CN101805780B - 一种二氧化钛纳米管抗菌性的定量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种二氧化钛纳米管抗菌性的定量测定方法，本发明将微波法制得的二氧化钛纳米管配成悬浊液，采用微量热法定量分析测定二氧化钛纳米管对大肠杆菌的抗菌性能，得到二氧化钛纳米管对大肠杆菌的最小抑菌浓度。本发明的测定方法样品用量少，数据准确可靠，重复性好。
Description
技术领域
本发明涉及一种二氧化钛纳米管抗菌性的定量测定方法及应用，属于抗菌材料领域。
背景技术
自从Iijima发现碳纳米管以来，具有独特性质的纳米管状结构材料的研究引起了广大科研工作者的极大兴趣。其中二氧化钛纳米管由于具有稳定性能好、光催化活性高和比表面积大等特殊性质而备受关注，在环境净化、气体传感器、高效太阳能电池和光催化抗菌剂等领域具有广泛的应用前景。
二氧化钛纳米管的制备方法主要包括模板合成法、阳极氧化法、超分子自组装合成法、水热合成法、溶胶—凝胶法和微波法等。其中微波水热合成法具有加热速度快、反应灵敏、受热体系均匀等特点为人们广泛采用，参见吴省等人，利用微波法合成二氧化钛纳米管，无机化学学报，2006，22(2)：341-345。
迄今为止，对微波法制备的二氧化钛纳米管进行抗菌性能的定量分析研究尚未见文献报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有对二氧化钛纳米管抗菌性能研究的不足，提供一种对二氧化钛纳米管抗菌性的定量测定方法。
采用微波法制备二氧化钛纳米管，制备方法参见：吴省等人，利用微波法合成二氧化钛纳米管，无机化学学报，2006，22(2)：341-345，其中采用的微波装置改用微波催化合成/萃取仪，2450GHz，最大输出功率1000W，北京祥鹄科技发展有限公司。所得二氧化钛纳米管产品为白色粉体，属于四方晶系，比表面积100～380m2/g。
本发明利用微量热法测定二氧化钛纳米管的抑菌效果试验，微量热法测定基本原理如下：
根据微生物培养的限制性生长条件建立指数生长模型，推导出Logistic方程式：
Pt＝Pm/(1+αe-μt)
式中μ为生长速率常数，α为积分常数，Pm和Pt分别为细菌的最大输出功率和t时刻细菌的输出功率。从热功率—时间的实验测试曲线中获得的Pm和Pt等数值，经线性回归分析求出生长速率常数μ的值，通过计算机模拟建立生长速率常数μ与抗菌剂浓度C之间的关系。当生长速率常数μ＝0时，得到抗菌剂的最小抑菌浓度(MIC)数值。该数值越小，表明其抑菌效果越好。
本发明的技术方案如下：
一种二氧化钛纳米管抗菌性的定量测定方法，步骤如下：
1)量取1mL的大肠杆菌菌液，加入99mL的食盐水中，混合均匀，然后移取该混合液10μL，加入10mL液体培养基稀释，得大肠杆菌稀释液备用。
其中食盐水浓度为常规生理盐水的浓度，大肠杆菌液体培养基为本领域常规培养基。
2)称取适量的微波法制备的二氧化钛纳米管粉体，加入10mL的二甲基甲酰胺(DMF)，超声分散10min，得二氧化钛纳米管悬浊液，二氧化钛纳米管悬浊液浓度为2-4mg/ml，备用。
利用3114/3236 TAMAir型八通道微量热活性检测仪测定在37℃时二氧化钛纳米管悬浊液对大肠杆菌代谢作用的热功率—时间曲线。
3)分别取8份上述步骤1)制得的大肠杆菌稀释液8mL放在8个安瓶里。第一个安瓶中不加入二氧化钛纳米管悬浊液，其它7个安瓶中依次加入步骤2)配制的二氧化钛纳米管悬浊液，体积分别为50、100、150、200、250、300、350uL。封口后，放入热活性检测仪中，开始记录数据，当细菌代谢的热功率-时间曲线返到基线时即认为实验结束。
4)将步骤3)中记录的原始数据进行计算机处理，利用Logistic方程式：
Pt＝Pm/(1+αe-μt)
得到大肠杆菌在不同浓度的二氧化钛纳米管悬浊液中的生长速率常数μ值。
Logistic方程式中μ为生长速率常数，α为积分常数，Pm和Pt分别为细菌的最大输出功率和t时刻细菌的输出功率。从热功率-时间的实验测试曲线中获得的Pm和Pt等数值，经线性拟合，建立生长速率常数μ与抗菌剂浓度C之间的关系，得到μ-c直线方程式：μ＝0.11034-0.26144C。当生长速率常数μ＝0时，得到抗菌剂的最小抑菌浓度(MIC)数值。
优选的，步骤3)中二氧化钛纳米管悬浊液浓度为3mg/ml。
步骤2)中食盐水浓度范围可根据本领域的技术进行常规选择，一般掌握0.8-1.0wt％，优选0.9wt％。
根据本发明的检测结果证明，本发明选用的针状二氧化钛纳米管可以作为一种高效抗菌剂开发应用，具有潜在的应用前景。
本发明采用微量热法研究微波法制备的二氧化钛纳米管对大肠杆菌的代谢作用，利用3114/3236 TAMAir型八通道微量热活性检测仪测定在37℃时二氧化钛纳米管悬浊液对大肠杆菌代谢作用的热功率—时间曲线，以Logistic模型处理数据，得到大肠杆菌的生长速率常数，建立生长速率常数与二氧化钛纳米管浓度之间的关系，确立二氧化钛纳米管的最小抑菌浓度。对二氧化钛纳米管抗菌性的定量研究具有重要的理论和实际意义。
