饰或糖基化变体，群体中的各个抗体是相同的。修饰词“单克隆”表明所述抗体是从基本均一的抗体群体获得的特征，而不应解释为需要通过任何特定方法来产生抗体。术语“单克隆抗体”也包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的部分与衍生自特定物种的或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或具有同源性，而所述链的剩余部分与衍生自另一物种的或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或具有同源性，以及此类抗体的片段，只要它们展现所需的生物活性。非人类(如，鼠、兔、牛、马、猪和类似生物)抗体的“人源化”形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其他抗原结合子序列)，所述免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段含有最少量源自非人类免疫球蛋白的序列。

术语“那他珠单抗”指也称作AN100226(抗体代号)的抗体，并且是

(商标名；以前的

)中的活性成分。术语“那他珠单抗”是美国采用的名称(USAN)(对药物物质的官方非专有或通用名称)。那他珠单抗是重组的人源化抗-α-4整联蛋白抗体。那他珠单抗是IgG4抗体。通过引用并入本文的美国专利第5,840,299号描述了如何使用常规的合成和分子生物学方法制备重组的人源化抗-α-4整联蛋白抗体，包括那他珠单抗。

术语“冻干”、“冻干的”和“冷冻干燥的”指首先将要干燥的材料冷冻然后在真空环境中通过升华除去冰或冷冻的溶剂的过程。冻干前制剂中可包括一种或多种赋形剂以增强冻干的产品的储存稳定性。

术语“药物制剂”指采取允许活性成分有效存在的形式，并且不含对所述制剂将要施用的受治疗者有毒的其他组分的制品。

“药学可接受”赋形剂(介质、添加剂)是可合理地施用于受治疗者哺乳动物以提供有效剂量的所采用的活性成分的那些赋形剂。

“重建时间”是用溶液将冻干的制剂再水化为无颗粒的澄清溶液所需的时间。

“稳定的”制剂是其中的蛋白质经储存后基本保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性的制剂。测量蛋白质稳定性的各种分析技术是本领域可得的，并综述于Peptide and Protein Drug Delivery(肽和蛋白质药物递送)，247-301，Vincent Lee编，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Pubs.(1991)和Jones，A.Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90(1993)。稳定性可在选定的温度下测量选定的时间段。

“稳定的”冻干的免疫球蛋白制剂是在冷藏温度(2-8℃)下至少12个月、优选地2年和更优选地3年；或在室温(23-27℃)下至少3个月、优选地6个月和更优选地1年而未观察到显著变化的冻干的抗体制剂。稳定性的标准如下所示。如SEC-HPLC所测量的不超过10％的抗体单体被降解。优选地，如SEC-HPLC所测量的不超过5％的抗体单体被降解。再水化的溶液是肉眼分析为无色的或透明至轻微乳光。制剂的浓度、pH和同渗重摩的变化不超过+/-10％。效价在对照的70-130％内并且优选地80-120％内。观察到不超过10％的剪切(clipping)。优选地，观察到不超过5％的剪切。形成的聚集不超过10％。优选地，形成的聚集不超过5％。

如果免疫球蛋白经肉眼检查颜色和/或透明度或用紫外线散射、尺寸排阻层析(SEC)和动态光散射测量未显示聚集、沉淀和/或变性的显著增加，则它在药物制剂中“保持了其物理稳定性”。蛋白质构象的变化可通过确定蛋白质四级结构的荧光光谱法和通过确定蛋白质二级结构的FTIR光谱法评估。

如果免疫球蛋白未显示显著的化学改变，则它在药物制剂中“保持了其化学稳定性”。化学稳定性可通过检测并定量蛋白质的化学改变形式来评估。经常改变蛋白质化学结构的降解过程包括水解或剪切(通过诸如尺寸排阻层析和SDS-PAGE等方法评估)、氧化(通过诸如联合质谱或MALDI/TOF/MS的肽作图的方法评估)、脱酰胺(通过诸如离子交换层析、毛细管等电聚焦、肽图谱法、异天冬氨酸测量等方法评估)和异构化(通过测量异天冬氨酸含量、肽图谱法等评估)。

如果在给定的时间免疫球蛋白的生物活性在制备药物制剂时展现的生物活性的预定范围内，则所述免疫球蛋白在所述药物制剂中“保持了其生物活性”。免疫球蛋白的生物活性可通过例如抗原结合测定来确定。

术语“等渗的”意指目标制剂与人类血液基本具有相同的渗透压。等渗制剂通常具有约270-328mOsm的渗透压。略微低渗的压力为250-269mOsm，而略微高渗的压力为328-350mOsm。可使用例如蒸气压或冰冻型渗透压力计测量渗透压。

术语“缓冲剂”包括在冻干之前使溶液pH保持在可接受范围内的那些试剂，并可包括组氨酸、琥珀酸盐(钠或钾)、磷酸盐(钠或钾)、Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)、二乙醇胺、柠檬酸盐(钠)、葡糖酸盐和其他有机酸缓冲剂。

“张力调节剂”包括可用于控制渗透压的盐，诸如NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2等。此外，冷冻保护剂(cryprotecant)、冻干保护剂和/或膨胀剂，诸如蔗糖、甘露醇、甘氨酸等，可充当张力调节剂。

在本发明环境中，“治疗有效量”的免疫球蛋白指有效预防或治疗所述免疫球蛋白对其治疗有效的病症的量。“病症”是将从免疫球蛋白治疗中受益的任何状况。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易受相关病症的那些病理状况。优选地，所述病症是可被识别并结合α-4整联蛋白的免疫球蛋白诸如那他珠单抗治疗和/或预防的病症。

“治疗”指治疗性治疗和预防性或防止性措施两方面。需要治疗者包括已具有病症者以及需要预防病症者。

“防腐剂”是一种化合物，例如，该化合物可包括在制剂中以显著降低其中的细菌作用，因而有利于生产多用途的制剂。潜在的防腐剂的实例包括十八烷基二甲基苄基氯化铵、六甲氯铵、苯扎氯铵(烷基苄基二甲基氯化铵的混合物，其中烷基是长链化合物)和苄索氯铵。其他类型的防腐剂包括芳香醇诸如苯酚、丁醇和苯甲醇，对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚。

术语“患者”或“受治疗者”意指包括任何哺乳动物。以治疗为目的，“哺乳动物”指分类学上是哺乳动物的任何动物，包括但不限于人类、家畜和农场动物，以及动物园动物、体育场动物或宠物，诸如狗、马、猫、牛和类似动物。优选地，所述哺乳动物是人类。优选地，在哺乳动物中治疗的疾病或状况是在施用治疗有效剂量的那他珠单抗时被调节的疾病或状况。

2.免疫球蛋白制剂

本发明的组合物最大限度地减少了聚集体和颗粒的形成，并确保溶解的免疫球蛋白随时间保持其免疫反应性。所述组合物包含从水性冻干前制剂制备的无菌的、药学可接受的冻干的制剂，所述水性冻干前制剂包含：于具有中性或酸性pH(约5.5至约6.5)的缓冲剂中的免疫球蛋白、蔗糖和聚山梨酯。

在一优选的实施方案中，免疫球蛋白以约30至约60mg/ml、更优选地约40至约50mg/ml和甚至更优选地约40mg/ml的浓度存在于冻干前制剂中。优选的免疫球蛋白是IgG抗体、更优选地IgG4抗体、甚至更优选地人源化重组IgG4抗体和最优选地那他珠单抗。

在冻干前制剂中使用pH为约5.5至约6.5的缓冲剂。优选地，pH是约6.0。合适的缓冲剂的实例包括组氨酸、琥珀酸盐(诸如琥珀酸钠)、葡糖酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸缓冲剂。优选的冻干前制剂含有组氨酸，优选地约1至约12mM组氨酸。甚至更优选的冻干前制剂含有约6mM组氨酸。

冻干前制剂还包含蔗糖。合适的蔗糖浓度在约20至约50mg/ml范围中，优选地约41mg/ml。

冻干前制剂还包含聚山梨酯，诸如聚山梨酯20或聚山梨酯80(分别即吐温(Tween)20和吐温80)和泊洛沙姆(poloxamer)(如泊洛沙姆188)。在一优选的实施方案中，所述聚山梨酯是聚山梨酯80。聚山梨酯优选地以约0.02至约0.08％、更优选地约0.04％的重量/体积浓度存在。

冻干前制剂中免疫球蛋白与蔗糖的重量比优选地在约2∶1至约0.5∶1范围中，更优选地约1∶1。免疫球蛋白与蔗糖的摩尔比是约300∶1至约500∶1、优选地约400∶1至500∶1、更优选地约450∶1。

可任选地向本发明组合物中添加提供良好的冻干的饼状物(cake)性质的膨胀剂，诸如丝氨酸、甘氨酸和甘露醇。这些试剂还对制剂的张力有贡献，并可针对冻融过程提供保护和改善长期稳定性。此外，可向制剂中添加张力调节剂以控制渗透压。所述制剂还可包含一种或多种防腐剂。

优选的冻干前制剂是包含约40mg/ml那他珠单抗、约6mM组氨酸(pH约6)、约0.04％聚山梨酯80和约41mg/ml蔗糖的制剂。将上述冻干前制剂冻干以形成干燥的、稳定的粉末，其可容易地重建为适合施用于人类的无颗粒溶液。

