CN101812452B

CN101812452B - Rala基因的小干扰rna在制备抗白血病药物中的应用

Info

Publication number: CN101812452B
Application number: CN2010101576782A
Authority: CN
Inventors: 费嘉; 李育敏; 谷景义; 朱雪姣; 姚君琳; 林春燕; 黄康康; 李灿峰
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2010-04-21
Filing date: 2010-04-21
Publication date: 2011-11-16
Anticipated expiration: 2030-04-21
Also published as: CN101812452A

Abstract

本发明公开了一种RALA基因的小干扰RNA及其在制备抗白血病药物中的应用。所述小干扰RNA的序列如下：正义链为：5′-CGUGGAAACAUCUGCUAAATT-3′；反义链为：5′-UUUAGCAGAU GUUUCCACGTA-3′。所述RALA基因的小干扰RNA可用于制备抗白血病的药物。本发明RALAsiRNA可以通过下调癌基因RALA的表达抑制人白血病k562细胞生长，对肿瘤基因治疗具有潜在的应用价值，有望将其应用于白血病的治疗，并在此基础之上，开发抗白血病新药，为临床白血病的防治做出贡献。

Description

RALA基因的小干扰RNA在制备抗白血病药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，特别涉及一种RALA基因的小干扰RNA及其在制备抗白血病药物中的应用。

背景技术

慢性粒细胞性白血病是一种起源于多能造血干细胞的恶性增殖性疾病，约占成年人白血病的20％～30％，在我国白血病中发病率仅次于急粒和急淋而居第三位，成为威胁人民健康的一种常见恶性肿瘤。目前CML尚缺乏特效的治疗方案，以化疗为主。近年来，对白血病以及其他肿瘤的治疗已由“全细胞毒杀”时代进入到目前的“靶向治疗”新纪元。寻求肿瘤恶性转化的关键“靶标”或与肿瘤发生密切相关的基因，开发靶向药物已经成为肿瘤基因治疗研究的重要方向。

RALA(v-ral simian leukemia viral oncogene homolog A)是一种癌基因，它翻译的蛋白质类似于RAS基因翻译的连接于GTP上的连接蛋白，这种蛋白可以与细胞膜上的受体结合，调节细胞内外物质的转运。研究表明RALA与肿瘤发生、侵袭和转移相关，尤其在肿瘤发生过程中起重要作用。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)现象自1998年发现以来，作为一种反向遗传学技术，已被成功应用于线虫、果蝇、植物、真菌和哺乳动物等生物的多个研究领域中。小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)可特异性、高效率沉默靶基因表达，能在低于反义核酸几个数量级的浓度下，使靶基因的表达降至极低水平。本实验设计并合成RALA siRNA，将其导入慢性粒细胞性白血病(chronicmyeloid leukemia，CML)细胞株k562细胞，检测RALA siRNA的基因沉默功效。

RNAi是近几年发展起来的一种新型基因阻断技术，其主要参与成分为siRNA，siRNA可特异性抑制靶目标mRNA的表达。RNAi具有高度的序列专一性，可以特异性地使目的基因沉默，利用此技术沉默肿瘤相关基因，通过观察细胞表型的改变、分析基因表达和功能的变化，不仅有助于了解肿瘤发生、发展过程，而且有助于辨认和确定肿瘤基因治疗的靶点。目前，RNA干扰已广泛应用于肿瘤研究工作中，并取得了一些突破性进展，在真核生物体内和体外模型都证明了RNAi具有良好的基因沉默效应。由于RNAi具有特异、高效、毒性小的特点，因此可以用来对一些肿瘤进行治疗。

发明内容

为了弥补现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种RALA基因的小干扰RNA。

本发明的另一目的在于提供一种上述RALA基因的小干扰RNA的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种RALA基因的小干扰RNA(siRNA)，所述小干扰RNA的序列如下：

