CN101820902A - 活的减毒的枝原体菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明提供活的减毒枝原体细菌，其相对于相同物种的野生型枝原体细菌，表现出一种或多种蛋白的降低的表达，所述蛋白选自丙酮酸脱氢酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白L35。还提供了疫苗和疫苗接种方法(其包括使用所述活的减毒枝原体细菌)，以及用于制备活的减毒枝原体细菌的方法。

Description

活的减毒的枝原体菌株
发明的背景技术
发明的技术领域
本发明涉及微生物学和免疫学领域。更具体地，本发明涉及新的抗细菌性病原体的疫苗。
背景技术
枝原体(Mycoplasma)是属于柔膜菌纲(Mollicutes)的小的原核生物(0.2至0.3μm)，柔膜菌纲的成员缺少细胞壁并且具有小基因组。柔膜菌纲包括至少100种枝原体。枝原体的种是人和非人动物以及植物中几种疾病的致病物(causative agent)。
在人类中，例如肺炎枝原体(M.pneumoniae)，是社区获得性肺炎(非肺炎球菌细菌性肺炎)的主要病因。另一种人病原性枝原体，人型枝原体(M.hominis)与男性的泌尿生殖道和女性的上泌尿生殖道的病理状况有关。人型枝原体被认为是非淋球菌尿道炎，尿道前列腺炎(urethroprostatitis)，阴道炎，子宫内膜炎，盆腔炎性疾病，宫颈炎，不孕，产后败血症，妊娠废物(pregnancy wastage)，低出生体重和出生缺陷的病因。其他人病原性枝原体的种包括生殖道枝原体(M.genitalium)(牵涉关节炎，慢性非淋球菌尿道炎，慢性盆腔炎性疾病，其他泌尿生殖器感染，不孕和AIDS/HIV)，发酵枝原体(M.fermentans)(牵涉关节炎，海湾战争综合症，纤维肌痛，慢性疲劳综合症，狼疮，AIDS/HIV，自身免疫疾病，ALS，银屑病和硬皮病，Crohn′s和IBS，癌症，内分泌失调，多发性硬化和糖尿病)，唾液枝原体(M.salivarium)(牵涉关节炎，TMJ障碍，眼和耳的障碍和感染，牙龈炎和牙周病包括龋齿)，未识枝原体(M.incognitus)和穿透枝原体(M.penetrans)(牵涉AIDS/HIV，泌尿生殖器感染和疾病，和自身免疫障碍和疾病)，梨枝原体(M.pirum)(牵涉泌尿生殖器感染和疾病，和AIDS/HIV)，咽喉枝原体(M.faucium)，嗜脂枝原体(M.lipophilum)和颊枝原体(M.buccale)(牵涉龈沟和呼吸道的疾病)。
鸡败血枝原体(M.gallisepticum)和关节液枝原体(M.synoviae)造成家禽中显著的疾病病状。鸡败血枝原体，例如与鸡和火鸡的急性呼吸道疾病有关并且还可以引起猎禽的上呼吸道疾病。另外，鸡败血枝原体已经被认为是北美家雀结膜炎的病因。关于关节液枝原体，家禽被这个物种感染导致体重增加的减少和产蛋量降低。
在猪中，猪肺炎枝原体(M.hyopneumoniae)是枝原体肺炎的病原，导致养猪业显著的经济损失(由于重量增加的减少和低饲料转化效率)。猪被猪肺炎枝原体感染导致慢性咳嗽，无光泽的皮毛，迟滞的生长和不壮实的外观(持续数周)。在受感染的动物中观察到紫色至灰色的实变区的特征性损害，特别是在腹部末端(ventral apical)和心叶中。
牛枝原体(M.bovis)是家养或集中饲养的牛和奶牛中的牛病原体。最经常报告的临床表现是小牛的肺炎，其经常伴随关节炎，又称为肺炎-关节炎综合症。它的病因学作用还与母牛和公牛的乳腺炎，耳炎，和生殖疾病或障碍有关。
用于预防和控制由枝原体感染引起的疾病的有效的策略，是用枝原体细菌的活的减毒菌株进行疫苗接种。通常，活的减毒疫苗的优点包括，将感染剂的所有相关免疫原性决定簇以其天然形式呈递给宿主免疫系统，和需要相对小量的免疫剂(由于所述试剂在被接种的宿主中增殖的能力)。
活的减毒疫苗菌株通常通过在培养基中多次连续传代毒株产生。虽然已经通过连续传代获得抗某些枝原体物种的活的减毒疫苗菌株，但此类菌株通常很少在分子水平上进行表征。据认为，通过连续传代产生的减毒菌株具有累积的突变，其使该微生物具有较少的毒力但仍能够复制。然而关于减毒的枝原体菌株，导致减毒的突变的结果(例如，其表达模式在减毒菌株中发生改变的蛋白质的身份(identity))通常是未知的。
因此，本领域需要新的活的减毒枝原体细菌，其已在蛋白质组水平上进行表征并且在疫苗制剂中是安全而有效的。
发明概述
本发明涉及活的减毒枝原体细菌，其相对于相同物种的野生型枝原体细菌表现出一种或多种蛋白的降低的表达，所述蛋白选自丙酮酸脱氢酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白L35。本发明的活的减毒枝原体细菌可以是任何枝原体物种。在特定的，非限制性示例性实施方案中，本发明提供活的减毒鸡败血枝原体菌株，其相对于野生型鸡败血枝原体细菌，表现出丙酮酸脱氢酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白L35的降低的表达。根据本发明的某些实施方案，本发明的活的减毒枝原体细菌通过蛋白质组分析表征为具有一种或多种上述蛋白的降低的表达。