冻干是药品制备中经常使用的用来保存其生物活性的冷冻干燥过程。制备液体组合物，然后将其冻干以形成干燥的饼样产物。该过程一般牵涉在真空下将先前冷冻的样品干燥以除去冰，使非水组分保持不变，形成粉状或饼样物质。冻干的产物可储存更长的时间和在更高的温度下储存，而不损失生物活性，并可通过添加适当的稀释剂而容易地重建为无颗粒溶液。适当的稀释剂可以是生物学可接受并且冻干的粉末在其中完全溶解的任何液体。水尤其是无菌无热原的水是优选的稀释剂，因为它不包括可影响抗体稳定性的盐或其他化合物。冻干的优点是将水含量降低至大大减少各种分子事件的水平，所述分子事件导致长期储存的产物的不稳定。冻干的产物还更容易抵挡运输中的物理应力。重建的产物是无颗粒的，因而它可以施用而无需事先过滤。

本发明的冻干前制剂可使用适当的冷冻和干燥参数冻干。例如，参数可包括在约10℃至约-10℃保持约10-30分钟的预冷冻。冷冻参数可包括在-50℃至-70℃冷冻约45分钟至约75分钟的时间。另外的冷冻步骤的参数可包括在-40℃至约-60℃冷冻。干燥参数可包括约温度-10℃至-30℃和压力约40mTorr至约120mTorr的第一干燥阶段；约10℃至约25℃的第二干燥阶段，使用约40mTorr至120mTorr的压力。优选的总循环时间是约60至100小时。优选的冻干循环可包括预冷冻步骤、冷冻步骤、第一干燥步骤和第二干燥步骤。冻干循环的考虑因素包括冷冻温度、压力、第一干燥、第二干燥和循环时间。

例如，优选的冻干循环参数可以是如下参数：

首先，预冷冻，在0℃保持15分钟。

对于冷冻，在60分钟内斜坡下降至-60℃。在-60℃保持60分钟。

在另外的冷冻步骤中，斜坡下降至-50℃并保持30分钟。

对于第一干燥，在45分钟内斜坡上升至-15℃并将压力降低至50mTorr。在-15℃和50mT压力下保持54小时。

对于第二干燥，在35分钟内斜坡上升至20℃并保持24小时。

总循环时间是82小时。

此冻干的产物保留了免疫球蛋白的免疫活性的稳定性，并防止意欲施用于人类受治疗者的免疫球蛋白在最终产物中发生物理和化学降解。

使用时将冻干的产物在稀释剂(如，无菌的水或盐水)中再水化以产生无颗粒溶液。甚至在将冻干的饼状物在环境温度长期储存之后，重建的抗体溶液仍是无颗粒的。重建的溶液可胃肠外优选地肌内或皮下施用于受治疗者。

冻干的产物的一个重要特性是重建时间或再水化产物所花的时间。为了实现非常快速和完全的再水化，饼状物具有高度多孔的结构是重要的。饼状物结构是许多参数的函数，所述参数包括蛋白质浓度、赋形剂类型和浓度以及冻干循环的过程参数。一般而言，重建时间随蛋白质浓度增加而增加，因此，短的重建时间是开发高浓度冻干的抗体制剂的重要目标。长的重建时间可由于使蛋白质暴露于更浓缩的溶液更长时间而减损产物品质。此外，在使用者方面，产物在其完全再水化之前是不能施用的。这是为了确保产物是无颗粒的、施用了正确的剂量且其无菌性不受影响。因此，快速的再水化，诸如再水化时间少于十分钟，为患者和医生提供更多方便。

在冻干的产物中，可通过在目标蛋白浓度下冻干制剂并用与起始灌装体积的体积相同的体积重建产物来获得所需的剂量。也可通过冻干更大体积的稀释制剂并用较少的体积重建来获得所需的剂量。例如，如果所需的产品剂量是1mL制剂中的100mg蛋白质，则可用下列液体配置冻干制剂：1mL100mg/mL、2mL 50mg/ml或4mL 25mg/mL蛋白质制剂。在所有情况下，最终产物可用1mL稀释剂重建以获得100mg/mL的目标蛋白质浓度。不过，由于降低了冻干前制剂中的蛋白质浓度，灌装体积成比例增加。这相应增加了冻干循环的长度(尤其是第一干燥时间)，并因此显著增加了产物的成本。例如，如果1mL灌装体积(在小瓶中1mm高度)的冷冻材料花费大约1小时来升华其中的游离水，那么10mL灌装体积(10mm高度)的冷冻产物将花费大约10小时的第一干燥时间。因此，具有浓缩的冻干前制剂(免疫球蛋白浓度为约40mg/ml至约50mg/ml)是有利的，以使冻干过程更加有效。

本发明提供高度浓缩的冻干前免疫球蛋白制剂(约40mg/ml至约50mg/ml)，其被有效率地和有效力地冻干成保留免疫球蛋白的生物、物理和化学稳定性的干燥制剂。所述干燥制剂可在室温下稳定储存至少3个月、优选地6个月。所述干燥制剂可在小于十分钟的短时间内重建为含有约80mg/ml至约160mg/ml免疫球蛋白的无颗粒溶液。此类高度浓缩的抗体溶液能够用于胃肠外施用诸如静脉内、肌内、腹膜内或皮下注射。

优选的重建的产物包含约80mg/ml至约160mg/ml那他珠单抗、更优选地约120mg/ml那他珠单抗；约123mg/ml蔗糖；约0.12％聚山梨酯80；和约18mM组氨酸，约pH6.0。

3.分析方法

用于评估产物稳定性的方法包括尺寸排阻层析(SEC)、动态光散射测试(DLS)、差示扫描量热法(DSC)、异天冬氨酸定量、效价、340nm下的UV、UV光谱法和FTIR。SEC(J.Pharm.Scien.，83：1645-1650，(1994)；Pharm.Res.，11：485(1994)；J.Pharm.Bio.Anal.，15：1928(1997)；J.Pharm.Bio.Anal.，14：1133-1140(1986))测量产物中的单体百分比，并给出可溶性聚集体量的信息。可通过抗体结合其抗原的能力测量其效价或生物特性(bioidentity)。抗体与其抗原的特异性结合可通过本领域技术人员已知的任何方法定量，所述方法例如免疫测定，诸如ELISA(酶联免疫吸附测定)。这些(there)方法仅仅是本领域技术人员公知的评估产物稳定性的方法的示例。例如，340nm下UV测量340nm的散射光强度并给出关于可溶聚集体和不溶聚集体的量的信息。UV光谱法测量278nm下的吸光度并给出蛋白质浓度的信息。FTIR(Eur.J.Pharm.Biopharm.，45：231(1998)；Pharm.Res.，12：1250(1995)；J.Pharm.Scien.，85：1290(1996)；J.Pharm.Scien.，87：1069(1998))测量酰胺一区的IR谱图并给出蛋白质二级结构的信息。特定的分析方法还列举于以上文献的实验部分。

4.重建的制剂的使用

本发明的重建的免疫球蛋白制剂可根据已知的方法施用于需要用所述免疫球蛋白治疗的哺乳动物。这些方法可包括但不限于作为快速浓注或通过持续一段时间的连续输注的静脉内施用，通过肌内、腹膜内、脑脊内(intracerobrospinal)、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口腔、局部或吸入路径。在优选的实施方案中，免疫球蛋白制剂通过肌内或皮下施用而施用于哺乳动物。典型的每日剂量范围可为约1μg/kg至约200mg/kg受治疗者体重或更多、更优选地约0.01mg/kg至约150mg/kg受治疗者体重、更优选地约0.1mg/kg至约100mg/kg受治疗者体重、更优选地约1mg/kg至约75mg/kg受治疗者体重和最优选地约3mg/kg至约6mg/kg受治疗者体重。通常，医生将施用免疫球蛋白直至达到实现所需的效应的剂量。此疗法的进度可容易地使用常规方法和测定来监测。

免疫球蛋白的适当剂量将取决于例如治疗的状况、状况的严重度和进程、所述免疫球蛋白的施用是用于预防还是治疗目的、先前的治疗、患者的临床史和对免疫球蛋白的响应、所用的免疫球蛋白的类型和主治医生的判断。通常，医生将施用免疫球蛋白直至达到实现所需效应的剂量。此疗法的进度可容易地使用常规测定监测。

免疫球蛋白适合一次或在一系列治疗中施用于患者，并可在诊断之后的任何时间施用于患者。免疫球蛋白可作为单一治疗或联合在治疗相关状况中有用的其他药物或疗法施用。如本文所用，当两种(或多种)药剂同时施用或以使所述药剂同时期起作用的方式独立施用时，即说它们是组合施用。例如，本发明的那他珠单抗制剂可与其他治疗剂或物理疗法组合施用以治疗类风湿性关节炎、多发性硬化(MS)、克隆氏病和α-4介导的其他疾病。

本发明进一步通过下列实施例说明，其不应被解释为将本发明限制于其中描述的特定程序的范围。

实施例

实施例1

在食蟹猴中对那他珠单抗的高浓度重建的冻干制剂和液体制剂进行了比较研究。研究的结果显示那他珠单抗的重建的冻干制剂产生与液体制剂非常相似的预期的药物代谢动力学(pharmakokinetic)和药效学图谱。

评估了那他珠单抗的高浓度液体制剂和重建的冻干制剂以比较它们的相应的药物代谢动力学/药效学图谱、相对生物利用度以及皮下(SC)和肌内(IM)给药后的局部耐受能力。液体(150mg/mL)和重建的冻干的(120mg/mL)高浓度制剂二者在第1天各自通过血管外路径施用，并在第36天评估它们的药物代谢动力学/药效学图谱。还在第1天施用单次30mg剂量的商业的液体那他珠单抗以确定所述高浓度制剂的相对生物利用度。SC和IM给药组的动物在第36天施用第二注射，并在第39天对注射部位进行活检以评估局部耐受能力。

