CN101820897A - 神经退行性疾病的细胞质苹果酸脱氢酶(mdh1)靶向治疗 - Google Patents

神经退行性疾病的细胞质苹果酸脱氢酶(mdh1)靶向治疗 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于治疗包括ALS的神经退行性疾病的组合物，所述神经退行性疾病涉及胞质苹果酸脱氢酶与某些引起神经退行性疾病的蛋白形成复合物，所述组合物包含能够减少苹果酸脱氢酶蛋白与构象改变的或突变的蛋白之间的相互作用，所述构象改变的或突变的蛋白与神经退行性病症相关，包括突变的SOD1蛋白。本发明还提供了鉴定物质的方法以及治疗神经退行性病症的方法，所述物质能够治疗包括ALS的这类病症，所述鉴定物质的方法包括对物质破坏或阻止苹果酸脱氢酶与构象改变的或突变的蛋白形成复合物(包括MDH-突变的SOD1复合物)的能力进行测验，所述构象改变的或突变的蛋白与神经退行性病症相关。

Description

神经退行性疾病的细胞质苹果酸脱氢酶(MDH1)靶向治疗
发明领域
本发明涉及在神经退行性病症的治疗及其筛选方法中有用的能够阻止细胞质苹果酸脱氢酶与引起疾病的蛋白之间相互作用的物质，包括肽和小分子。
背景
肌萎缩性侧索硬化症(ALS)是一种成人发病的、致死性的运动神经元神经退行性疾病。不完全了解导致ALS中运动神经元损伤和细胞死亡的分子途径。在大约3％的ALS病例中，所述疾病是由编码人铜锌超氧化物歧化酶(hSOD1)基因的基因突变引起的。已经在家族型ALS中识别出hSOD1基因中超过90种的ALS相关突变。这些表明ALS的原因是毒性的功能获得而不是催化的hSOD1活性的丧失，但是还没有确定毒性的本质。线粒体异常和活性氧类别(ROS)的过量产生已经在表达突变体G93A-hSOD1(此类突变的一个实例)的细胞中反复得到证明(1-4)。这些变化反映了在ALS患者中观察到的线粒体电子传递链(ETC)活性的改变(3，5，6)。
苹果酸脱氢酶(MDH，L-苹果酸：NAD氧化还原酶，IUBMB酶命名法EC 1.1.1.37)在线粒体呼吸中起重要作用。具体而言，它们在细胞质(cytMDH)和线粒体(MitMDH)中催化苹果酸和草酰乙酸的NAD/NADH依赖性互变。这个反应在跨越线粒体膜的细胞质之间的苹果酸/天冬氨酸穿梭中和在线粒体基质内的三羧酸循环中起关键作用。
之前的研究已经指出在其他的神经退行性病症例如阿尔茨海默病(AD)中的正常或增多的苹果酸脱氢酶(MDH)活性[Butterworth和Besnard，Metab Brain Dis 1990：5；179-184，Miulli等人.J Am Osteopath Assoc 1993：93；670-676，den Velde和Stam，J Am Geriatr Soc 1976：24；12-16，She等人.AnnNeurol 1985：17；444-449]。Korolainen等人[Neurobiol Aging.2006：27；42-53]公开了在AD脑中线粒体谷氨酸脱氢酶和胞质苹果酸脱氢酶的量增加。此外，Korolainen教导这两种酶与对照相比在AD脑中展示出显著降低的氧化程度。[Korolainen等人.Neurobiol Aging.2006：27；42-53]。
迄今为止，MDH在神经退行性疾病的病因学中的作用还没有被描述。然而，MDH活性的改变被认为是神经退行性变的结果而不是原因。例如，Ferraiuolo等人[Journal ofNeuroscience，2007，27(34)：9201-9219]教导，在无数的上调基因当中，苹果酸脱氢酶在ALS期间也被上调，如通过微阵列分析所检测的那样。以上参考文献都没有公开或暗示带有引起神经退行性疾病的蛋白的MDH复合物的存在或者其作为ALS或任何神经退行性疾病的治疗靶的有用性。
发明概述
本发明提供了在受治疗者中治疗ALS和神经退行性病症的组合物和方法，包括能够减少或抑制在苹果酸脱氢酶(MDH)蛋白与引起神经退行性疾病的蛋白例如SOD1突变蛋白之间的相互作用的物质。本发明还提供了鉴定能够治疗ALS的物质的方法，包括测验候选物质破坏或阻止苹果酸脱氢酶与构象改变的或突变的引起神经退行性疾病的蛋白形成复合物的能力。
本发明部分地基于未预料的发现：一种细胞质酶苹果酸脱氢酶与神经退行性过程相关的特定突变蛋白形成复合物。包含与MDH1竞争相互作用位点的相互作用基序的特定的MDH1衍生肽例证了本发明。
一方面，本发明提供了在需要它的受治疗者中治疗ALS的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用治疗有效量的能够降低苹果酸脱氢酶与SOD1蛋白之间的相互作用的物质，由此治疗ALS。在一个实施方案中，靶SOD1蛋白是一种突变的SOD1蛋白。在另一个实施方案中，所述突变的SOD1蛋白与肌萎缩性侧索硬化症(ALS)相关。在另一个实施方案中，所述物质是肽。在一个具体的实施方案中，所述物质是从MDH蛋白序列衍生的肽。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
在另一方面，本发明提供了一种治疗神经退行性病症的方法，所述方法包括向需要它的个体施用治疗有效量的能够增加脑线粒体呼吸的物质，由此治疗所述神经退行性病症，条件是所述物质不是丙酮酸或草酰乙酸。在一个实施方案中，所述物质能够在需要它的受治疗者中增加细胞质苹果酸脱氢酶活性。在另一个实施方案中，所述物质能够在需要它的受治疗者中增加细胞质的苹果酸水平。在另一个实施方案中，所述物质是肽物质。在另一个实施方案中，所述肽物质包含人苹果酸脱氢酶的至少4-7个连续的氨基酸。在另一个实施方案中，所述肽物质包含人苹果酸脱氢酶的至少8-18个连续的氨基酸。在另一个实施方案中，所述物质包含SEQ ID NO：1中所列出的序列，所述序列对应于cytMDH蛋白的氨基酸217-239：SWLKGEFITTVOQRGAAVIKARK(SEQ ID NO：1)。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
本发明的方法和组合物的物质在某些实施方案中是肽。在一些实施方案中，所述肽包括苹果酸脱氢酶蛋白的片段。在另一个实施方案中，所述苹果酸脱氢酶蛋白是一种胞质苹果酸脱氢酶蛋白(cytMDH)。在另一个实施方案中，所述苹果酸脱氢酶蛋白是一种cytMDH苹果酸脱氢酶蛋白同种型。在另一个实施方案中，所述苹果酸脱氢酶蛋白是一种人苹果酸脱氢酶蛋白。在另一个实施方案中，所述苹果酸脱氢酶蛋白是一种人cytMDH蛋白同种型。在另一个实施方案中，所述苹果酸脱氢酶是本领域已知的任何其他的苹果酸脱氢酶。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
在另一个实施方案中，本发明提供了长度为19-50个氨基酸的G93A-hSOD1的片段，所述肽包括SEQ ID NO：1中列出的序列。在另一个实施方案中，所述G93A-hSOD1片段的长度为19-45个氨基酸。在另一个实施方案中，所述G93A-hSOD1片段的长度为19-40个氨基酸。在另一个实施方案中，所述G93A-hSOD1片段的长度为19-35个氨基酸。在另一个实施方案中，所述G93A-hSOD1片段的长度为19-30个氨基酸。在另一个实施方案中，所述G93A-hSOD1片段的长度为19-25个氨基酸。在另一个实施方案中，所述G93A-hSOD1片段的长度为25-45个氨基酸。在另一个实施方案中，所述G93A-hSOD1片段的长度为25-40个氨基酸。在另一个实施方案中，所述G93A-hSOD1片段的长度为25-35个氨基酸。在另一个实施方案中，所述G93A-hSOD1片段的长度为25-30个氨基酸。在另一个实施方案中，本发明的一种肽具有SEQ ID NO：1中列出的序列。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和作为活性成分的能够阻止苹果酸脱氢酶与突变的SOD1蛋白之间相互作用的肽物质，其中所述突变的SOD1蛋白与肌萎缩性侧索硬化症(ALS)相关。
在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定能够治疗ALS的物质的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将所述物质与苹果酸脱氢酶蛋白和突变的SOD1蛋白的复合物的制品相接触，其中所述突变的SOD1蛋白与肌萎缩性侧索硬化症(ALS)相关；并且测量在存在所述物质时所述复合物的量，由此，如果在存在所述物质时所述复合物的量小于初始量，那么所述物质能够治疗肌萎缩性侧索硬化症。
在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定能够治疗ALS的物质的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在存在所述物质时，将苹果酸脱氢酶蛋白与突变的SOD1蛋白相接触，其中所述突变的SOD1蛋白与肌萎缩性侧索硬化症(ALS)相关；(b)接着步骤(a)，测量所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的SOD1蛋白之间复合物形成的量；c)在不存在所述物质时，将所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的SOD1蛋白相接触；并且d)接着步骤(c)，测量所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的SOD1蛋白之间复合物形成的量，由此，如果步骤(b)的量小于步骤(d)的量，那么所述物质能够治疗肌萎缩性侧索硬化症。
在另一个实施方案中，本发明的复合物被荧光标记。在另一个实施方案中，测量苹果酸脱氢酶-突变的SOD1复合物的量的步骤是通过测量来自该复合物的信号来进行的。在另一个实施方案中，所述信号是荧光信号。在另一个实施方案中，所述信号是FRET信号。在另一个实施方案中，信号的变化是在加入测验物质后测量的。如本文所述的，本发明提供了可以容易地被本领域技术人员推广到可依赖于完整的苹果酸脱氢酶-突变的SOD1复合物而设计的任何类型的定量或半定量的信号的方法。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
附图简述
本文参考附图仅示例描述本发明。现在详细地具体参考附图，需要强调的是所示细节仅仅作为例子并且出于说明性讨论本发明的优选实施方案的目的，并且将其呈现是为了提供被认为是对本发明的原理和概念最有用的和最易理解的描述。在这点上，没有尝试比基本理解本发明所需更为详细地显示本发明的结构细节，附图伴随的描述使得本发明的几种形式可如何在实践中被实施对于本领域技术人员是明显的。
在附图中：
图1.下述各项的FACS分析：A)用BFP-GFP嵌合体表达质粒转染的表达G93A-hSOD1-GFP的NSC-34细胞；B)用BFP-GFP嵌合体表达质粒转染的NSC-34细胞；以及C)用BFP表达质粒转染的表达G93A-hSOD1-GFP的NSC-34细胞。激发紫外光；发射-530nm。
图2.A)当表达G93A-hSOD1-CFP和YFP标记的候选蛋白的细胞在405nm激发时获得的发射光谱(数据集A)。FRET相关的YFP发射(图2A-F405)是通过减去从只表达G93A-hSOD1-CFP的对照细胞收集的CFP光谱得出的(数据集B)。B)在表达G93A-hSOD1-CFP和YFP标记的候选物的细胞中的F405/F514(比值A)和通过直接激发只表达YFP标记的候选蛋白的NSC-34细胞中的YFP所引起的F405/F514(比值A0)。C)当表达WT-hSOD1-CFP和YFP标记的候选蛋白的细胞在405nm激发时获得的发射光谱(图2C，数据集A)。FRET相关的YFP发射(图2C-F405)是通过减去从只表达G93A-hSOD1-CFP的对照细胞收集的CFP光谱得出的(图2C，数据集B)。B)在表达WT-hSOD1-CFP和YFP标记的候选物的细胞中的F405/F514(比值A)和通过直接激发只表达YFP标记的候选蛋白的NSC-34细胞中的YFP所引起的F405/F514(比值A0)。
图3.cytMDH与hSOD1的共免疫沉淀。用48h后溶解的YFP-cytMDH和未标记的WT-hSOD1或未标记的G93A-hSOD1共转染NSC-34细胞，并且使细胞经历与抗hSOD1抗体的免疫沉淀。A)在免疫沉淀前的样品中YFP-cytMDH和肌动蛋白的Western印迹。B)在免疫沉淀的蛋白中YFP-cytMDH和hSOD1的衍生物的Western印迹。
图4：YFP-cytMDH构建体的MDH活性。用YFP-MDH(黑色圆圈)或YFP(空白圆圈)的表达质粒转染NSC-34细胞。48小时后，细胞被溶解并且移取含有25μg蛋白的小份用于评估MDH活性，通过伴随草酰乙酸转化为苹果酸的NADH(OD 340nm)的减少所测量。
图5：用媒介物(非诱导的)或多西环素(诱导的)处理WT-hSOD1-GFP和G93A-hSOD1-GFP细胞48h以诱导hSOD1表达。A)通过RT-PCR测量了与管家基因GAPDH的表达相比cytMDH的表达。B)和C)测量了在非诱导的和诱导的WT-hSOD1-GFP(B)和G93-A-hSOD1-GFP(C)细胞中的MDH活性。*指出与非诱导的对照相比p＜0.05。
图6：用媒介物(非诱导的)或多西环素(诱导的)处理WT-hSOD1-GFP和G93A-hSOD1-GFP细胞48h以诱导hSOD1表达。苹果酸(A)和乳酸(B)的水平在溶解的细胞中被评估并且以mg/mg细胞蛋白表示。*指出与非诱导的对照相比p＜0.05。
图7：用媒介物(非诱导的)或多西环素(诱导的)处理WT-hSOD1-GFP和G93A-hSOD1-GFP细胞48h以诱导hSOD1表达。制备了细胞溶胶(A)和线粒体(B)的组分(fraction)并且分析了它们的NAD+和NADH含量。结果被标准化为样品的每份蛋白含量。**指出与非诱导的对照相比p＜0.01。
图8：苹果酸脱氢酶的模型。已识别的肽用黄色凸显，MDH1的单体单元用蓝色和绿色凸显。NADH用棍球模型表示。
图9：下述各项的FACS分析：A)用G93A-hSOD1-CFP质粒和表达YFP的质粒转染的NSC-34细胞(阴性FRET对照)。B)用G93A-hSOD1-CFP和cytMDH-YFP表达质粒转染的NSC-34细胞(阳性FRET对照)。C)用G93A-hSOD1-CFP/cytMDH-YFP表达质粒和myc标记的肽217-239表达质粒共转染的NSC-34细胞(阴性FRET)。D)用G93A-hSOD1-CFP/cytMDH-YFP表达质粒和myc标记的肽14-27表达质粒共转染的NSC-34细胞(阳性FRET)。激发-405nm，发射-530nm。
图10：在鱼藤酮攻击的表达WT-hSOD1-GFP和G93A-hSOD1-GFP的NSC-34细胞中肽217-239对细胞存活的影响。用多西环素孵育细胞24h，然后用媒介物(实心条)或1μmol/L的肽(空心条)孵育4小时。A)加入0.5μmol/L鱼藤酮并且再继续孵育24小时。B)然后用含有5％血清和1mg/ml葡萄糖的、带有媒介物(实心条)和1μmol/L肽(空心条)的DMEM更换培养基持续72小时。通过亚甲基蓝测定法评估了生存力。*指出在存在或不存在肽的情况下的水平之间的显著差异(t检验)。