本发明还提供包含本发明的活的减毒枝原体细菌的疫苗组合物，和给动物接种疫苗以抗枝原体感染的方法。
另外，本发明提供用于制备和/或鉴定减毒枝原体克隆的方法。根据本发明的这一方面，本方法包括使枝原体细菌的初始群体(initialpopulation)经历减毒条件，测定单独的克隆相对于相同物种的野生型枝原体细菌的一种或多种蛋白的降低的表达，所述蛋白选自丙酮酸脱氢酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白L35，以及测试所述克隆的毒力。根据本发明的该方面的方法产生的枝原体克隆将优选表现出至少一种上述蛋白的降低的表达和降低的毒力(相对于相同物种的野生型枝原体细菌)。
附图简述
图1是二维(2-D)聚丙烯酰胺凝胶的照片，其图示减毒的鸡败血枝原体菌株MGx+47的蛋白斑点。编号19，49，74，108，114，127，147，166，175和225的画圈的点对应于在MGx+47中上调(相对于野生型菌株R-980)的蛋白。编号40，68，98，99，130，136和217的画圈的点对应于在MGx+47中下调(相对于野生型菌株R-980)的蛋白。
发明详述
本发明涉及适用于疫苗制剂的活的减毒枝原体细菌。本发明的枝原体细菌表现出一种或多种下述蛋白的降低的表达：丙酮酸脱氢酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和/或核糖体蛋白L35，相对于这些蛋白在相同物种的野生型枝原体细菌中的表达。
枝原体物种
本发明部分基于新的活的减毒鸡败血枝原体疫苗菌株的惊人发现，其通过蛋白质组分析证明具有降低的蛋白水平，所述蛋白例如丙酮酸脱氢酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白L35。(参见本文实施例3)。本发明通过使用鸡败血枝原体的实施例来举例说明；然而，丙酮酸脱氢酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白L35的降低的水平与细菌减毒有关的发现适用于枝原体的所有的种(由于这些蛋白质在枝原体物种中的保守性)。
例如，鸡败血枝原体丙酮酸脱氢酶蛋白(又称为AcoA)的同源物，特别地，在猪肺炎枝原体232，猪肺炎枝原体7448，猪肺炎枝原体J，M.florum，山羊枝原体山羊亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capricolum)，生殖道枝原体，运动枝原体(Mycoplasma mobile)163K，蕈状枝原体蕈状亚种(Mycoplasma mycoides subsp.mycoides)SC，穿透枝原体，肺炎枝原体，肺枝原体(Mycoplasma pulmonis)和关节液枝原体中发现。
鸡败血枝原体的磷酸丙酮酸水合酶蛋白(又称为Eno)的同源物，特别地，在猪肺炎枝原体232，猪肺炎枝原体7448，猪肺炎枝原体J，M.florum，山羊枝原体山羊亚种，生殖道枝原体，运动枝原体163K，蕈状枝原体蕈状亚种SC，穿透枝原体，肺炎枝原体，肺枝原体，关节液枝原体，洋葱黄化植原体(Onion yellows phytoplasma)，解脲尿枝原体(Ureaplasma urealyticum)/微小尿枝原体(Ureaplasmaparvum)和翠菊黄化丛枝植原体(Aster yellows witches-broomphytoplasma)中发现。
鸡败血枝原体的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶蛋白(又称为DERA或DeoC)的同源物，特别地，在猪肺炎枝原体232，猪肺炎枝原体7448，猪肺炎枝原体J，M.florum，山羊枝原体山羊亚种，生殖道枝原体，运动枝原体163K，蕈状枝原体蕈状亚种SC，穿透枝原体，肺炎枝原体，肺枝原体，关节液枝原体，和解脲尿枝原体/微小尿枝原体中发现。
鸡败血枝原体核糖体蛋白L35蛋白(又称为RpmI)的同源物，特别地，在猪肺炎枝原体232，猪肺炎枝原体7448，猪肺炎枝原体J，M.florum，生殖道枝原体，肺炎枝原体和肺枝原体中发现。
上文列出的同源物意欲是举例说明性的而不是穷举的，并且本领域技术人员将认识到，除上文所列的那些之外，枝原体物种中存在鸡败血枝原体AcoA，Eno，DeoC和/或RpmI的另外的同源物。
因为大多数枝原体物种表达某种形式的丙酮酸脱氢酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白L35，并且因为这些蛋白质显然在这些物种中提供同源的功能，因而这些蛋白的减少的表达是减毒枝原体菌株的限定性特征，如通过本文实施例中描述的减毒的鸡败血枝原体菌株例证的。