测试品：商业的液体那他珠单抗、液体高浓度那他珠单抗和冻干的高浓度那他珠单抗由Biogen Idec供应。重建的冻干的那他珠单抗重建液、注射用无菌水作为水性溶液供应。在每个给药日使用贮存测试品的新鲜小瓶，并将对其进行配制以产生适当浓度的给药溶液。

将三十只未经受过实验的食蟹猴(15只雄性和15只雌性)分配到如下面的表1中所示的五个给药组：

表1

组编号	M/F的数量	路径	测试品制剂	剂量水平(mg/动物)	剂量体积(mL/动物)	剂量溶液浓度(mg/ml)
							1	3/3	IV	液体*	30	1.5	20
2	3/3	SC	液体**	150	1.0	150
							3	3/3	IM	液体**	150	1.0	150
4	3/3	SC	冻干的***	120	1.0	120
							6	3/3	IM	冻干的***	120	1.0	120

^*商业的液体那他珠单抗；^**液体高浓度那他珠单抗；^***重建的冻干的高浓度那他珠单抗IV＝静脉内；SC＝皮下；IM＝肌内；M/F＝雄性/雌性

在所有组中观察到与实验前基线值相比，外周血淋巴细胞(和在较小程度上，嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和未分类的细胞)的药理学相关增加，并将其视为测试品的预期药效学作用。与较低IV剂量的商业的制剂(通常第8天至第15天)相比，接受较高SC和IM剂量的那他珠单抗的个体动物中受影响的白细胞的水平的增加一般持续更长时间(如，第8天至第36天)。然而，不存在响应幅度或持续时间作为测试品的液体还是冻干的高浓度制剂、性别或施用路径的函数的一致的或明显的差异。

商业的液体IV剂量组最快达到平均T_max，且对于高浓度制剂，IM组比SC组更快。当与商业的液体IV剂量组相比时，平均C_max值小于各路径的比例剂量，并且在血管外施用时，其在高浓度制剂中是一致的。平均t1/2值在所有剂量组中是一致的，而与路径无关。

平均AUC_last和AUC_inf二者均大于SC和IM剂量组中的比例剂量而与制剂无关，表明完全的吸收(即相对生物利用度为100％)，并且当血管外施用时，这在制剂之间也非常一致。

与所有剂量组中中存在的研究前基线相比，观察到循环淋巴细胞计数和在较小程度上嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和未分类的细胞计数的预期的测试品相关的增加。这些结果与α4-整联蛋白饱和图谱一致，并且归因于那他珠单抗的药理学作用。受影响的白细胞计数增加的持续时间是剂量依赖性的，并且通常是液体高浓度那他珠单抗治疗组和冻干的高浓度那他珠单抗治疗组(如，第8天至第36天)与接受静脉内商业的液体制剂的组(通常第8天至第15天)相比更高。未观察到相对于那他珠单抗的高浓度液体制剂和重建的冻干制剂之间的这些白细胞群体变化的一致性差异，或认为与施用路径(皮下或肌内注射)或动物的性别相关的任何差异。

总而言之，在食蟹猴中，以120mg剂量(重建的冻干制剂)皮下和肌内注射后的重建的冻干的高浓度那他珠单抗制剂是良好耐受的，并且产生预期的药理学相关的外周血淋巴细胞计数的增加，该增加与商业的液体制剂的单次30mg静脉内剂量后的相当，但持续时间略长。

实施例

那他珠单抗目前是作为1至2小时时间段的IV输注递送的。这要求患者访问医院或专门的输注中心。为了使那他珠单抗的递送更加方便，需要皮下施用。开发较低浓度的大量(bulk)药物物质的冻干制剂是有利的，所述冻干制剂之后可以较高浓度重建。这里描述的研究设计为筛选各种起始和最终蛋白质浓度对使用蔗糖作为赋形剂的稳定性的效应(研究A)。本研究的第二部分设计为筛选其他公知的冻干保护剂和赋形剂对蛋白质稳定性的效应(研究B)。还进行了检查就灌装体积和重建体积方面而言具有合适的制备能力的溶液的工作。

在研究A中，制备了四种制剂以检查起始和最终蛋白质浓度对冻干前散装物(bulk)和冻干的饼状物的实时和加速的稳定性的效应。所有四种冻干前制剂展现充分的稳定性以用作冻干前散装物，其在5℃下保持时间达6个月。两种冻干制剂展现充分的制剂特性和稳定性，考虑将其作为进一步制剂开发的候选物。这些制剂中的一种由起始浓度为40mg/mL而重建浓度为100mg/mL的重量比为1∶1的蛋白质与蔗糖组成。第二种候选制剂含有50mg/mL起始浓度和重建浓度为200mg/mL的重量比为2∶1的蛋白质与蔗糖。两种制剂均含有组氨酸缓冲剂和聚山梨酯80。

此外，制备了与现有的那他珠单抗(Tysabri^TM)制剂具有相同的赋形剂图谱的高浓度液体制剂。在5℃下，此制剂展示了对聚集体形成的充分稳定性，以将其考虑作进一步开发的候选物，虽然脱酰胺速率要快于冻干制剂中的速率。在加速温度下，此制剂显示形成低分子量降解产物的倾向，而在冻干制剂中未观察到相同程度。

实验设计

材料

这些研究中使用的那他珠单抗是从BiogenIdec供应的、2003年2月生产的那他珠单抗制备的。在用于这些制剂研究之前，此材料已进行配制并装入小瓶，因此，需要汇集该材料并除去聚山梨酯80。简要而言，这是通过渗滤至低离子强度、高pH(10mM tris、10mM NaCl、pH8.5)缓冲液中实现的。在这些条件下将所述材料结合于DEAE-琼脂糖凝胶柱，然后用10mM磷酸钠、140mM NaCl在pH6下洗脱。然后在进一步配制之前，将柱洗脱物渗滤至6mM组氨酸、pH6，并浓缩至70至100mg/mL。

化学品和试剂

除了注明的之外，此研究中使用的所有化学品和试剂均购自VWR，并且是ACS级或更好的。方便时使用USP级试剂作为赋形剂。聚山梨酯80购自Sigma(目录号P6474)，并且是植物来源和低过氧化物的。

研究A的制剂

下列制剂是通过将赋形剂和活性剂的贮存溶液稀释至如表2：研究A制剂参数所示的期望浓度而制备的。所有制剂在pH6下配制。

表2：研究A制剂参数。

制剂ID	冻干前浓度	重建浓度
			3944-18A	20mg/mL Ab、20mg/mL蔗糖、6mM his、0.02％PS80	100mg/mL Ab、100mg/mL蔗糖、30mM his、0.1％PS80

制剂ID	冻干前浓度	重建浓度
			3944-18B	40mg/mL Ab、40mg/mL蔗糖、6mM his、0.02％PS80	100mg/mL Ab、100mg/mL蔗糖、15mM his、0.05％PS80
3944-18C	50mg/mL Ab、25mg/mL蔗糖、6mM his、0.02％PS80	200mg/mL Ab、100mg/mL蔗糖、24mM his、0.08％PS80
			3944-18D	75mg/mL Ab、40mg/mL蔗糖、6mM his、0.02％PS80	225mg/mL Ab、120mg/mL蔗糖、18mM his、0.06％PS80
3944-18L	100mg/mL、10mM磷酸钠、140mM NaCl、pH6、.02％PS80	不可得

缩写：Ab＝抗体，his＝组氨酸，PS80＝聚山梨酯80

研究B的制剂

下列制剂是通过将赋形剂和活性剂的贮存溶液稀释至如表3：研究B制剂参数所示的期望浓度而制备的。所有制剂为pH6。

表3：研究B制剂参数。

制剂ID	冻干前浓度	重建浓度
			3976-4C	50mg/mL Ab、25mg/mL蔗糖、6mMhis、0.02％PS80	200mg/mL Ab、100mg/mL蔗糖、24mM his、0.08％PS80
3976-4G	50mg/mL Ab、25mg/mL蔗糖、15mMNaCl、6mM his、0.02％PS80	200mg/mL Ab、100mg/mL蔗糖、60mM NaCl、24mM his、0.08％PS80
			3976-4H	50mg/mL Ab、25mg/mL蔗糖、6mMhis、0.02％PS20	200mg/mL Ab、100mg/mL蔗糖、24mM his、0.08％PS20
3976-4I	50mg/mL Ab、25mg/mL海藻糖、6mMhis、0.02％PS80	200mg/mL Ab、100mg/mL海藻糖、24mM his、0.08％PS80
			3976-4K	40mg/mL Ab、25mg/mL蔗糖、6mMhis、0.02％PS80	160mg/mL Ab、100mg/mL蔗糖、24mM his、0.08％PS80

缩写：Ab＝抗体，his＝组氨酸，PS80＝聚山梨酯80

方法

制剂的制备

将溶液过滤灭菌并按所示灌装于无菌玻璃小瓶。用于冻干前分析的所有样品和3944-18L以0.5mL灌装于2cc小瓶、加塞并加盖。要冻干的配方物(formulas)以下列体积灌装于5cc Kimble小瓶：制剂3944-18A-2.5mL，制剂3944-18B-1.25mL，制剂3944-18C-2mL，制剂3944-18D-1.5mL。研究B的所有制剂以2mL灌装于5cc Kimble小瓶。

冻干循环

对于研究A，将小瓶在-20℃下冷冻。周末时冷冻干燥机发生故障，温度降至-70℃。重启冻干循环的随后尝试使温度在再冷冻之前升至3-4℃。重启冷冻干燥机，继续所述循环。第一干燥在-20℃下以100mTorr真空执行20小时。然后在100mTorr下将温度在3小时内斜坡上升至20℃并保持30小时，以进行第二干燥。