图11：在鱼藤酮攻击的表达WT-hSOD1-GFP和G93A-hSOD1-GFP的NSC-34细胞中辛酸对细胞存活的影响。A)用多西环素孵育细胞24h，然后在(i)鱼藤酮(1.25μmol/L)+媒介物(实心条)或(ii)鱼藤酮+3mM辛酸(空心条)的存在下孵育24小时。B)用3mM的辛酸或媒介物孵育细胞，并且将培养基更换为具有5％血清的低(1mg/ml)葡萄糖的DMEM持续72小时。然后评估细胞的存活。通过亚甲基蓝测定法评估了生存力。*指出野生型和突变的细胞水平之间的显著差异(t检验)。
优选的实施方案的描述
本发明提供了在受治疗者中治疗神经退行性病症例如ALS的方法，包括向所述受治疗者施用能够降低苹果酸脱氢酶蛋白与一种SOD1蛋白之间相互作用的物质的步骤。本发明还提供了鉴定能够治疗ALS的物质的方法，包括对物质破坏或阻止形成苹果酸脱氢酶-SOD1复合物的能力进行测验；以及治疗由其他的一种构象改变的或突变的引起神经退行性疾病的蛋白与胞质苹果酸脱氢酶形成复合物所引起的神经退行性病症的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了在需要它的受治疗者中治疗神经退行性病症的方法，所述方法包括向该受治疗者施用治疗有效量的能够减少苹果酸脱氢酶与一种构象改变的或突变的蛋白之间相互作用的物质，由此治疗由胞质苹果酸脱氢酶与一种构象改变的或突变的引起所述病症的蛋白形成复合物所引起的神经退行性病症。在另一个实施方案中，所述神经退行性病症是肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。在另一个实施方案中，所述构象改变的或突变的蛋白是一种突变的SOD1蛋白。在另一个实施方案中，所述突变的SOD1蛋白与ALS相关。在另一个实施方案中，所述物质是肽。在另一个实施方案中，所述物质是本发明的任何肽。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗神经退行性病症的方法，所述方法包括向需要它的个体施用治疗有效量的能够增加脑线粒体呼吸的物质，由此治疗所述神经退行性病症，条件是所述物质不是丙酮酸或草酰乙酸。在另一个实施方案中，所述物质能够在需要它的受治疗者中增加细胞质的苹果酸水平。在另一个实施方案中，所述物质是肽物质。在另一个实施方案中，所述肽物质包含人丙酮酸脱氢酶的至少4个氨基酸。在另一个实施方案中，所述物质包含在SEQ ID NO：1中列出的序列。在另一个实施方案中，所述物质是本发明的任何肽。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
本发明的方法和组合物的物质在另一个实施方案中是肽。在另一个实施方案中，所述肽包括苹果酸脱氢酶蛋白的片段。在另一个实施方案中，所述苹果酸脱氢酶是一种人苹果酸脱氢酶。在另一个实施方案中，所述苹果酸脱氢酶是本领域已知的任何其他的苹果酸脱氢酶。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
由本发明的方法和组合组所治疗的ALS或神经退行性病症在另一个实施方案中与编码人铜锌超氧化物歧化酶(hSOD1)蛋白的基因中的突变相关。在另一个实施方案中，所述ALS或神经退行性病症是由hSOD基因中的突变引起的。在另一个实施方案中，所述hSOD突变是一种功能获得性突变。在另一个实施方案中，所述hSOD突变是一种毒性的功能获得性突变。在另一个实施方案中，所述ALS或神经退行性病症的病因学是未知的。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
在另一个实施方案中，所述苹果酸脱氢酶的片段长度为4个氨基酸。在另一个实施方案中，所述片段长度为至少3个氨基酸。在另一个实施方案中，所述片段长度为至少5个氨基酸。在另一个实施方案中，所述片段长度为至少6个氨基酸。在另一个实施方案中，所述片段长度为至少7个氨基酸。在另一个实施方案中，所述片段长度为至少8个氨基酸。在另一个实施方案中，所述片段长度为至少9个氨基酸。在另一个实施方案中，所述片段长度为至少10个氨基酸。在另一个实施方案中，所述片段长度为至少15个氨基酸。在另一个实施方案中，所述片段长度为至少20个氨基酸。在另一个实施方案中，所述片段长度为至少30个氨基酸。在另一个实施方案中，所述片段长度为至少40个氨基酸。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
在另一个实施方案中，所述肽包含一种苹果酸脱氢酶蛋白的至少4个连续的氨基酸。在另一个实施方案中，所述肽包含一种苹果酸脱氢酶蛋白的至少3个连续的氨基酸。在另一个实施方案中，所述肽包含一种苹果酸脱氢酶蛋白的至少5个连续的氨基酸。在另一个实施方案中，所述肽包含一种苹果酸脱氢酶蛋白的至少6个连续的氨基酸。在另一个实施方案中，所述肽包含一种苹果酸脱氢酶蛋白的至少7个连续的氨基酸。在另一个实施方案中，所述肽包含一种苹果酸脱氢酶蛋白的至少8个连续的氨基酸。在另一个实施方案中，所述肽包含一种苹果酸脱氢酶蛋白的至少9个连续的氨基酸。在另一个实施方案中，所述肽包含一种苹果酸脱氢酶蛋白的至少10个连续的氨基酸。在另一个实施方案中，所述肽包含一种苹果酸脱氢酶蛋白的至少15个连续的氨基酸。在另一个实施方案中，所述肽包含一种苹果酸脱氢酶蛋白的至少20个连续的氨基酸。在另一个实施方案中，所述肽包含一种苹果酸脱氢酶蛋白的至少30个连续的氨基酸。在另一个实施方案中，所述肽包含一种苹果酸脱氢酶蛋白的至少40个连续的氨基酸。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
与ALS相关的突变的SOD1蛋白的一个非限制性实例是G93A-hSOD1。在另一个实施方案中，突变的SOD1蛋白是本领域已知的与ALS相关的任何其他突变的SOD1蛋白。如本文所述，本发明提供了可容易地被本领域技术人员推广到治疗由任何突变的SOD1蛋白特别是与MDH相关的突变的SOD1所引起的神经退行性病症例如ALS的方法。引起所述疾病的突变的SOD1蛋白不必与测验所述物质所使用的蛋白相同。因为许多突变的SOD1蛋白将以基本上相同的方式与MDH相互作用，所以相同的物质可以被用于不同的突变SOD1蛋白。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
在另一个实施方案中，所述肽包含MDH1与一种SOD1蛋白的二聚位点。在另一个实施方案中，所述肽重叠了MDH1与SOD1蛋白的二聚位点。在另一个实施方案中，所述肽落在MDH1与SOD1蛋白的二聚位点之内。在另一个实施方案中，所述SOD1蛋白是一种突变的SOD1蛋白。在另一个实施方案中，所述突变的SOD1蛋白与ALS相关。作为一个非限制性实例，MDH1与G93A-hSOD1的二聚位点本文描绘于图8中。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
在另一个实施方案中，所述肽包含MDH1与另一种引起神经退行性疾病的蛋白的二聚位点。在另一个实施方案中，所述肽重叠了MDH1与一种引起神经退行性疾病的蛋白的二聚位点。在另一个实施方案中，所述肽落在MDH1与另一种引起神经退行性疾病的蛋白的二聚位点之内。在另一个实施方案中，另一种引起神经退行性疾病的蛋白是构象改变的或突变的蛋白。在另一个实施方案中，所述构象改变的或突变的蛋白与神经退行性病症相关。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
在另一个实施方案中，本发明提供了长度为19-50个氨基酸的MDH片段，该肽包括SEQ ID NO：1中列出的序列。在另一个实施方案中，所述MDH片段的长度为19-45个氨基酸。在另一个实施方案中，所述MDH片段的长度为19-40个氨基酸。在另一个实施方案中，所述MDH片段的长度为19-35个氨基酸。在另一个实施方案中，所述MDH片段的长度为19-30个氨基酸。在另一个实施方案中，所述MDH片段的长度为19-25个氨基酸。在另一个实施方案中，所述MDH片段的长度为25-45个氨基酸。在另一个实施方案中，所述MDH片段的长度为25-40个氨基酸。在另一个实施方案中，所述MDH片段的长度为25-35个氨基酸。在另一个实施方案中，所述MDH片段的长度为25-30个氨基酸。在另一个实施方案中，本发明的一种MDH衍生肽是从野生型MDH获得的。在另一个实施方案中，所述肽是从突变的MDH获得的。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
破坏MDH1-G93A-hSOD1复合物的肽的另一个非限制性实例是具有在SEQ ID NO：1中列出的序列的肽。在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的肽包含SEQ ID NO：1中列出的序列。在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的肽具有SEQ ID NO：1中列出的序列。在另一个实施方中，所述肽重叠了在SEQ ID NO：1中列出的序列。在另一个实施方案中，所述重叠是至少10个氨基酸的长度。在另一个实施方案中，所述重叠是至少8个氨基酸的长度。在另一个实施方案中，所述重叠是至少6个氨基酸的长度。在另一个实施方案中，所述重叠是至少12个氨基酸的长度。在另一个实施方案中，所述重叠是至少14个氨基酸的长度。在另一个实施方案中，所述重叠是至少16个氨基酸的长度。在另一个实施方案中，所述重叠是至少18个氨基酸的长度。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和作为活性成分的能够阻止苹果酸脱氢酶与一种构象改变的或突变的蛋白之间相互作用的物质，其中所述构象改变的或突变的蛋白与一种神经退行性病症相关。在另一个实施方案中，所述神经退行性病症是肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。在另一个实施方案中，所述构象改变的或突变的蛋白是一种SOD1蛋白。在另一个实施方案中，所述物质是肽物质。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的物质是一种小分子。在另一个实施方案中，所述小分子选自由苹果酸、辛酸、α-酮戊二酸、琥珀酸和富马酸组成的组。在另一个实施方案中，所述小分子是能够上调苹果酸脱氢酶活性的本领域已知的任何其他小分子。在另一个实施方案中，所述苹果酸脱氢酶是一种胞质苹果酸脱氢酶。在另一个实施方案中，所述小分子是能够上调乙酰辅酶A酶的本领域已知的任何其他小分子。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
在本发明的方法和组合物的另一个实施方案中，所述构象改变的或突变的蛋白与帕金森病相关。在另一个实施方案中，所述蛋白是α突触核蛋白。在另一个实施方案中，所述蛋白是帕金蛋白。在另一个实施方案中，所述蛋白是PINK1。在另一个实施方案中，所述蛋白是DJ-1。在另一个实施方案中，所述蛋白是ATP13A2。在另一个实施方案中，所述蛋白是其突变与帕金森病有关的另外的蛋白。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
在另一个实施方案中，所述构象改变的或突变的蛋白与阿尔茨海默病相关。在另一个实施方案中，所述蛋白是β淀粉样肽(Aβ)。在另一个实施方案中，所述蛋白是突变与阿尔茨海默病有关的另外的蛋白。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
在另一个实施方案中，所述构象改变的或突变的蛋白是已知包含聚谷氨酰胺重复的蛋白。在另一个实施方案中，所述蛋白是亨廷顿蛋白，其基因的突变已知与亨廷顿病相关。在另一个实施方案中，所述蛋白是雄激素受体，其基因的突变已知与肯尼迪病(也称作脊髓延髓肌肉萎缩症)相关。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
在另一个实施方案中，所述构象改变的或突变的蛋白是一种微管相关蛋白tau。编码tau的基因的突变与阿尔茨海默病和其他的神经退行性疾病相关，所述其他的神经退行性疾病例如皮克氏病(PID)、进行性核上麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、以及与17号染色体相关的额颞痴呆伴帕金森综合征(FTDP-17)。
在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定能够治疗肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的物质的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将所述物质与已知初始量的、苹果酸脱氢酶蛋白和突变的SOD1蛋白的复合物相接触，其中所述突变的SOD1蛋白与ALS相关；并且测量在存在所述物质时所述复合物的量，由此，如果在存在所述物质时所述复合物的所述量小于所述已知初始量，那么所述物质能够治疗肌萎缩性侧索硬化症。
在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定能够治疗ALS的物质的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在存在所述物质时，将苹果酸脱氢酶蛋白与突变的SOD1蛋白相接触，其中所述突变的SOD1蛋白与ALS相关；(b)接着步骤(a)，测量所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的SOD1蛋白之间复合物形成的量；c)在不存在所述物质时，将所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的SOD1蛋白相接触；并且d)接着步骤(c)，测量所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的SOD1蛋白之间复合物形成的量，由此，如果步骤(b)的量小于步骤(d)的量，那么所述物质能够治疗肌萎缩性侧索硬化症。