本发明的减毒枝原体细菌可以是任何枝原体物种。在优选的实施方案中，减毒的细菌来源于动物病原性枝原体细菌。如本文使用的，术语″动物病原性枝原体细菌″指这样的细菌，其野生型，非减毒状态可以感染并且引起动物的疾病和/或病恙(illness)。″动物的疾病和/或病恙″包括动物的不利的身体表现以及仅通过组织学、显微镜和/或分子诊断学指示的疾病或感染的临床症状。
动物病原性枝原体细菌包括人和非人病原性枝原体细菌。人病原性枝原体细菌包括但不限于，例如枝原体属物种生殖道枝原体，发酵枝原体，唾液枝原体，人型枝原体，肺炎枝原体，未识枝原体，穿透枝原体，梨枝原体，咽喉枝原体，嗜脂枝原体和颊枝原体的细菌。非人病原性枝原体细菌包括例如鸟，猪，绵羊，牛，山羊或犬病原性枝原体细菌。鸟病原性枝原体细菌包括但不限于，例如枝原体属物种阴沟枝原体(M.cloacale)，鸡枝原体(M.gallinarum)，鸡败血枝原体，火鸡枝原体(M.gallopavonis)，噬乙二醇枝原体(M.glycophilum)，不活跃枝原体(M.iners)，衣阿华枝原体(M.iowae)，生脂枝原体(M.lipofaciens)，火鸡枝原体(M.meleagridis)和关节液枝原体的细菌。猪病原性枝原体细菌包括但不限于，例如枝原体属物种絮状枝原体(M.flocculare)，猪肺炎枝原体，猪鼻枝原体(M.hyorhinis)和猪关节液枝原体(M.hyosynoviae)的细菌。绵羊，牛，山羊或犬病原性枝原体细菌包括但不限于，例如枝原体属物种山羊枝原体山羊亚种，山羊枝原体山羊肺亚种(M.capricolum subsp.capripneumoniae)，蕈状枝原体蕈状亚种LC，蕈状枝原体山羊亚种(M.mycoides subsp.capri)，牛枝原体，牛眼枝原体(M.bovoculi)，犬枝原体(M.canis)，加利福尼亚枝原体(M.californicum)和殊异枝原体(M.dispar)的细菌。
枝原体蛋白的降低的表达
本领域普通技术人员使用常规分子生物学技术能够确定减毒的枝原体细菌是否表现出一种或多种蛋白的降低的表达，所述蛋白在野生型枝原体细菌细胞中正常表达。可以通过本领域已知的几种方法确定减毒细菌是否相对于野生型细菌表现出特定的蛋白(例如丙酮酸脱氢酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶，核糖体蛋白L35等)的降低的表达。示例性的方法包括，例如定量的基于抗体的方法，例如蛋白质印迹法，放射免疫测定(RIA)和酶联免疫吸附测定(ELISA)，其中使用检测并且结合目的蛋白的抗体。另外，因为信使RNA(mRNA)水平通常反映其编码的蛋白的量，所以也可以使用定量的基于核酸的方法以确定减毒的枝原体细菌是否表现出一种或多种蛋白的降低的表达。例如，可以使用定量的逆转录酶/聚合酶链式反应(RT-PCR)方法以测量对应于特定目的蛋白的mRNA的量。很多定量的基于核酸的方法是本领域公知的。
下述是非限定性示例性方法，其能够用于确定减毒的枝原体细菌是否表现出例如磷酸丙酮酸水合酶的降低的表达。为了该示例性方法，假定枝原体细菌是鸡败血枝原体细菌，然而，本领域普通技术人员将理解，该示例性方法同样可以应用于枝原体属的所有物种并且可用于评估任何枝原体蛋白的相对表达。
首先，减毒的鸡败血枝原体细胞群和野生型鸡败血枝原体细胞群在基本上相同的条件下在基本上相同的培养基中培养。然后，两个细胞群经历细胞破碎条件。破碎的细胞(或其包含蛋白的级分)平行地经历SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并且经历蛋白质印迹法(其使用与鸡败血枝原体磷酸丙酮酸水合酶蛋白结合的抗体(此类抗体可以用本领域公知的标准方法获得))。然后使用标记的二抗以提供可测量的信号，所述信号与来源于所述细胞的蛋白的量成正比。如果由减毒的鸡败血枝原体菌株表现的信号的量小于由野生型鸡败血枝原体菌株表现的信号的量，则可以推断，减毒菌株相对于野生型菌株表现出降低的磷酸丙酮酸水合酶的表达。该示例性方法的变体和其替代物对本领域的普通技术人员来说是显而易见的。
本发明包括减毒的枝原体细菌，其表现出蛋白(例如丙酮酸脱氢酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶，核糖体蛋白L35等)表达的任何程度的减少(与野生型菌株中观察到的该蛋白的表达相比)。在某些实施方案中，相对于野生型细菌，减毒的细菌表现出蛋白表达减少至少约5％。例如，如果给定量的野生型枝原体菌株表现出100单位的特定蛋白的表达并且相同量的相同物种的候选减毒枝原体菌株表现出95单位的所述蛋白的表达，则推断，相对于野生型细菌，所述减毒菌株表现出所述蛋白表达减少5％(计算″表达减少的百分比″的其他实例在本文的其他地方阐明)。在某些其他的实施方案中，相对于野生型枝原体细菌，减毒的细菌表现出所述蛋白的表达减少至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在其他的实施方案中，相对于野生型枝原体细菌，减毒的枝原体菌株表现出不表达所述蛋白(即表达减少100％)。