对于研究B，将小瓶在-50℃下冷冻2小时以确保均匀的冷冻。然后在100mTorr真空下于20min内将温度升至-40℃。然后在100mTorr真空下于20分钟内将温度斜坡上升至-25℃，并且第一干燥持续20小时。在100mTorr下于10小时内将架温度缓慢地斜坡上升至20℃，以开始第二干燥，然后在20℃保持4小时。

研究设置

将冻干前液体、高浓度液体对照和冻干的饼状物的小瓶置于5、30和40℃下。在2、4、8和12周时测定储存在40℃下的样品。在3、6、9和12周时测定储存在30℃下的样品。在4、8和12周时测定储存在5℃下的样品。对于一些制剂，在6个月和1年时分析30℃和5℃下的其他小瓶。在冻干前和冻干后的零时测定所有制剂。

测定

样品通过以下方法测定。并非在所有时间点执行所有测定。除冻干前样品的零时外，对每种测定取样两小瓶。

肉眼检查外观

肉眼检查所有样品并记录其外观。检查冻干的饼状物的颜色、均匀性、强度和回熔迹象。检查液体和重建样品的颜色、透明度和颗粒的存在。

残留水分和重建时间

使用Karl Fischer在零时测定冻干的饼状物的残留水分(BOP 000-01290)。通过添加适当体积的DI水、然后轻轻涡旋来测量重建时间。记录饼状物完全溶解的时间(EOP 000-01292)。

浓度

测量了所有样品的浓度。使用那他珠单抗安慰剂将样品稀释至1mg/mL。使用Varian 300Bio分光光度计和1cm光程比色杯以200nm/分钟扫描400至240nm的UV吸光度。记录最大λ下的吸光度，并通过将该值除以1.498(那他珠单抗的吸光系数)和调节适当的稀释度而确定浓度。

浊度

使用10mm小体积比色杯(Starna Cells Inc.目录号16.160-Q-10\Z20)测量纯样品的300至400nm的吸收。报告在360nm下记录的值。

尺寸排阻层析

使用修饰的Biogen SOP 22d.505确定单体、高分子量物类、二聚体和低分子量物类的量。将样品上样至净(neat)柱并调节上样体积以允许柱上有大约400μg质量。将参考材料上样的质量也调节至相当水平。记录215和280nm二者下的检测，不过215nm下的主峰超出范围，所以使用280nm的迹线进行此处报告的计算。

阳离子交换层析

执行了阳离子交换层析。由于层析系统的差异，稍微修改了梯度以使主峰在9至12分钟洗脱。因为使用的系统是双泵，所以仅在每组分析后执行高盐洗涤。没有证据表明在高盐洗液中有以晚保留时间洗脱的任何峰。因为每种样品后不执行高盐洗涤，所以再平衡时间缩短至7分钟。

效价

通过VCAM溶解产物测定(AAM 001-00965)和Jurkat细胞测定(AAM001-00700)分析所选样品的效价。

研究A的结果

此研究设计为用于检查初始蛋白质浓度和最终蛋白质浓度二者对冻干的饼状物参数、重建时间和稳定性的效应的筛选研究。初步研究显示，蔗糖向那他珠单抗提供充分的短期冻干保护剂性质，而甘露醇则不。为此，使用蔗糖作为冻干保护剂执行初步筛选。早期研究还显示那他珠单抗的最优pH是pH6。磷酸盐、柠檬酸盐和组氨酸缓冲剂是此pH下最常用的缓冲剂。由于冷冻后的pH变化，磷酸盐缓冲剂对于在蛋白质的冻干中使用不是最优的。柠檬酸盐缓冲剂已牵涉一些皮下制剂中的注射疼痛。因此，选择组氨酸作为优选的缓冲剂物类。初始浓度固定为6mM，以便于制备制剂和保持重建后的最终浓度在30mM或低于30mM。对于研究3A，冻干前溶液中的聚山梨酯80浓度保持在0.02％，因为已显示这可向蛋白质提供充分的保护，并且还保持最终浓度在0.1％或低于0.1％。蔗糖浓度选择为保持蛋白质与糖的1∶1至2∶1的重量比，并仍保持最终溶液是接近等渗的。

冻干前制剂和液体制剂

附录中的表格含有所有制剂的所有记录结果。经肉眼检查，所有制剂显示无色和透明至乳光，没有任何可见的颗粒。如所预期的，乳光在某种程度上随蛋白质浓度增加而增加。在分析的变化范围内，没有样品显示蛋白质浓度的变化，并且也没有观察到这种趋势。如360nm下的吸光度所测量的，在研究的5℃下6个月或30℃下12周内，浊度未显示变化。对于40、50和75mg/mL下的样品，40℃冻干前样品显示浊度随时间的轻微增加。20mg/mL冻干前样品和高浓度液体未展示40℃样品中的这种趋势。

监测了所有制剂的二聚体、高分子量聚集体和低分子量物类的形成。制成表格的结果显示于附录的表格中。图1和2显示30℃和40℃下的高分子量物类形成。在5℃下，储存6个月的任何制剂中的高分子量物类水平没有变化。

5℃数据显示在这里。30℃的结果(图1)未显示储存12周后任何冻干前制剂的高分子量物类形成的趋势。高浓度液体制剂于30℃下储存6个月后显示高分子量物类的明确增加。

在40℃下，对于冻干前制剂，高分子量物类的形成直到储存4周后才显示开始。然后高分子量物类的量持续增加。高离子强度的高浓度液体制剂显示较低的高分子量物类起始百分比，但是在40℃下的3个月研究中，其量显示以恒定速率增加。

图3和4显示冻干前溶液中30℃和40℃下的低分子量物类形成。30℃下的3个月储存过程中，低分子量物类的水平仅有非常小的变化，但是观察到明确的上升趋势。在6个月时，仅测定了高浓度液体。在该时间，已存在可观量的低分子量物类，几乎6％。

40℃下的储存过程中，有低分子量物类形成的明确趋势。此温度下的形成率显示某种浓度依赖性，因为较高浓度样品显示更快的形成。另外，30℃和40℃下的低分子量物类形成显示以更快速率领先于高分子量物类的形成，使得这成为液体样品中的重要降解途径。

对于在5℃下储存的样品，6个月时间段内的低分子量物类百分比的变化非常小。此数据显示于附录中，但是没有在这里制成图表。所有冻干前制剂从大约0.6-0.9％的初始水平升至6个月的0.15％。即使在5℃下储存6个月，高浓度液体未显示任何低分子量物类。

图5、6和7显示在各种温度下由于高分子量和低分子量两种物类的形成造成的单体的总损失。在2-8℃下，单体百分比几乎没有变化。这将表明，在2-8℃下储存6个月，这些制剂中的任一种作为冻干前制剂具有适当的稳定性高浓度液体制剂在2-8℃下也未显示变化。30℃样品显示单体的非常轻微的减少。此变化是由于形成低分子量物类。这也表明，这些制剂的任一种在室温下将展现充分的稳定性以允许加工。在6个月时，高浓度液体显示伴随低分子量物类增加的单体的损失。在40℃下测试的三个月时间段内，所有制剂显示单体的损失。损失速率显示与蛋白质浓度粗略相关，100mg/mL液体制剂和75mg/mL冻干前制剂显示最快的损失速率。对由于低分子量物类形成造成的降解机制的进一步研究可提供对此降解路径的更好稳定。

通过阳离子交换层析分析所选的样品。在所有情况下，结果显示随基于时间和温度的储存的向更酸性物类的变化(脱酰胺)。各种冻干前制剂之间没有差异。因为脱酰胺一般受pH、离子强度和某些缓冲剂物类的影响，所以可预期到此结果。在5℃下，高浓度液体制剂的降解与冻干前制剂没有显著不同。然而，其在30℃和40℃两种温度下均显示显著更快的降解。这最有可能是由于高离子强度和磷酸盐缓冲剂的存在。

冻干制剂

表5-12显示作为冻干制剂在5℃、30℃和40℃下储存的样品的稳定性的结果。所有制剂在40℃储存12周、30℃和5℃储存6个月。此外，在于30℃和5℃下1年后分析制剂3944-18B和3944-18C。

在初始时间点分析制剂的残留水分。残留水分比所需的高，很可能是由于冻干循环中经历的问题。这些样品的残留水分在5-6％范围内。

测量了重建的时间，其与起始和最终蛋白质浓度直接相关。从75mg/mL蛋白质溶液冻干的饼状物耗费平均15-20分钟重建。从50mg/mL冻干的样品耗费平均6-7分钟、从40mg/mL的耗费5-6分钟，且从20mg/mL的耗费4-5分钟。这些值是变化的，但是未显示关于储存时间或温度的任何趋势。

检查了重建的小瓶的外观。所有样品为透明至乳光、无色且没有颗粒。在30℃下储存1年的两种制剂显示一些轻微的黄色。浊度测量为360nm下的吸光度的函数。当在40℃下储存12周时间段时，所有制剂显示浊度的上升。当在30℃下储存多达12个月时，所有制剂显示浊度的较不明显的上升。当在5℃下储存达一年时，除制剂3944-18C外，所有制剂显示浊度的轻微上升。(参见附录E-H中的表格)。未观察到手动灌装和材料重建本身的正常变化之外的蛋白质浓度的变化。

