CN101822844A - 肿瘤靶向分子化疗基因-病毒制剂SG500-dNKmut及构建方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肿瘤靶向分子化疗基因-病毒制剂SG500-dNKmut及构建方法和用途，其特点是该病毒制剂以E1B55kda基因缺失的5型腺病毒SG500为载体，并携带有分子化疗基因Dm-dNKmut。本发明注射人体后与低浓度核苷酸化疗药配合使用，可对实体肿瘤进行靶向杀伤，并且将安全控制机制引入可复制增殖的病毒载体，解决了病毒使用安全性问题，有效减低病毒及化疗药物带来的副作用，是具有分子水平安全控制机制的肿瘤靶向双重杀伤机制的实体肿瘤分子治疗制剂。

Description

肿瘤靶向分子化疗基因-病毒制剂SG500-dNKmut及构建方法和用途

技术领域

本发明涉及一种溶瘤腺病毒生物制剂，特别是涉及一种携带有分子化疗基因的溶瘤腺病毒生物制剂-肿瘤靶向分子化疗基因-病毒制剂SG500-dNKmut及构建方法和用途，该溶瘤腺病毒生物制剂注射人体后与低浓度核苷酸化疗药配合使用，可对实体肿瘤进行靶向杀伤，并且有效减低病毒及化疗药物带来的副作用，是具有分子水平安全控制机制的肿瘤靶向双重杀伤机制的实体肿瘤分子治疗制剂。

背景技术

尽管投入巨大，肿瘤的病因学研究近50年在世界范围内没有根本性突破(2006年诺贝尔论坛瑞典)；中国工程院院士郝希山最近主持完成的“恶性肿瘤流行趋势分析及预防研究”发现59种恶性肿瘤发病率20年间升高了约50％；然而，美国国立癌症研究院NCI(National Cancer Institute)的年度报告显示：肿瘤病死率连续两年呈下降趋势，报告中指出病死率的下降得益于过去几十年戒烟的普及，早期肿瘤的筛查，以及有效的新的治疗手段¹；可见积极预防，早期发现，提高治疗水平是目前应对肿瘤行之有效的三项法宝。然而，尽管随着诊断技术的进步，越来越多的早期肿瘤被发现；但对于早期即发生的微转移病灶及晚期转移性肿瘤目前尚无根本有效的杀伤治疗手段。给患者带来巨大痛苦、及沉重经济负担的化学治疗、放射治疗、内分泌治疗也只能对于20-70％左右的某些组织来源的肿瘤病人有效，且即使结合外科治疗也难以达到完全根治水平^2，3。

尽管一些关键问题有待解决，肿瘤分子治疗的研究正在世界范围内广泛开展。国内外多年恶性肿瘤全方位的研究已经明确：肿瘤的发生是一个多基因，多步骤，多因素的复杂过程^2，3，针对某一致癌基因的单一基因治疗往往难以奏效；然而，抛开众多复杂的致瘤基因，通过某种机制，从单纯杀伤角度，用单一基因杀伤肿瘤细胞却是切实可行的；其技术的关键是杀伤基因的作用强度，外源基因转入手段及肿瘤细胞的靶向杀伤。

恶性肿瘤转入编码单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因，再辅以GCV(ganciclovir)治疗是最常见的肿瘤“自杀”基因治疗策略；核苷酸激酶可以磷酸化核苷酸类似物(癌前药物)如GCV成毒性代谢产物，干扰DNA的合成复制⁴，从而导致肿瘤细胞死亡。另外，除了表达HSV-TK的细胞，由于某种机制已磷酸化核苷酸类似物也可以进入周围细胞⁵，这种被称做“旁观者效应”的现象可以大大增强“自杀”基因治疗效果。以HSV-TK基因为代表的自杀基因治疗恶性肿瘤早已进入临床III期试验。然而实际临床效果却未能达到实验室及动物实验水平，其主要原因就是自杀基因本身的酶动力活性的强度不足及其底物的单一性⁶，寻找新的自杀基因或遗传学改造现有基因一直是科学家努力的方向。

