CN101802619A - 筛选NF-κB途径活化的选择性调节剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及筛选NF-κB途径活化的选择性调节剂的方法。本发明涉及到通过识别和选择调节NEMO和其他蛋白之间相互作用的分子来初步筛选有可能调节(激活或抑制)NF-κB途径活化分子的方法。本发明同样也涉及到第二次筛选NF-κB途径活化的调节剂(活化剂或抑制剂)的方法。
Description
技术领域
本发明涉及识别和选择分子的方法，该分子通过调节NEMO和其他蛋白之间的相互作用来调节(激活或抑制)NF-κB途径活化。
背景技术
核因子-κB(NF-κB)信号传导是一种涉及各种基本细胞代谢过程包括炎症反应、肿瘤生成、病毒感染、调节细胞增殖、凋亡以及B和T淋巴细胞的抗原刺激的信号传导途径(Ghosh，1998，Annu.Rev.Immunol.；Karin，1999，J.Biol.Chem.；Israel，2000，Trends CellBiol.；Santoro，2003，EMBO J.)。在哺乳动物细胞中，存在5种二聚体化的NF-κB家族成员：RelA、RelB、c-Rel、NF-κB2/p100/p52和NF-κB1/p105/p50。NF-κB的主要的形式是由p50和RelA亚基组成的异二聚体的转录因子，在静止细胞中，其仍然通过与蛋白抑制家族成员例如为人们所熟悉的IκB相结合而被保留在细胞质中。一旦受到一些因子包括细胞因子TNF-α和白介素-1、内毒素(LPS)、微生物和病毒感染的刺激，促炎症信号就汇集于经典的IκB激酶复合物(IKK)，这是由两个激酶亚基IKKα/IKK-1和IKKβ/IKK-2以及一个结构性/调节性亚基NEMO/IKK-γ组成的蛋白复合物。一旦活化的IKK复合物磷酸化IκB蛋白，会引发它们的泛素化(ubiquitination，遍在蛋白化)和随后的被蛋白酶体降解。释放的NF-κB转录因子被移位至细胞核中，启动或上调基因表达。尽管IKKα和IKKβ呈现出惊人的结构相似性(52％)，但是遗传学研究已经表明它们涉及到激活NF-κB的两个途径(Pomerantz，2002，Mol Cell)。IKKβ是负责经典的NF-κB复合物活化的促炎症激酶，反之IKKα与NF-κB诱导激酶(NIK)结合，在非经典的NF-κB信号传导途径中起着重要的作用(Senftleben，2001，Science)。IKKα也在角质细胞分化上起着一定的作用，但是这个过程与其激酶活性无关(Hu，2001，Nature)。
NEMO蛋白(NF-κB essential modulator，NF-κB基本的调节剂)在NF-κB途径活化中起着关键的作用。NEMO蛋白与IKK复合物的IKKα和IKKβ蛋白激酶相结合。IKK激酶经过未知的机制被磷酸化活化，这被认为是NEMO寡聚化的结果(Agou et al.，2004，J.Biol.Chem.)。NEMO蛋白的存在是IKK活化的基础，因为NEMO缺陷型细胞不能应答于许多刺激而激活NF-κB。
应答于促炎症刺激而引发IKK活化的生化机制仍然不清楚。已经证明了活化T环上的两个丝氨酸残基的磷酸化引发了IKKβ的活化。但是，引起磷酸化的机制仍然是未知的。一个可能的机制包括NEMO寡聚化诱导的激酶的构型的改变(Agou et al.，2004，J.Biol.Chem.)。这种寡聚化状态的改变可能通过反式-自磷酸化的机制而诱导T环的活化(Zandi，1997，Cell；Tang，2003，J.Biol.Chem.)。
与IKK活化中的NEMO寡聚化的作用相符合的是，在应答于许多刺激物的NEMO缺陷型细胞的活化中，最小的寡聚化结构域的突变不能通过基因互补来解救NF-κB。此外，NEMO的强制的寡聚化导致了IKK复合物的完全活化(Inohara，2000，J.Biol.Chem.；Poyet，2000，J，Biol.Chem.；Poyet，2001，J.Biol.Chem.)。最近，已经有报道应答于TNF-α的NEMO的磷酸化和泛素化(Carter，2001，J.Biol.Chem.；Trompouky，2003，Nature；Kovalenko，2003，Nature)。但是，还没有证明这些NEMO的修饰是应答于一些促炎症刺激物IKK复合物活化的关键步骤。