在本发明的某些示例性实施方案中，相对于相同物种的野生型枝原体细菌，减毒的细菌表现出一种或多种蛋白的表达减少至少5％，所述蛋白选自丙酮酸脱氢酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白L35。
如本文所用的，由减毒的枝原体菌株表现的特定蛋白的″表达减少的百分比″(相对于野生型菌株)通过下式计算：(A-B)/Ax100；其中A＝野生型枝原体菌株中所述蛋白的表达的相对水平；并且B＝减毒菌株中所述蛋白的表达的相对水平。仅仅用于举例说明，如果野生型枝原体菌株表现出0.2500单位的蛋白″Y″的表达，并且枝原体减毒菌株表现出0.1850单位的蛋白″Y″的表达，则所述减毒菌株称为相对于野生型菌株，表现出蛋白″Y″的表达减少[(0.2500-0.1850)/0.2500×100]＝26％。本文实施例3中的表5提供计算示例性鸡败血枝原体减毒菌株相对于野生型鸡败血枝原体菌株的表达减少的百分比的另外的说明性实例。
疫苗组合物
本发明还包括疫苗组合物，所述疫苗组合物包含本发明的活的减毒枝原体细菌和药学上可接受的载体。如本文所用的，表达″本发明的活的减毒枝原体细菌″包括任何活的减毒枝原体细菌，其在本文其它地方描述和/或要求保护。药学上可接受的载体可以是例如水，稳定剂，防腐剂，培养基或缓冲剂。包含本发明的减毒的枝原体细菌的疫苗制剂可以以悬浮液形式或冻干形式或可选地以冷冻形式配制。如果是冷冻的，则可以添加甘油或其他相似的试剂以在冷冻时增强稳定性。
给动物接种疫苗的方法
本发明还包括给动物接种疫苗以抗枝原体感染的方法。根据本发明的这一方面的方法包括对动物施用免疫有效量的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含本发明的活的减毒枝原体细菌。如本文所用的，表达″本发明的活的减毒枝原体细菌″包括任何活的减毒枝原体细菌，其在本文其它地方描述和/或要求保护。表述″免疫有效量″指接种时引起动物中产生保护水平的抗体所需要的疫苗组合物的量。疫苗组合物可以以本领域已知的任何方式施用给动物，包括口服，鼻内，粘膜，局部，透皮，和胃肠外(例如静脉内，腹膜内，皮内，皮下或肌内)途径。还可以用无针递送装置进行施用。可以用组合途径进行施用，例如首先用胃肠外途径施用，随后用粘膜途径施用等。
在其中活的减毒枝原体细菌是鸟病原性枝原体细菌例如鸡败血枝原体细菌的本发明的实施方案中，对其施用所述减毒细菌的动物优选是鸟类，例如鸡或火鸡。当所述动物是鸟类时，可以施用本发明的疫苗制剂以使制剂立即或最终与鸟类的呼吸粘膜接触。因此，疫苗制剂可以例如鼻内，口服和/或眼内施用给鸟类。用于鸟施用的疫苗组合物可以如上所述进行配制和/或配制为适于通过喷雾施用的形式，包括气溶胶(用于鼻内施用)或在饮用水中(用于口服施用)。
通过将活的减毒枝原体细菌掺入小的液体颗粒中来配制本发明的通过喷雾或气溶胶施用的疫苗组合物。所述颗粒可以具有约10μm至约100μm的初始液滴大小。可以通过例如常规喷雾器和气溶胶发生器，包括商业可获得的用于背负式喷雾，孵化场喷雾和原子喷雾(atomist spray)的喷雾发生器来产生这样的颗粒。
用于制备减毒枝原体克隆的方法
在本发明的另一个方面，本发明提供用于鉴定和/或制备减毒枝原体克隆的方法。根据本发明的这一方面的方法包括使枝原体细菌的初始群体经历减毒条件，从而产生推定减毒的细菌群体。然后，测定推定减毒的细菌群体的单独的克隆相对于相同物种的野生型枝原体细菌的一种或多种蛋白的降低的表达，所述蛋白选自丙酮酸脱氢酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶，核糖体蛋白L35。然后测试被鉴定为具有一种或多种上述蛋白的降低的表达的克隆的毒力。表现出一种或多种上述蛋白的降低的表达和降低的毒力(相对于相同物种的野生型枝原体细菌)的克隆被鉴定为减毒枝原体克隆。
根据本发明的这一方面，″枝原体细菌的初始群体″可以是任何量的枝原体细菌。在某些实施方案中，细菌是野生型细菌。可选地，细菌可以包含一个或多个突变。然而，优选地，初始群体中的细菌是克隆同一的(clonally identical)或基本上克隆同一的；即细菌优选全部来源于单个亲本枝原体细菌细胞和/或具有相同的或基本上相同的基因型和/或表型特征。
如本文所用的，术语″减毒条件″指具有将一个或多个遗传改变(例如核苷酸突变)引入枝原体细菌基因组的潜力的任何条件或条件的组合。示例性非限定性减毒条件包括例如在培养物中传代细菌，用可插入基因组的基因元件例如转座子(例如随机插入枝原体基因组的转座子)转化细菌，将细菌暴露于一种或多种诱变剂(例如化学诱变剂或紫外线)等。当通过体外传代减毒细菌细胞时，细胞可以体外传代任意次，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40或更多次。