公开号为CN1793343的中国发明专利申请《具有肿瘤靶向性和肿瘤自杀性的溶瘤性抗癌重组腺病毒》，给出了两组(十种)溶瘤性重组腺病毒。一组由在病毒E1A基因上定点突变而产生。另一组以肿瘤专异性启动子取代E1A启动子而构建成。此外，一部分重组腺病毒因其纤维末端节加了RGD短肽而具有感染癌细胞的靶向性。同时，一部分重组病毒携带有肿瘤自杀性基因HSV₁-tkm。但是，以上溶瘤性重组腺病毒所采用的自杀基因HSV-TK是早在80年代就已经发现并应用的(Intervirology.1991；32(2)：76-92.Review)，TK作为自杀基因国际上早已进行三期临床实验，且效果不理想，所提供的溶瘤腺病毒以及类似发明中的E1A保留的增殖性腺病毒在实际应用中均有着共同的弊端，即腺病毒虽然能够通过增殖导致肿瘤细胞凋亡，起到治疗作用，但之后其腺病毒在人体内感染播散能力往往难以控制。

本申请人1999-2002年在Johansson研究小组攻读博士期间，完成了黑腹果蝇脱氧核苷酸激酶(Deoxyribonucleoside Kinase of DrosophilaMelanogaster Dm-dNK)作为新的“自杀”基因在in vitro水平的评估实验；结果表明^7-9：黑腹果蝇的这一脱氧核苷酸激酶完全可以在人类的恶性肿瘤细胞(如胰腺癌、骨肉瘤)中表达并继续保持高的催化活性，细胞毒性实验证实：表达基因的肿瘤细胞对一些核苷酸类似物的半数致死量(IC50)较非转染的肿瘤细胞对照降低50-6400倍。Dm-dNK极有可能用作分子化疗基因，从分子水平治疗恶性肿瘤。

最近的研究¹⁰发现Dm-dNK氨基酸序列C末端的最后10位氨基酸具有与其它激酶不同的特殊性，它不仅影响到催化活性，而且包含了核定位信号，我们用PCR碱基置换法对Dm-dNK末10位氨基酸进行了改变，位点分别为244E，245S，和251S，并在序列最后插入了氨基酸252R，得到了Dm-dNK mutant(dNKmut)。通过研究发现，dNKmut激酶有着比Dm-dNK野生型更高的活性，而且能够胞浆强表达，在胞核弱表达，这样核苷酸药物在进入细胞后，就可以在不同的细胞亚结构进行磷酸化，导致最终的三磷酸化产物进入细胞核或线粒体，抑制肿瘤DNA的合成，使癌细胞凋亡，因此分子化疗基因dNKmut与Dm-dNK相比更适合于在基因治疗中的应用。

腺病毒不仅是最常用最有效的外源基因转入载体，而且可以直接作为肿瘤细胞的靶向生物杀伤武器^11-14。ONYX-015(d11520)是研究最多的用于靶向瘤裂解的腺病毒，腺病毒在宿主细胞中的复制会受到E1B 55Kda蛋白和p53蛋白的调控，其主要机制是p53蛋白可抑制腺病毒在宿主细胞中的复制，而E1B 55K蛋白则通过抑制宿主细胞p53以确保腺病毒的复制能顺利进行。d11520是E1B 55K基因改变或缺失的腺病毒。

由于这个缺陷，d11520不能表达E1B 55Kda蛋白，从而不能抑制p53，因此不能在p53功能正常的细胞中复制，但可以在p53功能缺陷的肿瘤细胞中复制^15，16。尽管确切机制有待进一步探讨^17，18，E1B缺陷性腺病毒治疗实体肿瘤已进入III期临床试验^12，13，19。几乎完全相同的E1B缺陷性腺病毒H101(中国三维生物科技有限公司)已于2005年11月在中国获得新药证书，成为具有中国专利的国家创新药物。然而，与复制缺陷病毒载体相比，它的复制及传播扩散能力大大增加了毒副作用出现的可能，特别是由于先前事故的发生，其使用的安全性受到了广泛的关注和担心，因此病毒滴度使用的限制及单一的杀伤手段可能是导致临床治疗效果不完美的根本因素。