通过尺寸排阻层析分析了重建的样品的低分子量和高分子量降解产物二者的形成。低分子量降解在一些时间点是明显的，但是未观察到形成的趋势。任何样品中所有时间点的量都低于0.2％，认为这是通过BiogenIdec的测定的检测限。降解的主要途径是通过形成二聚体和更高阶聚集体。单体随时间的损失显示于图8、9和10。在40℃储存下，有一些单体损失，损失最快的是制剂3944-18D和3944-18C。制剂39944-18B和3944-18A显示的向下的趋势要不显著得多。在30℃下观察到了相似级别的趋势，3944-18D和3944-18C显示更快的单体损失。在5℃下3944-18A和3944-18D储存6个月以及3944-18B和3944-18C储存达一年，没有制剂显示单体的损失。

通过阳离子交换层析分析所选的样品。制剂之间未显示任何差异。在5℃下，有从71％主峰至66％主峰的转换。酸性峰的百分比随时间保持得相当恒定，但是碱性峰的百分比随时间增加，从初始时间点的8-10％增加至一年后的14-15％。30℃和40℃样品展现相似的趋势，碱性峰百分比达到30℃下一年后的18-19％和40℃下3个月后的22-26％。需要另外的实验来表征此反应途径和确定降解物类的来源。

研究B的结果

制剂的选择

研究B设置为研究除蔗糖外的赋形剂对那他珠单抗稳定性的效应并验证研究A中观察到的结果。基于研究A的结果，确定40-50mg/mL的起始浓度对于良好的饼状物形成和重建特性是最优的。蛋白质与蔗糖的比值固定为2∶1重量比，初始浓度为50mg/mL，重建浓度目标为200mg/mL。此外，检查了起始浓度为40mg/mL和目标重建浓度为160mg/mL的一种制剂。此制剂还具有1.6∶1重量比的蛋白质与蔗糖的比值。

制剂3976-4C含有与研究A中的3944-18C相同的制剂。研究A中检查了冻干前溶液的稳定性，所以B中不予以重复。文献报道表明向高浓度的蛋白质溶液添加低水平的氯化钠可帮助降低这些溶液的粘性。制剂3976-4G具有向冻干前配方中添加的15mM NaCl以检查NaCl的效应。聚山梨酯20(PS20)经常代替聚山梨酯80(PS80)用于蛋白质制剂中。在制剂3976-4H中，0.02％PS80取代为等量的PS20。在制剂3976-4I中，等量的海藻糖取代了蔗糖。

冻干前的制剂

分析了冻干前制剂的外观。无论储存温度如何，没有观察到任何溶液的外观发生显著的变化。它们全部是无色和轻微乳光且没有颗粒出现。没有任何制剂的蛋白质浓度发生变化。测量了所有时间点的浊度。对于制剂3976-4G，初始浊度测量值很高，但在随后的时间点保持得相当恒定。未在任何制剂中观察到浊度的变化趋势，虽然3976-4G的测量值在所有温度下持续高于其他制剂。

监测了由于二聚体和高分子量聚集体的形成和由于低分子量片段的单体损失。如先前观察的，在5℃下多达3个月，没有任何样品的单体百分比具有变化。还分析了在5℃下6个月的制剂3976-4K，并且没有显示单体百分比的变化。图11和12分别显示30℃和40℃下各种制剂的低分子量物类形成。如先前观察的，在40℃下，所有制剂中都有低分子量物类的显著形成，3976-4K中的形成率稍微低些，其具有较低的蛋白质浓度。这些结果与研究A中观察到的那些相当。另外，赋形剂看来对此反应没有影响。在30℃下，低分子量物类有轻微的上升。此比率也与先前在研究3A中观察到的在12周后达到0.2至0.4％相当。

在40℃下，除3976-4H外的所有制剂中的高分子量物类有轻微的增加，3976-4H含有PS20(图13)。在其他温度下，没有任何制剂的高分子量具有变化。看来所有制剂对于聚集体的形成都是稳定的，并且主要的降解途径是在升高的温度下形成低分子量物类。这些制剂中的任一种对于进一步开发用作冻干前散装药物都是充分稳定的。

在初始时间点对所有制剂执行阳离子交换层析，但在5℃储存下6个月后仅对3976-4K执行。如研究A中观察到的，储存后有向更酸性物类的变化。此降解是由pH和温度驱动的。

冻干制剂

在初始时间点分析了所有样品的水分、饼状物外观和重建时间。所有饼状物的饼状物外观都是可接受的。水分水平比研究A中略低，通常在3％至4％之间，制剂3976-4I例外，其具有5.4％水分。所有时间点和温度下所有样品的重建时间通常是可接受的并且低于10分钟，少量例外耗费10至14分钟。制剂3976-4K显示更快的重建时间，其具有最低的起始蛋白质浓度。重建后，在所有温度下，除3976-4I和3976-4G外的所有样品保持无色和轻微乳光至乳光多达12周。在40℃和12周，3976-4I为非常的乳光。从30℃下的6周以及5℃和40℃下的8周开始，3976-4G为非常的乳光。添加NaCl看起来的确降低制剂的粘性，如重建过程中较少的起泡和泡沫形成的趋势所观察到的，不过，它还显示溶液乳光的显著增加。分析了在5℃下6个月和1年的制剂3976-4C。在5℃下一年后，3976-4C显示轻微的黄色。分析了在5℃和30℃下6个月和1年的制剂3976-4K。在30℃下储存6个月后，制剂3976-4K显示轻微的黄色，但是在5℃下1年后则没有。

通过尺寸排阻层析分析了在40℃下多达3个月的样品。在5℃和30℃下，分析了多达3个月的样品，然后在一年时间点进行分析。此外，还在6个月时分析制剂3976-4C和3976-4K。在所有样品中，低分子量物类的量低于0.2％。降解的主要途径是由于形成二聚体和高分子量物类。图14、15和16显示每种温度下由于形成聚集体造成的单体损失。很明显在所有温度下，制剂3976-4I中的单体损失都快于其他制剂，制剂3976-4I含有海藻糖。含有PS20和NaCl的制剂显示与含有蔗糖和PS80的制剂相当的降解。在所有温度下，制剂3976-4K显示最慢的单体损失。此制剂具有较低的起始蛋白质浓度、较低的重建浓度和较高的蔗糖与蛋白质的比值。

通过阳离子交换层析分析所选的样品。此测定的结果在一定程度上是变化的，但是在5℃下所有制剂显示对电荷分布的变化是稳定的。在40℃下，所有制剂显示主峰的减少和酸性及碱性物类二者的增加。还在来自制剂3976-4K的样品中观察到了此趋势，该样品在30℃下储存1年后进行分析。

在8周时间点，在VCAM溶解产物和Jurkat细胞测定中分析了在5℃和40℃下储存的制剂3976-4K的效价。结果显示在表中。

表4：效价测定结果

样品/测定	VCAM溶解产物	Jurkat
			3976-4K-5℃	126％	98.2

用于开发那他珠单抗的高浓度冻干制剂的形成筛选研究

3976-4K-40℃

124.3％

104％

结论

冻干前的散装制剂

在高浓度液体制剂中，在5℃下多达6个月时没有单体损失，然而存在酸性物类的增加，这可能是由于脱酰胺造成的。对于30℃下6个月和40℃下3个月，此制剂显示通过高分子量和低分子量降解物类二者的形成的单体损失。如果不经进一步的优化，当前制剂中的高蛋白质浓度液体可能不展现充分的长期稳定性以用作合适的商业制剂。

在5℃下储存3至6个月时，没有冻干前制剂显示任何显著的单体损失。这些制剂的脱酰胺的量的变化与在高浓度液体中观察到的相当。在30℃下储存多达3个月，制剂显示很小或未显示二聚体和高分子量聚集体的增加，然而形成的低分子量片段化物类的量增加。在40℃下，低分子量物类的增加快于高分子量物类的增加。低分子量物类的增加速率显示与蛋白质浓度相关。

一般而言，含有50mg/mL或更低的蛋白质浓度以及组氨酸、蔗糖和PS80的制剂看起来展示用于冻干前散装物的充分的稳定性。

冻干制剂

在所有温度和时间点下，从50mg/mL或更低浓度冻干并重建为100至200mg/mL的制剂显示良好的饼状物形成和可接受的重建时间。在5℃下多达一年，含有组氨酸、蔗糖和PS80的制剂没有单体损失。这些制剂中的一些在储存一年后显示碱性物类的轻微增加；然而，鉴于测定的变化性，此增加难以进行定量。在升高的温度下蛋白质降解的主要路径是形成二聚体和高分子量聚集体。添加NaCl降低了粘性，但造成溶液浊度的增加。用PS20取代PS80显示对稳定性没有效应，而用海藻糖取代蔗糖增加聚集体的形成速率。

含有蔗糖、组氨酸和聚山梨酯80以及那他珠单抗的冻干制剂展示充分的稳定性以移至临床前和早期临床研究中。将执行另外的研究以优化起始蛋白质浓度、蔗糖与蛋白质的比值、重建的蛋白质浓度和冻干循环。此外，还将检查重建的样品的稳定性。

实施例3

如下文证明的，具有略微不同的初始蛋白质浓度的三种制剂成功进行了冻干并在于5℃储存6个月时显示优秀的稳定性。这些制剂在40℃下储存8周的稳定性与先前观察到的稳定性相当。冻干前制剂在5℃下储存6个月和重建的溶液在5℃或25℃下储存一周的稳定性也是优秀的。40mg/mL的起始浓度比其他制剂显示略微更好的稳定性和更好的重建特性。不过，此制剂的重建确实允许150mg/mL下1mL的可递送剂量。

材料

下表列出了材料和它们的来源。

表22

物品	生产商
		散装那他珠单抗(77.4mg/mL)	Elan
蔗糖(96mg/mL)	Elan
		1％PS80	Elan
60mM组氨酸	Elan
		6mM组氨酸	Elan
0.22-微米醋酸纤维素过滤器	Corning
		5cc小瓶	Kimble
灰色丁基20mm冻干塞，2leg	Kimble
		20mm撕拉型密封铝皮	Wheaton

