CN101805702A - 西方伊萨酵母菌株及其制备方法,以及用该菌株制备木糖醇、乙醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微生物菌株西方伊萨酵母Issatchenkia occidentalis(Lj-3)，CCTCC NO：M206097。所述菌株的26S rDNA D1/D2区域核苷酸特征序列与GenBank登记号为EF030708的特征序列同源性为100％。本发明还公开了所述菌株的制备方法，以及该菌株的生物脱毒用途，即将所述菌株与发酵木糖生成木糖醇微生物混合接种，实现半纤维素水解物同步脱毒发酵生产木糖醇；将脱毒活性菌株与发酵木糖生成乙醇的微生物混合接种，实现半纤维素水解物同步脱毒发酵生产乙醇。与传统技术相比，本发明生产效率，产品质量更高。

Description

西方伊萨酵母菌株及其制备方法，以及用该菌株制备木糖醇、乙醇的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种半纤维水解物的生物脱毒方法及其专用脱毒活性微生物菌株。

背景技术

半纤维素是植物细胞壁中除纤维素之外的聚糖类，含量随不同植物而有所差别，大致占植物体重量的20-35％，是地球上除纤维素之外最丰富的多糖。

纤维素是完全由葡萄糖单元聚合成的均一性聚糖，而半纤维素则主要是由木糖以β-(1-4)糖苷键构成主链，阿伯糖、甘露糖和半乳糖形成支链结构的非均一性聚糖。半纤维素的木聚糖主链一般含有50-150个木糖单位，无结晶结构，结合在纤维素微纤维的表面。

半纤维素比纤维素容易水解得多，用稀酸在100-130℃条件下，就很容易将半纤维素，水解生成以五碳糖为主要成分的半纤维素水解物。发酵半纤维素水解物生产市场容量大的木糖醇、乙醇等各类化工产品，是能够大规模利用半纤维素资源的有效途径。

虽然用稀酸将半纤维素水解生成以单糖为主要成分的水解物的过程并不困难，但是，稀酸水解过程会伴随产生一系列微生物代谢抑制物，要改善半纤维水解物的发酵性能，必须除去其中的微生物代谢抑制物，即脱毒过程是必不可少的。

目前在半纤维素水解物中已鉴定的毒物成分已经有几十种，其中代表性毒物包括三大类，即：糠醛类化合物，如糠醛，5-羟甲基糠醛；脂肪酸类化合物，如甲酸，乙酸，丙酸；木质素降解生成的一系列含有苯环的化合物，如愈创木酚，苯甲醛，阿魏酸等。

已经报道真空蒸发，溶剂抽提，活性炭吸附，大孔树脂吸附，离子交换树脂处理，都可以脱去某些毒物，改善水解物的发酵性能。然而，一种物理或化学方法只能除去某一类有毒物质，通常需要联合采用多种理化措施处理，半纤维水解物才能达到比较好的脱毒效果。但是，脱毒是一个耗费成本的过程，同时使用多种理化措施对半纤维素水解物进行脱毒处理，必须大幅度提高产物发酵的成本。

事实上，自然界的一些微生物对半纤维素水解物中的某些毒物具有降解活性。例如，例如降解木质素及由木质素降解生成的一系列酚类化合物的白腐菌(林海陆钢张庆娜，降解造纸废水木质素菌种的筛选鉴定及应用，北京科技大学学报。2007，29(6)：569-573；陶杨廖俊和罗学刚，生物制浆技术最新应用研究进展。纤维素科学与技术。2007，15(1)：70-74，降解糠醛，5-羟甲基糠醛细菌，酵母(代书玲，张鲁嘉，糠醛及其衍生物微生物降解(转化)研究进展。氨基酸和生物资源2007，29(4)：41-45；刘爱平许学书樊行雪，利用酵母生物转化植物纤维为乙醇的研究进展。生物技术通讯，2004，15(2)：193--196)，降解短链脂肪酸的子囊菌(何刚强堵国成刘立明，嗜热子囊菌利用短链有机酸生产角质酶。生物工程学报，2008，24(5)：821-828)