在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定能够治疗帕金森病的物质的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在存在所述物质时，将苹果酸脱氢酶蛋白与突变的蛋白相接触，其中所述突变的蛋白与帕金森病相关；(b)接着步骤(a)，测量所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的蛋白之间复合物形成的量；c)在不存在所述物质时，将所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的蛋白相接触；并且d)接着步骤(c)，测量所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的蛋白之间复合物形成的量，由此，如果步骤(b)的量小于步骤(d)的量，那么所述物质能够治疗帕金森病。在另一个实施方案中，所述突变的蛋白是α-突触核蛋白。在另一个实施方案中，所述突变的蛋白是帕金蛋白。在另一个实施方案中，所述突变的蛋白是PINK1。在另一个实施方案中，所述突变的蛋白是DJ-1。在另一个实施方案中，所述突变的蛋白是ATP13A2。在另一个实施方案中，所述突变的蛋白是已知与帕金森病相关的任何其他突变的蛋白。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定能够治疗阿尔茨海默病的物质的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在存在所述物质时，将苹果酸脱氢酶蛋白与突变的蛋白相接触，其中所述突变的蛋白与阿尔茨海默病相关；(b)接着步骤(a)，测量所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的蛋白之间复合物形成的量；c)在不存在所述物质时，将所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的蛋白相接触；并且d)接着步骤(c)，测量所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的蛋白之间复合物形成的量，由此，如果步骤(b)的量小于步骤(d)的量，那么所述物质能够治疗阿尔茨海默病。在另一个实施方案中，所述突变的蛋白是β淀粉样肽(Aβ)。在另一个实施方案中，所述突变的蛋白是已知与阿尔茨海默病相关的任何其他突变的蛋白。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定能够治疗亨廷顿病的物质的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在存在所述物质时，将苹果酸脱氢酶蛋白与突变的蛋白相接触，其中所述突变的蛋白与亨廷顿病相关；(b)接着步骤(a)，测量所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的蛋白之间复合物形成的量；c)在不存在所述物质时，将所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的蛋白相接触；并且d)接着步骤(c)，测量所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的蛋白之间复合物形成的量，由此，如果步骤(b)的量小于步骤(d)的量，那么所述物质能够治疗亨廷顿病。在另一个实施方案中，所述突变的蛋白是亨廷顿蛋白。在另一个实施方案中，所述突变的蛋白是已知包含聚谷氨酰胺重复的另外的蛋白。在另一个实施方案中，所述突变的蛋白是已知与亨延顿病相关的任何其他突变的蛋白。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定能够治疗肯尼迪病(也称作脊髓延髓肌肉萎缩症)的物质的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在存在所述物质时，将苹果酸脱氢酶蛋白与突变的蛋白相接触，其中所述突变的蛋白与肯尼迪病相关；(b)接着步骤(a)，测量所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的蛋白之间复合物形成的量；c)在不存在所述物质时，将所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的蛋白相接触；并且d)接着步骤(c)，测量所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的蛋白之间复合物形成的量，由此，如果步骤(b)的量小于步骤(d)的量，那么所述物质能够治疗肯尼迪病。在另一个实施方案中，所述突变的蛋白是雄激素受体。在另一个实施方案中，所述突变的蛋白是已知包含聚谷氨酰胺重复的另外的蛋白。在另一个实施方案中，所述突变的蛋白是已知与肯尼迪病相关的任何其他突变的蛋白。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定能够治疗神经退行性病症的物质的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在存在所述物质时，将苹果酸脱氢酶蛋白与突变的微管相关蛋白tau相接触，其中所述tau蛋白与神经退行性病症相关；(b)接着步骤(a)，测量所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的tau蛋白之间复合物形成的量；c)在不存在所述物质时，将所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的tau蛋白相接触；并且d)接着步骤(c)，测量所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的tau蛋白之间复合物形成的量，由此，如果步骤(b)的量小于步骤(d)的量，那么所述物质能够治疗神经退行性病症。在另一个实施方案中，所述神经退行性病症是阿尔茨海默病。在另一个实施方案中，所述神经退行性病症是皮克氏病(PID)。在另一个实施方案中，所述神经退行性病症是进行性核上麻痹(PSP)。在另一个实施方案中，所述神经退行性病症是皮质基底节变性(CBD)。在另一个实施方案中，所述神经退行性病症是与17号染色体相关的额颞痴呆伴帕金森综合征(FTDP-17)。在另一个实施方案中，所述神经退行性病症是与突变的tau蛋白相关的任何其他的神经退行性病症。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
在另一个实施方案中，本发明的复合物被荧光标记。在另一个实施方案中，测量苹果酸脱氢酶-突变的SOD1复合物的量的步骤是通过测量来自该复合物的信号来进行的。在另一个实施方案中，所述信号是荧光信号。在另一个实施方案中，所述信号是FRET信号。在另一个实施方案中，信号上的改变是紧接着测验物质的加入而测量的。在另一个实施方案中，所述信号是使用FRET产生的。在另一个实施方案中，所述信号是能够被设计为依赖完整的苹果酸脱氢酶-突变的SOD1复合物的本领域已知的任何其他类型的信号。如本文所述的，本发明提供了可以容易地被本领域技术人员推广到能够被设计为依赖完整的苹果酸脱氢酶-突变的SOD1复合物的任何类型的定量或半定量的信号的方法。每种可能性均代表本发明的一个独立的实施方案。
本发明的实施方案提供了物质和使用该物质治疗神经退行性病症例如ALS的方法。在一些实施方案中，所述物质是能够干扰细胞质苹果酸脱氢酶与ALS相关的SOD1结合或者干扰解除对神经元中苹果酸-天冬氨酸穿梭的抑制的肽物质，例如肽或小分子。本发明另外的实施方案提供了筛选能够干扰细胞质苹果酸脱氢酶与SOD1结合的物质的新颖方法。
如本文使用的术语“肽”包括天然的肽(降解产物、合成的肽或重组的肽)和模拟肽(通常是合成的肽)、以及是肽类似物的类肽和半类肽，它们可以具有例如使得肽在体内更稳定或者更能渗入细胞的修饰。此类修饰包括但不限于N端修饰、C端修饰、肽键修饰、主链修饰以及残基修饰，所述肽键修饰包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O、O＝C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S＝C-NH、CH＝CH或CF＝CH。用于制备模拟肽化合物的方法是本领域公知的，并且在例如Quantitative Drug Design，CA.Ramsden Gd.，第17.2节，F.Choplin Pergamon Press(1992)中被指明，所述文献通过引用并入，就如同在此完全给出一样。下文提供了这方面的进一步的细节。
在肽中的肽键(-CO-NH-)可以被例如下述键取代：N甲基化的键(-N(CH3)-CO-)、醚键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮亚甲基键(-CO-CH2-)、α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)(其中R是任何烷基，例如甲基)、carba键(-CH2-NH-)、羟基亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯属双键(-CH＝CH-)、逆酰胺键(-NH-CO-)、肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中R是自然情况下出现在碳原子上的“正常的”的侧链。
这些修饰可以存在于沿肽链的键的任一个，甚至同时存在几个(2-3)。
天然芳香族氨基酸Trp、Tyr和Phe可以被合成的非天然酸例如TIC、萘基丙氨酸(Nol)、Phe的环甲基化的衍生物、Phe的卤代衍生物或者o-甲基-Tyr取代。
除了以上所述之外，本发明的肽还可以包括一种或多种修饰的氨基酸或者一种或多种非氨基酸单体(例如脂肪酸、复合碳水化合物等等)。
术语“氨基酸(amino acid)”或“氨基酸(amino acids)”被理解为包括20种天然存在的氨基酸；这些氨基酸通常在体内翻译后修饰，包括例如羟基脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；以及其他的非天然氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羟基赖氨酸、异锁链素、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。此外，术语“氨基酸”既包括D-氨基酸也包括L-氨基酸。
下表1和表2列出了能够用于本发明的天然存在的氨基酸(表1)和非常规的或修饰的氨基酸(表2)。
表1
  氨基酸   三字母缩写   单字母符号
  丙氨酸   Ala   A
  精氨酸   Arg   R
  天冬酰胺   Asn   N
  天冬氨酸   Asp   D
  氨基酸   三字母缩写   单字母符号
  半胱氨酸   Cys   C
  谷氨酰胺   Gln   Q
  谷氨酸   Glu   E
  甘氨酸   Gly   G
  组氨酸   His   H
  异亮氨酸   Iie   I
  亮氨酸   Leu   L
  赖氨酸   Lys   K
  甲硫氨酸   Met   M
  苯丙氨酸   Phe   F
  脯氨酸   Pro   P
  丝氨酸   Ser   S
  苏氨酸   Thr   T
  色氨酸   Trp   W
  酪氨酸   Tyr   Y
  缬氨酸   Val   V
  如上述的任何氨基酸   Xaa   X
表2
  非常规氨基酸   代码   非常规氨基酸   代码
  α-氨基丁酸   Abu   L-N-甲基丙氨酸   Nmala
  α-氨基-α-甲基丁酸   Mgabu   L-N-甲基精氨酸   Nmarg
  氨基环丙烷-   Cpro   L-N-甲基天冬酰胺   Nmasn
  羧酸   L-N-甲基天冬氨酸   Nmasp
  氨基异丁酸   Aib   L-N-甲基半胱氨酸   Nmcys
  氨基降冰片基-   Norb   L-N-甲基谷氨酰胺   Nmgin
  羧酸   L-N-甲基谷氨酸   Nmglu
  环己基丙氨酸   Chexa   L-N-甲基组氨酸   Nmhis
  环戊基丙氨酸   Cpen   L-N-甲基异亮氨酸   Nmile
  D-丙氨酸   Dal   L-N-甲基亮氨酸   Nmleu
  D-精氨酸   Darg   L-N-甲基赖氨酸   Nmlys
  D-天冬氨酸   Dasp   L-N-甲基甲硫氨酸   Nmmet
  D-半胱氨酸   Dcys   L-N-甲基正亮氨酸   Nmnle
  D-谷氨酰胺   Dgln   L-N-甲基正缬氨酸   Nmnva
  D-谷氨酸   Dglu   L-N-甲基鸟氨酸   Nmorn
  D-组氨酸   Dhis   L-N-甲基苯丙氨酸   Nmphe
  D-异亮氨酸   Dile   L-N-甲基脯氨酸   Nmpro
  D-亮氨酸   Dleu   L-N-甲基丝氨酸   Nmser
  D-赖氨酸   Dlys   L-N-甲基苏氨酸   Nmthr
  D-甲硫氨酸   Dmet   L-N-甲基色氨酸   Nmtrp
  非常规氨基酸   代码   非常规氨基酸   代码
  D-鸟氨酸   Dorn   L-N-甲基酪氨酸   Nmtyr
  D-苯丙氨酸   Dphe   L-N-甲基缬氨酸   Nmval
  D-脯氨酸   Dpro   L-N-甲基乙基甘氨酸   Nmetg
  D-丝氨酸   Dser   L-N-甲基叔丁基甘氨酸   Nmtbug
  D-苏氨酸   Dthr   L-正亮氨酸   Nle
  D-色氨酸   Dtrp   L-正缬氨酸   Nva
  D-酪氨酸   Dtyr   α-甲基-氨基异丁酸   Maib
  D-缬氨酸   Dval   α-甲基-γ-氨基丁酸   Mgabu
  D-α-甲基丙氨酸   Dmala   α-甲基环己基丙氨酸(αethylcyclohexylalanine)   Mchexa
  D-α-甲基精氨酸   Dmarg   α-甲基环戊基丙氨酸   Mcpen
  D-α-甲基天冬酰胺   Dmash   α-甲基-α-萘基丙氨酸   Manap
  D-α-甲基天冬氨酸   Dmasp   α-甲基青霉胺   Mpen
  D-α-甲基半胱氨酸   Dmcys   N-(4-氨基丁基)甘氨酸   Nglu
  D-α-甲基谷氨酰胺   Dmgln   N-(2-氨基乙基)甘氨酸   Naeg
  D-α-甲基组氨酸   Dmhis   N-(3-氨基丙基)甘氨酸   Norn
  D-α-甲基异亮氨酸   Dmile   N-氨基-α-甲基丁酸   Nmaabu
  D-α-甲基亮氨酸   Dmleu   α-萘基丙氨酸   Anap
  D-α-甲基赖氨酸   Dmlys   N-苯甲基甘氨酸   Nphe
  D-α-甲基甲硫氨酸   Dmmet   N-(2-氨甲酰基甲基)甘氨   Ngln
  非常规氨基酸   代码   非常规氨基酸   代码
  酸
  D-α-甲基鸟氨酸   Dmorn   N-(氨甲酰基甲基)甘氨酸   Nasn
  D-α-甲基苯丙氨酸   Dmphe   N-(2-羧乙基)甘氨酸   Nglu
  D-α-甲基脯氨酸   Dmpro   N-(羧甲基)甘氨酸   Nasp
  D-α-甲基丝氨酸   Dmser   N-环丁基甘氨酸   Ncbut
  D-α-甲基苏氨酸   Dmthr   N-环庚基甘氨酸   Nchep
  D-α-甲基色氨酸   Dmtrp   N-环己基甘氨酸   Nchex
  D-α-甲基酪氨酸   Dmty   N-环癸基甘氨酸   Ncdec
  D-α-甲基缬氨酸   Dmval   N-环十二烷基甘氨酸(N-cyclododeclglycine)   Ncdod
  D-α-甲基丙氨酸(D-α-methylaline)   Dnmala   N-环辛基甘氨酸   Ncoct
  D-α-甲基精氨酸   Dnmarg   N-环丙基甘氨酸   Ncpro
  D-α-甲基天冬酰胺   Dnmasn   N-环十一烷基甘氨酸   Ncund
  D-α-甲基天冬氨酸   Dnmasp   N-(2，2-二苯基乙基)甘氨酸   Nbhm
  D-α-甲基半胱氨酸   Dnmcys   N-(3，3-二苯基丙基)甘氨酸   Nbhe