在经历减毒条件后，枝原体细胞的初始群体在本文称为推定减毒的细菌群体。可以通过标准微生物学技术(包括例如连续稀释细胞并且挑出单个细胞接种到适当的培养基上)来获得推定减毒的细菌群体的单独的克隆。在获得后，就一种或多种指定蛋白的降低的表达测定推定减毒的细菌群体的单独的克隆。用于确定减毒枝原体细菌是否表现出一种或多种蛋白的降低的表达的方法在本文其它地方描述，所述的蛋白在野生型枝原体细菌细胞中正常表达。示例性方法包括例如基于RT-PCR的方法，蛋白质印迹等。
可以通过将克隆施用给对野生型(未减毒的)细菌的感染易感的动物来测试鉴定为具有一种或多种蛋白(例如丙酮酸脱氢酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶，核糖体蛋白L35)的降低的表达的单独的克隆的毒力。如本文所用的，″对野生型枝原体细菌的感染易感的动物″是用野生型枝原体细菌攻击后展示至少一种临床症状的动物。所述症状是本领域普通技术人员已知的。例如，在表现出降低的例如丙酮酸脱氢酶的表达的推定减毒的鸡败血枝原体菌株的情况下，所述菌株可以施用给例如火鸡或鸡(其通常对野生型鸡败血枝原体的感染易感)。家禽动物的鸡败血枝原体感染的临床症状包括，例如急性呼吸症状，心包炎，肝周炎，肺泡炎(air sacculitis)，气管增厚，减少的体重增加，纤毛脱落(deciliation)，异常杯状细胞，毛细管扩张，淋巴细胞、浆细胞和/或异嗜白细胞的数量增加，和在某些情况下产蛋量降低。因此，如果推定减毒的鸡败血枝原体菌株施用给鸡或火鸡时导致与感染野生型鸡败血枝原体菌株的火鸡或鸡相比，较少和/或较不严重的症状，则推定减毒的鸡败血枝原体菌株被认为具有″降低的毒力″。任何程度的症状的减轻将推定减毒的菌株鉴定为具有降低的毒力。在某些实施方案中，推定减毒的菌株是无毒力的。
根据本发明，表现出一种或多种蛋白的降低的表达且表现出降低的毒力(相对于相同物种的野生型枝原体细菌)的枝原体克隆是减毒枝原体克隆，所述蛋白选自丙酮酸脱氢酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白L35。
下列实施例举例说明而非限定本发明的方法和组合物。通常在分子生物学和化学中遇到的条件和参数的种种其他适当的改变和修改(鉴于本公开内容，其对本领域技术人员来说是显而易见的)，在本发明的精神和范围内。
实施例
实施例1
活的减毒鸡败血枝原体菌株的产生
通过体外传代野生型鸡败血枝原体菌株R980多次来产生新的活的减毒鸡败血枝原体菌株。特别地，将0.1mL野生型鸡败血枝原体菌株R-980的种子材料接种到20mL改良的Frey′s培养基中(Frey等，Am.J.Vet.Res.29：2163-2171(1968)(本文中也称为″MG培养基″)。培养野生型细胞直到培养基的颜色变为亮黄色。随后，亮黄色的培养物用于再接种如上所述的新鲜MG培养基。以这种方式总共传代培养物47次。通过给多组鸟接种疫苗然后用野生型鸡败血枝原体攻击，就减毒测试所得到的菌株。攻击两周后尸检(necropsized)所有的鸟，观察到枝原体相关病理。高传代的菌株(x+47)提供抗与鸡败血枝原体感染相关的临床症状的保护。命名为MGx+47的减毒鸡败血枝原体菌株(也称为″MG-P48″)于2007年6月19日保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108并且赋予登录号PTA-8485。
实施例2
活的减毒鸡败血枝原体疫苗在鸡中的安全性和功效的评估
在本实施例中，在鸡中评估实施例1中获得的新的鸡败血枝原体疫苗菌株MGx+47的安全性和功效。
71只SPF白色来亨鸡(leghorn chicken)被分成如下七组：
表1：研究设计
  组   #鸡   疫苗接种   攻击
  1   11   否   是
  2   10   是   否
  3   11   是   是
  4a   10   是   否
  组   #鸡   疫苗接种   攻击
  4b   11   是   否
  4c   9   是   否
  5   9   否   否
以3.62×107CCU/mL/只用减毒菌株MGx+47接种组2，3，4a，4b和4c中的鸡，通过在4周龄时粗喷施用。以7.74×105CCU/mL用0.5mL鸡败血枝原体菌株R气管内(IT)攻击7周龄的组1和3中的鸡。在9周龄时尸检组1，2，3和5中的鸡，并且分别在疫苗接种后第7，14和21天(DPV)尸检组4a，4b和4c的鸡。就平均体重增加，心包炎，肝周炎，肺泡炎和气管炎对鸡进行评估。结果在表2中概括。
表2：安全性和功效概要
疫苗接种＝3.62×107CFU/mL/只
攻击＝0.5mL(以7.74×105CFU/mL)
组 疫苗接种 攻击   平均体重增加(kg/天) 心包炎 肝周炎 肺泡炎  肺泡炎评分(阳性平均值) 气管(组织学)
  1   否   是   0.016   0/11   0/11   9/11   3.56   严重的气管炎
