CN101812477A - 靶向抗肿瘤的表达超抗原sea基因的溶瘤腺病毒载体的构建 - Google Patents
靶向抗肿瘤的表达超抗原sea基因的溶瘤腺病毒载体的构建 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101812477A CN101812477A CN200910031699A CN200910031699A CN101812477A CN 101812477 A CN101812477 A CN 101812477A CN 200910031699 A CN200910031699 A CN 200910031699A CN 200910031699 A CN200910031699 A CN 200910031699A CN 101812477 A CN101812477 A CN 101812477A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sea
- superantigen
- oncolytic adenovirus
- gene
- tumor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种肿瘤的基因治疗，具体涉及一种靶向抗肿瘤的表达超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒载体的构建，属基因工程技术领域。它包括溶瘤腺病毒部分和超抗原部分，所述的溶瘤腺病毒部分分为溶瘤腺病毒穿梭质粒pSG218与病毒骨架质粒pPE3-ccdB，通过脂质体共转染HEK293细胞，超抗原部分为金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因片段，它以肿瘤特异性增殖腺病毒质粒为载体，携带超抗原SEA基因片段，并进一步与病毒骨架质粒重组包装成溶瘤腺病毒-超抗原复合物，该复合物将既具有在肿瘤细胞内特异性增殖能力又具有强大细胞毒T淋巴细胞刺激能力，进而对肿瘤细胞产生强大的靶向治疗效。
Description
技术领域
本发明涉及一种肿瘤的基因治疗，具体涉及一种靶向抗肿瘤的表达超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒载体的构建，属基因工程技术领域。
背景技术
肿瘤是危害人类健康的顽症之一，尽管除了手术、放疗和化疗，还有导向治疗、肿瘤疫苗和基因治疗等多种新的疗法，但目前效果仍不尽人意。众所周知，人体的免疫反应具有抗肿瘤作用，它通过细胞免疫机能捕获和消灭机体内新生的肿瘤细胞。而引起肿瘤发生的最终因素都可以归结为机体免疫效应细胞在数量和质量上不足以激发起有效的抗肿瘤免疫应答。因此，从治疗上讲，有效的抗肿瘤策略：(1)增强机体抗肿瘤免疫反应，主要是提高肿瘤局部活化的免疫效应细胞的数量，其中主要组织相容性复合物(MHC)限制性的细胞毒T细胞(CTL/Tc，即杀伤性T细胞)是最重要的免疫监视和效应细胞。(2)采取有效手段直接杀死肿瘤细胞。
超抗原(Superantigen，SAg)是一组细菌或病毒编码的蛋白质分子，可不需要抗原提呈细胞(Antigen-presenting cell，APC)提呈作用，以完整的蛋白质分子形式直接与APC膜的MHC-II类分子抗原结合槽外侧结合并且提呈给T细胞。SAg-MHC-II类分子复合物仅与TCR(T细胞抗原受体)β链的V区相结合，由于人类Vβ基因有20余种，故SAg激活的T细胞克隆数可达普通抗原的数千倍乃至数万倍。超抗原的抗肿瘤作用主要是由SAg依赖的细胞介导的细胞毒作用来完成(Superantigen-dependented cellular totoxicity，SDCC)，这是超抗原抗肿瘤的主要作用。再者，SAg激活的CD4+T细胞还可以分泌多种足量的细胞因子如：TNF-α、TNF-β和INF-γ、IL-2、IL-6等，直接或间接地杀伤肿瘤细胞。超抗原作为一种新型的抗肿瘤治疗模式，近年来研究进展很快，主要集中在超抗原直接抗肿瘤作用、超抗原靶向抗肿瘤作用、以及超抗原的基因治疗等方面；目前最有效的是已进入II期临床试验用于晚期肾癌的5T4Fab-SEA靶向超抗原。金黄色葡萄球菌肠毒素A(Staphyloccollal enterotoxin，SEA)是目前研究最多的超抗原。但是无论是单用超抗原进行抗肿瘤治疗还是目前抗体靶向的超抗原抗肿瘤治疗，都还有很多需要克服的困难：单用SAg治疗的缺陷也是非常明显的，即SAg介导的CTL主要杀伤MHC-II阳性的肿瘤细胞，对MHC-II阴性的肿瘤细胞杀伤作用较弱，但肿瘤细胞MHC-II阳性率一般都很低，并具有明显的异质性，因此，单纯的SAg抗肿瘤的效果不理想，且难以避免对机体MHC-II阳性的正常细胞造成的毒副作用。