  D-N-甲基亮氨酸   Dnmleu   N-(3-吲哚基乙基)甘氨酸   Nhtrp
  D-N-甲基赖氨酸   Dnmlys   N-甲基-γ-氨基丁酸   Nmgabu
  N-甲基环己基丙氨酸   Nmchexa   D-N-甲基甲硫氨酸   Dnmmet
  非常规氨基酸   代码   非常规氨基酸   代码
  D-N-甲基鸟氨酸   Dnmorn   N-甲基环戊基丙氨酸   Nmcpen
  N-甲基甘氨酸   Nala   D-N-甲基苯丙氨酸   Dnmphe
  N-甲基氨基异丁酸   Nmaib   D-N-甲基脯氨酸   Dnmpro
  N-(1-甲基丙基)甘氨酸   Nile   D-N-甲基丝氨酸   Dnmser
  N-(2-甲基丙基)甘氨酸   Nile   D-N-甲基丝氨酸   Dnmser
  N-(2-甲基丙基)甘氨酸   Nleu   D-N-甲基苏氨酸   Dnmthr
  D-N-甲基色氨酸   Dnmtrp   N-(1-甲基乙基)甘氨酸   Nva
  D-N-甲基酪氨酸   Dnmtyr   N-甲基-萘基丙氨酸   Nmanap
  D-N-甲基缬氨酸   Dnmval   N-甲基青霉胺   Nmpen
  γ-氨基丁酸   Gabu   N-(对羟苯基)甘氨酸   Nhtyr
  L-叔丁基甘氨酸   Tbug   N-(硫代甲基)甘氨酸   Ncys
  L-乙基甘氨酸   Etg   青霉胺   Pen
  L-高苯丙氨酸   Hphe   L-α-甲基丙氨酸   Mala
  L-α-甲基精氨酸   Marg   L-α-甲基天冬酰胺   Masn
  L-α-甲基天冬氨酸   Masp   L-α-甲基叔丁基甘氨酸   Mtbug
  L-α-甲基半胱氨酸   Mcys   L-甲基乙基甘氨酸   Metg
  L-α-甲基谷氨酰胺(L-α-thylglutamine)   Mgln   L-α-甲基谷氨酸   Mglu
  L-α-甲基组氨酸   Mhis   L-α-甲基高苯丙氨酸   Mhphe
  非常规氨基酸   代码   非常规氨基酸   代码
  L-α-甲基异亮氨酸   Mile   N-(2-甲基硫代乙基)甘氨酸   Nmet
  D-N-甲基谷氨酰胺   Dnmgln   N-(3-胍基丙基)甘氨酸   Narg
  D-N-甲基谷氨酸   Dnmglu   N-(1-羟乙基)甘氨酸   Nthr
  D-N-甲基组氨酸   Dnmhis   N-(羟乙基)甘氨酸   Nser
  D-N-甲基异亮氨酸   Dnmile   N-(吲哚基乙基)甘氨酸   Nhis
  D-N-甲基亮氨酸   Dnmleu   N-(3-吲哚基乙基)甘氨酸   Nhtrp
  D-N-甲基赖氨酸   Dnmlys   N-甲基-γ-氨基丁酸   Nmgabu
  N-甲基环己基丙氨酸   Nmchexa   D-N-甲基-甲硫氨酸   Dnmmet
  D-N-甲基鸟氨酸   Dnmorn   N-甲基环戊基丙氨酸   Nmcpen
  N-甲基甘氨酸   Nala   D-N-甲基苯丙氨酸   Dnmphe
  N-甲基氨基异丁酸   Nmaib   D-N-甲基脯氨酸   Dnmpro
  N-(1-甲基丙基)甘氨酸   Nile   D-N-甲基丝氨酸   Dnmser
  N-(2-甲基丙基)甘氨酸   Nleu   D-N-甲基苏氨酸   Dnmthr
  D-N-甲基色氨酸   Dnmtrp   N-(1-甲基乙基)甘氨酸   Nval
  D-N-甲基酪氨酸   Dnmtyr   N-甲基-萘基丙氨酸   Nmanap
  D-N-甲基缬氨酸   Dnmval   N-甲基青霉胺   Nmpen
  γ-氨基丁酸   Gabu   N-(对羟苯基)甘氨酸   Nhtyr
  L-叔丁基甘氨酸   Tbug   N-(硫代甲基)甘氨酸   Ncys
  非常规氨基酸   代码   非常规氨基酸   代码
  L-乙基甘氨酸   Etg   青霉胺   Pen
  L-高苯丙氨酸   Hphe   L-α-甲基丙氨酸   Mala
  L-α-甲基精氨酸   Marg   L-α-甲基天冬酰胺   Masn
  L-α-甲基天冬氨酸   Masp   L-α-甲基-叔丁基甘氨酸   Mtbug
  L-α-甲基半胱氨酸   Mcys   L-甲基乙基甘氨酸   Metg
  L-α-甲基谷氨酰胺   Mgln   L-α-甲基谷氨酸   Mglu
  L-α-乙基组氨酸   Mhis   L-α-甲基高苯丙氨酸   Mhphe
  L-α-甲基异亮氨酸(L-αthylisoleucine)   Mile   N-(2-甲基硫代乙基)甘氨酸   Nmet
  L-α-甲基亮氨酸   Mleu   L-α-甲基赖氨酸   Mlys
  L-α-甲基甲硫氨酸   Mmet   L-α-甲基正亮氨酸   Mnle
  L-α-甲基正缬氨酸   Mnva   L-α-甲基鸟氨酸   Morn
  L-α-甲基苯丙氨酸   Mphe   L-α-甲基脯氨酸   Mpro
  L-α-甲基丝氨酸   Mser   L-α-甲基苏氨酸   Mthr
  L-α-甲基缬氨酸(L-αethylvaline)   Mtrp   L-α-甲基酪氨酸   Mtyr
  L-α-甲基亮氨酸   MvalNnbhm   L-N-甲基高苯丙氨酸   Nmhphe
  N-(N-(2，2-二苯基乙基)   N-(N-(3，3-二苯基丙基)
  氨甲酰基甲基甘氨酸   Nnbhm   氨甲酰基甲基(1)甘氨酸   Nnbhe
  非常规氨基酸   代码   非常规氨基酸   代码
  1-羧基-1-(2，2-二苯基乙基氨基)环丙烷   Nmbc
本发明的肽优选地以线性形式利用，但要理解假如环化没有严重干扰肽的特性，那么也可以利用所述肽的环状形式。
可通过肽合成领域的技术人员已知的任何技术来合成本发明的肽。对于固相肽合成，许多技术的概述可以在J.M.Stewart和J.D.Young，SolidPhase Peptide Synthesis(固相肽合成)，W.H.Freeman Co.(旧金山)，1963和J.Meienhofer，Hormonal Proteins and Peptides(激素蛋白和肽)，第2卷，46页，Academic Press(New York)，1973中被发现。对于经典的溶液合成，参见G.Schroder和K.Lupke，The Peptides(肽)，第1卷，Academic Press(New York)，1965。
一般来说，这些方法包括向正在增长的肽链中按序地加入一个或多个氨基酸或者适当保护的氨基酸。正常情况下，第一个氨基酸的氨基或羧基受适合的保护基保护。然后在适合于形成酰胺键的条件下，通过在具有适当保护的互补的(complimentary)(氨基或羧基)基团的序列中加入下一个氨基酸，受保护的或衍生的氨基酸可被连接至惰性固体支持体或者在溶液中被利用。然后将保护基从这种新加入的氨基酸残基中除去，然后加入下一个氨基酸(适当保护的)，等等。在以适当的顺序连接所有希望的氨基酸之后，按序或同时地除去所有剩余的保护基(和任何固体支持体)，提供最终的肽化合物。通过对这个一般程序的简单修改，有可能一次向正在增长的肽链加入多于一个氨基酸，例如通过将一个受保护的三肽与一个适当保护的二肽相偶联(在不使手性中心外消旋化的条件下)以便在脱保护后形成一个五肽。在美国专利号6,472,505中公开了肽合成的进一步描述。
制备本发明的肽化合物的一个优选的方法涉及固相肽合成。
Andersson Biopolymers 2000；55(3)：227-50描述了大规模的肽合成。
本发明的肽可使用基因治疗技术或者作为肽分子被递送给受治疗者。
要理解，因为本发明的物质是肽，所以它们容易被胃内的酶破坏。因此，为了改善药物递送，本发明的肽物质可以与粘膜粘着剂结合。各种粘膜粘着剂例如粘膜粘着聚合物是已知的，认为它们与包覆胃的粘液层和胃肠道的其他区域结合。如本文讨论的粘膜粘着聚合物的实例包括但不限于：壳聚糖、聚丙烯酸、羟丙基甲基纤维素和透明质酸。最优选地，所述粘膜粘着聚合物是壳聚糖[Guggi等人，(2003)J of Controlled Release92：125-135]。
还要理解肽物质递送到脑受血脑屏障限制。多年来，已经提出了几种规避血脑屏障的策略，例如通过BBB的暂时渗透开放、高给药量(例如，化学疗法的高给药量)、载体系统如抗体的使用、或者甚至可生物降解的植入物。所有这些系统均被本发明考虑。
此外，已经研究将安排为球体的几种合成的NP聚合物作为穿过BBB的药物的载体。已经报道了聚(氰基丙烯酸丁酯)有效地递送不同的药物，包括肽[Kreuter J.Adv.Drug Delivery Rev.2001，47：65-81；Gulayev AE等人，Pharm Res 1999，16：1564-9]。
还已表明脂质体能够增强药物穿过血脑屏障递送到脑[Umezawa和Eto，Biochem.Biophys.Res.Comm.153：1038-1044(1988)；Chan等人，Ann.Neurol，21：540-547(1987)；Laham等人，Life Sciences 40：2011-2016(1987)；以及Yagi等人，J.APRIo Biocheme 4：121-125(1982)]。脂质体是包含由水隔室分开的磷脂的一个或多个同心双层的小囊泡(通常亚微米大小)。
已表明，外部配体例如甘露糖的使用能够提高脂质体颗粒穿过BBB的能力[Huitinga等人，J exp Med 172(1990)1025-33；Umezawa F.，BiochemBiophys Res Commun 153(1988)1038-44]。显示甘露醇化的脂质体加入神经胶质细胞而不是神经细胞，神经胶质细胞具有甘露糖的受体[Umezawa F.，Biochem Biophys Res Commun 153，1988，1038-44]。授予Micklus的PCT申请公开号WO9402178A1讨论了脂质体与抗体结合片段的偶联，所述抗体结合片段与在哺乳动物血脑屏障的血管内皮细胞上存在的受体分子相结合。所述肽或许还可以通过噬菌体递送或者以液体或固体制剂例如经鼻内递送。
本发明的肽和小分子可以用来治疗神经退行性病症。神经退行性病症的实例包括但不限于：肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、阿尔茨海默氏痴呆、亚历山大病、阿尔珀斯病(Alper′s disease)、共济失调-毛细血管扩张症、巴腾病(Batten disease)、牛海绵状脑病(BSE)、Canavan病、科凯恩综合征(Cockayne syndrome)、皮质基底节变性、克-雅病、亨廷顿病、HIV相关痴呆、肯尼迪病、克拉伯病(Krabbe disease)、路易体痴呆、马查多-约瑟夫病(脊髓小脑共济失调3型)、多发性硬化症、多系统萎缩、神经疏螺旋体病(Neuroborreliosis)、帕金森病、佩-梅病、皮克氏病、原发性侧索硬化、Prion病、雷夫叙姆病(Refsum′s disease)、桑德霍夫病(Sandhoffdisease)、希尔德病、精神分裂症、Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病、脊髓小脑共济失调和脊髓性肌肉萎缩症。
本发明的肽或小分子物质可以本身或者作为药物组合物的一部分送给受治疗者。
如本文使用的“药物组合物”是指一种或多种本文所述的活性成分与其他化学组分例如生理学上适合的载体和赋形剂的制品。药物组合物的目的是促进化合物施用至生物体。
本文的术语“活性成分”是指可负责生物效应的本发明的DJ-1肽。
此后，可互换使用的短语“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”是指不引起对生物体的显著刺激并且不消除所施用的化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。在这些短语下包括佐剂。
本文术语“赋形剂”是指被加入到药物组合物中进一步促进活性成分的施用的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
本发明的药物组合物可以通过本领域公知的方法制造，例如通过常规的混合、溶解、造粒、糖衣片制作、磨细、乳化、装胶囊、包埋(entrapping)或冷冻干燥的方法。
如此可使用一种或多种生理学可接受的载体以常规方式来配制根据本发明使用的药物组合物，所述载体包括赋形剂和助剂，它们促进活性成分加工成可在药学上使用的制品。适当的制剂取决于所选的施用途径。
对于注射，可以将药物组合物的活性成分配制在水溶液中，优选地在生理学上相容的缓冲液中，例如汉克斯液、林格氏液或者生理盐缓冲液。
本文术语“赋形剂”是指被加入到药物组合物中进一步促进活性成分的施用的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
用于配制和施用药物的技术可发现于“Remington′s PharmaceuticalSciences”(雷明顿药学)Mack出版公司，Easton，PA，最新版中，其通过引用并入本文。
适合的施用途径可以例如包括口服、直肠、经粘膜特别是经鼻、肠或肠胃外的递送，包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接的心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
可选地，可以局部而非全身的方式施用所述药物组合物，例如通过将所述药物组合物直接注射到患者的组织区域(即脑)中。
本发明的药物组合物可以通过本领域公知的方法制造，例如通过常规的混合、溶解、造粒、糖衣片制作、磨细、乳化、装胶囊、包埋或冷冻干燥的方法。
如此可使用一种或多种生理学可接受的载体以常规方式来配制根据本发明使用的药物组合物，所述载体包括赋形剂和助剂，它们能够促进活性成分加工成可在药学上使用的制品。适当的制剂取决于所选的施用途径。
对于注射，可以将药物组合物的活性成分配制在水溶液中，优选地在生理学上相容的缓冲液中，例如汉克斯液、林格氏液或者生理盐缓冲液。对于经粘膜施用，在制剂中使用了适合于待渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂是本领域公知的。
本文所述的药物组合物可以被配制用于肠胃外施用，例如，通过弹丸注射或连续输注。用于注射的制剂可以以单位剂量形式存在，例如与任选地添加的防腐剂一起在安瓿或者在多剂量容器中。所述组合物可以是处于油性或水性媒介物中的混悬液、溶液或乳液，并且可以包含配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
用于肠胃外施用的药物组合物包括水溶性形式的活性制品的水溶液。另外，可将所述活性成分的混悬液配制为适当的油性或基于水的注射混悬液。适合的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油例如芝麻油或合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。含水的注射混悬液可以包含增加混悬液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，所述混悬液还可以包含适合的稳定剂或物质，它们增加活性成分的溶解度以允许制备高浓缩溶液。