本发明微量热法定量测定二氧化钛纳米管抗菌剂的抗菌活性，样品用量少，数据准确可靠，重复性好。该方法还可用于其它抗菌剂的抗菌活性的测定。
附图说明
图1为实施例1采用微波法制备的二氧化钛纳米管的X-射线衍射谱图。
图2为实施例1采用微波法制备的二氧化钛纳米管的的透射电镜照片。
图3为实施例2中二氧化钛纳米管对大肠杆菌的生长代谢热功率—时间曲线；
其中，(a)0mg/ml；(b)0.01242mg/ml；(c)0.02470mg/ml；(d)0.04878mg/ml；(e)0.05996mg/ml；(f)0.07228mg/ml；(g)0.09524mg/ml；(h)0.1176mg/ml。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
实施例1、二氧化钛纳米管的制备，步骤如下：
1、称取平均粒径为10nm的二氧化钛纳米粉体0.25g，加入装有60mL 10M NaOH溶液的聚四氟乙烯反应釜中，搅拌20min。
2、将步骤1中的聚四氟乙烯反应釜置于带有回流装置的微波催化合成/萃取仪(北京祥鹄科技发展有限公司出品)内，在500W功率下，加热90min。
3、取出反应釜冷至室温，分离出固体产物。依次用0.1M HCl和去离子水洗涤至pH＝7，在80℃条件下真空干燥，研磨，得到二氧化钛纳米管粉体。
所制得的二氧化钛纳米管呈针状，内直径为5nm，壁厚1nm，长度100～200nm。X-射线衍射谱图如图1，透射电镜照片如图2。
实施例2、
开始测定实验前，将所用仪器在紫外灯下灭菌30min。
1)量取1mL浓度为106cfu/ml的大肠杆菌菌液，加入99mL 0.9％的食盐水中混合均匀，然后移取该混合液10μL，加入10mL液体培养基稀释，得大肠杆菌稀释液备用。
所用液体培养基配方：10.0克蛋白胨、5.0克牛肉浸膏和5.0克氯化钠，溶解在1000mL水中，煮沸5min，调节pH为7.0～7.2，在高压锅内蒸煮20min，温度为121℃，压力为1.0MPa，冷却后置4℃冰箱内冷藏备用。
2)称取30mg的实施例1制备的二氧化钛纳米管粉体，加入10mL DMF(二甲基甲酰胺)，配成的悬浊液浓度为3mg/ml，在功率为300W的条件下，超声分散10min，制得二氧化钛纳米管悬浊液，备用。
利用3114/3236 TAMAir型八通道微量热活性检测仪测定在37℃时二氧化钛纳米管悬浊液对大肠杆菌代谢作用的热功率—时间曲线。
3)分别取8份步骤1)制备的大肠杆菌稀释液8mL，放入8个安瓶中，依次加入步骤2)中配制的二氧化钛纳米管悬浊液0、50、100、150、200、250、300、350uL。封口后，放入热活性检测仪中，记录原始数据。当细菌代谢的热功率-时间曲线返到基线时即认为实验结束。
4)将步骤3)中记录的原始数据输入计算机中，利用Logistic model处理，得到大肠杆菌在不同浓度的二氧化钛纳米管悬浊液中的生长速率常数μ值(见表1)，经线性拟合，得到μ-c直线方程式，即μ＝0.11034-0.26144C；当μ＝0时，计算出最小抑菌浓度(MIC)为0.4220mg/ml。
表1 大肠杆菌在不同浓度的二氧化钛纳米管悬浊液中的生长速率常数μ值
拟合方程式(μ-c)μ＝0.11036-0.26128C CMIC＝0.4220 r＝0.9984
Claims (1)
1.一种微波法制备的二氧化钛纳米管抗菌性的定量测定方法，步骤如下：
(1)量取1mL的大肠杆菌菌液，加入99mL的食盐水中，混合均匀，然后移取该混合液10μL，加入10mL液体培养基稀释，得大肠杆菌稀释液备用；
(2)称取适量的微波法制备的针状二氧化钛纳米管粉体，加入10mL的二甲基甲酰胺，超声分散10min，得二氧化钛纳米管悬浊液，二氧化钛纳米管悬浊液浓度为3mg/ml，备用；
利用3114/3236 TAMAir型八通道微量热活性检测仪测定在37℃时二氧化钛纳米管悬浊液对大肠杆菌代谢作用的热功率-时间曲线；
(3)分别取8份上述步骤(1)制得的大肠杆菌稀释液8mL放在8个安瓶里，第一个安瓶中不加入二氧化钛纳米管悬浊液，其它7个安瓶中依次加入步骤(2)配制的二氧化钛纳米管悬浊液，体积分别为50、100、150、200、250、300、350uL，封口后，放入热活性检测仪中，开始记录数据，当细菌代谢的热功率-时间曲线返到基线时即认为实验结束；
(4)将步骤(3)中记录的原始数据进行计算机处理，利用Logistic方程式：
Pt＝Pm/(1+αe-μt)
得到大肠杆菌在不同浓度的二氧化钛纳米管悬浊液中的生长速率常数μ值；
Logistic方程式中μ为生长速率常数，α为积分常数，Pm和Pt分别为细菌的最大输出功率和t时刻细菌的输出功率；
从热功率-时间的实验测试曲线中获得的Pm和Pt等数值，经线性拟合，建立生长速率常数μ与抗菌剂浓度C之间的关系，得到μ-c直线方程式：μ＝0.11034-0.26144C。
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