而单抗与超抗原的融合蛋白活化的T细胞是SEA反应性的，并不是肿瘤特异性的T细胞。故此类超抗原-单克隆抗体的融合蛋白尚缺乏抗瘤的广谱性和特异性，其诱导的靶向抗肿瘤免疫应答并不尽如人意。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足之处，提供一种靶向抗肿瘤的表达超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒载体的构建，它包括溶瘤腺病毒部分和超抗原部分，所述的溶瘤腺病毒部分分为溶瘤腺病毒穿梭质粒pSG218与病毒骨架质粒pPE3-ccdB，通过脂质体共转染HEK293细胞，超抗原部分为金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因片段，该技术能够利用病毒自身的裂解能力杀死肿瘤细胞，同时病毒的复制产生子代病毒导致级连放大效应，在肿瘤间自行扩散，达到最终消活全部肿瘤的效果。更关键的是，它能选择性在肿瘤细胞内增殖、裂解肿瘤细胞，而对正常细胞几乎没有影响，这使其在保证治疗率的同时保证了安全性。因此，肿瘤特异性增殖病毒是一种具有抗肿瘤作用的特殊病毒性基因治疗载体。我们以肿瘤特异性增殖腺病毒质粒为载体，携带超抗原SEA基因片段，并进一步与病毒骨架质粒重组包装成溶瘤腺病毒-超抗原复合物，该复合物将既具有在肿瘤细胞内特异性增殖能力又具有强大细胞毒T淋巴细胞刺激能力，进而对肿瘤细胞产生强大的靶向治疗效。
本发明是以如下技术方案实现的：一种靶向抗肿瘤的表达超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒载体的构建，其特征是：它包括溶瘤腺病毒部分和超抗原部分，所述的溶瘤腺病毒部分分为溶瘤腺病毒穿梭质粒pSG218与病毒骨架质粒pPE3-ccdB，通过脂质体共转染HEK293细胞，超抗原部分为金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因片段。
所述的金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因片段，且SEA基因片段的长度为771bp。
所述的靶向抗肿瘤的表达超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒载体的构建方法，其特征是按如下步骤进行：
(1)超抗原SEA基因的克隆；
(2)溶瘤腺病毒载体的构建；
(3)溶瘤腺病毒的包装、纯化、滴度测定。
本发明的优点是：该技术能够利用病毒自身的裂解能力杀死肿瘤细胞，同时病毒的复制产生子代病毒导致级连放大效应，在肿瘤间自行扩散，达到最终消活全部肿瘤的效果。它能选择性在肿瘤细胞内增殖、裂解肿瘤细胞，而对正常细胞几乎没有影响，这使其在保证治疗率的同时保证了安全性。因此，肿瘤特异性增殖病毒是一种具有抗肿瘤作用的特殊病毒性基因治疗载体。我们以肿瘤特异性增殖腺病毒质粒为载体，携带超抗原SEA基因片段，并进一步与病毒骨架质粒重组包装成溶瘤腺病毒-超抗原复合物，该复合物将既具有在肿瘤细胞内特异性增殖能力又具有强大细胞毒T淋巴细胞刺激能力，进而对肿瘤细胞产生强大的靶向治疗效。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明：
图1是SEA基因的PCR电泳结果；
图2是DNA序列分析结果；
图3是pDC318-SEA经SEA引物PCR扩增后电泳结果；
图4是pDC318-SEA经SpeI和SalI双酶切后电泳结果；
图5为已构建的携带超抗原SEA基因的非增殖腺病毒DC318-SEA结构图；
图6为DC318-SEA的PCR鉴定结果；
具体实施方式
实施例：
(1)实验所需试剂
病毒载体pSG218、PPE3-ccdB、HEK293细胞均购自上海肝胆外科医院病毒与基因治疗中心。
Taq酶 申能博彩公司
DNA连接酶SolutionI TakaRa公司
蛋白酶K、RNA酶 PROMEGA公司
胎牛血清、小牛血清、DMEM GIBCO BRL公司
琼脂糖、溴化乙锭 GENE公司
琼脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物 UNIPATH公司
胶回收试剂盒 QIAGEN公司
PCR产物回收试剂盒 QIAGEN公司
质粒DNA制备试剂盒 QIAGEN公司
病毒DNA提取试剂盒 QIAGEN公司
LipofectAmine2000试剂盒 GIBCO BRL公司
(2)超抗原SEA基因克隆与鉴定