虽然dNKmut比Dm-dNK野生型及传统化疗基因HSV-TK有着更高的催化效率及更广的底物特异性，由于该基因的发现属于申请人的原创研究，时至今日并未有人将其与靶向瘤裂解的腺病毒(溶瘤腺病毒)相结合使用，来进一步提高肿瘤靶向治疗的实用价值。而且我们课题组的最新研究首次发现Dm-dNKmut基因还有另一个更重要的特性，即将核苷酸化疗药物磷酸化后，磷酸化产物可以终止病毒的复制，即将安全控制机制引入可复制增殖的病毒载体，减低治疗副作用，这是以往利用病毒载体进行基因治疗的方法中所没有解决的。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，将利用分子化疗基因的肿瘤基因治疗与溶瘤病毒治疗二者的优势结合起来，同时又能够高效磷酸化多种核苷酸药物的肿瘤分子化疗基因-病毒SG500-dNKmut.

本发明另一个目的在于将安全控制机制引入可复制增殖的病毒载体可望解决病毒使用安全性问题。Dm-dNKmut基因的一个最重要的特性就是，它即可以磷酸化抗肿瘤癌前药物，也可以磷酸化抗病毒的核苷酸类似物。一但这些核苷酸类似物被使用，病毒的复制将被完全终止。

本发明另一个目的在于提供了一种肿瘤靶向分子化疗基因-病毒的构建方法。

本发明给出的技术解决方案是：这种肿瘤靶向分子化疗基因-病毒制剂SG500-dNKmut，其特征在于，该病毒制剂以E1B55kda基因缺失的5型腺病毒SG500为载体，并携带有分子化疗基因Dm-dNKmut。

本发明给出的这种肿瘤靶向分子化疗基因-病毒制剂SG500-dNKmut的构建方法，包括以下步骤：

A、将分子化疗基因Dm-dNKmut克隆进载体质粒的多克隆位点，然后用限制性内切酶切除基因表达框，该表达框包含CMV启动子、分子化疗基因Dm-dNKmut、SV40polyA尾巴，插入肿瘤特异性增殖的腺病毒载体质粒pSG500，构建成质粒pSG500-dNKmut；

B、将得到的质粒pSG500-dNKmut与含有腺病毒骨架DNA的质粒pBHGE3共转染293细胞株，同源重组后扩增，经过氯化铯梯度离心提纯产生，具有感染性的含有分子化疗基因的病毒制剂SG500-dNKmut。

为更好的实现本发明的目的，所述CMV启动子也可以用下列特异性启动子中的一种启动子代替：(1)端粒酶逆转录酶启动子；(2)乳腺癌组织特异性启动子；(3)癌胚抗原启动子；(4)前列腺特异性抗原启动子；(5)甲胎蛋白启动子。

本发明给出的这种肿瘤靶向分子化疗基因-病毒制剂SG500-Dm-dNK的用途，是用于制备治疗实体肿瘤药物。特别是肿瘤靶向分子化疗基因-病毒制剂SG500-dNKmut可以与下列化合物之一组成药用组合物：各种化疗药物、生物毒素、免疫抑制化合物、单克隆抗体。

本发明提供的携带肿瘤靶向分子化疗基因dNKmut的重组腺病毒，构建方法易于掌握，经细胞试验证明，分子化疗基因dNKmut可以特异性的在肿瘤细胞中高表达，而在正常细胞中表达很少，该化疗基因能够磷酸化多种嘧啶嘌呤类的核苷酸化疗药物，可用于治疗多种肿瘤；

本发明提供的分子化疗基因-病毒制剂SG500-dNKmut，是一种肿瘤特异性病毒，能选择性地在肿瘤细胞内复制增殖和表达所携带的分子化疗基因dNKmut，故该病毒制剂具有很高的靶向抗癌作用。