表23

设备
	HPLC
HPLC

设备
	Uv-Vis分光光度计
Karl Fischer电量滴定仪
	pH计

那他珠单抗

用于此研究的那他珠单抗与研究3A和研究3B中使用的相同(AQS-2190)。用于这些研究的那他珠单抗是从BiogenIdec供应的那他珠单抗制备的。在用于此制剂研究之前，除去此材料(其已进行配制并装入小瓶)中包括的聚山梨酯80。简要而言，将材料渗滤至低离子强度、高pH(10mM tris、10mMNaCl、pH＝8.5)缓冲液。在这些条件下将所述材料结合于DEAE-琼脂糖凝胶柱，然后用10mM磷酸钠、140mM NaCl在pH6下洗脱。然后在进一步配制之前，将柱洗脱物渗滤至6mM组氨酸、pH6，并浓缩至70至100mg/mL。

化学品和试剂

除了注明的之外，此研究中使用的所有化学品和试剂均购自VWR，并且是ACS级或更好的。方便时使用USP级试剂作为赋形剂。聚山梨酯80购自Sigma(目录号P6474)，并且是植物来源和低过氧化物的。

制剂

下列制剂是通过将赋形剂和活性剂的贮存溶液稀释至期望浓度而制备的。所有制剂为pH6。

表24：研究4制剂参数

缩写：Ab＝抗体，his＝组氨酸，PS80＝聚山梨酯802.2

方法

制剂的制备

将样品制剂过滤灭菌并按所示灌装于无菌玻璃小瓶。用于冻干前分析的所有样品以0.5mL灌装于3cc小瓶、加塞并加盖。要冻干的配方物以4.0mL灌装于5cc Kimble小瓶。

冻干循环

在冷冻阶段过程中，将含有样品的小瓶首先冷却至5℃并保持30分钟。然后在20分钟内将温度斜坡下降至-5℃并在-5℃保持60分钟。对于最后的冷冻阶段，在45分钟内将小瓶温度斜坡下降至-40℃，在此温度下保持2小时，其中最后20分钟应用100mTorr真空。然后执行第一干燥，即在100mTorr真空下在20min内将温度升至-25℃并保持34小时。在100mTorr下于10小时内将架温度缓慢地斜坡上升至20℃，以开始第二干燥，然后在20℃保持6小时。

研究设置

将冻干前液体和冻干的饼状物的小瓶置于5和40℃。在2、4和8周时测定储存在40℃下的样品。在4周和6个月时测定储存在5℃下的样品。在4周时间点时，将来自各储存温度下的4小瓶重建，之后将2小瓶置于5℃而将2小瓶置于25℃，以获得1周的重建稳定性。在冻干前和冻干后的零时测定所有制剂。

测定

样品通过以下方法测定，并且结果呈现于表27-30。并非在所有时间点执行所有测定。除冻干前和冻干后样品的零时外，对每种测定取样两小瓶。

肉眼检查外观

肉眼检查所有样品并记录其外观。检查冻干的饼状物的颜色、均匀性、强度和回熔迹象。检查液体和重建样品的颜色、透明度和颗粒的存在。

残留水分和重建时间

使用Karl Fischer电量滴定仪在零时测定冻干的饼状物的残留水分。通过添加适当体积的DI水、然后轻轻涡旋来测量重建时间。记录饼状物完全溶解的时间。

浓度

测量了所有样品的浓度，使用那他珠单抗安慰剂将样品稀释至1mg/mL。使用Varian Cary 300Bio和10mm光程比色杯以200nm/min扫描400至250nm的UV吸光度。记录最大λ下的吸光度，并通过将该值除以1.498(那他珠单抗的吸光系数)和调节适当的稀释度而确定浓度。

浊度

使用10mm小体积比色杯(Starna Cells Inc.目录号16.160-Q-10\Z20)测量纯样品的300至400nm的吸收。报告在360nm下记录的值。

尺寸排阻层析

通过尺寸排阻层析确定样品中单体、高分子量聚集体、二聚体和低分子量物类的量。简要而言，将样品上样至净柱并调节上样体积以允许柱上有大约400uμg质量。将参考材料上样的质量也调节至相当水平。记录215和280nm二者下的检测，不过215nm下的主峰超出范围，所以使用280nm的迹线进行计算。结果呈现于表27-30。

结果

冻干前制剂

表27-30含有所有制剂的记录结果。经肉眼检查，所有制剂显示无色和轻微乳光，没有任何可见的颗粒。在5℃或40℃下，外观不随时间改变。在分析的变化范围内，没有样品显示蛋白质浓度的变化，并且也没有观察到这种趋势。如360nm下的吸光度所测量的，所有制剂的浊度在5℃下6个月后显示轻微的增加。对于所有三种制剂，40℃冻干前样品显示浊度随时间的增加。

监测了所有制剂的二聚体、高分子量(聚集体)和低分子量物类的形成。结果显示于表格和图17-19中。

图17显示40℃下高分子量物类的形成。在冻干前制剂中，高分子量物类的形成直到储存4周后才显示开始。在8周时，高分子量物类的少量增加是明显的。

在5℃下，储存6个月后没有任何制剂的高分子量物类水平具有变化。此数据显示于附录中，但是没有在这里制成图表。

图18显示40℃下低分子量物类的形成。40℃下的储存过程中，有低分子量物类形成的明确趋势。另外，低分子量物类的形成显示以更快速率领先于高分子量物类的形成，使得这成为液体样品中的重要降解途径。

对于在5℃下储存的样品，6个月时间段内的低分子量物类百分比的变化非常小。此数据显示于附录中，但是没有在这里制成图表。所有冻干前制剂从大约0.11％的初始水平升至6个月的0.18％。BiogenIdec已显示此测定的定量下限是0.2％。低于该水平的值的报告仅是为了趋势信息。

图19显示40℃下由于高分子量和低分子量两种物类的形成造成的单体的总损失。在5℃下，单体百分比几乎没有变化。这将表明，在2-8℃下储存6个月，这些制剂中的任一种作为冻干前制剂具有适当的稳定性。

通过阳离子交换层析分析所选的样品。在所有情况下，结果显示随基于时间和温度的储存的向更酸性物类的变化(脱酰胺)。各种冻干前制剂之间没有差异。因为脱酰胺一般受pH、离子强度和某些缓冲剂物类的影响，所以可预期到此结果。此数据显示于下表中。

所有三种冻干前制剂显示与研究3A和3B中的冻干前制剂相似的结果。

冻干制剂

下面的表25显示为了达到150mg/mL的蛋白质浓度所测试的重建体积。然后使用确定为最接近目标浓度的重建体积进行其余的实验。每种样品完全溶解后，确认浓度。对4089-1L、4089-1M和4089-1N使用的重建体积分别为0.85、1.0和1.1mL。

表25：重建体积

下面的表26显示从重建的样品中取出1mL剂量的能力。仅有4089-1N是可能的，其用1.1mL重建。这些数据表明，为了产生1mL 150mg/mL的最终可递送体积，4mL的灌装体积和50mg/mL的蛋白质浓度将是必需的。

表26：1mL剂量的评估

稳定性

经肉眼检查，所有制剂显示具有可接受的冻干的饼状物，证实4mL体积可在5mL小瓶中成功冻干。重建后，所有制剂显示无色和轻微乳光，没有任何可见的颗粒。在5℃或40℃下，外观不随时间改变。在分析的变化范围内，没有样品显示蛋白质浓度的变化，并且也没有观察到这种趋势。如360nm下的吸光度所测量的，所有制剂的浊度在5℃下6个月后显示轻微的增加，从大约0.099-0.104至0.111-0.116。对于所有制剂，40℃冻干前样品显示浊度随时间的增加。

冻干的饼状物的水分百分比在4.3至5.6范围内，如Karl Fischer电量滴定仪所测量的。4089-1L、4089-1M和4089-1N的平均水分百分比分别为4.5、5.2和4.9。这些样品中的水分相当高。

此研究的重建时间全部低于17分钟。图4显示40℃下的重建时间。在40℃下，显示有随储存增加重建时间的轻微趋势。具有较高起始蛋白质浓度的样品还显示更长重建时间的趋势。在更早的研究(研究A和B)中也注意到了这一点。

监测了所有制剂的二聚体、高分子量聚集体和低分子量物类的形成。制成表格的结果显示于下面的表格中。

图5显示40℃下高分子量物类的形成。在此温度下的储存过程中，有高分子量物类形成的明确趋势。制剂4089-1L中聚集体的形成速率显示略慢。不希望受理论的束缚，这可能是由于起始制剂的较低蛋白质浓度或略高的蔗糖与蛋白质的比值。

在5℃下，储存6个月后没有任何制剂中的高分子量物类水平具有变化，其展示为不同时间的％HMW。

图6显示40℃下低分子量物类的形成。与展现低分子量物类的形成快速增加的冻干前样品相反，冻干的样品在8周内未显示变化。对于在5℃下储存的样品，6个月时间段内的低分子量物类百分比没有变化。此数据显示于附录中，但是没有在这里制成图表。

图7显示40℃下由于高分子量和低分子量两种物类的形成造成的单体的总损失。在5℃下，单体百分比基本没有变化。这将表明，在2-8℃下储存达6个月或更长，这些制剂中的任一种作为冻干制剂具有适当的稳定性。