1、超抗原SEA基因的PCR扩增：
以产SEA金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC13565为模板，根据GenBank已知的SEA基因序列设计1对引物(P1：5’-CCAATATGAAAAAAACAGCAT-3’，P2：5’-ATTGGACTTGTATATAAATATATA-3’)，行PCR扩增后。循环参数为94℃预变性4min，94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环，最后72℃延伸7min，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到771bpDNA片段，见图1。
2、PCR产物连接入克隆载体pUC57：
用EcoRV酶切pUC57质粒，将目的基因的PCR产物与pUC57载体酶切产物进行连接，16℃反应过夜。转化JM109感受态细胞，涂氨苄抗性平板，37℃过夜培养，筛选克隆，提取质粒电泳及KpnI、HindIII双酶切鉴定，并测序确认插入产物，见图2。
(3)携带超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒载体PDC318-SEA的构建及鉴定
1、携带SEA基因的非增殖溶瘤腺病毒载体PDC318-SEA的构建：应用PCR技术将引入SpeI和SalI酶切位点的超抗原SEA基因片段连接到经SpeI和SalI双酶切后的非增殖溶瘤腺病毒穿梭质粒pSG218中，将鉴定正确的非增殖溶瘤腺病毒载体命名为PDC318-SEA。见图3和图4。
1.1PDC318载体的酶切
PDC318 3.0ul
SpeI 3.0ul
10*BSA 7.0ul
2Buffer 7.0ul
H2O 50.0ul
总体系 70.0ul
37℃水浴6h后，加入
SalI 3.0ul
10*BSA 3.0ul
3Buffer 10.0ul
H2O 14.0ul
总体系 100.0ul
37℃水浴6h后，1.2％琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒(QIAquick GelExtraction)
回收PDC318线性化条带3926bp。
1.2PCR获得目的基因SEA(图2)
Puc 1.0ul
2mM dNTP 5.0ul
KOD plus Buffer 5.0ul
25mM MgSO4 2.0ul
上游引物 1.0ul
下游引物 1.0ul
KOD plus 1.0ul
H2O 34.0ul
总体系 20.0ul
PCR参数：
puc57-SEA质粒 1.0ul 94℃3min
KoD酶Buffer 5.0ul
2mM dNTP 5ul
H2O 14.0ul
68℃10min
总体系 50.0ul
PCR后，用胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction)直接回收SEA基因771bp。
1.3连接
PDC318/Spe I Sal I 2ul
SEA/Spe I Sal I 8ul
Solution I 10ul
总体系 20.0ul
12℃连接12h。将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，铺琼脂板(含AMP)后，37℃生化培养箱内培养10--12h。挑取生长的细菌单克隆，在含氨苄青霉素的LB溶液中，37℃摇床扩增12h。抽提阳性克隆的质粒DNA，酶切鉴定正确后命名为PDC318-SEA(需要正向克隆)。
1.4PDC318-SEA载体的鉴定(图3、4、5)
PDC318-SEA 3.0ul PDC318-SEA 3.0ul
EcoR I 0.5ul Aat II 0.5ul
Xho I 0.5ul Cla I 0.5ul
EcoR I Buffer 2.0ul Buffer 4 2.0ul
10×BSA 2.0ul 10×BSA 2.0ul
H2O 12.0ul H2O 12.0ul
总体系 20.0ul 总体系 20.0ul
切出条带大小：3787bp+887bp 切条带大小：2730bp+1240bp+704bp
PDC318-SEA 3.0ul PDC318-SEA 3.0ul
Spe I 0.5ul Cla I 0.5ul
Sal I 0.5ul Hinc II 0.5ul
Buffer 3 2.0ul Buffer 4 2.0ul
10×BSA 2.0ul 10×BSA 2.0ul
H2O 12.0ul H2O 12.0ul
总体系 20.0ul 总体系 20.0ul
37℃水浴1h后，1.2％琼脂糖凝胶电泳.