本发明提供的分子化疗基因-病毒制剂SG500-dNKmut，经细胞和动物实验证明，低滴度病毒感染细胞或动物，与低于正常剂量100-1000倍的核苷酸化疗药配合使用，即能有效抑制肿瘤生长，杀灭肿瘤细胞的同时而不影响正常细胞，为今后用于人类肿瘤治疗打下了良好基础。

本发明提供的分子化疗基因-病毒制剂SG500-dNKmut，经细胞和动物实验证明，再高效杀伤肿瘤同时能够控制自身病毒过量增殖，限制了病毒复制及传播扩散能力而带来的毒副作用，安全性得到了保障。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)双重肿瘤杀伤机制(“二次打击”)；病毒选择性瘤裂解机制和分子化疗机制；

(2)引入安全控制机制，增加了复制增殖腺病毒载体的使用安全性；

(3)E1B缺陷腺病毒的肿瘤细胞选择复制的同时也控制了dNKmut肿瘤细胞的靶向转染；

(4)短期基因表达即可见效，并不需要知道肿瘤的致病原因；

(5)肿瘤细胞毒性代谢产物将同时杀伤非耐药性及已产生耐药性的肿瘤细胞；

(6)由于“旁观者效应”的存在，即使转入一小部分肿瘤细胞，也可达到整体杀伤效果，而复制增殖腺病毒载体的使用将增强“旁观者效应”；

(7)由于病毒增殖能力和dNKmut的高催化活性，可以使用极低滴度的病毒和低浓度的癌前药物，将进一步增加病毒使用安全性，减少毒副作用；

(8)dNKmut的多底物特性，使得有多种抗癌及抗病毒的核苷酸类似物可供选择；

(9)由于dNKmut并无毒性，只有加入核苷酸类似物(抗癌，抗病毒药物)后方呈现细胞毒性，因此可人为控制加入核苷酸类似物的时间，治疗更具主动性和可操作性；并方便观察第一杀伤机制的效果，可能产生全新的杀伤肿瘤细胞、并杀灭或控制病毒复制、防止全身播散的新策略。

附图说明

图1A为本发明的分子化疗基因dNKmut氨基酸改变位点，及SG500-dNKmut结构示意图。

图1B为本发明的分子化疗基因-病毒SG500-dNKmut构建所用质粒结构图。

图2为本发明的分子化疗基因-病毒SG500-dNKmut靶向双重杀伤机制示意图。

图3A为分子化疗基因-病毒SG500-dNKmut在正常细胞或肿瘤细胞中的表达位置。

图3B为分子化疗基因-病毒SG500-dNKmut在正常细胞或肿瘤细胞中的表达情况。

图3C为分子化疗基因-病毒SG500-dNKmut在正常细胞或肿瘤细胞中，Dm-dNK活性，即磷酸化能力的测定。

图4为MTT法检测肿瘤细胞和正常细胞经1MOI(multiplicity ofinfection)病毒SG500-dNKmut及对照病毒处理后，再不同浓度，不同种类核苷酸化疗药作用下，细胞的存活率。

图5Westernblot法检测肿瘤细胞和正常细胞经1MOI(multiplicity ofinfection)病毒SG500-dNKmut及对照病毒处理后，在低浓度核苷酸化疗药作用下，腺病毒早期转录单位E1A表达下降，病毒明显被抑制。

图6A为分子化疗基因-病毒SG500-dNKmut与低浓度化疗药物配合在裸鼠体内治疗肿瘤细胞移植瘤的结果示意图。

图6B为免疫组化方法，检测分子化疗基因-病毒SG500-dNKmut与低浓度化疗药物配合，在裸鼠肿瘤细胞移植瘤内使腺病毒早期转录单位E1A表达下降，活体内抑制病毒增殖情况。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。

