CN101824475A - 一种与晚期非小细胞肺癌患者铂类化疗毒副作用相关的miRNA标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种与晚期非小细胞肺癌患者铂类化疗毒副作用相关的miRNA标志物及其应用和相关试剂盒，该标志物为hsa-mir-196a2 rs11614913，可用于检测或预测晚期非小细胞肺癌患者铂类化疗毒副作用，为此类病患的个性化治疗提供用药依据。

Description

一种与晚期非小细胞肺癌患者铂类化疗毒副作用相关的miRNA标志物及其应用

技术领域

本发明涉及医学遗传学和临床医学，具体为一种与晚期非小细胞肺癌患者铂类化疗毒副作用相关的miRNA标志物及其应用，将具体单碱基多态位点的不同基因型应用于预测晚期非小细胞肺癌患者接受铂类化疗后毒副作用的剧烈程度，并为此类病患的个性化治疗提供用药依据。

背景技术

肺癌一直是世界上死亡率最高的一种癌症，而非小细胞肺癌(non-small celllung cancer，NSCLC)则是造成其中85％病患死亡的原因。由于肺癌一般难以发现，病患确诊时往往已是晚期。因此，对于晚期非小细胞肺癌的临床治疗非常重要。

小分子核糖核酸(MicroRNA，miRNA)是一类内源性、小分子、非编码RNA，在细胞内起到负调控子的作用。在肺癌细胞中，小分子核糖核酸的表达谱以及特定小分子核糖核酸已被证明是肺癌有效的诊断和预后指标。而小分子核糖核酸基因中的单碱基多态位点(single-nucleotide polymorphism，SNP)能够通过改变小分子核糖核酸的表达量进一步改变小分子核糖核酸的功能。因此，小分子核糖核酸基因中的单碱基多态位点很可能成为一个影响肿瘤治疗效果的重要因素。其中，hsa-mir-196a2 rs11614913是为数不多的小分子核糖核酸成熟序列里单碱基多态位点中的一个。多篇文献都证明，此单碱基多态位点与中国人群中肺癌、乳腺癌、胰腺癌的发病率以及非小细胞肺癌的生存期显著相关。rs11614913会影响成熟的has-mir-196a2的表达，也会影响成熟hsa-mir-196a2的3’端与目标mRNA之间的结合。因此，hsa-mir-196a2 rs11614913极有可能是肺癌治疗中一个重要的生物指标。

另外，毒副作用在预后评价中是非常重要的一个临床指标，它直接关系到病患的生存质量，也影响着病患的生存期。在个性化治疗的应用中，毒副作用也是一个需要考虑的重要方面。

对于非小细胞肺癌，现行较为普遍的治疗方法是用铂类药物辅以细胞毒药进行治疗。然而，有些患者很容易对这类治疗方法产生剧烈的毒副反应，造成非常不理想的临床预后效果。而个性化治疗则能够根据病患自身遗传特征进行治疗，能够提高临床疗效并减少对病人正常组织细胞的伤害，因而具有重要研究意义。个性化治疗主要需要分析病人疾病相关基因的基因型，根据以往研究结果及病患的基因型选择最佳的治疗方案。但是，hsa-mir-196a2 rs11614913与非小细胞肺癌铂类化疗毒副作用的关联性国内外均未见报道，即此单碱基多态位点在肺癌个性化治疗方面应用上的研究仍然需要进一步研究。

发明内容

本发明旨在提供一种与晚期非小细胞肺癌患者铂类化疗毒副作用相关的miRNA标志物。

本发明还提供了上述miRNA标志物的应用。

本发明另一个目的在于提供检测晚期非小细胞肺癌患者铂类化疗毒副作用测试的试剂盒。

本发明从晚期非小细胞肺癌患者血液样本中提取DNA，通过检测其microRNA基因hsa-mir-196a2单碱基多态位点rs11614913基因型，分析不同基因型与其接受铂类化疗后临床毒副反应的程度，得出各基因型与临床毒副反应程度的关联，可预测罹患晚期非小细胞肺癌的患者(尤其是中国大陆患者)接受铂类化疗后临床毒副反应的程度，为此类病患的个性化治疗提供用药依据。