近年有人开始尝试以生物酶法去除水解物中的毒物。Jonsson等人用漆酶与过氧化物酶联合处理木材酸水解物，能除去了大部分的单环酚性物(monoaromatic phenolic copounds)。处理后的水解物用于乙醇发酵，结果葡萄糖消耗速率与乙醇生成速率提高了近5倍(Jonsson J L，Palmqvist E，Nilvebrant N O.，Detoxification of wood hydrolysates with laccase andperoxidase from the white-rot fungus Trametes versicolor.Appl.Microbiol Biotechnol.1998，(49)：691-697))。但复杂的毒物成分需要复杂的酶系的联合降解，这无疑大大增加了脱毒的成本。

Lopez等人以微生物Conichaeta ligniaria NRRL 30616发酵处理木质纤维稀酸水解物，不仅去除糠醛、5-羟甲基糠醛的效果显著，同时也明显减少了水解物中的酚类物质。经过这一菌株处理的水解物再用产乙醇酵母发酵，80h产生1.66％°乙醇，而未处理的却没有乙醇产生(Lopez J M，Nichols N N，Dien B Set al.Isolation of microorganisms for biological detoxification oflignocellulosec hydrolysates.Appl Microbiol Biotechnol.2004，64(1)：125-131)。

上述研究表明，利用微生物降解木质纤维水解物中复杂有毒物质是可能实现的。尤其是，如果能够获得一种同时具备降解半纤维水解物中的三大代表性毒物的代谢系统，即可以同时降解糠醛、脂肪酸及含有苯环结构化合物的微生物，并且这种微生物又不能利用木糖的话，那么直接利用这种微生物发酵半纤维水解物进行脱毒物质处理，就能有效克服现有理化脱毒方法工艺繁琐、成本高的缺点，并具有环境友好的优势。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有的半纤维素水解物理化脱毒工艺所存在的过程烦琐，成本高的问题。

本发明的内容包括：发明人自造纸厂，木糖厂，糠醛厂周围土壤污泥样富含培养、分离、筛选，获得能有效改善木质纤维水解物发酵性能的两个分离物：S-7和Lj-3。发明人鉴定分离物S-7属于东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)，它在2006年9月18日被保存到中国武汉·武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M206098，不能利用木糖；分离物Lj-3属于西方伊萨酵母(Issatchenkia occidentalis)，它在2006年9月18日被保存到中国武汉·武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCNO：M206097，利用木糖的能力极微弱。发明人用这种脱毒活性新菌株建立了半纤维水解物的生物脱毒法；将脱毒活性菌株与发酵木糖生成木糖醇微生物混合接种，实现半纤维素水解物同步脱毒发酵生产木糖醇；将脱毒活性菌株与发酵木糖生成乙醇的微生物混合接种，实现半纤维素水解物同步脱毒发酵生产乙醇。上述两种酵母的保藏信息参见本专利申请所附的两份保藏受理通知书。

属于本发明的两个生物脱毒活性菌株S-7(CCTCC NO：M206098)和Lj-3(CCTCC NO：M206097)，其分离筛选、及分类鉴定的过程如下：

用蔗渣半纤维素水解物为分离培养基的基本成分，适当真空后用碱调节pH 5-6。如果制成平板，外加琼脂20g/L作为固形剂。

从纸浆厂废水污染的环境采集的土壤、淤泥作分离样品。250ml三角瓶装量25ml，接入废水或淤泥分离样品约1g，30℃，200rpm摇瓶富集培养72h。取有菌体生长的培养液在同一培养基平板上划线分离，选择能够快速生长的类型，转到斜面保存。

斜面培养物转移到半纤维稀酸水解物中并在摇瓶条件下培养24小时，离心除去菌体，然后接入能够同化木糖的酵母菌株进行发酵，选留那些能够有效改善半纤维素稀酸水解物发酵性能的脱毒活性菌株。如此经过十余个批次的样品分离，获得改善半纤维素水解物发酵性能活性最强的两个分离物，编号分别为S-7和Lj-3。