实施例1、分子化疗基因-病毒SG500-dNKmut结构及靶向双重杀伤原理

Dm-dNK与dNKmut氨基酸序列对比图，如图1所示，与Dm-dNK野生型相比，dNKmut最后10位氨基酸发生了随机改变，位点分别为244E，245S，和251S，并在序列最后插入了氨基酸252R。SG500溶瘤腺病毒为病毒E1，E3区保留，E1B55-kDa基因缺失的靶向病毒，其中dNKmut的表达框(CMV启动子，his-tag组氨酸标签，ATG起始密码，dNKmut序列，SV40polyA尾)被插入到E3区的多克隆位点处，产生重组腺病毒SG500-dNKmut。ITR，腺病毒末端重复序列；ψ，5型腺病毒包装信号；Ad5 fiber，5型腺病毒骨架。

感染SG500-dNKmut病毒后，dNKmut激酶能够在癌细胞内靶向表达，加入极低浓度的核苷酸化疗药后，由于dNKmut激酶的高催化效率，核苷酸类的化疗药物仍能磷酸化成为单磷酸盐，经人体内内源性细胞激酶作用，使其转化成高度毒性的三磷酸盐，抑制癌细胞DNA合成致细胞凋亡；另一方面溶瘤病毒SG500(购自上海医元生物公司)能够在瘤细胞内靶向增殖，致瘤裂解，直接杀伤癌细胞，实现双重杀伤。随着实际应用过程中核苷酸药物浓度不断下调，表达有dNKmut的癌细胞由于dNKmut激酶的高催化效率仍能催化核苷酸成为高毒性的三磷酸形式，杀伤癌细胞并产生旁观者效应⁹；而正常细胞或未感染dNKmut的癌细胞由于自身激酶效率低，对低浓度的药物不敏感，药物未能磷酸化，因此细胞毒性不明显，实现了分子水平安全控制机制的实体肿瘤靶向双重杀伤，如图2。

实施例2、肿瘤靶向分子化疗基因-病毒SG500-dNKmut的构建

本发明给出的肿瘤靶向分子化疗基因-病毒制剂SG500-dNKmut的构建方法，包括以下步骤：

将分子化疗基因Dm-dNK克隆进载体质粒的多克隆位点，然后用限制性内切酶切除基因表达框，该表达框包含CMV启动子、分子化疗基因dNKmut、SV40polyA尾巴，插入肿瘤特异性增殖的腺病毒载体质粒pSG500，构建成质粒pSG500-dNKmut；

将得到的质粒pSG500-dNKmut与含有腺病毒骨架DNA的质粒pBHGE3共转染293细胞株，同源重组后扩增，经过氯化铯梯度离心提纯产生，具有感染性的含有分子化疗基因的病毒制剂SG500-dNKmut。

具体的构建方法如下：

1、PUC19载体的酶切回收

PUC19          20.0ul

EcoR I         3.0ul

BamH I         3.0ul

NEB 2 Buffer   10.0ul

10×BSA        10.0ul

H₂O            54.0ul

                              

总体系         100.0ul

37℃水浴6h后，直接用胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction)回收PUC19线性化条带2665bp。

2、dNKmut目的基因获得

Plxsn-dNKmut    1.0ul

GT160           1.0ul

GT161           1.0ul

KOP PLUS        1.0ul

dNTP            5.0ul

MgSO4           2.0ul

KOD Buffer      5.0ul

H₂O             34.0ul

                                

总体系          50.0ul

1.2％琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction)回收dNKmut基因779bp。

dNKmut目的基因酶切回收

dNKmut          30.0ul

EcoR I          3.0ul

BamH I          3.0ul

NEB 2 Buffer    10.0ul

10×BSA         10.0ul

H₂O             44.0ul

                                 

总体系          100.0ul

37℃水浴6h后，直接用胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction)回收753bp条带。

3、连接

PUC19/EcoR I+BamH I       2ul

dNKmut/EcoR I+BamH I      8ul

Solution I                10ul

                                    

总体系                    20.0ul

12℃连接12h。将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，铺琼脂板(含AMP)后，37℃生化培养箱内培养10--12h。挑取生长的细菌单克隆，在含氨苄青霉素的LB溶液中，37℃摇床扩增12h。抽提阳性克隆的质粒DNA，酶切鉴定正确后命名为PUC 19-dNKmut。