正义链为：5′-CGUGGAAACAUCUGCUAAATT-3′；

反义链为：5′-UUUAGCAGAUGUUUCCACGTA-3′。

上述的一种RALA基因的小干扰RNA可用于制备抗白血病的药物。

本发明的作用原理是：RALA是一种癌基因，它翻译的蛋白质类似于RAS基因翻译的连接于GTP上的连接蛋白，这种蛋白可以与细胞膜上的受体结合，调节细胞内外物质的转运。研究表明RALA与肿瘤发生、凋亡、侵袭和转移密切相关，尤其在肿瘤发生过程中起重要作用。本发明RALA siRNA可以下调RALA的表达，从而有效抑制人白血病k562细胞的生长，具有分子靶向抗白血病的作用。

本发明与现有技术相比具有如下优点和有益效果：本发明设计合成RALAsiRNA，将其导入人白血病K562细胞，发现RALA siRNA明显抑制细胞生长，细胞内RALA mRNA的表达水平降低，RALA siRNA转染k562细胞48小时后细胞生长受到明显抑制，持续至72小时(P＜0.05)；转染终浓度25nmol/L的RALA siRNA即开始表现出对细胞生长的抑制活性，125nmol/L的RALAsiRNA表现出非特异性抑制作用(P＜0.05)；RALA siRNA转染K562细胞48小时后，RALA mRNA的表达水平显著降低；本发明RALA siRNA可以通过下调癌基因RALA的表达抑制人白血病k562细胞生长，对肿瘤基因治疗具有潜在的应用价值，有望将其应用于白血病的治疗，并在此基础之上，开发抗白血病新药，为临床白血病的防治做出贡献。

附图说明

图1是RALA siRNA抑制k562细胞生长的量效关系图，*表示有统计学意义。

图2是RALA siRNA抑制k562细胞生长的时效关系图，*表示有统计学意义。

图3是Real-time PCR检测细胞内RALA mRNA的相对表达水平图，*表示有统计学意义。

具体实施方式

下面结合具体的实例与附图对本发明作进一步详细的叙述，但本发明的实施方法灵活，不仅仅限于此例所述的具体操作方式。

实施例中所需材料的准备：

RALA siRNA序列如下：

正义链：5′-CGUGGAAACAUCUGCUAAATT-3′；

反义链：5′-UUUAGCAGAUGUUUCCACGTA-3′；

以随机序列的RNA双链(scramble，SCR)作对照，随机RNA双链序列如下：

正义链：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；

反义链：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′；

RALA siRNA和随机RNA双链由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成，-20℃保存。

细胞培养：将K562细胞接种于含体积分数10％的新生牛血清、无抗生素的DMEM/F₁₂培养基中，置于37℃、体积分数为5％的CO₂培养箱，饱和湿度下培养。每2～3天换液传代。实验选用对数生长期、0.2％台盼蓝拒染率＞95％的细胞。

实施例1：四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测RALA siRNA对细胞的生长抑制作用的量效效应及抑制率

本实施例分RALA siRNA组、随机对照组和空白对照组，每组设4个复孔。RALA siRNA组中RALA siRNA序列的核酸终浓度为25、50、75、100和125nmol/L，随机对照组中随机序列的RNA双链的核酸终浓度为25、50、75、100和125nmol/L。取对数生长期的K562细胞，各组细胞以1×10⁵/mL的密度接种于96孔板，每孔50μL，转染体积100μL(转染方法参照Invitrogen公司LipofectamineTM 2000说明书)，空白对照组加入50μL的无血清Opti-MEM培养基。转染6h后，加入100μL含20％血清DMEM/F₁₂培养基，使终体积200μL。48小时后每孔加入MTT液20μL，于培养箱中培养4小时后，1000rpm/min离心10min，弃上清，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)；震荡使结晶充分溶解，在多功能酶标仪上测定吸光度A₅₇₀nm，以A₅₇₀间接反映存活细胞量。实验重复三次，计算增殖抑制率。增殖抑制率＝[1-(A_实验组/A_对照组)]×100％。

采用SPSS 13.0统计软件处理数据，数据以均数±标准差表示，采用完全随机设计的单因素方差分析法(one-way ANOVA)分析各组数据间差异的显著性。以P＜0.05为有显著性差异。