本发明技术方案为：一种与晚期非小细胞肺癌患者铂类化疗毒副作用相关的miRNA标志物，是hsa-mir-196a2 rs11614913。

上述miRNA标志物在制备检测或预测晚期非小细胞肺癌患者铂类化疗毒副作用的试剂方面的应用。

miRNA标志物的引物对，其序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。

一种检测或预测晚期非小细胞肺癌患者铂类化疗毒副作用的试剂盒，含有上述miRNA标志物的引物对。优选方案为，含有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的引物对。

本发明可以检测或预测具有不同基因型及不同临床特征的晚期非小细胞肺癌病患接受铂类化疗后是否会发生剧烈的毒副反应。此方法材料易得，操作方便灵活，限制少；根据has-mir-196a2 rs11614913的基因型预判铂类化疗毒副作用的程度非常简单易行，可以依基因型判断病人是否适合接受铂类化疗，易于临床广泛推广，亦能提高个性化治疗的水平。因此，此发明为晚期非小细胞肺癌患者的个性化治疗提供了一个新的着眼点。由于晚期非小细胞肺癌患者的众多、铂类药物的广泛应用、毒副反应对患者的身心折磨，本发明若进入实际应用，有助于提高晚期非小细胞肺癌病患的生存质量和延长患者生存期。

附图说明

图1为has-mir-196a2 rs11614913 TT基因型的LDR峰图示意图

图2为has-mir-196a2 rs11614913 CT基因型的LDR峰图示意图

图3为has-mir-196a2 rs11614913 CC基因型的LDR峰图示意图；S3代表has-mir-196a2 rs11614913的T/C多态

具体实施方式

实施例1制备用于检测或预测晚期非小细胞肺癌患者铂类化疗毒副作用程度的脱氧核糖核酸试剂盒作

脱氧核糖核酸试剂盒的制作和操作流程运用现在常用的脱氧核糖核酸测序技术、扩增技术等。

试剂盒可只包括hsa-mir-196a2 rs11614913基因型的脱氧核糖核酸引物，也可同时配有脱氧核糖核酸扩增所需的常用试剂。使用者需准备好从患者正常组织细胞中提取的基因组脱氧核糖核酸，再根据具体的实验条件，选择扩增方法、测序方法，得出患者hsa-mir-196a2 rs11614913的基因型。此试剂盒所操作限制少，方法灵活，根据基因型预判铂类化疗毒副作用的程度非常简单易行，亦能提高个性化治疗的水平。

实施例2采集样本和提取DNA

I.按统一标准筛选研究人群并建立数据库

病人必须是确诊患TNM分期系统中的III期或IV期非小细胞肺癌，无法手术，年龄在18-70岁之间，无恶性肿瘤病史，此前未做过手术或放化疗。本次研究招募到445名符合条件的病人，他们通过问卷调查等方式系统、如实地提供各项临床信息，我们在此基础上建立数据库。

II.为病人采集血液样本并进行基因分型

在病人开始化疗前，为其采集血样。我们从外周血白细胞中抽提基因组脱氧核糖核酸，引物设计并进行多聚酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)扩增，又成功地分析了其中442名病患的hsa-mir-196a2 rs11614913的基因型。并且，我们做了5％的重复性实验，结果完全一致。病人的遗传学资料也存入数据库中。