高效液相色谱的检测结果表明，S-7和Lj-3对半纤维素稀酸水解物中的代表性毒物：醋酸，糠醛及酚性物均有良好的降解活性，其中S-7不利用木糖，Lj-3只能微弱利用木糖。

上述方法分离得到的两个菌株于4℃冷藏或冻干法保藏。

按照《酵母菌鉴定手册》(青岛海洋大学出版社)一书提供的方法，鉴定了S-7和Lj-3的细胞、菌落与生理生化特征(表1，表2)。分离物S-7的生理、生化特征与《酵母菌鉴定手册》中所描述的东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)完全相同；分离物Lj-3的生理、生化特征与同一书中所述的西方伊萨酵母(Issatchenkia occidentalis)完全相同。

用引物5’-GCATATCAAAAGCGGAGGAAAAG-3’和5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’，聚合酶链式反应(PCR)扩增S-7和Lj-3的26S rDNA D1/D2区域核酸序列(方法参照Kurtzman C P，Four new Candida species from geographically diverse locations.Antonie van Leeuwenhoek，2001，79：353-361)。测定扩增产物的核酸序列(表3，表4)，并用此序列在GenBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索(Nucleotide-nucleotide BLAST)。搜索结果表明，S-7的26S rDNA D1/D2区域的核酸序列，与GenBank现有Issatchenkia orientalis同一区域核酸序列同源性均达100％；Lj-3与其中与Issatchenkia occidentalis同一区域核酸序列的同源性达到100％。

根据上述的细胞、菌落形态、生理生化与分子生物学特征的可以确定，S-7的分类地位属于东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)；Lj-3的分类地位属于的西方伊萨酵母(Issatchenkia occidentalis)。

东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)S-7在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的保藏号为CCTCC NO：M206098，它的26S rDNA D1/D2区域的核苷酸序列在GenBank的登记号为EF030708

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nucleotide&val＝116834296；

西方伊萨酵母(Issatchenkia occidentalis)Lj-3在CCTCC的保藏号为CCTCC NO：M206097，它的26S rDNA D1/D2区域的核苷酸序列的GenBank登记号为EF030710

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nucleotide&val＝116834298。

表1分离物S-7、Lj-3的细胞与菌落形态特征

	菌落形态	细胞特征
			S-7	表面干燥，边缘辐射状。	多端出芽，细胞平均长度为：10～20um之间。
Lj-3	有光泽，表面粘稠，边缘整齐平滑。	多端出芽，细胞平均长度为：5～15um。

表2分离物S-7、Lj-3的生理生化特征(+，利用；-，不利用)

东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)S-7(CCTCC NO：M206098)26SrDNA D1/D2区域的核酸序列(GenBank登记号EF030708)：

1  taagcggagg aaaagaaacc aacagggatt gcctcagtag cggcgagtga agcggcaaga

61 gctcagattt gaaatcgtgc tttgcggcac gagttgtaga ttgcaggttg gagtctgtgt

121ggaaggcggt gtccaagtcc cttggaacag ggcgcccagg agggtgagag ccccgtggga

181tgccggcgga agcagtgagg cccttctgac gagtcgagtt gtttgggaat gcagctccaa

241gcgggtggta aattccatct aaggctaaat actggcgaga gaccgatagc gaacaagtac

301tgtgaaggaa agatgaaaag cactttgaaa agagagtgaa acagcacgtg aaattgttga

361aagggaaggg tattgcgccc gacatgggga ttgcgcaccg ctgcctctcg tgggcggcgc

421tctgggcttt ccctgggcca gcatcggttc ttgctgcagg agaaggggtt ctggaacgtg

481gctcttcgga gtgttatagc cagggccaga tgctgcgtgc ggggaccgag gactgcggcc

541gtgtaggtca cggatgctgg cagaacggcg caacaccgcc cgtcttgaaa cacgga

西方伊萨酵母(Issatchenkia occidentalis)Lj-3(CCTCC NO：M206097)的26S rDNA D1/D2区域核酸序列(GenBank登记号EF030710)：