4、PUC19-dNKmut载体的酶切回收

PUC19-dNKmut            20.0ul

EcoR I                  3.0ul

BamHI                   3.0ul

Buffer 2        10.0ul

10×BSA         10.0ul

H₂O             54.0ul

                              

总体系          100.0ul

37℃水浴6h后，1.2％琼脂糖凝胶电泳.用胶回收试剂盒(QIAquick GelExtraction)回收dNKmut基因755bp。

5、PENTER12载体的酶切回收

PENTER12       3.0ul

EcoR I         3.0ul

BamHI          3.0ul

Buffer 2       10.0ul

10×BSA        10.0ul

H₂O            71.0ul

                               

总体系         100.0ul

37℃水浴6h后，1.2％琼脂糖凝胶电泳.用胶回收试剂盒(QIAquick GelExtraction)回收线性化载体3025bp。

6、连接

PUC19-dNK/EcoR I+BamH I     8ul

PENTER12/EcoR I+BamH I      2ul

Solution I                  10ul

                                       

总体系                      20.0ul

12℃连接12h。将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，铺琼脂板(含AMP)后，37℃生化培养箱内培养10--12h。挑取生长的细菌单克隆，在含KAN的LB溶液中，37℃摇床扩增12h。抽提阳性克隆的质粒DNA，酶切鉴定正确后命名为PENTER12-dNKmut。

7、LR重组

PENTER12-dNKmut(150ng/ul)  1ul

PPE3-RC(150ng/ul)          1ul

LR重组酶                   2ul

1XTE                       6ul

                                      

总体系                     10.0ul

25℃连接12h。第二日转化前加入1ul的蛋白酶K.将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，铺琼脂板(含AMP)后，37℃生化培养箱内培养10--12h。挑取生长的细菌单克隆，在含AMP的LB溶液中，37℃摇床扩增12h。抽提阳性克隆的质粒DNA，酶切鉴定正确后命名为PPE3-mCMV-dNKmut。

8、重组腺病毒

将质粒PPE3-mCMV-dNKmut与SG502用Lipofectamine2000共转染至293细胞。共转染后9-14天出现病毒空斑，应用QIAGEN DNA Blood Mini Kit(QIAGEN公司)提取腺病毒DNA，应用PCR进行鉴定。应用氯化铯梯度离心纯化病毒。经鉴定正确的腺病毒命名为SG500-dNKmut，即mCMV调控的带dNKmut基因的肿瘤特异性增殖型腺病毒。

附：试剂材料

PENTR12，PENTR13，PPE3-RC载体，SG500   上海新基因公司

XbaI、BamHI、EcoRI、Hind III、ScaI     NEB公司

Taq酶                               申能博彩公司

DNA连接酶SolutionI                  TakaRa公司

蛋白酶K、RNA酶                      PROMEGA公司

胎牛血清、小牛血清、dNKM            GIBCO BRL公司

琼脂糖、溴化乙锭                    GENE公司

琼脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物        UNIPATH公司

胶回收试剂盒                        QIAGEN公司

PCR产物回收试剂盒                   QIAGEN公司

质粒DNA制备试剂盒                   QIAGEN公司

病毒DNA提取试剂盒                   QIAGEN公司

LipofectAmine2000试剂盒             GIBCO BRL公司

引物GT160 5’CCGGAATTCACCATGGCGGAGGCA  3’

GT161 5’CGCGGATCCTCATTATCTGGCGAC  3’

实施例3、病毒SG500-dNKmut感染正常细胞或肿瘤细胞后化疗基因Dm-dNK表达及活性情况

免疫荧光观察dNKmut表达位置及表达量，1×10⁵的乳腺癌细胞系Bcap37、胃癌细胞系SGC-7901和正常肺成纤维细胞系MRC-5(细胞系均购于上海中科院细胞库)铺于24孔板中，感染MOI＝1的SG500-dNKmut及Ad-dNKmut(非增殖型腺病毒携带dNKmut基因)48h后，用PBS(磷酸盐缓冲液)冲洗细胞后，4％多聚甲醛固定25分钟，孵育一抗(鼠抗人组氨酸标签抗体购于Merck，德国)2个小时后，Hochest33258染细胞核15分钟后，孵育二抗(罗丹明标记的羊抗鼠购于Santa Cruz Biotechnology，美国)，标记的蛋白dNKmut在荧光显微镜下观察(Olympus Tokyo，日本)。