具体步骤为：

1、外周血脱氧核糖核酸抽提：

A.材料的预处理：

1)1ml新鲜血液加入180μl酸性柠檬酸葡萄糖(acid，citrate anddextrose；ACD)抗凝剂抗凝，混匀后-70℃长期保存；

2)0.5ml冻藏血加0.5ml磷酸盐缓冲液，用枪打匀，5000rpm 5分钟，弃上清；

3)反复用磷酸盐缓冲液(0.5-0.8ml)吹打洗涤、离心弃上清，至上清无明显红色为止，弃上清。

B.脱氧核糖核酸的抽提和纯化：

4)消化：沉淀中加入500μl三(羟基)氨基甲烷乙二胺四乙酸(Tris-EDTA，TE)缓冲液，25μl 20％十二烷基硫酸钠(sodium-dodecylsulphate，SDS)，4μl 10mg/ml蛋白酶K，混匀；55℃水浴2-3小时，至溶液透明为止；

5)抽提：冷却至室温，加700μl平衡酚，缓慢来回颠倒移液管至混匀(约10分钟)；12k离心10分钟，上清转移至1.5ml移液管，加700μl酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，混匀(约来回颠倒10分钟)，12k 10分钟，上清转移至1.5ml移液管，加700μl氯仿-异戊醇(24∶1)，混匀，12k 10分钟，上清转移至1.5ml移液管。

C.乙醇沉淀脱氧核糖核酸：

6)上清中加入1/10体积3M醋酸钠和2-2.5体积-20℃预冷的无水乙醇，立即摇匀，-20℃1小时；

7)取出后12000rpm 15分钟，倒去乙醇，吸干，-20℃预冷，70％乙醇洗涤(约500μl)；12000rpm 15分钟，弃上清，吸干，空气中干燥；

8)加50μl三(羟基)氨基甲烷乙二胺四乙酸缓冲液溶解，-20℃保存。

D.脱氧核糖核酸的电泳检测：

2μl样品加2μl 6x上样液加8μl三(羟基)氨基甲烷醋酸乙二胺四乙酸(Tris-acetate-EDTA，TAE)缓冲液室温，0.8％琼脂糖凝胶，恒压80V，电泳30分钟。电泳结束后，EB染色约15分钟，紫外观察。

E.脱氧核糖核酸的浓度测定及纯度判定：

取脱氧核糖核酸溶液用TE缓冲液做适量稀释，以三(羟基)氨基甲烷乙二胺四乙酸缓冲液作空白对照，在紫外分光光度计上读取A260和A280的光密度值。

按下面公式计算浓度：脱氧核糖核酸浓度(μg/μl)＝A260×50×稀释倍数/1000；

脱氧核糖核酸纯度的判定：A260/A280比值应介于1.7-2.0之间。

2、has-mir-196a2 T/C多态分型：

基因分型用多聚酶链式反应-LDR的方法进行。has-mir-196a2基因的上游引物(SEQ ID No.1)：5’-ACCCAGCAACCCAAAGTCTAC-3’，下游引物(SEQ ID No.2)：5’-GGTTGAGAGGACGGCATAAAG-3’。多聚酶链式反应反应用GeneAmp 9600多聚酶链式反应仪进行。

多聚酶链式反应反应条件为：步骤1：95℃15分钟；步骤2：95℃30s；步骤3：60℃2分钟；步骤4：72℃60s；步骤5：72℃10分钟；从步骤2至步骤4重复35次。高温连接酶检测反应技术(ligase detection reaction，LDR)的通用探针序列是：5’-p-CTGAGTTACATCAGTCGGTTTTCGTtttttt-羧基荧光素-3’；

C-特异性探针，5’-ttttttttTTTGAACTCGGCAACAAGATACTGC-3’；T-特异性探针，5’-tttttttttttTTTGAACTCGGCAACAAGATACTGT-3’。通用探针的3’端用6-羧基荧光素标记，5’端磷酸化。