1  tatcaataag cggaggaaaa gaaaccaaca gggattgcct cagtagcggc gagtgaagcg

61 gcaaaagctc agatttgaaa tcgtgtttcg gcacgagttg tagattgcag gttggagtct

121ttgtggaagc gtgtgtctaa gtcccttgga acagggtgcc attgagggtg agagccccgt

181gagacgcgtg cggaagctgt aaggcccttc tgacgagtcg agttgtttgg gaatgcagct

241ctaagtgggt ggtaaattcc atctaaggct aaatattggc gagagaccga tagcgaacaa

301gtactgtgaa ggaaagatga aaagcacttt gaaaagagag tgaaacagca cgtgaaattg

361ttgaaaggga agggtattgg gctcgacatg ggatttgcgc accgctgctc cttgtgggcg

421gcgctctgtg cttttcctgg gccagcatcg gtttttgccg caggagaagg cgtgctggaa

481tgtggctctt cggagtgtta tagccagtgc gagatgctgc gtgcggggac cgaggactgc

541gacatctgtc tcggatgctg gcacaacggc gcaataccgc ccgtcttgta a

本发明按下述方法制备所需要的半纤维素水解物：

将甘蔗渣、玉米芯、稻草等作物秸秆粉碎至适当粒度，按固液比1∶6～7加入0.3～3％(w/w)的稀硫酸或稀盐酸溶液，搅拌均匀，在耐酸的压力容器内加热至100～130℃，维持0.5～3小时。水解结束后滤除残渣，滤液即为半纤维素水解物。用固体碳酸钙或氢氧化钙将半纤维素稀酸水解液调至pH值3～8，可直接或浓缩后再进行生物脱毒。一般地，较高酸浓度的条件可以使用较低的水解温度，或相应缩短水解时间，较低的酸浓度则必须提高水解温度或延长水解时间。

本发明按下述方法培养用于半纤维水解物生物脱毒，木糖醇发酵，乙醇发酵的微生物菌种：

脱毒菌株种子液的培养：将CCTCC NO：M206098或CCTCC NO：M206097的斜面培养物接入液体种子培养基，装液量为摇瓶容量的20％，在27--30℃，转速200rmp条件下摇床培养12～18小时，即可获得可用于脱毒的种液。种子培养基组成为：葡萄糖50g/L，MgSO₄.7H₂O 2g/L，K₂HPO₄ 4g/L，KH₂PO₄ 6g/L，酵母膏5g/L。

发酵木糖生成木糖醇的菌株种子液培养：所用的菌株为热带假丝酵母(Candida tropicalis)，它在2005年6月15日被保存到中国武汉·武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M205067，分类命名为热带假丝酵母1-18Candida tropicalis 1-18，(见发明专利“热带假丝酵母菌株的分离及其用于木糖醇生产的方法”，发明专利申请号200510037580.2)，含葡萄糖20g/L，木糖20g/L，其余成分与培养条件同脱毒菌株种子培养。

发酵木糖生成乙醇的菌株种子液培养：所用的菌株为保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)的嗜单宁管囊酵母(Pachysolen tannophilus)CICC 1770，培养基成分及培养条件同发酵木糖生成木糖醇的菌种培养。

本发明按下述方法进行半纤维素水解物生物脱毒：

半纤维素水解物总糖含量为4～20％(w/w)，其中还原性单糖占总糖含量＞90％以上，以木糖为主成分。用碱液(氢氧化钙，氨水等)调节至pH3-7，按10％(v/v)接种量接入培养好的CCTCC NO：M206098或CCTCC NO：M206097种子液，在25～35℃，通气条件下发酵脱毒5～2O小时，其中的大部分微生物有毒成分即可被降解除去。收集离心沉淀的菌体重复用于下一批新鲜的半纤维素水解物脱毒，离心上清液可直接或者浓缩后用于木糖醇发酵，或乙醇发酵。