还通过阳离子交换层析分析样品。在40℃下8周后，所有情况下的结果显示向更碱性物类的变化。在测定的可变性内，电荷分布的变化非常小。选择样品还在该时间点显示向更酸性物类的轻微转变。此数据显示在下表中的最后一列，为％酸性、％主峰和％碱性。

重建的稳定性

在5℃或40℃下储存4周后，重建样品，然后将其置于5℃和25℃下1周以获得重建的稳定性。测试在初始时间点和1周时执行。附录中的表格含有所有制剂的所有记录结果。经肉眼检查，所有制剂显示无色和轻微乳光。除了两种样品外，所有样品显示没有颗粒。含有“蓬松的”白色颗粒的两小瓶在重建之前已在40℃下储存，然后在25℃下储存1周。分析者可能已在打开这些小瓶用于初始时间点测试时污染了它们。在分析的变化范围内，没有样品显示蛋白质浓度的变化，并且也没有观察到趋势。在分析的变化范围内，如360nm下的吸光度所测量的，在5℃或25℃下1周后，所有制剂的浊度未显示变化。

监测了所有制剂的二聚体、高分子量(聚集体)和低分子量物类的形成。结果显示于下表中。在重建和置于5℃或25℃下1周后，没有任何制剂中的高分子量物类水平具有变化。在重建后于25℃储存下，低分子量物类的水平显示略微增加，并基本保持与5℃重建储存后的相同。这些结果显示，如果重建然后置于5℃或25℃下1周，所有制剂将保持稳定。

还通过阳离子交换层析分析了在5℃下储存的样品的重建稳定性。所有三种制剂的结果显示1周后更酸性物类的轻微增加，无论重建之前其储存温度如何。重建之前已在5℃下储存的样品还显示储存1周后向更碱性物类的轻微转变。重建之前在40℃下储存的样品在5℃下储存1周后显示较少的向更碱性物类的转变。这些变化非常小，并且可能更多地指示测定的可变性而不是蛋白质的实际变化。

结论

前述研究4显示4mL体积可在5mL Kimble小瓶中成功冻干并具有可接受的饼状物结构。

确定给出150mg/mL的目标蛋白质浓度的重建体积为4089-1L(40mg/mL冻干前浓度)0.85mL、4089-1M(45mg/mL冻干前浓度)1.0mL和4089-1N(50mg/mL冻干前浓度)1.1mL。4089-1N是能够递送1mL剂量的唯一制剂，显示1.1mL水是需要的最小重建体积。这些结果可用于指导开发的关于灌装体积、总固体和重建体积的最终表示法(presentation)。一般而言，具有较低初始蛋白质浓度和较高蔗糖与蛋白质的比值的样品显示更短的重建时间和就单体损失方面而言略好的稳定性。基于灌装体积和重建体积，这指示较低的最终蛋白质浓度可给出更需要的产品。

重建稳定性显示，在5℃和25℃下储存1周，所有制剂是稳定的，没有单体损失。

所有三种冻干前制剂在5℃下保持稳定超过6个月。然而，在40℃下储存时，所有制剂显示低分子量物类的量增加的趋势。鉴于低分子量物类的快速率形成，显示低分子量物类的形成是液体样品中重要的降解途径。

还证明冻干制剂在5℃下稳定多达6个月。在40℃下储存时，有高分子量物类的量增加的明确趋势，而低分子量物类的量保持相同。这显示高分子量物类的形成是冻干的样品中更重要的降解途径。残留水分水平和蔗糖与蛋白质的比值的另外优化应改善稳定性。

那他珠单抗重制剂开发

表37

表38

实施例4

此研究的目的是使用实验设计来确定最终蛋白质浓度和最优的蛋白质与蔗糖的比值对于那他珠单抗的冻干的效应，以防止和最大限度减少聚集体形成。

实验设计参数

检查了40mg/mL至160mg/mL的最终蛋白质浓度，蛋白质与蔗糖的比值为1∶100至1∶500。聚山梨酯80水平保持恒定为每10mg/mL蛋白质0.01％的量，且组氨酸保持恒定为每40mg/mL蛋白质10mM。起始蛋白质浓度(冻干前)将是40mg/mL。小瓶以2mL灌装，然后重建至所需的最终蛋白质浓度。

检查了在40摄氏度下0、2、4和6周的短期稳定性。

程序：

1.将当前制剂对下列缓冲液之一渗滤。然后超滤至蛋白质浓度＞40mg/mL。测量蛋白质浓度并稀释至40mg/mL。

a.制剂SA：100∶1蔗糖∶蛋白质比-最终制剂7、8、9

b.制剂SB：300∶1蔗糖∶蛋白质比-最终制剂1、2、5、6、10

c.制剂SC：500∶1蔗糖∶蛋白质比-最终制剂3、4、11

2.以2mL/小瓶灌装20小瓶各种制剂。这允许10小瓶用于40度下的稳定性分析和另外的小瓶用于Tg、水分、FTIR分析、同渗重摩等的分析。需要的量为：

a.制剂SA：120mL

b.制剂SB：200mL

c.制剂SC：120mL

3.使用保守的循环冻干小瓶以降低水分，并将其重建至期望的蛋白质浓度

a.制剂4、6、8-用2mL重建以获得40mg/mL的最终浓度

b.制剂1、2、5、6、10-用0.8mL重建以给出100mg/mL的最终浓度

c.制剂1、3、9-用0.5mL重建以给出160mg/mL的最终浓度

4.通过浊度、浓度、外观、SEC检查在40度下2、4和6周时的稳定性。可在0和6周时运行其他测定，诸如IEX、非还原型SDS-PAGE和氧化。

表53

冻干

25C

     ％HMW

     A1     A2     B3     B4     A5     A6     C7     C8     C9     A10    B11

0    0.50   0.51   0.45   0.44   0.51   0.58   0.79   0.76   0.77   0.52   0.46

4    1.03   1.02   0.70   0.72   1.02   0.92   2.34   2.33   2.38   1.02   0.71

6    1.13   1.12   0.75   0.75   1.12   1.14   2.71   2.69   2.76   1.14   0.75

8    1.25   1.23   0.80   0.80   1.24   1.27   3.20   3.16   3.22   1.24   0.76

12   1.40   1.38   0.82   0.83   1.39   1.39   3.67   3.66   3.73   1.37   0.83

    ％LMW

     A1     A2     B3     B4     A5     A6     C7     C8     C9     A10    B11

0    0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.09   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00

4    0.07   0.08   0.07   0.06   0.07   0.07   0.09   0.08   0.09   0.07   0.06

6    0.08   0.07   0.07   0.06   0.07   0.07   0.09   0.09   0.09   0.07   0.06

8    0.11   0.09   0.09   0.08   0.10   0.08   0.09   0.11   0.11   0.09   0.10

12   0.08   0.08   0.08   0.07   0.08   0.07   0.10   0.10   0.10   0.08   0.07

     ％单体

     A1     A2     B3     B4     A5     A6     C7     C8     C9     A10    B11

0    99.50  99.49  99.55  99.56  99.49  99.32  99.22  99.24  99.23  99.48  99.54

4    98.89  98.90  99.22  99.22  98.91  98.90  97.57  97.58  97.53  98.91  99.22

6    98.79  98.81  99.18  99.19  98.80  98.79  97.20  97.22  97.15  98.80  99.18

8    98.64  98.67  99.11  99.12  98.67  98.65  96.71  96.73  96.67  98.67  99.14

12   98.52  98.55  99.10  99.10  98.53  98.54  96.22  96.25  96.16  98.55  99.09

表54

冻干

25C

     ％HMW

     A1     A2     B3     B4     A5     A6     C7     C8     C9     A10    B11

0    0.50   0.51   0.45   0.44   0.51   0.58   0.79   0.76   0.77   0.52   0.46

4    0.65   0.65   0.56   0.59   0.66   0.65   0.99   1.01   1.02   0.66   0.57

8    0.68   0.67   0.57   0.58   0.67   0.67   1.10   1.09   1.14   0.68   0.58

12   0.71   0.72   0.60   0.58   0.72   0.69   1.17   1.18   1.21   0.72   0.58

     ％LMW

     A1     A2     B3     B4     A5     A6     C7     C8     C9     A10    B11

0    0.00   0.00   0.00   0.00   0.00   0.09   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00

4    0.07   0.06   0.07   0.06   0.07   0.06   0.07   0.07   0.08   0.06   0.06

8    0.10   0.08   0.10   0.07   0.08   0.07   0.08   0.07   0.08   0.08   0.09

12   0.08   0.07   0.09   0.07   0.06   0.07   0.05   0.07   0.07   0.07   0.08

％单体

     A1     A2     B3     B4     A5     A6     C7     C8     C9     A10    B11

0    99.50  99.49  99.55  99.56  99.49  99.32  99.22  99.24  99.23  99.48  99.54

4    99.27  99.28  99.37  99.35  99.27  99.28  98.94  98.92  98.90  99.28  99.37

8    99.22  99.25  99.34  99.34  99.24  99.25  98.83  98.84  98.79  99.23  99.33

12   99.21  99.21  99.32  99.35  99.22  99.24  98.78  98.75  98.72  99.21  99.34

表57

重建稳定性

实施例5

本文描述的制剂是含有那他珠单抗、蔗糖、组氨酸和聚山梨酯80的冻干的饼状物。冻干前散装药物物质含有40mg/mL抗体、41mg/mL蔗糖、0.04％聚山梨酯80和6mM组氨酸HCl、pH6.0。将此以每小瓶4mL灌装、冻干、并用1.0mL水重建至120mg/mL、123mg/mL蔗糖、0.12％聚山梨酯80和18mM组氨酸HCl、pH6.0。