可选地，所述活性成分可以是粉末形式以供使用前与合适的媒介物一起构建，所述合适的媒介物例如基于无菌无热原的水的溶液。
适合于在本发明的背景中使用的药物组合物包括这样的组合物，其中包含了有效实现预定目的的量的活性成分。更具体而言，治疗有效量表示有效阻止、减轻或改善病症(例如神经退行性病症)的症状或者延长被治疗的受治疗者的存活的活性成分的量。
治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力之内，特别是按照本文提供的详细公开内容。
对于在本发明的方法中使用的任何制品，可从动物模型中估计达到希望的浓度或滴度的治疗有效量或剂量。此种信息可被用来更准确地确定在人体内的有用剂量。
本文所述的活性成分的毒性和治疗效果可通过实验动物中的标准药学程序确定。从这些动物研究中获得的数据可被用于配制供人使用的一系列剂量。所述剂量可以随着采用的剂量形式和利用的施用途径而改变。确切的制剂、施用途径和剂量可由个别医生考虑患者状况进行选择(参见例如，Fingl等人，1975，在″The Pharmacological Basis of Therapeutics(治疗法的药理学基础)″，第一章第一页中)。
可以个别地调整剂量的量值和间隔以提供足以诱导血糖量正常的细胞数(最小有效浓度，MEC)。MEC会因每种制品而不同，但是可以从体外数据中估计。达到MEC所需的剂量将取决于个体特征和施用途径。检测测定法可被用来确定血浆浓度。
当然，待施用的组合物的量将取决于被治疗的受治疗者、痛苦的严重度、施用的方式、处方医生的判断等等。
如果需要，本发明的组合物可以提供在一个包装或分配装置中，例如FDA批准的试剂盒，它可包括含有所述活性成分的一种或多种单位剂量形式。所述包装可以例如包括金属箔或塑料箔，例如吸塑包装。所述包装或分配装置可以附有施用说明书。所述包装或分配装置还可以容纳有一个与容器一起的通告，形式是管理药品生产、使用或销售的政府机构所规定的，所述通告反映了机构对组合物形式或者人或兽施用的批准。此种通告例如可以具有由美国食品药品管理局对处方药批准的标签或者批准的产品插页。配制于相容的药物载体中、包含本发明的制品的组合物还可以被制备、放在一个适当的容器中、并且被标记出用于治疗标明的病况，如同上述进一步详细说明的。
实验细节部分
现在参考下述实施例，它们连同以上的描述一起以非限制性方式说明了本发明。
总体上，本文使用的术语和在本发明中利用的实验程序包括分子的、生物化学的、微生物学的和重组DNA的技术。此类技术在下述文献中得到彻底地解释。参见例如，″Molecular Cloning：A laboratory Manual(分子克隆：实验手册)″Sambrook等人(1989)；″Current Protocols in MolecularBiology(现代分子生物学实验技术)″I-III卷Ausubel，R.M.，编(1994)；Ausubel等人″Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验技术)″，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，″A PracticalGuide to Molecular Cloning(分子克隆实践指南)″，John Wiley & Sons，NewYork(1988)；Watson等人″Recombinant DNA(重组DNA)″，ScientificAmerican Books，New York；Birren等人(编)″Genome Analysis：ALaboratory Manual Series(基因组分析：实验室手册系列)″，1-4卷，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；如在下述美国专利号中列出的方法学：4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057；″CellBiology：A Laboratory Handbook(细胞生物学：实验室手册)″，I-III卷Cellis，J.E.编(1994)；由Freshney，Wiley-Liss，N.Y.(1994)编的″Culture of AnimalCells-A Manual of Basic Technique(动物细胞的培养-基础技术手册)″第三版；″Current Protocols in Immunology(现代免疫学实验技术)″I-II卷Coligan J.E.编(1994)；Stites等人(编)，″Basic and Clinical Immunology(基础和临床免疫学)″(第8版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(编)，″Selected Methods in Cellular Immunology(细胞免疫学中的选择方法)″，W.H.Freeman及其他成员，New York(1980)；在下述专利和科学文献中广泛描述的可利用的免疫测定法，参见例如：美国专利号3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771以及5,281,521；″Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)″Gait，M.J.编(1984)；″Nucleic Acid Hybridization(核酸杂交)″Hames，B.D.和Higgins S.J.编(1985)；″Transcription and Translation(转录和翻译)″Hames，B.D.和Higgins S.J.编(1984)；″Animal Cell Culture(动物细胞培养)″Freshney，R.L编(1986)；″Immobilized Cells and Enzymes(固定化细胞和酶)″IRL Press，(1986)；″A Practical Guide to Molecular Cloning(分子克隆实践指南)″Perbal，B.，(1984)和″Methods in Enzymology(酶学方法)″1-317卷，Academic Press；″PCR Protocols：A Guide To Methods And Applications(PCR实验技术：方法和应用的指南)″，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等人″Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual(蛋白质纯化和表征的策略-实验室过程手册)″CSHL Press(1996)；所有这些文献均通过引用并入本文，就如同完全在此列出一样。本文件通篇提供了其他一般的参考。其中的程序被认为是本领域公知的并且是为方便读者而提供。其中包含的所有信息均通过引用并入本文。
实施例
材料
达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、热灭活的胎牛血清(FCS)、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素和EZ第一链cDNA合成RNA试剂盒、L-谷氨酰胺、G418和抗生素从Biological Industries(Beit Haemek，Israel)获得；多西环素、噻唑蓝(MTT)、醇脱氢酶、PES、潮霉素B、NADH和NAD来自Sigma(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)；Lipofectamin 2000来自Invitrogen(San Diego，CA)；(兔)抗人SOD1抗体来自Santa Cruz公司(USA)；多克隆(兔)抗GFP来自Abcam(UK)；山羊抗兔-IRDey-800来自Li-Cor；Taq DNA聚合酶来自Bioline(Luckenwalde，Germany)；SMART cDNA合成试剂盒pEGFP pECFP、pEYFP和pTRE2hyg质粒来自Clonetech；苹果酸和乳酸的测定试剂盒来自ENZYTEC(Germany)；μ-slide8孔板来自Ibidi(Germany)；蛋白A琼脂糖凝胶来自Amersham Bioscience；氨苄西林来自Applichem；并且pQBI25 fc1，2，3来自(Qbiogene/MPBiomedicals[Irvine，California])。
表达G93A-hSOD1-GFP和WT-hSOD1-GFP的可诱导形式的稳定细胞系
NSC-34细胞由Neil Cashman博士提供。含有野生型或G93A-突变的hSOD1cDNA的pcDNA3.1质粒由David Gozal博士提供。稳定表达在C端融合了GFP的WT-hSOD1或G93A-hSOD1的可诱导形式的NSC-34细胞系是通过用pUHD 172-1和pTRE2hyg-WT-hSOD1-GFP或pTRE2hyg-G93A-hSOD1-GFP的cDNA共转染获得的。
细胞培养
在37℃于5％CO2的加湿气氛中使NSC-34细胞生长于补充有5％的热灭活FCS、1mM谷氨酰胺和抗生素(100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素)的DMEM中。通过加入G418(700μg/mL)+潮霉素B(200ug/mL)，将WT-hSOD1和G93A-hSOD1细胞系保持在选择之中直至使用。用多西环素(1μg/mL；24h)孵育细胞以诱导WT-hSOD1-GFP和G93A-hSOD1-GFP蛋白的表达。
小鼠脊髓和运动皮质的cDNA文库构建。
因另一个研究项目被处死的C57黑色小鼠的新鲜离体的脑和脊髓是由D M Michaelson博士捐赠。使用EZ-RNA制备试剂盒从新鲜离体组织中制备了总RNA。使用SMART cDNA合成试剂盒根据用户手册使总RNA的小份(1ug)经历cDNA合成。使用包括一个NotI限制酶切位点的引物5′-CCTAGCGGCCGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′(SEQ ID NO：3)使第一链经历PCR扩增。用NotI消化cDNA并且使其经历与包含蓝色荧光蛋白(BFP)编码序列的一组3个载体pQBI25 fc 1，2，3连接。使连接产物电穿孔进入DH5α细菌，获得1*10^6个克隆。
为了评估文库的差异性，使用下述引物将来自转化的DH5α的代表量的克隆经PCR分析：正向引物5′-CATTACCTGTCCACACAATCTGCCC-3’(SEQ ID NO：4)，反向引物5′-CACCTACTCAGACAATGCGATGC-3′(SEQ ID NO：5)。将文库在含有氨苄西林的2XTY培养基中扩增过夜。通过离心收集细菌沉淀物(pellet)并将其悬浮于5ml的2XTY+15％甘油中，并在-70℃冷冻直至使用。
FRET分析
pQBI-BFP-GFP质粒的构建：制备了含有BFP-GFP嵌合体的质粒以用作FRET研究的阳性对照。用CIaI和NotI消化pQBI25质粒。使用下述引物通过PCR扩增将pEGFP质粒用来获得GFP DNA：正向引物5′-CTCAGATATCGATCTCAAGCT-3′(SEQ ID NO：6)，反向引物5′-CCTCTACAAATGTGGTATGGCTG-3′(SEQ ID NO：7)。用ClaI和NotI消化GFP DNA，并且使其经历与带有一个23个氨基酸接头的pQBI25质粒连接。
FRET活细胞筛选：使用lipofectamine转染试剂将小鼠的cDNA文库pQBI -BFP-GFP和pQBI质粒转染进入WT-hSOD1-GFP和G93A-hSOD1-GFP细胞中。24h后，加入1ug/ml的多西环素以诱导hSOD1-GFP嵌合体的表达。24h后，细胞用PBS洗涤、收集并且使用设定为0.133W和530/30nm发射滤光片的激发UV激光通过荧光激活细胞分选(FACS)进行分析。
将转染了pQBI-BFP-GFP的NSC-34细胞和转染了pQBI-BFP-GFP的WT-hSOD1-GFP细胞及G93A-hSOD1-GFP细胞用来鉴定具有阳性FRET信号的细胞。将转染了pQBI25(它含有BFP)的WT-hSOD1-GFP和G93A-hSOD1-GFP用来评价来自于BFP和GFP部分之间相互作用的FRET信号。将门控区域设定在由阳性FRET信号限定的群体上。使转染有小鼠脊髓和运动皮质文库的WT-hSOD1-GFP和G93A hSOD1-GFP细胞经历FACS以分选出显示阳性FRET信号的细胞。
从每个分选出的细胞中提取总RNA并且使用EZ-第一链cDNA合成RNA试剂盒使其经历RT，紧接着用下述引物PCR扩增：正向引物5′-CATTACCTGTCCACACAATCTGCCC-3′(SEQ ID NO：8)，反向引物5′-CACCTACTCAGACAATGCGATGC-3′(SEQ ID NO：9)。用NotI消化PCR产物并且将其重新克隆到pQBI50fc1、2、3质粒中。在这些克隆中，60个单独的克隆被测序。选择在G93A-hSOD1中重复出现但未在WT-hSOD1中重复出现的克隆用于进一步的共聚焦FRET和共免疫沉淀研究。
共聚焦FRET分析
YFP CFP荧光团质粒：用AgeI和HindIII消化含有CFP(氰基荧光蛋白)的pECFP质粒并且将其与含有WT-hSOD1和G93A-hSOD1cDNA的pcDNA3.1质粒连接。制备了含有NotI限制性酶切位点的一组3个载体pEYFP fc 1，2，3。这样，用EcoRI和BamHI消化pEYFP并使其与3对移框的寡核苷酸连接，每对含有NotI和EcoRV位点，具有下述序列：
框1正义5′-AATTCTGCGATATCGCGGCCGCG-3′(SEQ ID NO：10)；反义5′-GATCCGCGGCCGCGATATCGCA-3′(SEQ ID NO：11)；
框2正义5′-AATTCTGCCGATATCGCGGCCGCG-3′(SEQ ID NO：12)；反义5′-AATTCTGCCGATATCGCGGCCGCG-3′(SEQ ID NO：13)；
框3正义5′-AATTCTGCCGATATCGCGGCCGCG-3′(SEQ ID NO：14)；反义5′-GATCCGCGGCCGCGATATCGGGCA-3′(SEQ ID NO：15)。
从FACS分选的FRET阳性克隆中选择的克隆被克隆进入适合的pEYFP载体以产生所选克隆的pEYFP衍生物并且经历了共聚焦FRET分析。
共聚焦FRET分析：在一个μ-slide 8孔玻片中铺板1*10^5NSC-34细胞/孔。在有和没有所选克隆的pEYFP衍生物的情况下用pECFP-G93A-hSOD1和pECFP-WT-hSOD1转染细胞。此外，用所选克隆的pEYFP衍生物或者用单独的对照pEYFP转染细胞。使转染的细胞生长48h并且经历ZEISS共聚焦显微术。分别使用405nm和514nm的激光激发收集CFP和YFP的发射光谱，以及对于CFP激发而言在449到599之间的10nm发射窗口，以及对于YFP激发而言在524到599之间的10nm发射窗口。如(14)所述计算出FRET效率。表达胞质苹果酸脱氢酶(cytMDH)的一个克隆显示出高FRET效率并且被选定用于进一步的共免疫沉淀研究。
Pull-down免疫沉淀