每个多聚酶链式反应产物都要进行高温连接酶检测反应。高温连接酶检测反应技术反应条件为：步骤1：94℃2分钟；步骤2：94℃30s；步骤3：60℃2分钟；从步骤2至步骤3重复40次。接下来每个高温连接酶检测反应技术反应取出1μl+1μl参比荧光(ROX)+1μl缓冲液，用ABI Prism 373脱氧核糖核酸序列分析。另外，取几个代表性的基因组脱氧核糖核酸，直接用ABI Prism 310序列测序，验证高温连接酶检测反应技术方法的正确性。我们利用多聚酶链式反应-高温连接酶检测反应技术的方法同时对3各位点进行基因分型，具体峰的位置如附图图1、图2、图3。读取的标准一般为，一个峰是另一个峰的1/3以下时，这个峰不读。S3代表has-mir-196a2rs11614913的T/C多态(S1、S2与本发明无关)。图1为TT基因型，图2为CT基因型，图3为CC基因型。

III.病患接受铂类药物化疗，记录临床数据

所有病人都接受了2-6次统一的一线铂类药物化疗疗程安排。其中，铂类药物是顺铂和卡铂，这是两种非小细胞肺癌常用的化疗铂类药物。疗程中每隔两周主治医生会根据美国国家癌症中心通用毒性标准3.0版(the National CancerInstitute Common Toxicity Criteria version 3.0)评价一次病患毒副反应的程度，包括血液毒性和胃肠道毒性的综合评价；毒副反应包括白细胞减少、中性粒细胞减少、血红蛋白减少、血小板减少、恶心、呕吐。3级和4级毒副反应视为严重毒副反应。所有数据均被整理后存入数据库。

IV.统计分析，得到结果

对毒副作用的结果进行分组，出现严重毒副反应的分为一组，未出现的归为另一组。使用统计分析软件SPSS 12.0运用非条件罗基斯(Logistic)回归将hsa-mir-196a2 rs11614913的基因型与毒副作用数据进行总体及分组的关联分析，P＜0.05视为显著。最后得到此单碱基多态位点与总体毒副作用有显著相关性(P＝0.02)。在分层分析中，rs11614913对使用顺铂进行治疗的病人的毒副反应程度的影响更为显著(P＝0.008)，在使用卡铂的患者中则无显著性(P＝0.74)；男性患者的毒副作用剧烈程度受此位点影响较大(P＝0.02)，而女性则不太受影响(P＝0.42)；此单碱基多态位点显著影响了大于或等于此次研究平均年龄(57岁)的患者的毒副作用严重程度(P＝0.01)，缺未显著影响低于平均年龄的患者(P＝0.36)。在此次研究中，hsa-mir-196a2 rs11614913的纯合子CC是提高毒副反应剧烈程度的风险因素，其在男性患者、顺铂化疗病人、高龄(年龄≥57岁)病患中的作用尤为明显(见表1)。

表1hsa-mir-196a2 rs11614913不同基因型与晚期非小细胞肺癌患者接受铂类化疗后毒副作用程度的关联

¹第一组表示毒副作用为1级或2级

²第二组表示毒副作用为3级或4级

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>华东师范大学

<120>一种与晚期非小细胞肺癌患者铂类化疗毒副作用相关的miRNA标志物及

其应用

<130>none

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

 

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>1

acccagcaac ccaaagtcta c                                              21

 

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>2

ggttgagagg acggcataaa g                                              21

Claims (5)

1.一种与晚期非小细胞肺癌患者铂类化疗毒副作用相关的miRNA标志物，其特征在于，是hsa-mir-196a2 rs11614913。

2.权利要求1所述的miRNA标志物在制备检测或预测晚期非小细胞肺癌患者铂类化疗毒副作用的试剂方面的应用。

3.权利要求1所述的miRNA标志物的引物对，其特征在于，其序列分别为SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2。

4.一种检测或预测晚期非小细胞肺癌患者铂类化疗毒副作用的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述miRNA标志物的引物对。

5.权利要求4所述一种检测或预测晚期非小细胞肺癌患者铂类化疗毒副作用的试剂盒，其特征在于，含有权利要求3所述的引物对。

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