  2   是   否   0.018   0/10   0/10   0/10   0   正常
  3   是   是   0.017   0/11   0/11   2/11   2.5   混合的气管炎
  4a   是   否   0.016   0/9   0/9   0/9   0   正常
  4b   是   否   0.017   0/11   0/11   0/11   0   正常
  4c   是   否   0.017   0/10   0/10   0/10   0   正常
  5   否   否   0.015   0/9   0/9   0/9   0   正常
表3：安全性表：福尔马林固定的来自单独的疫苗接种/未攻击的鸡(组4a，4b和4c)的鸡气管的组织学报告
Figure GPA00001096821100131
Figure GPA00001096821100141
表4：功效表：福尔马林固定的来自单独的鸡的鸡气管的组织学报告
Figure GPA00001096821100142
Figure GPA00001096821100151
安全性和功效表(表3和4)的关键词：
●所有″接种疫苗的″鸟以3.62×107CCU/mL/只用疫苗菌株MGx+47通过粗喷接种疫苗；
●所有″被攻击的″鸟以7.74×105CCU/mL用0.5mL鸡败血枝原体菌株R进行气管内(IT)攻击。
●时间点(在表3：安全性表中)＝鸡被检查时的疫苗接种后的天数，表示为疫苗接种后#天(DPV)。
●纤毛：″N ″＝正常纤毛；″-″＝纤毛脱落；
●杯状细胞/M(″-″＝正常杯状细胞；″+″＝粘液处于呼吸面上)；
●毛细管扩张(″-″＝没有扩张或炎症；″+″＝中度的毛细管扩张或炎症；″++″＝严重的毛细管扩张或炎症)；
●LC/PC＝淋巴细胞和浆细胞(″-″＝没有；″+″＝几乎没有；
″++++″＝很多)；
●PMN＝异嗜白细胞(″-″＝没有；″+″＝几乎没有；″++++″-很多)；
组2的鸡(接种疫苗但未被攻击)的组织学分析与组5的鸡(未接种疫苗且未被攻击)的组织学分析基本上相似，表明新产生的MGx+47疫苗菌株的安全性。(参见例如上文表2)。
关于功效，组3的鸡(接种疫苗并被攻击)展示与组1的鸡(未接种疫苗但被攻击)相比显著降低的肺泡炎。(参见例如表2和4)。另外，如表4中举例说明的，组3的鸡表现出更少的关于纤毛，杯状细胞，毛细管扩张，淋巴细胞和浆细胞(LC/PC)，异嗜白细胞(PMN)和气管厚度的鸡败血枝原体感染的组织学症状(参见表4)。
因此，本实施例证明MGx+47是安全的并且有效的活的减毒鸡败血枝原体疫苗菌株。
实施例3
MGX+47疫苗菌株的蛋白质组特征
为了更精确地在分子水平上定义MGx+47疫苗菌株(参见实施例1和2)，对该菌株进行蛋白质组分析。
在本实施例中，从野生型鸡败血枝原体菌株R-980和新鉴定的疫苗菌株MGx+47中分离总蛋白。通过2维聚丙烯酰胺凝胶电泳然后通过计算机分析凝胶图像而分辨来自各个菌株的蛋白。(参见图1)。鉴定在疫苗菌株中差异表达的蛋白斑点。从凝胶中切除与野生型菌株相比在疫苗菌株中不存在的或以显著降低的水平表达的蛋白斑点。
鉴定出5个点，其与野生型鸡败血枝原体相比在MGx+47疫苗菌株中以显著更低的水平表达。从凝胶切除各个所述蛋白斑点并进行酶促消化。然后用基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱分析(MALDI-TOFMS)得到肽质谱指纹。将各个蛋白斑点的鉴定的质谱与肽质量数据库进行比较以鉴定所述蛋白和编码它们的相应基因。该分析的结果在下表中概括：
表5：MGx+47的蛋白质组分析的概要：
基因 产物 功能   野生型MG中的表达水平   MGx+47中的表达水平   表达减少的百分比
acoA 丙酮酸脱氢酶   能量产生和转化(Kreb′s循环)所必需的 0.1872 0.0858 54.2％
eno   磷酸丙酮酸水合酶   催化磷酸烯醇丙酮酸的形成 0.0683 0.0173 74.7％
deoC   2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶   核苷酸代谢所必需的 0.0525 0.0309 41.1％
rpmI 核糖体蛋白L35   翻译，核糖体结构和生物发生 0.1171 0.0259 77.9％
  MGA_0621   假定蛋白   未知   0.4534   0.0835   81.6％
基因产物表达的减少还可以表示为″表达的倍数减少″。例如，在表5中，菌株MGx+47可以被称为表现出acoA，eno，deoC，rpmI和MGA_0621的表达分别减少2.2，3.9，1.7，4.5和5.4倍(相对于野生型MG)。