检测结果如图1所示，转染25nmol/L RALA siRNA即开始表现出抑制细胞生长活性，终浓度100nmol/L RALA siRNA作用效果最佳，且细胞毒性小，随着浓度的增大，抑制效应增强，但毒性增加，与随机对照组和空白对照组相比有显著差异(P＜0.05)。

实施例2：台盼蓝拒染法检测RALA siRNA对细胞的生长抑制作用的时间效应

实验分组及转染处理同实施例1，RALA siRNA组中RALA siRNA序列的核酸终浓度为100nmol/L，随机对照组中随机序列的RNA双链的核酸终浓度为100nmol/L。于24、48和72小时将每组细胞充分混匀后用台盼蓝拒染法计数每组活细胞数，重复3次，取均值。

采用SPSS 13.0统计软件处理数据，数据以均数±标准差

表示，采用完全随机设计的单因素方差分析法(one-way ANOVA)分析各组数据间差异的显著性。以P＜0.05为有显著性差异。

检测结果如图2所示，终浓度100nmol/L的RALA siRNA作用于k562细胞后48小时开始表现出生长抑制效应，持续至72小时，与随机对照组和空白对照组相比有显著差异(P＜0.05)。

实施例3：Real-time PCR检测RALA siRNA对细胞内RAlA mRNA的表达水平影响

实验分组同实施例1，各组细胞以1.5×10⁵/mL的密度接种于24孔板，每孔400μL，转染终体积500μL。6小时后加入500μL体积分数为20％的血清培养基置于培养箱中培养。RALA siRNA组中RALA siRNA序列的核酸终浓度为100nmol/L，随机对照组中随机序列的RNA双链的核酸终浓度为100nmol/L。于48小时后收集细胞，总RNA抽提按Trizol试剂(Invitrogen公司)说明书进行，提取的总RNA用紫外分光光度仪(UVPupland，USA)测A260/A280进行RNA纯度及浓度计算，利用SYBR Green I Real-time PCR检测白血病K562细胞内RALAmRNA的表达水平，以GAPDH为内参。逆转录条件：37℃持续1h，95℃持续5min。Real-time PCR条件：①94℃持续5min；②94℃持续30s；③RALA 56℃，GAPDH 57.5℃持续30s；④72℃持续30s；⑤读板；⑥第二步至第五步共40循环；⑦融解曲线分析，60℃至95℃，读板1s/0.3℃。PCR所用引物自行设计，由上海生物工程技术有限公司合成：

RALA上游引物：5′-ATCGGAAGAAGGTAGTGC-3′，

下游引物：5′-AAATCTGCTCCCTGAAGT-3′；

GAPDH上游引物：5′-CAACGGATTTGGTCGTATT-3′，

下游引物：5′-CACAGTCTTCTGGGTGGC-3′。

RALA和GAPDH的扩增片段长度分别为182bp和541bp。RALA mRNA的相对表达水平用ΔC_T和2^-ΔΔCT计算。

采用SPSS 13.0统计软件处理数据，数据以均数±标准差

检测结果如图3所示，终浓度100nmol/L的RALA siRNA作用于k562细胞后48小时后，RALA mRNA的表达水平显著降低，与随机对照组和空白对照组相比有显著差异(P＜0.05)。

实施例4

取实施例1合成的RALA siRNA，配制成浓度为100nmol/L的抗白血病药物，临床上可以通过静脉注射或者直接将siRNA药物直接注射到瘤体内进行治疗。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110>暨南大学

<120>RALA基因的小干扰RNA在制备抗白血病药物中的应用

<130>32

<160>8

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

cguggaaaca ucugcuaaat t 21

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

uuuagcagau guuuccacgt a 21

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

acgugacacg uucggagaat t 21

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

atcggaagaa ggtagtgc 18

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

aaatctgctc cctgaagt 18

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

caacggattt ggtcgtatt 19

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

cacagtcttc tgggtggc 18

Claims

1.一种RALA基因的小干扰RNA，其特征在于：所述小干扰RNA的序列如下：

正义链为：5′-CGUGGAAACAUCUGCUAAATT-3′；

反义链为：5′-UUUAGCAGAUGUUUCCACGTA-3′。

2.根据权利要求1所述的一种RALA基因的小干扰RNA用于制备抗白血病的药物。