用pCDNA3.1-WT-hSOD1和pEYFP-cytMDH或者用pCDNA3.1-G93A-hSOD1和pEYFP-cytMDH同转染NSC-34细胞。48小时后，细胞被溶解在增溶缓冲液(50mM Hepes PH7.5，150mM NaCl，10％甘油，1％Triton-X，1mM EDTA，1Mm EGTA和1.5mM MgCl2)中。使用固定在蛋白A偶联的琼脂糖珠上的抗hSOD1抗体使含有0.5mg蛋白的样品经历免疫沉淀。洗涤这些珠子并且将蛋白溶解在SDS上样缓冲液中。将样品煮沸3min并使其经历7.5％的聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹。
SOD1衍生物和YFP标记的MDH的免疫印迹和定量
将细胞溶解在pH-7.5的50mM Hepes缓冲液中，此缓冲液含有150mMNaCl、10％甘油、1％Triton X-100、1mM EDTA、1mM EGTA和1.5mMMgCl2。用十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液稀释细胞裂解物。将混合物煮沸3min并且储存在-80℃用于随后的分析。使蛋白(每个泳道100μg)经历7.5％(v/v)的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳并且将已分开的蛋白电印迹(electroblot)到硝酸纤维素膜上。通过用处于Tris缓冲盐水(TBST)中的5％(w/v)脱脂乳孵育将硝酸纤维素膜上的非特异性结合位点封闭1h，所述Tris缓冲盐水含有150mM NaCl、pH 7.4的10mM Tris-HCl和0.1％(v/v)Tween-20。将硝酸纤维素膜与在具有1％(w/v)牛血清白蛋白的TBST中1∶1000稀释的一抗(抗人SODl；抗GFP；抗β肌动蛋白)在4℃一起孵育过夜。在TBST中洗涤后，将硝酸纤维素膜与在TBST中1∶10,000稀释的连接IRDey-800的二抗在室温(20℃)下一起孵育1h，在TBST中洗涤并且经历在来自Li-Cor bioscience的odyssey荧光阅读仪上的分析。
线粒体和细胞溶胶组分的制备
铺板3.5*10^6G93A-hSOD1-GFP和WT-hSOD1-GFP细胞(各自12个10cm的板)。24h后向一半的板加入多西环素(1ug/ml)，并且48h后将细胞从板中刮去，将每两个板的细胞合并，通过离心收集。将细胞沉淀物(pellet)悬浮在含有250mM蔗糖和2mM EDTA的500ul的pH-7.4的10mMTris-HCl缓冲液中。使细胞经历3轮冻/融。然后加入0.5g的玻璃珠(60目)，将试管涡旋3次并离心(2000rpm 5min)。收集上清液(含有细胞溶胶和线粒体)并且以10,000rpm离心15min。收集上清液(细胞溶胶)和沉淀物(线粒体)。将沉淀物悬浮在含有250mM蔗糖和2mM EDTA的250ul的pH-7.4的10mM Tris-HCl缓冲液(含有0.5％Tween)中。
MDH酶活性的评估
将胞质组分的小份与含有2mM NADH的pH 7.4的100mM磷酸钾缓冲液一起孵育。反应开始于10mM草酰乙酸的加入(edition)，并且在′ultraspec 2000′上测量出NADH的降低，其测量条件为340nm，3min，3秒间隔。
乳酸和苹果酸的分析
使用细胞溶胶组分的小份(100ul)用EnzytecTM乳酸和苹果酸测定试剂盒来确定乳酸和苹果酸的浓度。
NADH NAD+的测量
如(15)所述通过分光光度酶循环酶测定法(spectrophotometricenzymatic cycling assay)测量了NAD+和NADH的浓度。对于NADH测定，将细胞溶胶和线粒体悬浮液的50μl小份在1N NaOH中稀释以产生0.2NNaOH浓度，并且在60℃加热20min以破坏NAD+。对于总NADH和NAD+的测定，将细胞溶胶和线粒体悬浮液的50μl小份在1N NaOH中稀释以产生0.2N NaOH浓度，没有加热。将加热的和未加热的样品的15ul小份与200ul的循环测定混合物一起在37℃孵育10min，所述循环测定混合物含有100mM Tris-HCl、2mM PES、0.5mM噻唑蓝、0.2mg/ml醇脱氢酶和0.6M乙醇。在OD 570nm读取NAD+吸光度(线性范围1-80nM NADH或NAD+)。
筛选出抑制MDH1与疾病蛋白缔合的肽物质
筛选方法是基于在氰基荧光蛋白(CFP)嵌合蛋白与黄色荧光蛋白(YFP)嵌合蛋白之间的荧光共振能量转移(FRET)系统。本发明人设计和使用这个系统来识别G93A SOD1与MDH1的特异性相互作用，以便在MDH1内识别出对G93A SOD1-MDH1相互作用至关重要的基序。测验的物质是从MDH1获得的肽。
制备了表达MDH1的小片段的Myc标记的肽文库。用AluI或/和DpnI消化MDH1 cDNA，并且将所述片段克隆以使得每个肽都被放在原蛋白的正确的阅读框中以及与人myc标签序列处于框内。在有和没有myc标记的文库的情况下，将G93A SOD1-CFP和MDH1-YFP表达质粒转染到NSC-34细胞中。
假设包含相互作用基序的特异性的MDH1衍生肽将与MDH1竞争G93A SOD1-MDH1相互作用位点。在这种情况中，G93A SOD1-CFP和MDH1-YFP的GFP和YFP荧光仍将存在，但是FRET信号将减少。使用具有405nm激发激光和530/30nm发射滤光片的一个细胞分选仪(FACS)进行筛选研究。没有显示FRET信号的CFP标记的细胞被分选出来。从分选的细胞中提取RNA，将其转化为cDNA并且经历PCR扩增以便扩增所述肽的DNA序列。
重新克隆来自分选细胞的DNA序列。获得了四个克隆，一个对应于cytMDH蛋白的氨基酸14-27 GQIAHSLLYSIGNG(SEQ ID NO：2)，而三个对应于cytMDH蛋白的氨基酸217-239SWLKGEFITTVQQRGAAVIKARK(SEQ ID NO：1)。在基于FACS的系统中重新分析已识别的克隆以验证其以1∶1∶1的比率水平竞争G93A SOD1一MDH1相互作用的能力。如此，用等量的G93A-hSOD1-CFP和cytMDH-YFP以及推测的表达myc标记的cytMDH肽的质粒来转染5*10^6NSC-34细胞。认为阻止FRET的肽(也就是使细胞群体移向FRET阴性门控区域的那些肽)损害G93A-hSOD1-CFP/cytMDH-YFP相互作用。
在这些条件下两个克隆中只有一个阻止FRET。识别的myc标记的肽被测序并被识别为cytMDH蛋白的氨基酸217-239SWLKGEFITTVQQRGAAVIKARK(SEQ ID NO：1)。
功能分析
如通过细胞存活所监测的，通过在表达突变的G93A SOD1-GFP的可诱导形式的NSC-34克隆中减轻鱼藤酮(一种线粒体抑制剂)或低葡萄糖的攻击评估了损失此种相互作用的功能重要性。合成了SWLKGEFITTVQQRGAAVIKARK(SEQ ID NO：1)肽(SBS Gentech北京)，其中在N端具有5，6-TAMRA修饰(以允许检测)。将TAMRA修饰的肽溶解在10％的乙酸中并且在含有1％乙醇的培养基中被加入到细胞培养基中。这样，在含10％血清的DMEM中将15,000个细胞(WT-hSOD1或G93A-hSOD1)接种在96孔板的每个孔中。24小时后，将细胞用1*10^-6M cytMDH肽(或乙酸/乙醇媒介物)孵育4h，没有血清。然后加入于含10％血清的DMEM中的1-10μmol/L鱼藤酮，持续24小时，或者将培养基更换为具有5％血清的低葡萄糖(1mg/ml)DMEM，持续72小时。然后评估细胞的存活。据预期，如果已识别的肽相互作用消除了G93ASOD1-GFP的毒性相互作用的获得，那么在鱼藤酮或低葡萄糖攻击时细胞的存活将提高。
辛酸作用的确定
在含10％血清的DMEM中将15,000个细胞(WT-hSOD1或G93A-hSOD1)接种在96孔板的每个孔中。24小时后，在DMEM，10％血清中有和没有1-10μmol/L鱼藤酮的情况下，将细胞与3mM辛酸一起孵育24小时。或者，用3mM的辛酸孵育细胞，并且将培养基更换为具有5％血清的常规(5mg/L)葡萄糖或低(1mg/ml)葡萄糖的DMEM持续72小时。然后评估细胞的存活。据预期，如果G93A SOD1-GFP的毒性相互作用的获得是由于苹果酸-天冬氨酸穿梭的抑制，那么辛酸将通过替代旁路提供替代的能量来源，并且在受鱼藤酮或低葡萄糖攻击时细胞的存活将提高。
细胞的存活
通过亚甲基蓝测定法评估了细胞的存活。用4％甲醛溶液将细胞固定1h，然后用0.1M的pH8.5硼酸钠缓冲液洗涤，用1％亚甲基蓝染色20min并且用水洗涤。用200μl的0.1MHCl洗脱细胞结合的染料。在ELISA板阅读仪中评估了在595nm的光密度。
结果
实施例1：FRET分析揭示G93A-hSOD1与cytMDH的相互作用
对于最初的筛选，使用以一种基因稳定转染的两种运动神经元衍生的细胞系(NSC-34)，所述基因可诱导地表达疾病的(G93A)和WT hSOD1基因，这些基因在C末端与要用作FRET受体的绿色荧光蛋白(GFP)相融合。从小鼠脊髓和皮质的运动神经元中产生了一个cDNA嵌合体文库，其中这些克隆在N末端与要用作FRET供体的BFP相融合。用细胞分选仪(FACS)进行筛选研究以收集显示出阳性FRET信号的细胞。原则上，在供体(BFP)激发过程中受体(GFP)的发射应该指示出阳性FRET信号，并因此被解释为供体标记蛋白与受体标记蛋白接近的证据。然而，因为在GFP和BFP光谱中的重叠，所测量的由FRET引起的GFP发射总是被GFP的直接激发和GFP范围内的BFP发射污染。为了克服这些问题，首先构建了BFP-GFP嵌合体以用作FRET信号的阳性对照并且在由阳性信号所限定的群体上设定FACS门控区域。图1描绘了被转染到G93A-hSOD1-GFP(图1A)和亲代NSC-34(图1B)细胞系中的BFP-GFP嵌合体和BFP表达质粒的FACS分析。以GFP-BFP嵌合体转染的G93A-hSOD1-GFP细胞的FACS分析揭示了两个不同的细胞群体(R1和R2)。在不存在GFP标记的hSOD1时，这些群体中仅有一个(R2)出现在以BFP-GFP嵌合体转染的NSC-34细胞中，这样鉴定R1为来自GFP标记的h-SOD1蛋白的污染(非FRET)荧光。以BFP转染的G93A-hSOD1-GFP细胞的FACS分析(图1C)揭示了与GFP荧光团和没有污染的BFP发射光的非FRET荧光相对应的单一的细胞群体(R1)。因而R2被界定为阳性FRET群体。因而，仅当来自BFP标记的文库的蛋白与G93A-hSOD1-GFP或WT-hSOD1-GFP紧密靠近时产生这种FRET阳性细胞群体。因而，FACS门控区域被设定在R2群体上以分选出这样的细胞：其中来自小鼠运动-皮质脊髓文库的hSOD1-GFP衍生物与BFP标记的候选蛋白之间存在明显缔合。
用BFP标记的文库转染G93A-hSOD1-GFP和WT-hSOD1-GFP NSC-34细胞并诱导其表达hSOD1蛋白。使用FACS分选出显示阳性FRET信号的单一细胞。初始的筛选鉴定出许多FRET阳性的候选BFP标记的蛋白，所述蛋白看来似乎有差别地与G93A-hSOD1-GFP相互作用但不与WT-hSOD1-GFP相互作用。出现得最频繁的是HSP-70，它已经显示出与hSOD1(16)、髓鞘、醛缩酶-1a、转铁蛋白、驱动蛋白-5a的3′端以及胞质苹果酸脱氢酶(cytMDH)相互作用。
实施例2：通过共聚焦显微术使用不同的荧光团对证实G93A-hSOD1-cytMDH相互作用
通过共聚焦显微术在单细胞水平上进一步表征了在每种候选蛋白与G93A-hSOD1和WT-hSOD1蛋白之间的相互作用，这次使用了一组不同的供体(CFP)和受体(YFP)荧光团以排除识别出由荧光团本身驱使的蛋白相互作用的可能性。编码与CFP融合的G93A-hSOD1和WT-hSOD1的表达质粒被制备作为FRET供体，并且编码与每个候选相互作用蛋白相融合的YFP的质粒被制备作为FRET受体。将CFP连接到SOD1的C端，并且将YFP连接到候选蛋白的N端。用与CFP相融合的G93A-hSOD1或WT-hSOD1的表达质粒和/或编码与候选相互作用蛋白相融合的YFP的表达质粒瞬时转染NSC-34细胞，并且48小时后通过FRET共聚焦显微术评估相互作用。FRET被测量为在供体(CFP)激发过程中增强的受体(YFP)发射。然而，因为在GFP和YFP光谱中的重叠，所测量的由FRET引起的YFP发射被YFP的直接激发和YFP范围内的CFP发射污染。为了克服这些局限，使用如(14)所述的光谱测量将FRET效率量化。当表达G93A-hSOD1-CFP和YFP标记的候选蛋白的细胞在405nm供体激发时获得发射光谱(图2A，数据集A)。FRET相关的YFP发射(F405)是通过减去从只表达G93A-hSOD1-CFP的对照细胞收集的CFP光谱得出的(图2A，数据集B)。还测量了当受体直接激发时的YFP光谱(F514)。计算出表达G93A-hSOD1-CFP和YFP标记的候选蛋白的细胞在405nm和514nm激发时获得发射光谱的比值(F405/F514)(比值A；图2B)。类似地计算出只表达YFP标记的蛋白的细胞在405nm和514nm激发时获得的发射光谱的比值(F405/F514)(比值A0；图2B)。因为比值A不依赖于波长，所以它被用来检查由其他荧光来源(14)产生的显著污染。与FRET效率成正比的差值(比值A-比值A0)被计算为接近指标(indicatorof proximity)。对表达WT-hSOD1-CFP和YFP标记的候选蛋白的细胞(图2C，数据集A)和只表达WT-hSOD1-CFP的细胞(图2C，数据集B)进行类似的测量。相应地评估了比值A和比值A0(图2D)。在筛选中识别的六种候选蛋白中，对于G93A-hSOD1-CFP只有YFP-cytMDH在这个系统中显示阳性FRET信号(图2A-2B)。对于WT-hSOD1-CFP没有看到此种信号(图2C-2D)。因而，如在图2中所显示的，只有表达G93A SOD1cytMDH的细胞在用供体激发波长激发后在受体发射波长内表现出发射。
实施例3：使用共免疫沉淀证实G93A-hSOD1-cytMDH相互作用
接下来进行共免疫沉淀研究来进一步证实G93A-hSOD1cytMDH相互作用。为了避免由于潜在的相互作用蛋白之一过量而形成复合物，用等量的未标记的WT-hSOD1或G93A-hSOD1与cytMDH-YFP共转染亲代NSC-34细胞。细胞被溶解，用抗hSOD1抗体进行免疫沉淀。使沉淀的蛋白经历SDS凝胶电泳接着用抗GFP抗体免疫印迹。如在图3中所描绘的，表达了相当量的CFP标记的G93A-hSOD1和WT-hSOD1与cytMDH-YFP。cytMDH-YFP与G93A-hSOD1共免疫沉淀但不与WT-hSOD1共免疫沉淀，由此进一步证实了cytMDH-YFP-G93A-hSOD1相互作用。
YFP标记的cytMDH保留了正常功能。这通过在以cytMDH-YFP(外源性MDH)和单独的YFP(内源性MDH)转染的首次使用的NAC-34细胞中测量MDH活性而显示，其指出在以外源性cytMDH转染的细胞中草酰乙酸催化转化为苹果酸的催化转化率提高了近3倍(图4)。
实施例4：G93A-hSOD1上调cytMDH但降低了体内cytMDH活性