本发明按下述方法发酵脱毒后的半纤维素水解物生产木糖醇：

已经过CCTCC NO：M206098，或CCTCC NO：M206097发酵脱毒过的半纤维素水解物，真空浓缩至木糖约150g/L，氨水调节至pH＝6，另加入酵母膏5g/L，得到用于木糖醇发酵的半纤维素水解物培养基。木糖醇发酵用摇瓶进行，摇瓶装量10％，按5％(v/v)接种量接入热带假丝酵母(Candida tropicalis)CCTCCNO：M205067种子液，200rmp，33℃进行发酵至木糖消耗完。收集离心沉淀的菌体，投入到新鲜的半纤维素水解物培养基中继续新一轮的木糖醇发酵，离心上清液用于制备木糖醇。

本发明按下述方法利用半纤维素水解物进行同步脱毒发酵生产木糖醇：

真空浓缩半纤维素水解物至木糖含量约100--150g/L，用碱(氢氧化钙，或氨水)调至pH 3--pH7，，离心或过滤除去沉淀，加入酵母膏5g/L，得半纤维素水解物培养基，分装于三角瓶；取培养好的株CCTCC NO：M206098种子液，或者CCTCC NO：M206097的种子液，并与等体积的CCTCC NO：M205067种子液混合，然后按5％(v/v)和用种量接入半纤维素水解物中，摇瓶培养至木糖消耗完。离心收集沉淀的酵母细胞并用于新鲜的培养基中，继续同步脱毒发酵。如此不断地循环，直至酵母细胞不能利用。

本发明按下述方法利用半纤维素水解物进行同步脱毒发酵生产乙醇：

同步脱毒发酵生产乙醇所用的半纤维素水解物的培养基，与同步脱毒发酵生产木糖醇的培养基相同。取培养好的株CCTCC NO：M206098种子液，或者CCTCCNO：M206097的种子液，与等体积的CICC 1770种子液混合，然后按5％(v/v)和用种量接入半纤维素水解物培养基摇瓶中，培养至木糖消耗完。离心收集沉淀的酵母细胞循环用于发酵新鲜的培养基，继续同步脱毒发酵，如此不断地循环，直至酵母细胞不能利用。蒸馏回收离心上清液中的乙醇。

本发明用高效液相色谱法检测生物脱毒菌株对半纤维素水解物中的代表性毒物质，及主要酚类物质降解活性。

选择乙酸、糠醛及愈创木酚作为半纤维素水解物中不同类型抑制物的代表，将这三种化合物一起加入到普通酵母培养基中，并接入脱毒活性菌株(CCTCCNO：M206097，或CCTCC NO：M206098)进行发酵。利用这三种化合物均在198nm处均有较强的紫外吸收的特点，在如下色谱条件：Waters486高效液相色谱仪，ZORBAX XDB-C18色谱柱，流动相甲醇∶磷酸(0.2％，w/w)＝75∶25(v/v)，对比检测这三种化合物在发酵前后的含量变化，判断这两个菌株对这三种代表性有毒成分均具有降解活性(图1)。

由于酚类化合物在270nm附近均有强的紫外吸收，故以270nm为检测波长，以高效液相对比检测操作1的蔗渣半纤维素水解物、操作3的经东方伊萨酵母CCTCC NO：M206098生物脱毒，经西方伊萨酵母CCTCC NO：M206097生物脱毒的蔗渣半纤维素水解物(图2)。并分析这一检测波长条件下的一些特征峰的信息(表4)，可知半纤维素水解物经生物脱毒处理之后，其中的糠醛及许多有毒的酚类物质已被降解。