如表5中指出的，鉴定出5种基因产物，其在活的减毒MGx+47疫苗菌株中与野生型R-980菌株相比具有显著降低的表达：AcoA，Eno，DeoC，RmpI和MGA_0621(鉴定的假定蛋白，NCBI登录号NP_852784)。重要的是，这些基因中的三种(acoA，eno和deoC)编码参与代谢/能量产生途径的蛋白。另外，在大多数枝原体物种中发现了AcoA，Eno，DeoC和RpmI的同源物，有力地表明一种或多种这些基因产物的下调可能是使枝原体减毒的一般策略。
***
虽然为了清楚地理解，前述发明已经通过举例说明和实施例进行了相当详细的描述，但本发明不限于所公开的特定实施方案，而意欲覆盖在本发明的精神和范围(如通过所附权利要求书所定义的)内的所有的变化和修饰。
在本说明书中提到的所有出版物和专利表明了本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有的出版物和专利通过引用并入本文，如同每一个单独的出版物或专利申请明确且单独地被指明通过引用并入。

Claims (47)

1.活的减毒枝原体细菌，其相对于相同物种的野生型枝原体细菌，表现出一种或多种蛋白的降低的表达，所述蛋白选自丙酮酸脱氢酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白L35。
2.权利要求1的细菌，其中所述细菌来源于动物病原性枝原体细菌。
3.权利要求2的细菌，其中所述动物病原性枝原体细菌是人病原性枝原体细菌。
4.权利要求3的细菌，其中所述人病原性枝原体细菌是选自生殖道枝原体(M.genitalium)，发酵枝原体(M.fermentans)，唾液枝原体(M.salivarium)，人型枝原体(M.hominis)，肺炎枝原体(M.pneumonia)，未识枝原体(M.incognitus)，穿透枝原体(M.penetrans)，梨枝原体(M.pirum)，咽喉枝原体(M.faucium)，嗜脂枝原体(M.lipophilum)和颊枝原体(M.buccale)的物种的细菌。
5.权利要求1的细菌，其中所述细菌来源于非人病原性枝原体细菌。
6.权利要求5的细菌，其中所述非人病原性细菌是鸟病原性枝原体细菌。
7.权利要求6的细菌，其中所述鸟病原性枝原体细菌是选自阴沟枝原体(M.cloacale)，鸡枝原体(M.gallinarum)，鸡败血枝原体(M.gallisepticum)，火鸡枝原体(M.gallopavonis)，噬乙二醇枝原体(M.glycophilum)，不活跃枝原体(M.iners)，衣阿华枝原体(M.iowae)，生脂枝原体(M.lipofaciens)，火鸡枝原体(M.meleagridis)和关节液枝原体(M.synoviae)的物种的细菌。
8.权利要求5的细菌，其中所述非人病原性细菌是猪病原性枝原体细菌。
9.权利要求8的细菌，其中所述猪病原性枝原体细菌是选自絮状枝原体(M.flocculare)，猪肺炎枝原体(M.hyopneumoniae)，猪鼻枝原体(M.hyorhinis)和猪关节液枝原体(M.hyosynoviae)的物种的细菌。
10.权利要求5的细菌，其中所述非人病原性细菌是绵羊，牛，山羊或犬病原性枝原体细菌。
11.权利要求10的细菌，其中所述绵羊，牛，山羊或犬病原性枝原体细菌是选自山羊枝原体山羊亚种(M.capricolum subsp.capricolum)，山羊枝原体山羊肺亚种(M.capricolum subsp.capripneumoniae)，蕈状枝原体蕈状亚种(M.mycoides subsp.mycoides)LC，蕈状枝原体山羊亚种(M.mycoides subsp.capri)，牛枝原体(M.bovis)，牛眼枝原体(M.bovoculi)，犬枝原体(M.canis)，加利福尼亚枝原体(M.californicum)和殊异枝原体(M.dispar)的物种的细菌。
12.权利要求1的细菌，其中所述细菌相对于所述野生型细菌表现出所述一种或多种蛋白的表达减少至少25％。
13.权利要求2的细菌，其中所述细菌相对于所述野生型细菌表现出所述一种或多种蛋白的表达减少至少50％。
14.权利要求3的细菌，其中所述细菌相对于所述野生型细菌表现出所述一种或多种蛋白的表达减少至少75％。
15.权利要求1的细菌，其中所述细菌表现出降低的丙酮酸脱氢酶的表达。
16.权利要求1的细菌，其中所述细菌表现出降低的磷酸丙酮酸水合酶的表达。
17.权利要求1的细菌，其中所述细菌表现出降低的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶的表达。
18.权利要求1的细菌，其中所述细菌表现出降低的核糖体蛋白L35的表达。
19.权利要求1的细菌，其中所述细菌表现出丙酮酸脱氢酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白L35的降低的表达。
20.疫苗组合物，其包含：
(a)活的减毒枝原体细菌，其相对于相同物种的野生型枝原体细菌，表现出一种或多种蛋白的降低的表达，所述蛋白选自丙酮酸脱氢酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白L35；和