然后评估了G93A-hSOD1-GFP和WT-hSOD1-GFP对内源性cytMDH的表达的影响。图5中示出了在多西环素诱导(为诱导hSOD1-GFP蛋白的表达)前和诱导后在G93A和WT hSOD1-GFP细胞系中内源性cytMDHRNA的表达。在诱导G93A-hSOD1-GFP的表达后观察到cytMDH mRNA显著上调2.4倍，而在诱导WT-hSOD1-GFP表达后未发现降低。
为了评价是否内源性cytMDH酶活性受G93A-hSOD1的存在影响，在稳定地含有用和不用多西环素处理的可诱导的G93A-hSOD1-GFP和WT-hSOD1-GFP的细胞系的细胞的裂解物中体外评估了内源性cytMDH活性。与非诱导的细胞相比，在G93A-hSOD1-GFP细胞的裂解物中草酰乙酸转化为苹果酸的转化率只略微(10％)提高。在非诱导的WT-hSOD1-GFP细胞中的相应cytMDH活性可与非诱导的G93A-hSOD1-GFP细胞相比，并且在诱导WT-hSOD1表达之后没有改变(图5)。
接下来测量了细胞的乳酸和苹果酸水平以评价G93A-hSOD1在完整的细胞中对cytMDH活性的影响。认为如果抑制了cytMDH活性，那么草酰乙酸转化为苹果酸将被抑制，并将因此降低苹果酸水平。此外，这个反应伴随的NADH转化为NAD+将因此通过替代途径也就是丙酮酸转化为乳酸而发生，由此导致乳酸水平升高。因而在表达G93A-hSOD1-GFP和WT-hSOD1-GFP的可诱导形式的稳定细胞系中评估了苹果酸和乳酸的水平。在没有(非诱导的)或有以多西环素48小时处理的这些细胞中所测量的苹果酸和乳酸的水平被描绘在图6中。尽管内源性酶的表达提高(图5)，但是诱导G93A-hSOD1-GFP的表达导致乳酸水平显著提高和苹果酸水平的显著降低。对于表达WT-hSOD1-GFP的细胞没有看到此种效应。值得注意的是，甚至在非诱导状态，G93A-hSOD1-GFP细胞与表达WT-hSOD1-GFP细胞的细胞相比具有更高的乳酸值和更低的苹果酸值。
在有或没有hSOD1诱导的两种细胞系中评估了草酰乙酸向苹果酸转化的效率改变对细胞溶胶和线粒体中的NADH/NAD+比值的影响(图7)。在非诱导的G93A-hSOD1-GFP细胞与WT-hSOD1-GFP细胞之间不存在细胞溶胶中的NADH/NAD+上的显著差异。与非诱导的G93A-hSOD1-GFP细胞以及WT-hSOD1-GFP细胞相比，在诱导的细胞中细胞溶胶内的NADH/NAD+比值没有差别。然而，在线粒体中，在非诱导的G93A-hSOD1-GFP细胞中的NADH/NAD+比值显著高于在WT-hSOD1-GFP细胞中的NADH/NAD+比值。发现在对G93A-hSOD1-GFP的表达的48小时诱导后，在线粒体中NADH/NAD+比值显著升高，但WT-hSOD1-GFP没有。
实施例5：抑制在MDH1与突变的G93A-hSOD1之间复合物形成的肽物质的鉴定
显示四种质粒表达与SOD1相互作用的肽。当然，在这些质粒当中，一个对应于cytMDH蛋白的氨基酸14-27GQIAHSLLYSIGNG(SEQ ID NO：2)，而三个对应于已鉴定的肽的氨基酸217-239，所述已鉴定的肽对应于cytMDH蛋白SWLKGEFITTVQQRGAAVIKARK(SEQ ID NO：1)(图8)。MDH1的限制图谱和用于文库制备的酶与SEQ ID NO：1一致，对应于MDH1的核苷酸745-807，也就是66-核苷酸片段730-796。
具有序列SWLKGEFITTVQQRGAAVIKARK(SEQ ID NO：1)的翻译的肽217-239位于MDH1表面，接近MDH1的二聚位点(图8；肽用黄色凸显，MDH1的单体单元用蓝色和绿色凸显。NADH用棍球模型表示)。
通过将编码myc标记的217-239蛋白和能够FRET的G93A-hSOD1/cytMDH蛋白的构建体共转染到NSC-34细胞中，接着通过测量FRET的FACS分析，测验了217-239肽破坏G93A-hSOD1-cytMDH1复合物的能力。如在图9中所示，217-239肽阻断了FRET，指示出G93A-hSOD1/cytMDH复合物的破坏；将含有217-239肽的(C)与缺少217-239肽的(B)相比。利用以编码G93A-hSOD1-CFP和YFP的构建体转染的细胞作为阴性FRET对照(A)，而用编码G93A-hSOD1-CFP/cytMDH-YFP和myc标记的14-27肽的构建体共转染的细胞(D)未被发现以1∶1∶1的化学计量抑制这两种蛋白之间的相互作用，将其用作myc标签非特异性作用的对照。
实施例6：在鱼藤酮的存在下G93A-hSOD1-cytMDH相互作用的抑制提高了细胞的存活
材料和实验方法
合成了SWLKGEFITTVQQRGAAVIKARK(SEQ ID NO：1)肽(SBSGentech北京)，其中在N端具有5，6-TAMRA修饰(以允许检测)，将合成的肽溶解在10％乙酸中，并且在含有1％乙醇的细胞培养基中进行稀释。这样，在含10％血清和多西环素(以诱导hSOD1蛋白的表达)的DMEM中将15,000个细胞(WT-hSOD1或G93A-hSOD1)接种在96孔板的每个孔中。24小时后，将培养基更换为无血清的DMEM，并且用1微摩尔/升的TAMRA标记的SWLKGEFITTVQQRGAAVIKARK肽或媒介物(1％乙酸/乙醇)孵育细胞4小时。在一些实验中，然后加入0.5μmol/L的鱼藤酮并且再继续孵育24小时(图10A)。在其他实验中，将培养基更换为具有肽或媒介物的5％血清的低葡萄糖(1mg/ml)的DMEM并且再继续孵育72小时(图10B)。然后评估细胞的存活。
结果
评估了217-239肽对由线粒体抑制剂鱼藤酮在表达WT-hSOD1-GFP和G93A-hSOD1-GFP的细胞上引起的细胞死亡的影响。据预期，如果G93A-hSOD1通过毒性相互作用的获得引起细胞死亡，那么这应当加剧鱼藤酮诱导的死亡，并且这种加剧应当通过用217-239肽抑制这种相互作用而缓解。
在其培养基被更换为无血清的DMEM之后，用多西环素诱导WT-hSOD1或G93A-hSOD1细胞的表达，并且用1μmol/L的TAMRA-SWLKGEFITTVQQRGAAVIKARK肽或媒介物(1％乙酸/乙醇)孵育细胞，接着加入鱼藤酮。用鱼藤酮进行的处理在G93A-hSOD1-GFP细胞中比在WT-hSOD1-GFP细胞中更大程度上降低了细胞生存力，如通过亚甲基蓝测定法所测量出的(相对于没有鱼藤酮的存活)。在217-239肽的存在下，在G93A-hSOD1-GFP细胞系中鱼藤酮的影响被大大地减小，但在非诱导的WT-hSOD1-GFP细胞系中没有(图10A)。
在其他实验中，加入肽后紧接着将培养基更换为具有肽或媒介物的5％血清的低葡萄糖(1mg/ml)DMEM。低葡萄糖水平在G93A-hSOD1-GFP细胞中比在WT-hSOD1-GFP细胞中更大程度上降低了细胞生存力，如通过亚甲基蓝测定法所测量出的(相对于具有正常葡萄糖的存活)。在217-239肽的存在下，在G93A-hSOD1细胞系中低葡萄糖的影响被显著地减小，但在非诱导的WT-hSOD1细胞系中没有(图10B)。
这些发现显示G93A-hSOD1-cytMDH相互作用的抑制通过抑制这种毒性相互作用的获得而提高了细胞的存活。
实施例7：G93A SOD1-GFP的毒性相互作用的获得是由于苹果酸-天冬氨酸穿梭的抑制
评估了辛酸对受鱼藤酮和低葡萄糖攻击的表达WT-hSOD1-GFP和G93A-hSOD1-GFP的细胞存活的影响(图11)。用鱼藤酮进行的处理(1.25(mol/L持续24h)在G93A-hSOD1-GFP表达细胞中比在WT-hSOD1-GFP表达细胞中更大程度上降低了细胞生存力，如通过亚甲基蓝测定法所测量出的(相对于没有鱼藤酮的存活)。在辛酸的存在下，在G93A-hSOD1-GFP细胞系中鱼藤酮的影响被大大地减小，但在非诱导的WT-hSOD1-GFP细胞系中没有(图11A)。低葡萄糖水平在G93A-hSOD1-GFP细胞中比在WT-hSOD1-GFP细胞中更大程度上导致降低了细胞生存力，如通过亚甲基蓝测定法所测量出的(相对于具有正常葡萄糖的存活)。在辛酸的存在下，在G93A-hSOD1-GFP细胞系中低葡萄糖的影响被大大地减小，但在非诱导的WT-hSOD1-GFP细胞系中没有(图11B)。因此，G93A SOD1-GFP的毒性相互作用的获得是由于苹果酸-天冬氨酸穿梭的抑制。
如本文所提供的，在活的运动神经元来源的细胞中，使用新颖的FRET技术鉴定了在突变的hSOD1-GFP(疾病蛋白)与BFP标记的cytMDH之间的相互作用，对于野生型hSOD1-GFP所述作用并未发生。此外，使用共聚焦显微术利用不同的一对荧光团和瞬时转染到亲代NSC-34细胞系中在这些蛋白之间显示出紧密的靠近。在细胞中使用pull-down免疫沉淀技术，在BFP标记的cytMDH与未标记的突变hSOD1之间显示了进一步的相互作用，对于未标记的WT-hSOD1所述作用并未发生。标记的cytMDH保留了MDH酶活性，表明其构象大部分是正常的。此外，突变蛋白的表达影响了内源性cytMDH的表达(增加)以及细胞苹果酸的(降低)和乳酸(增加)的水平以及在线粒体中的NADH/NAD+比值(提高)，所有这些结果都与内源性cytMDH被G93A-hSOD1抑制的结果相容，并且未在WT-hSOD1中看到。
苹果酸脱氢酶(MDH，L-苹果酸：NAD氧化还原酶，EC 1.1.1.37)在细胞质(cytMDH)和线粒体(MitMDH)中催化苹果酸和草酰乙酸的NAD/NADH依赖性互变。这个反应在跨越线粒体膜的细胞质之间的三羧酸循环中和在线粒体基质内的苹果酸/天冬氨酸穿梭中起关键作用。在突变的hSOD1与cytMDH之间的缔合可能依赖于这些蛋白的结构特性并且暗示所述突变的hSOD的一些结构特性不同于野生型酶的结构特性。这个概念与突变体蛋白形成凝集物和包涵体而野生型蛋白没有形成凝集物和包涵体是相容的(3，17)。胞质的MDH和mitMDH有共同的催化机理并且它们的动力学特性是相似的，这表明高度的结构相似性(3)。因此在G93A-hSOD1与cytMDH之间相互作用的特异性可能是因为二者优先的细胞质定位。
胞质MDH在苹果酸-天冬氨酸穿梭中是一种关键的酶，所述苹果酸-天冬氨酸穿梭是脑中最重要的穿梭并且在神经元中是特别重要的。苹果酸-天冬氨酸穿梭和甘油磷酸穿梭发挥作用来将还原当量从细胞溶胶中的NADH传递到线粒体，因为线粒体内膜对NADH和NAD+是不可渗透的(18)。因此，在细胞质中，cytMDH将草酰乙酸转化为苹果酸，同时将细胞溶胶中的NADH再氧化为NAD+。然后苹果酸进入线粒体作为对α-酮戊二酸的交换。线粒体的MDH是三羧酸(TCA)循环的酶的部分，将苹果酸转化成草酰乙酸，同时还原NAD+，形成等量的NADH。这种还原当量的传递对于保持葡萄糖的氧化代谢所需的理想的NAD+/NADH比值和脑中神经递质的合成是必不可少的。因此，这种穿梭的抑制损害了葡萄糖的利用，葡萄糖是神经元中代谢能量的主要来源，偏爱厌氧选择(乳酸的形成)胜过需氧选择(TCA循环)并导致较低的ATP产量。已经显示苹果酸-天冬氨酸穿梭的抑制降低了猪静动脉条(carotid arterial strip)中的氧消耗(19)，由此导致了与丙酮酸向乳酸的厌氧转化增加有关的细胞中的局部缺血状况。在此种状况下，比在ATP产生方面更有效的丙酮酸通过三羧酸(TCA)循环的氧化代谢减少了(18)。局部缺血状况提高了线粒体的NADH/NAD+比值(20)。在此呈现的这些研究的结果与cytMDH的抑制以及从而在表达突变的hSOD1的细胞中的苹果酸-天冬氨酸穿梭是相容的。因而，苹果酸水平降低而乳酸水平提高了，证实了厌氧状况，并且线粒体的NADH/NAD+比值相应提高了。通过这条路线，G93A-hSOD1与cyt-MDH之间的相互作用通过TCA循环减少了最大能量利用，由此使细胞转向厌氧呼吸和低氧状态。
苹果酸-天冬氨酸穿梭的抑制另一个关联是在表达突变的hSOD的细胞中活性氧类别(ROS)的增加。α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)是TCA循环中的关键的酶之一，其活性由NADH/NAD+比值调节。较高的NADH/NAD+比值诱导了较高的通过该酶的H2O2生产率。观察到的NADH/NAD+比值提高可因此促进α-KGDH介导的ROS的产生(21)。已显示ROS的增加诱导MDH表达(22)。这里显示的在表达G93A-hSOD1的细胞中cytMDH表达的上调因此与该细胞中升高的ROS是一致的。尽管cytMDH表达上调，酶活性在这些细胞中只略微增强的事实与突变的hSOD1蛋白对所述酶活性的抑制是相容的。
令人感兴趣的是，注意到与WT-hSOD1细胞中的对应值相比，甚至非诱导的G93A-hSOD1细胞都具有显著更高的乳酸水平和线粒体的NADH/NAD+比值。与大多数可诱导的系统一样，在非诱导的细胞的突变蛋白的表达中存在大约10％的遗漏(leakage)。最近的研究指出低水平的G93A-hSOD1足以增加ROS的产生并足以引起线粒体的损坏和NSC-34细胞的死亡(4)。因而我们假定甚至可诱导质粒的表达的轻微遗漏都足以在G93A-hSOD1细胞中引发一定的低氧状态。
因此，在突变的G93A-hSOD1蛋白与cytMDH之间的相互作用可能引起苹果酸-天冬氨酸穿梭的抑制，从而导致线粒体中的NADH/NAD+比值提高。后者导致α-KGDH的抑制并且升高了有害ROS的产生。ROS的增加可抑制HIF-1α-脯氨酰基-4-羟化酶(PHD)的活性，该酶发挥作用以增强低氧诱导因子1α的降解(23)。此外，胞质的PHD底物α-酮戊二酸的减少还可以导致PHD活性降低，从而引起HIF-1α的增加。另一方面，HIF-1α诱导PHD的表达，由此促进其自身的降解(24)。的确，之前的研究已证明表达G93A-hSOD1的神经元是处于长期的低氧状态，如在HIF-1α上调和在这些细胞中受损的低氧反应中所证明的那样(Mali & Zisapel未公布)。因此，苹果酸-天冬氨酸穿梭的抑制可通过PHD酶活性的调控解释在表达G93A-hSOD1的细胞中对低氧的细胞反应的失调。
受损的苹果酸-天冬氨酸穿梭的另一个方面是神经递质特别是谷氨酸的合成受损。胞质天冬氨酸氨基转移酶将天冬氨酸转化成草酰乙酸，同时将α-酮戊二酸转化成谷氨酸。苹果酸-天冬氨酸穿梭的抑制显著降低了神经递质谷氨酸在突触小体中的生物合成(28)。在ALS中还报道了异常的谷氨酸代谢。已报道了在ALS患者的脑组织和脊髓组织中减少的谷氨酸水平。谷氨酸脱氢酶的活性是将α-酮戊二酸转化成谷氨酸，发现谷氨酸脱氢酶的活性在来自ALS患者的白细胞中减少了(30)。
应当理解的是，为了清楚而在不同的实施方案的背景中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中以组合方式提供。相反，为了简明而在单个实施方案的背景中描述的本发明的各种特征也可以单独地或者以任何适宜的亚组合方式提供。
尽管已结合本发明的具体实施方案描述了本发明，很显然许多替代、修改和变化对本领域的技术人员将是明显的。相应地，旨在包括落在所附权利要求的精神和宽范围之内的所有此类替代、修改和变化。在本说明书中提及的所有公开文件、专利和专利申请均通过引用到本说明书中以全文并入本文，其程度如同每个个别的公开文件、专利或专利申请均被具体地和个别地指出是通过引用并入本文的。此外，在本申请中的任何参考文献的引用或识别不应当被解释为承认此类参考文献可用作本发明的现有技术。
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序列表
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<120>神经退行性疾病的细胞质苹果酸脱氢酶(MDH1)靶向治疗
 