切出条带大小：748+3888bp 切出条带大小：2325bp+1995bp+354b
2、携带SEA基因的非增殖溶瘤腺病毒DC318-SEA的重组：
将非增殖溶瘤腺病毒载体PDC318-SEA与病毒骨架质粒pPE3共转染至293细胞(是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，比较容易转染，是常用的表达研究外源基因的细胞株)，共转染后9-14天出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化，提取腺病毒DNA，应用PCR进行鉴定，经鉴定正确的腺病毒命名为DC318-SEA。见图5和图6。
PDC318-SEA载体的酶切
PDC318 3.0ul
SpeI 3.0ul
10*BSA 7.0ul
2Buffer 7.0ul
H2O 50.0ul
总体系 70.0ul
总体系 70.0ul
37℃水浴6h后，加入
SalI 3.0ul
10*BSA 3.0ul
3Buffer 10.0ul
H2O 14.0ul
总体系 100.0ul
37℃水浴8h后，1.2％琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒(QIAquick GelExtraction)回收SEA片段大小771bp。
(4)携带超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒PDC318-SEA的扩增和滴度测定20ml 10％FBS/DMEM培养75cm2培养瓶中长至80％-90％ 293细胞，换成15ml2％FBS/DMEM。取0.5ul首次扩增的病毒保存液(病毒空斑感染24孔获得)，小心加入病毒混合液，十字形慢慢晃动3次，37℃5％CO2孵箱中培养48小时后收集病毒上清或细胞沉淀，沉淀细胞加AD buffer保存液，-80℃至37℃冻融3次，600g离心20分钟后去沉淀取上清，收上清和细胞的混合液，-80℃至37℃冻融3次，600×g离心20分钟去除细胞碎片，收集上清。反复扩增至需要病毒量，50％组织培养感染剂量法测定病毒滴度。
Claims (3)
1.一种靶向抗肿瘤的表达超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒载体的构建，其特征是：它包括溶瘤腺病毒部分和超抗原部分，所述的溶瘤腺病毒部分分为溶瘤腺病毒穿梭质粒pSG218与病毒骨架质粒pPE3-ccdB，通过脂质体共转染HEK293细胞，超抗原部分为金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因片段。
2.根据权利要求1所述的靶向抗肿瘤的表达超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒载体的构建，其特征是：所述的金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因片段，且SEA基因片段的长度为771bp。
3.一种权利要求1所述的靶向抗肿瘤的表达超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒载体的构建方法，其特征是按如下步骤进行：
(1)超抗原SEA基因的克隆；
(2)溶瘤腺病毒载体的构建；
(3)溶瘤腺病毒的包装、纯化、滴度测定。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910031699A CN101812477A (zh) | 2009-06-24 | 2009-06-24 | 靶向抗肿瘤的表达超抗原sea基因的溶瘤腺病毒载体的构建 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910031699A CN101812477A (zh) | 2009-06-24 | 2009-06-24 | 靶向抗肿瘤的表达超抗原sea基因的溶瘤腺病毒载体的构建 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101812477A true CN101812477A (zh) | 2010-08-25 |
Family
ID=42619844
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200910031699A Pending CN101812477A (zh) | 2009-06-24 | 2009-06-24 | 靶向抗肿瘤的表达超抗原sea基因的溶瘤腺病毒载体的构建 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101812477A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108467872A (zh) * | 2018-03-06 | 2018-08-31 | 复百澳（苏州）生物科技有限公司 | 溶瘤腺病毒的构建方法和应用 |
| CN116284448A (zh) * | 2023-02-14 | 2023-06-23 | 浙江大学 | 一种超抗原参与的三功能t细胞衔接器及其应用 |
-
2009
- 2009-06-24 CN CN200910031699A patent/CN101812477A/zh active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108467872A (zh) * | 2018-03-06 | 2018-08-31 | 复百澳（苏州）生物科技有限公司 | 溶瘤腺病毒的构建方法和应用 |
| CN116284448A (zh) * | 2023-02-14 | 2023-06-23 | 浙江大学 | 一种超抗原参与的三功能t细胞衔接器及其应用 |
| CN116284448B (zh) * | 2023-02-14 | 2024-06-21 | 浙江大学 | 一种超抗原参与的三功能t细胞衔接器及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Su et al. | CRISPR-Cas9-mediated disruption of PD-1 on human T cells for adoptive cellular therapies of EBV positive gastric cancer | |
| Krishnamurthy et al. | Genetic engineering of T cells to target HERV-K, an ancient retrovirus on melanoma | |