本发明用对比生物发酵的方法检测生物脱毒菌株对半纤维素水解物的脱毒效果：

用CCTCC NO：M205067对比发酵经CCTCC NO：M206097，或经CCTCCNO：M206098脱毒处理前后半纤维素水解物，检测发酵产物木糖醇；或用CICC1770对比发酵经CCTCC NO：M206097，或经CCTCC NO：M206098脱毒处理前后半纤维素水解物，检测发酵产物乙醇。可以发现，经过本发明所提供的生物菌株及脱毒方法处理后的半纤维水解物，无论用于木糖醇发酵或乙醇发酵，发酵物的产量、生成速率均有大幅度提高。由此即可肯定，本发明提供的生物脱毒菌株及生物脱毒方法能有效地提高半纤维素水解物的发酵性能。

本发明突出的实质性特点和显著进步是：

1.本发明发现并提供的东方伊萨酵母CCTCC NO：M 206097，西方伊萨酵母CCTCC NO：M 206098这两个菌株，对半纤维水解物中三大代表性微生物代谢抑制物：以醋酸为代表的有机酸，以糠醛为代表的糖类降解产物，及以愈创木酚为代表的酚类化合物，均同时具有降解活性，它们对半纤维水解物均具有突出的生物脱毒活性。

2.本发明利用东方伊萨酵母CCTCC NO：M 206097，或西方伊萨酵母CCTCCNO：M 206098生物降解半纤维素水解物中的多种有毒成分，事实减少了基质中的杂质。与传统的理化脱毒工艺相比，用本发明对半纤维素水解物进行脱毒，显然具有简捷、低成本、及环境友好的突出优势。

3.本发明提供的两个脱毒活性菌株，其中CCTCC NO：M 206097完全不能同化木糖、CCTCC NO：M 206098对木糖的代谢能力也十分微弱，利用它们对半纤维素水解物脱毒，并并不会造成其中的木糖损失。由于这一特点，将它们与发酵木糖生成木糖醇，或发酵木糖生成乙醇的微生物置于同一发酵系统中，可实现半纤维水解物脱毒过程与木糖醇发酵，或与乙醇发酵相偶联，极大地简化发酵半纤维素水解物生产木糖醇发酵，或生产乙醇的工艺。

附图说明

图1为抑制物经脱毒活性菌株降解后的高效液相色谱变化。其中参数为：(A)抑制物，(B)培养基，(C)添加了抑制物的培养基，(D)含抑制物的培养基经CCTCC NO：M206097发酵脱毒，E含抑制物培养其经CCTCC NO：M206098发酵脱毒。峰号与化合物：1乙酸，2糠醛1，3愈创木酚，4、5培养基成分，6糠醛降解产物，7愈创木酚降解产物。

图2为蔗渣半纤维水解物生物脱毒前后的HPLC图谱(检测波长270nm)。其中参数为：A，糠醛标样；B，蔗渣半纤维水解物；C，经CCTCC NO：M206098脱毒的蔗渣半纤维水解物；D，经CCTCC NO：M206097脱毒的蔗渣半纤维水解物。

具体实施方式

操作1

称已经水洗并重新干燥过的蔗渣3kg，按固液比(w/v)为1∶7加入H2SO4溶液(2.5％，w/w)，120℃水解2h，离心收集滤液，滤渣水洗一次，合并滤液，用碳酸钙固体调pH值至3，抽滤除去沉淀，得蔗渣半纤维素水解物。此水解物还原糖含量3％，木糖单糖占总糖的80％以上。

操作2

取已经粉碎的干玉米芯2kg，按固液比1∶7加入2％(w/w)的H₂SO₄溶液，120℃水解2h，收集液体部分，碳酸钙中和至pH值3，抽滤除去沉淀物，得以玉米芯半纤维素稀酸水解液。此水解液总糖含量5％，其中木糖约占总糖的60％。

操作3

将西方伊萨酵母CCTCC NO：M206097斜面接种到液体种子培养基上，200rmp，30℃摇床培养12h，得活化种子液。按15％(v/v)的接种量接入操作1，所得的蔗渣半纤维素稀酸水解液中，200rmp，33℃摇床发酵脱毒45h，离心上清液即为经东方伊萨酵母CCTCC NO：M206098生物脱毒的蔗渣半水解物。