如图3A所示，罗丹明标记的红色荧光显示了dNKmut的表达位置，浆内表达明显，核内亦有少许，而且从荧光深浅程度可以看出表达量多少，增殖型的SG500-dNKmut比非增殖型的在癌细胞内表达要多，在正常细胞内差不多。

将1×10⁶的乳腺癌细胞系Bcap37、胃癌细胞系SGC-7901和正常肺成纤维细胞系MRC-5铺于25cm²培养瓶中，感染MOI＝1的SG500-dNKmut及SG500(空载体对照组)48h后，Trizol收集细胞，提取RNA，采用RT-PCR Kit(TaKaRa，Japan)及引物Sense 5’CCG GAA TTC ACC ATG GCG GAG GCA 3’，Antisense 5’CGCGGA TCC TCA TTA TCT GGC GAC 3’确定Dm-dNK在细胞内表达情况。

结果如图3B所示(a)SG500-dNKmut(b)SG500感染的细胞系中，乳腺癌细胞系Bcap37、胃癌细胞系SGC-7901中分子化疗基因Dm-dNK表达量高，而正常细胞系MRC-5表达量低，可见病毒SG500-dNKmut的靶向性。

放免法测定dNKmut活性：酶活性测定见上述文献7概括为：3.0μmol/L[methyl 3H]dThd及2μmol/L非标记的dThd用于酶促反应中。24℃恒温水浴30min。加入含2mmol/LEDTA的20mmol/L HEPES反应停止液中，Dowex AG层析，液闪方法测定[3H]-dThd的放射活性。

结果如图3C所示，病毒SG500-dNKmut在癌细胞系中酶活性很高，有很强磷酸化能力，由于病毒的选择性在正常细胞系中弱表达，而没有携带分子化疗基因的空载体病毒SG500基本无活性。

实施例4、病毒SG500-dNKmut与低浓度核苷酸药物配合对肿瘤杀伤能力及诱导凋亡情况的检测

乳腺癌细胞系Bcap37、胃癌细胞系SGC-7901和正常细胞系MRC-5以3000/孔铺入96孔板，培养24小时后，分别加入分别加入MOI＝1的病毒SG500-dNKmut，及对照用空载病毒SG500，非增殖型病毒Ad-dNKmut，及空载的Ad-blank，感染四种细胞系，感染48h后，梯度浓度加入核苷酸药物gemcitabine(dFdC，2’，2’-difluoro-deoxycytidine)，商品名为健泽，作用3天后做MTT实验(Cancer Research，1989，49(17)：4785-90)，通过比较癌细胞及正常细胞细胞存活率，病毒SG500-dNKmut杀伤效果及安全性。

如图4所示病毒SG500-dNKmut在极低浓度药物0.001μM gemcitabine配合下，即可杀伤80％以上的癌细胞，而对正常细胞MRC-5毒性很小，具有肿瘤靶向性，实现治疗目的，非增殖型病毒Ad-dNKmut则没有选择性。

实施例5、病毒SG500-dNKmut与低浓度核苷酸药物配合控制病毒自身复制的情况

乳腺癌细胞系Bcap37、胃癌细胞系SGC-7901和正常细胞系MRC-5以1×10⁶/孔铺于6孔板，培养24小时后，分别加入分别加入MOI＝1的病毒SG500-dNKmut，及对照用空载病毒SG500，非增殖型病毒Ad-dNKmut，野生5型腺病毒WtAd，，感染四种细胞系，感染48h后，分别加入低浓度的核苷酸药物gemcitabine，对照病毒组不加药物处理，作用3天后，6孔板内的细胞收集后，加入蛋白裂解液提取蛋白，Westernblot法检测腺病毒早期转录单位E1A表达量的变化。