| US11806374B2 (en) | Isolated recombinant oncolytic adenoviruses, pharmaceutical compositions, and uses thereof for drugs for treatment of tumors and/or cancers | |
| Allen et al. | Anti-tumor immunity in head and neck cancer: understanding the evidence, how tumors escape and immunotherapeutic approaches | |
| Roy et al. | Cell carriers for oncolytic viruses: current challenges and future directions | |
| Pule et al. | Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma | |
| Lamb Jr et al. | Engineered drug resistant γδ T cells kill glioblastoma cell lines during a chemotherapy challenge: a strategy for combining chemo-and immunotherapy | |
| Zhen et al. | Synergistic antitumor effect on cervical cancer by rational combination of PD1 blockade and CRISPR-Cas9-mediated HPV knockout | |
| Qiao et al. | Loading of oncolytic vesicular stomatitis virus onto antigen-specific T cells enhances the efficacy of adoptive T-cell therapy of tumors | |
| AU2017292582A1 (en) | HIV pre-immunization and immunotherapy | |
| Almela et al. | A review of immunotherapeutic strategies in canine malignant melanoma | |
| Sánchez et al. | Oncolytic viruses for canine cancer treatment | |
| Williams et al. | Dendritic cell based PSMA immunotherapy for prostate cancer using a CD40-targeted adenovirus vector | |
| CN104694575A (zh) | 启动子优化的慢病毒基因修饰t细胞在肿瘤治疗中的应用 | |
| Zhao et al. | Autologous tumor vaccine modified with recombinant new castle disease virus expressing IL-7 promotes antitumor immune response | |
| Dyer et al. | Turning cold tumours hot: oncolytic virotherapy gets up close and personal with other therapeutics at the 11th Oncolytic Virus Conference | |
| Rahma et al. | Pre-immature dendritic cells (PIDC) pulsed with HPV16 E6 or E7 peptide are capable of eliciting specific immune response in patients with advanced cervical cancer | |
| Wang et al. | A global bibliometric and visualized analysis of bacteria-mediated cancer therapy | |
| Nettelbeck et al. | Virotherapy in Germany—recent activities in virus engineering, preclinical development, and clinical studies | |
| Angelova et al. | Parvovirus-based combinatorial immunotherapy: a reinforced therapeutic strategy against poor-prognosis solid cancers | |
| Malfitano et al. | Virotherapy as a potential therapeutic approach for the treatment of aggressive thyroid cancer | |
| US20230137548A1 (en) | Neural stem cell-mediated cancer treatment | |
| Sun et al. | An effective therapeutic regime for treatment of glioma using oncolytic vaccinia virus expressing IL-21 in combination with immune checkpoint inhibition | |
| Batchu et al. | Efficient lysis of epithelial ovarian cancer cells by MAGE-A3-induced cytotoxic T lymphocytes using rAAV-6 capsid mutant vector | |
| Oh et al. | Cryopreserved human natural killer cells exhibit potent antitumor efficacy against orthotopic pancreatic cancer through efficient tumor-homing and cytolytic ability |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20100825 |