(或者按同条件，用东方伊萨酵母CCTCC NO：M206098处理操作1的蔗渣半纤维素水解物，得到经东方伊萨酵母CCTCC NO：M206098生物脱毒的蔗渣半纤维素水解物。)

操作4

操作3所得的经生物脱毒处理的蔗渣半纤维素水解物，继续真空浓缩至木糖150g/L，氨水调节至pH＝6，另加入酵母膏5g/L，接入热带假丝酵母(Candida tropicalis)CCTCC NO：M205067种子液，接入量为5％(v/v)，200rmp，33℃进行发酵。对比HPLC检测结果(表3)，经过生物脱毒处理后的半纤维素水解物用于木糖醇发酵，不仅产物生成速率提高了一倍以上，产物转化率也接近提高一倍。

表3.生物脱毒处理对木糖醇发酵的影响(初始木糖浓度，150g/L；发酵时间，61.5h)

操作5

将操作1所得的半纤维素水解物，减压浓缩至可溶性固形物木糖含量约120g/L，氨水调节至pH5，一组等量接入离心收集的东方伊萨酵母CCTCCNO：M206098和热带假丝酵母CCTCC NO：M 205067细胞，另一组则等量接入西方伊萨酵母CCTCC NO：M206097细胞和热带假丝酵母CCTCC NO：M 205067细胞。它们的总接种量均约为干细胞50g/L。33℃，200rpm条件下摇瓶同步脱毒发酵30小时。结果(表4)表明，同步脱毒发酵能明显提高发酵产物浓度，产物生成速率与产物转化率。

表4.半纤维素水解物同步脱毒发酵与直接发酵生产木糖醇性能的比较(初始木糖，120g/L；发酵时间，30小时)

操作6.

将操作2所得的半纤维素水解物，减压浓缩至可溶性固形物木糖含量约60g/L，氨水调节至pH5，分别按东方伊萨酵母CCTCC NO：M206098与热带假丝酵母CCTCC NO：M 205067组合，西方伊萨酵母CCTCC NO：M206097与热带假丝酵母CCTCC NO：M 205067组合的方式，进行等量混合细胞接种，总接种量约为培养其体积的5％，33℃，200rpm条件下摇瓶同步脱毒发酵80小时。结果(表5)表明，同步脱毒发酵能明显提高发酵产物乙醇的生成速率与乙醇浓度。

表5生物脱毒处理对木质纤维素水解残渣同步糖化发酵乙醇性能的影响

参见图1.抑制物经脱毒活性菌株降解后的高效液相色谱变化。其中参数为：(A)抑制物，(B)培养基，(C)添加了抑制物的培养基，(D)含抑制物的培养基经CCTCC NO：M206097发酵脱毒，E含抑制物培养其经CCTCC NO：M206098发酵脱毒。峰号与化合物：1乙酸，2糠醛1，3愈创木酚，4、5培养基成分，6糠醛降解产物，7愈创木酚降解产物。图2为蔗渣半纤维水解物生物脱毒前后的HPLC图谱(检测波长270nm)。其中参数为：A，糠醛标样；B，蔗渣半纤维水解物；C，经CCTCC NO：M206098脱毒的蔗渣半纤维水解物；D，经CCTCCNO：M206097脱毒的蔗渣半纤维水解物。

表6生物脱毒处理之后蔗渣半纤维水解物中某些紫外吸收物的含量变化(检测波长270nm)

Claims (7)

1.一种微生物菌株，其特征在于，所述微生物菌株为西方伊萨酵母Issatchenkia occidentalis(Lj-3)，CCTCC NO：M206097。

2.根据权利要求1所述的微生物菌株，其特征在于，所述微生物菌株的26SrDNA D1/D2区域核苷酸特征序列与GenBank登记号为EF030710的特征序列同源性为100％。