冻干前的那他珠单抗组合物由BiogenIdec提供。其在磷酸缓冲盐溶液中配制，并加工为硫酸铵溶液。然后将此材料渗滤至制剂缓冲液(不含聚山梨酯)并浓缩至40mg/mL。然后添加适当量的聚山梨酯80，将所述材料过滤灭菌至聚丙烯瓶，并在灌装和冻干之前在2-8℃下储存4周。使用手写批记录在非GMP套件(suite)中执行灌装和冻干。在灌装之前对套件进行清洁，并且所有灌装操作在层流柜中执行。冻干使用Virtis Gensis 25EL冷冻干燥机执行。

稳定性研究由三个分部(arm)组成，一个检查冻干前那他珠单抗组合物在建议的储存温度(2-8℃)下多达一年和在25℃的加速的温度下多达6个月的稳定性。冻干的组合物小瓶在建议的储存温度(2-8℃)下储存12个月、在25℃下6个月和在40℃下3个月。重建来自2-8℃分部的各个时间点的小瓶并在2-8℃(建议的温度)和25℃(加速的)两种温度下储存1周。

执行关于外观、A280、pH、非还原型和还原型SDS-PAGE、阳离子交换层析和尺寸排阻层析方面的质量控制稳定性测试。

材料、方法和测试时间点

将测试下列样品

表58.样品配置

批次(Batch/Lot)	描述
		冻干前BiogenIdec Lot#：LYO121504	2mL灌装于聚丙烯小瓶
冻干的小瓶Lot#K65001，含有160mg活性剂/小瓶	5mL小瓶，含有冻干的饼状物，具有丁基橡胶塞和Flip-off盖。小瓶要用1mL WFI或其他纯化的水重建。

表59.研究方法

方法编号	标题	需要的体积
			EOP 000-01291	确定冻干的小瓶的外观	2小瓶*
EOP 000-01291	水分	2小瓶
			EOP 000-01292	确定重建时间	2小瓶*
AAM 001-00141	确定Antegren和匹配安慰剂最终容器的外观**	2小瓶*

方法编号	标题	需要的体积
			AAM 001-00143	确定Antegren药物物质、最终容器和Antegren的安慰剂的pH	1mL*
AAM 001-00380	非还原型SDS-Page和还原型SDS-PAGE**	50μL
			EOP 001-01198	通过弱阳离子交换层析确定Antegren药物物质和最终容器的电荷分布**	50μL
EOP 001-01205	尺寸排阻层析**	50μL
			AAM 001-00025	通过A280确定药物物质、最终容器和Antegren的安慰剂的浓度**	200μL

^*非破坏型，使用小瓶进行后续测试。^**需要对方法进行修改，参见下文的3.3节。

表60.研究方法

方法编号	标题	需要的体积
			160a.213	VCAM溶解产物	1小瓶**
22d.530	还原型凝胶基片CE	1小瓶**
			22d.596	非还原型凝胶基片CE	1小瓶**
22d.544b和22d.552a	甲硫氨酸氧化	1小瓶**
			22d.84	小体积注射用药物中的微粒	1小瓶**

^**使用一小瓶进行所有5种测定

表61.冻干前散装物的稳定性测试和时间点

Claims (43)

1.一种通过冻干水性制剂制备的稳定的冻干制剂，其中所述水性制剂包含：

(a)约20mg/ml至约80mg/ml那他珠单抗；

(b)具有约5.5至约6.5的pH的缓冲剂；

(c)约20mg/ml至约80mg/ml蔗糖；和

(d)约0.02至约0.08％聚山梨酯。

2.根据权利要求1所述的稳定的冻干制剂，其中所述水性制剂包含约30mg/ml至约80mg/ml那他珠单抗。

3.根据权利要求2所述的稳定的冻干制剂，其中所述水性制剂包含约40mg/ml那他珠单抗。

4.根据权利要求1所述的稳定的冻干制剂，其中所述缓冲剂具有约6.0的pH。

5.根据权利要求1所述的稳定的冻干制剂，其中所述缓冲剂是组氨酸。

6.根据权利要求5所述的稳定的冻干制剂，其中所述组氨酸以约1mM至约12mM的浓度存在于所述水性制剂。

7.根据权利要求6所述的稳定的冻干制剂，其中所述组氨酸以约6mM的浓度存在于所述水性制剂。

8.根据权利要求1所述的稳定的冻干制剂，其中所述蔗糖以约20mg/ml至约80mg/ml的浓度存在于所述水性制剂。

9.根据权利要求8所述的稳定的冻干制剂，其中所述蔗糖以约41mg/ml的浓度存在于所述水性制剂。

10.根据权利要求1所述的稳定的冻干制剂，其中所述聚山梨酯是聚山梨酯80。

11.根据权利要求10所述的稳定的冻干制剂，其中所述聚山梨酯80以约0.02％至约0.08％的浓度存在于所述水性制剂。

12.根据权利要求11所述的稳定的冻干制剂，其中所述聚山梨酯80以约0.04％的浓度存在于所述水性制剂。

13.根据权利要求1所述的稳定的冻干制剂，其中所述水性制剂中那他珠单抗与蔗糖的重量比为约0.5∶1至约2∶1。

14.根据权利要求13所述的稳定的冻干制剂，其中所述水性制剂中那他珠单抗与蔗糖的重量比为约1∶1。

15.根据权利要求1所述的稳定的冻干制剂，其中所述水性制剂中蔗糖与那他珠单抗的摩尔比为约300∶1至约500∶1。

16.根据权利要求15所述的稳定的冻干制剂，其中所述水性制剂中蔗糖与那他珠单抗的摩尔比为约400∶1至约500∶1。

17.根据权利要求16所述的稳定的冻干制剂，其中所述水性制剂中蔗糖与那他珠单抗的摩尔比为约450∶1。

18.根据权利要求1所述的稳定的冻干制剂，其中所述水性制剂还包含膨胀剂。

19.根据权利要求1所述的稳定的冻干制剂，其中所述水性制剂还包含张力调节剂。

20.根据权利要求1所述的稳定的冻干制剂，其中所述水性制剂包含：

(a)约40mg/ml那他珠单抗；

(b)约6mM组氨酸，pH约6.0；

(c)约41mg/ml蔗糖；和

(d)约0.04％聚山梨酯80。

21.一种稳定的重建制剂，其包含：

(i)约80至约160mg/ml那他珠单抗；

(ii)约18mM组氨酸，pH约6.0；

(iii)约123mg/ml蔗糖；和

(iv)约0.12％聚山梨酯80；其中：

所述重建制剂是从稳定的冻干制剂制备的，所述稳定的冻干制剂是通过冻干包含以下的水性制剂制备的：

(a)约40mg/ml那他珠单抗；

(b)约6mM组氨酸，pH约6.0；

(c)约41mg/ml蔗糖；和

(d)约0.04％聚山梨酯80。

22.根据权利要求21所述的稳定的重建制剂，其中所述稳定的重建制剂包含约120mg/ml那他珠单抗。

23.一种用于制备稳定的重建制剂的方法，所述方法包括重建冻干的制剂，所述冻干的制剂是通过冻干包含以下的水性制剂制备的：

(a)约30至约60mg/ml那他珠单抗；

(b)具有约5.5至约6.5的pH的缓冲剂；

(c)约20至约50mg/ml蔗糖；和

(d)约0.02至约0.08％聚山梨酯。

24.根据权利要求24所述的方法，其中所述水性制剂包含约40mg/ml至约50mg/ml那他珠单抗。

25.根据权利要求25所述的方法，其中所述水性制剂包含约40mg/ml那他珠单抗。

26.根据权利要求23所述的方法，其中所述缓冲剂具有约6.0的pH。

27.根据权利要求23所述的方法，其中所述缓冲剂是组氨酸。

28.根据权利要求28所述的方法，其中所述组氨酸以约1mM至约12mM的浓度存在于所述水性制剂。

29.根据权利要求29所述的方法，其中所述组氨酸以约6mM的浓度存在于所述水性制剂。

30.根据权利要求23所述的方法，其中所述蔗糖以约20mg/ml至约50mg/ml的浓度存在于所述水性制剂。

31.根据权利要求31所述的稳定的冻干制剂，其中所述蔗糖以约40mg/ml的浓度存在于所述水性制剂。

32.根据权利要求23所述的方法，其中所述聚山梨酯是聚山梨酯80。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述聚山梨酯80以约0.02％至约0.08％的浓度存在于所述水性制剂。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述聚山梨酯80以约0.04％的浓度存在于所述水性制剂。

35.根据权利要求23所述的方法，其中所述水性制剂中那他珠单抗与蔗糖的重量比为约0.5∶1至约2∶1。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述水性制剂中那他珠单抗与蔗糖的重量比为约1∶1。

37.根据权利要求23所述的方法，其中所述水性制剂中蔗糖与那他珠单抗的摩尔比为约300∶1至约500∶1。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述水性制剂中蔗糖与那他珠单抗的摩尔比为约400∶1至约500∶1。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述水性制剂中蔗糖与那他珠单抗的摩尔比为约450∶1。

40.根据权利要求23所述的方法，其中所述水性制剂还包含膨胀剂。

41.根据权利要求23所述的方法，其中所述水性制剂还包含张力调节剂。

42.根据权利要求23所述的方法，其中所述水性制剂包含：

(a)约40mg/ml那他珠单抗；

(b)约6mM组氨酸，pH约6.0；

(c)约41mg/ml蔗糖；和

(d)约0.04％聚山梨酯80。

43.一种用于治疗受治疗者的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用治疗有效量的根据权利要求23所述的稳定的重建制剂，其中所述受治疗者具有可通过施用那他珠单抗治疗的病症。

Images