结果如图5Westernblot结果所示病毒SG500-dNKmut联合核苷酸药物gemcitabine处理的癌细胞，病毒早期转录单位E1A的表达与其他治疗组相比，下降了1000倍以上，正常细胞内的病毒复制能力下降更为明显，E1A表达量几乎测不出来，安全性得到了控制。

实施例6、病毒SG500-dNKmut与低浓度核苷酸药物配合在裸鼠体内治疗肿瘤细胞移植瘤及对活体内对病毒的抑制作用

将4-5周龄的裸鼠皮下接种乳腺癌细胞系Bcap37，10天后进行动物分组。治疗组分别瘤体原位注射1×10⁹pfu的病毒SG500-dNKmut、Ad-dNKmut、空载体溶瘤病毒SG500，同时腹腔注射低浓度药物ara-T，每天给药一次；对照组为PBS(缓冲液)处理组、单病毒Ad-blank及SG500处理组，每种处理因素8只裸鼠，每天测量瘤体大小，死亡情况，连续观察两个月后，剥离瘤体，做免疫组化观察不同治疗方法下E1A表达变化，即对病毒增殖的抑制作用。

实验结果如图6A所示：肿瘤生长曲线显示SG500-dNKmut治疗效果最好，治疗2个月后，肿瘤细胞移植瘤基本完全消除，治疗效果明显优于溶瘤病毒治疗及药物治疗，生存曲线分析也显示经SG500-dNKmut联合gemcitabine治疗后的裸鼠存活时间最长。免疫组化结果如图6B，E1A于核内表达呈棕色，在SG500、SG500联合gemcitabine、SG500-dNKmut联合gemcitabine、分别治疗2个月后，可以看出SG500-dNKmut联合gemcitabine治疗使E1A弱表达，控制了腺病毒的传播扩散，起到安全保障作用，而其他处理组均无法抑制病毒增殖导致E1A强表达，非增殖型病毒Ad-blank感染为阴性对照。

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Claims (5)

1.一种肿瘤靶向分子化疗基因-病毒制剂SG500-dNKmut，其特征在于，该病毒制剂以E1B55kda基因缺失的5型腺病毒SG500为载体，并携带有分子化疗基因Dm-dNKmut。

2.权利要求1所述的肿瘤靶向分子化疗基因-病毒制剂SG500-dNKmut的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

A、将分子化疗基因Dm-dNKmut克隆进载体质粒的多克隆位点，然后用限制性内切酶切除基因表达框，该表达框包含CMV启动子、分子化疗基因Dm-dNKmut、SV40polyA尾巴，插入肿瘤特异性增殖的腺病毒载体质粒pSG500，构建成质粒pSG500-dNKmut；

B、将得到的质粒pSG500-dNKmut与含有腺病毒骨架DNA的质粒pBHGE3共转染293细胞株，同源重组后扩增，经过氯化铯梯度离心提纯产生，具有感染性的含有分子化疗基因的病毒制剂SG500-dNKmut。

3.根据权利要求2所述的肿瘤靶向分子化疗基因-病毒制剂SG500-dNKmut的构建方法，其特征在于所述CMV启动子也可以用下列特异性启动子中的一种启动子代替：(1)端粒酶逆转录酶启动子；(2)乳腺癌组织特异性启动子；(3)癌胚抗原启动子；(4)前列腺特异性抗原启动子；(5)甲胎蛋白启动子。

4.权利要求1所述的肿瘤靶向分子化疗基因-病毒制剂SG500-dNKmut的用途，其特征在于用于制备治疗实体肿瘤药物。

5.根据权利要求4所述的肿瘤靶向分子化疗基因-病毒制剂SG500-dNKmut的用途，其特征在于所述的治疗实体肿瘤药物是指肿瘤靶向分子化疗基因-病毒制剂SG500-dNKmut与下列化合物之一组成药用组合物：各种化疗药物、生物毒素、免疫抑制化合物、单克隆抗体。

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