3.一种用于权利要求1或者2所述的微生物菌株的制备方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：

S1.用蔗渣半纤维素水解物为分离培养基的基本成分，适当真空后用碱调节pH 5-6，如果制成平板，外加琼脂20g/L作为固形剂；

S2.从纸浆厂废水污染的环境采集的土壤、淤泥作分离样品，250ml三角瓶装量25ml，接入废水或淤泥分离样品约1g，30℃，200rpm摇瓶富集培养72h；

S3.取有菌体生长的培养液在同一培养基平板上划线分离，选择能够快速生长的类型，转到斜面保存；

S4.斜面培养物转移到半纤维稀酸水解物中并在摇瓶条件下培养24小时，离心除去菌体，然后接入能够同化木糖的酵母菌株进行发酵，选留那些能够有效改善半纤维素稀酸水解物发酵性能的脱毒活性菌株；

S5.按照上述步骤经过十个以上批次的样品分离，获得改善半纤维素水解物发酵性能活性最强的一个分离物Lj-3；

S6.把按照上述步骤分离得到的菌株Lj-3于4℃冷藏或用冻干法保藏。

4.一种用于权利要求1或者2所述的微生物菌株的半纤维素水解物生物脱毒种子液制备方法，其特征在于，所述种子液制备方法包括如下步骤：

S1.制备培养基，所述培养基的组成为：葡萄糖50g/L，MgSO₄.7H₂O2g/L，K₂HPO₄ 4g/L，KH₂PO₄ 6g/L，酵母膏5g/L；

S2.将CCTCC NO：M206097的斜面培养物接入液体种子培养基，装液量为摇瓶容量的20％；

S3.在27--30℃，转速200rmp条件下摇床培养12～18小时，获得可用于脱毒的种子液。

5.用权利要求1或者2所述的菌株制备木糖醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.经过CCTCC NO：M206097发酵脱毒过的半纤维素水解物，真空浓缩至木糖约150g/L，氨水调节至pH＝6，另加入酵母膏5g/L，得到用于木糖醇发酵的半纤维素水解物培养基

S2.木糖醇发酵用摇瓶进行，摇瓶装量10％，按5％(v/v)接种量接入热带假丝酵母(Candida tropicalis)CCTCC NO：M205067种子液，200rmp，33℃进行发酵至木糖消耗完；

S3.收集离心沉淀的菌体，投入到新鲜的半纤维素水解物培养基中继续新一轮的木糖醇发酵，离心上清液制备木糖醇。

6.用权利要求1或者2所述的菌株对半纤维素水解物进行同步脱毒发酵生产木糖醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.真空浓缩半纤维素水解物至木糖含量约100--150g/L，用碱(氢氧化钙，或氨水)调至pH 3--pH7，离心或过滤除去沉淀，加入酵母膏5g/L，得半纤维素水解物培养基；

S2.取培养好的CCTCC NO：M206097种子液，与等体积的CCTCC NO：M205067种子液混合，然后按5％(v/v)和用种量接入半纤维素水解物中，摇瓶培养至木糖消耗完；

S3.离心收集沉淀的酵母细胞并用于新鲜的培养基中，继续同步脱毒发酵。如此不断地循环，直至酵母细胞不能利用。

7.用权利要求1或者2所述的菌株对半纤维素水解物进行同步脱毒发酵生产乙醇的方法，其特征在乎，包括如下步骤：

S1.真空浓缩半纤维素水解物至木糖含量约100--150g/L，用碱(氢氧化钙，或氨水)调至pH 3--pH7，离心或过滤除去沉淀，加入酵母膏5g/L，得半纤维素水解物培养基；

S2.取培养好的CCTCC NO：M206097种子液，与等体积的CICC 1770种子液混合，然后按5％(v/v)和用种量接入半纤维素水解物培养基摇瓶中，培养至木糖消耗完；

S3.离心收集沉淀的酵母细胞循环用于发酵新鲜的培养基，继续同步脱毒发酵，如此不断地循环，直至酵母细胞不能利用；

S4.蒸馏回收离心上清液中的乙醇。

Images