<130>RAMOT/025 PCT
 
<160>15
 
<170>PatentIn version 3.5
 
<210>1
<211>23
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
 
<400>1
 
Ser Trp Leu Lys Gly Glu Phe Ile Thr Thr Val Gln Gln Arg Gly Ala
1               5                   10                  15
Ala Val Ile Lys Ala Arg Lys
            20
 
<210>2
<211>14
<212>PRT
<213>小鼠
 
<400>2
 
Gly Gln Ile Ala His Ser Leu Leu Tyr Ser Ile Gly Asn Gly
1               5                   10
 
<210>3
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸
 
<400>3
cctagcggcc gcaagcagtg gtatcaacgc agagt    35
 
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸
 
<400>4
 
cattacctgt ccacacaatc tgccc               25
 
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸
 
<400>5
cacctactca gacaatgcga tgc                 23
 
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸
 
<400>6
ctcagatatc gatctcaagc t                   21
 
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸
 
<400>7
cctctacaaa tgtggtatgg ctg         23
 
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸
 
<400>8
cattacctgt ccacacaatc tgccc       25
 
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸
 
<400>9
cacctactca gacaatgcga tgc         23
 
<210>10
<211>23
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<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸
 
<400>10
aattctgcga tatcgcggcc gcg         23
<210>11
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸
 
<400>11
gatccgcggc cgcgatatcg ca        22
 
<210>12
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
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<400>12
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<210>13
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
 
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gatccgcggc cgcgatatcg gca       23
 
<210>14
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸
 
<400>14
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<210>15
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>合成的寡核苷酸
 
<400>15
gatccgcggc cgcgatatcg ggca    24

Claims (44)

1.一种药物组合物，包含药学上可接受的载体和作为活性成分的、能够阻止在苹果酸脱氢酶与构象改变的或突变的蛋白之间相互作用的物质，其中所述突变的蛋白与神经退行性病症相关。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述神经退行性病症是肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述构象改变的或突变的蛋白是突变的SOD1蛋白。
4.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述物质是肽物质。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其中所述肽物质包含人苹果酸脱氢酶的至少4-7个连续的氨基酸。
6.如权利要求4所述的药物组合物，其中所述肽物质包含SEQ ID NO：1。
7.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述苹果酸脱氢酶蛋白是胞质苹果酸脱氢酶(cytMDH)蛋白。
8.一种在需要它的受治疗者中治疗由胞质苹果酸脱氢酶与构象改变的或突变的蛋白形成复合物所引起的神经退行性病症的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用治疗有效量的能够减少所述胞质苹果酸脱氢酶与所述构象改变的或突变的引起神经退行性疾病的蛋白之间相互作用的物质，其中所述构象改变的或突变的引起神经退行性疾病的蛋白与所述神经退行性疾病相关，由此治疗受治疗者的神经退行性病症。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述神经退行性病症是肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述构象改变的或突变的蛋白是突变的SOD1蛋白。
11.如权利要求8所述的方法，其中所述物质是肽物质。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述肽包含人苹果酸脱氢酶的至少4个连续的氨基酸。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述肽包含SEQ ID NO：1。
14.如权利要求8所述的方法，其中所述苹果酸脱氢酶是胞质苹果酸脱氢酶(cytMDH)。
15.一种治疗神经退行性病症的方法，所述方法包括向需要它的个体施用治疗有效量的能够增加脑线粒体呼吸的物质，由此治疗所述神经退行性病症，条件是所述物质不是丙酮酸或草酰乙酸。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述物质能够提高细胞质的苹果酸水平。
17.权利要求16所述的方法，其中所述物质是肽物质。
18.权利要求15所述的方法，其中所述肽物质包含人苹果酸脱氢酶的至少4-7个氨基酸。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述肽物质如SEQ ID NO：1中所列出。
20.如权利要求15所述的方法，其中所述物质是小分子。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述小分子选自由苹果酸、辛酸、α-酮戊二酸、琥珀酸和富马酸组成的组。
22.如权利要求15所述的方法，其中所述物质能够上调苹果酸脱氢酶的活性。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述物质能够上调乙酰辅酶A。
24.如权利要求15所述的方法，其中所述苹果酸脱氢酶蛋白是胞质苹果酸脱氢酶(cytMDH)蛋白。
25.一种鉴定能够治疗ALS的物质的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将所述物质与已知初始量的、苹果酸脱氢酶和突变的SOD1蛋白的复合物相接触，其中所述突变的SOD1蛋白与肌萎缩性侧索硬化症(ALS)相关；并且
(b)在所述物质存在时测量所述复合物的量，
由此，如果在所述物质存在时所述复合物的所述量小于所述已知初始量，那么所述物质能够治疗肌萎缩性侧索硬化症。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述复合物被荧光标记并且测量所述复合物的量的步骤是通过测量来自所述复合物的信号来进行的。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述信号包含FRET。
28.如权利要求25所述的方法，其中所述苹果酸脱氢酶蛋白是胞质苹果酸脱氢酶(cytMDH)蛋白。
29.一种鉴定能够治疗ALS的物质的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在所述物质存在时，将苹果酸脱氢酶蛋白与突变的SOD1蛋白相接触，其中所述突变的SOD1蛋白与肌萎缩性侧索硬化症(ALS)相关；
(b)接着步骤(a)，测量所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的SOD1蛋白之间复合物形成的量；
(c)在所述物质不存在时将所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的SOD1蛋白相接触；并且
(d)接着步骤(c)，测量所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的SOD1蛋白之间复合物形成的量，
由此，如果步骤(b)的所述量小于步骤(d)的所述量，那么所述物质能够治疗肌萎缩性侧索硬化症。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述复合物被荧光标记并且测量所述复合物的量的步骤是通过测量来自所述复合物的信号来进行的。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述信号包含FRET。
32.如权利要求29所述的方法，其中所述苹果酸脱氢酶蛋白是胞质苹果酸脱氢酶(cytMDH)蛋白。
33.一种鉴定能够治疗神经退行性病症的物质的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将所述物质与已知初始量的、苹果酸脱氢酶和突变的蛋白的复合物相接触，其中所述突变的蛋白与所述神经退行性病症相关；并且
(b)在所述物质存在时测量所述复合物的量，
由此，如果在所述物质存在时所述复合物的所述量小于所述已知初始量，那么所述物质能够治疗所述神经退行性病症。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述突变的蛋白选自由以下组成的组：α-突触核蛋白、帕金蛋白、PINK1、DJ-1、ATP13A2、β淀粉样肽(Aβ)、亨廷顿蛋白、雄激素受体和微管相关蛋白tau的突变形式。
35.如权利要求33所述的方法，其中所述神经退行性病症选自由以下组成的组：帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、肯尼迪病、皮克氏病(PID)、进行性核上麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、以及与17号染色体相关的额颞痴呆伴帕金森综合征(FTDP-17)。
36.如权利要求33所述的方法，其中所述复合物被荧光标记并且测量所述复合物的量的步骤是通过测量来自所述复合物的信号来进行的。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述信号包含FRET。
38.如权利要求33所述的方法，其中所述苹果酸脱氢酶蛋白是胞质苹果酸脱氢酶(cytMDH)蛋白。
39.一种鉴定能够治疗神经退行性病症的物质的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在所述物质存在时，将苹果酸脱氢酶蛋白与突变的蛋白相接触，其中所述突变的蛋白与所述神经退行性病症相关；
(b)接着步骤(a)，测量所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的蛋白之间复合物形成的量；
(c)在所述物质不存在时将所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的蛋白相接触；并且
(d)接着步骤(c)，测量所述苹果酸脱氢酶蛋白与所述突变的蛋白之间复合物形成的量，
由此，如果步骤(b)的所述量小于步骤(d)的所述量，那么所述物质能够治疗所述神经退行性病症。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述突变的蛋白选自由以下组成的组：α-突触核蛋白、帕金蛋白、PINK1、DJ-1、ATP13A2、β淀粉样肽(Aβ)、亨廷顿蛋白、雄激素受体和微管结合蛋白微管相关蛋白tau的突变形式。
41.如权利要求39所述的方法，其中所述神经退行性病症选自由以下组成的组：帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、肯尼迪病、皮克氏病(PID)、进行性核上麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、以及与17号染色体相关的额颞痴呆伴帕金森综合征(FTDP-17)。
42.如权利要求39所述的方法，其中所述复合物被荧光标记并且测量所述复合物的量的步骤是通过测量来自所述复合物的信号来进行的。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述信号包含FRET。
44.如权利要求39所述的方法，其中所述苹果酸脱氢酶蛋白是胞质苹果酸脱氢酶(cytMDH)蛋白。
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