(b)药学上可接受的载体。
21.权利要求20的疫苗组合物，其中相对于所述野生型细菌，所述细菌表现出所述一种或多种蛋白的表达减少至少25％。
22.权利要求21的疫苗组合物，其中相对于所述野生型细菌，所述细菌表现出所述一种或多种蛋白的表达减少至少50％。
23.权利要求22的疫苗组合物，其中相对于所述野生型细菌，所述细菌表现出所述一种或多种蛋白的表达减少至少75％。
24.权利要求20的疫苗组合物，其中所述细菌表现出降低的丙酮酸脱氢酶的表达。
25.权利要求20的疫苗组合物，其中所述细菌表现出降低的磷酸丙酮酸水合酶的表达。
26.权利要求20的疫苗组合物，其中所述细菌表现出降低的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶的表达。
27.权利要求20的疫苗组合物，其中所述细菌表现出降低的核糖体蛋白L35的表达。
28.权利要求20的疫苗组合物，其中所述细菌表现出丙酮酸脱氢酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白L35的降低的表达。
29.一种给动物接种疫苗以抗枝原体感染的方法，所述方法包括给动物施用免疫有效量的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含活的减毒枝原体细菌，所述枝原体细菌相对于相同物种的野生型枝原体细菌具有降低的一种或多种蛋白的表达，所述蛋白选自丙酮酸脱氢酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白L35。
30.权利要求29的方法，其中相对于所述野生型细菌，所述细菌表现出所述一种或多种蛋白的表达减少至少25％。
31.权利要求30的方法，其中相对于所述野生型细菌，所述细菌表现出所述一种或多种蛋白的表达减少至少50％。
32.权利要求31的方法，其中相对于所述野生型细菌，所述细菌表现出所述一种或多种蛋白的表达减少至少75％。
33.权利要求29的方法，其中所述细菌表现出降低的丙酮酸脱氢酶的表达。
34.权利要求29的方法，其中所述细菌表现出降低的磷酸丙酮酸水合酶的表达。
35.权利要求29的方法，其中所述细菌表现出降低的2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶的表达。
36.权利要求29的方法，其中所述细菌表现出降低的核糖体蛋白L35的表达。
37.权利要求29的方法，其中所述细菌表现出丙酮酸脱氢酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白L35的降低的表达。
38.一种用于鉴定减毒的枝原体克隆的方法，所述方法包括：
(a)使枝原体细菌的初始群体经历减毒条件，从而产生推定减毒的细菌群体；和
(b)测定所述推定减毒的细菌群体的单独的克隆相对于相同物种的野生型枝原体细菌的一种或多种蛋白的降低的表达，所述蛋白选自丙酮酸脱氢酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脱氧核糖-5-磷酸醛缩酶和核糖体蛋白L35；和
(c)测试在(b)中鉴定为具有降低的所述一种或多种蛋白的表达的克隆的毒力；
其中相对于相同物种的野生型枝原体细菌表现出降低的所述一种或多种蛋白的表达和降低的毒力的枝原体克隆是减毒的枝原体克隆。
39.权利要求38的方法，其中(a)所述的减毒条件包括在体外传代所述枝原体细菌的初始群体至少2次。
40.权利要求39的方法，其中(a)所述的减毒条件包括在体外传代所述枝原体细菌的初始群体至少5次。
41.权利要求40的方法，其中(a)所述的减毒条件包括在体外传代所述枝原体细菌的初始群体至少10次。
42.权利要求38的方法，其中(a)所述的减毒条件包括用随机插入枝原体基因组的转座子转化所述枝原体细菌的初始群体。
43.权利要求38的方法，其中(a)所述的减毒条件包括将所述枝原体细菌的初始群体暴露于化学诱变剂或紫外线。
44.权利要求38的方法，其中在(b)中通过逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)就所述一种或多种蛋白的降低的表达测定所述推定减毒的细菌群体的所述单独的克隆。
45.权利要求38的方法，其中在(b)中通过蛋白质印迹法就所述一种或多种蛋白的降低的表达测定所述推定减毒的细菌群体的所述单独的克隆。
46.权利要求38的方法，其中在(c)中通过下述测试(b)中鉴定的所述克隆的毒力：将一种或多种所述克隆施用给对所述野生型枝原体细菌的感染易感的动物，并且在施用所述一种或多种克隆后将在所述动物中观察到的临床症状与未施用所述克隆的对照动物的临床症状进行比较。
47.权利要求29的方法，其中所述疫苗组合物通过直接注射，喷雾施用或饮用水施用施用给所述动物。
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