NF-κB活化的抑制组成了开发抗炎症和抗癌症药物的特别的靶点(May，2000，Science；Poulaki，2002，Am J Pathol)。在NF-κB信号传导途径的许多蛋白作用剂中，IKK复合物代表着用于发现新的特异性NF-κB抑制剂的最有希望的分子靶点之一。为了使得体内可能的毒性最小化，治疗的成功将极大地依赖于NF-κB抑制剂阻断活化信号而不改变NF-κB活性的基础水平的能力。May等人描述了细胞渗透性的肽抑制剂，其通过破坏组成性的NEMO与IKK激酶的相互作用来特异性地阻断促炎症NF-κB活化(May，2000，Science；May，2002，J.Biol.Chem.)。通过肽的合理的设计改变蛋白的功能而调节蛋白与蛋白间的相互作用，为新型的治疗性药物的基础研究和开发提供了重要的工具(Souroujon，1998，NatBiotechnol.)，尤其是呈现可变的并且动态结合特性的信号传导蛋白(Pawson，2003，Science)。
在文献中已经描述了肽调节剂的大量的研究，其中肽通过干扰定位(转移)(Lin，1995，J.Biol.Chem.)、汇集于受体(Chang，2000，J.Biol.Chem.)、分子内相互作用(Souroujon，1998，Nat Biotechnol.)以及寡聚化(Judice，1997，P.N.A.S.)来调节蛋白的功能。在寡聚化中，用不同的肽抑制HIV-1gp4融合蛋白提供了概念上的明确验证(对其综述见Chan，1998，Cell and Eckert，2001，Ann.Rev.Biochem.)。
因此，NEMO蛋白是用于发展新的抑制NF-κB途径的药物的很有希望的靶点，因为它整合和协同了大多数NF-κB刺激，并且它不是IκB激酶复合物(IKK)的多余的成分。
NEMO蛋白的氨基酸序列表明这个蛋白是由几个结构域组成(Agou et al.，J.Biol.Chem.，2004b)。简而言之，多肽的N末端部分包含一个大的卷曲螺旋基序(coiled-coil motif，CC1)并且所有的残基都参与了蛋白质与IKK激酶的相互作用(IKK结合结构域)。C末端部分(残基250-412)由两个连续的卷曲螺旋基序CC2(残基253-285)和LZ(残基301-337)、以及蛋白质C末端的极远端的锌指基序所组成，具有作为蛋白质的调节部分的作用，已经经常有报道其作为结合模板来连接许多上游的信号传导分子或病毒蛋白(Ghosh，1998，Annu.Rev.Immunol.；Santoro，2003，EMBO J.)。
有趣的是，主要是在分子的这个部分发现了引起色素失调症(IP)和有免疫缺陷的外胚层发育不良(EDA-ID)的突变(2001，Nature Gen.；Zonana，2000，Am.J.Hum.Genet)。NEMO的最小的寡聚化结构域(MOD)由CC2和LZ卷曲螺旋基序组成(Agouet al.，J.Biol.Chem.，2004a)。MOD结构域也包含NLM基序(NEMO样基序)(293-322)(Agou et al.，2004b)。上面显示的残基编号是相对于序列SEQ ID NO：1的小鼠NEMO蛋白而言的。对于人的NEMO蛋白，CC2、LZ和NLM结构域分别对应于序列SEQ ID NO：2的残基260-292、残基301-344和残基300-329。
本发明人以前合成了来源于NEMO的MOD结构域的肽，其通过抑制NEMO寡聚化能抑制NF-κB途径(专利申请WO 2005/027959)。实际上，序列SEQ ID NO：6和SEQ IDNO：7的spLZ肽分别对应于小鼠和人的NEMO蛋白的LZ结构域，并且序列SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的spCC2肽分别对应于小鼠和人的NEMO蛋白的CC2结构域，spLZ肽和spCC2肽在IC50的μM范围内抑制NF-κB活化(W02005/027959，Agou et al.，2004b)。
其他来源于NEMO的LZ基序的N末端序列的肽NLM和DR-NLM，也抑制NF-κB活化。在国际PCT专利申请WO 2005/027959中也报道了它们的IC50值。DR-NLM肽的长度是LZ肽长度的一半(国际PCT专利申请WO 2005/027959)。肽NLM(SEQ ID NO：10)和DR NLM(SEQ ID NO：11)对应于序列SEQ ID NO：1的残基294-314，它们的不同之处是在DR NLM中序列SEQ ID NO：1的304位的天冬氨酸Asp残基被精氨酸Arg残基取代。来源于人的NEMO蛋白的NLM和DRNLM被分别限定为序列SEQ ID NO：18和SEQ IDNO：12。
WO 2005/027959和Agou等人(2004b)的方法都使用了体内细胞水平分析系统来确定特定的物质是否影响核因子-κB途径。尤其是他们使用内源的NF-κB-lacZ报告基因进行NF-κB抑制试验来确定不同的肽，比如CC2和LZ结构域，对NF-κB途径的影响。这种体内细胞水平分析试验已知有许多不利因素，尤其是由于需要维持合适的细胞系和确保影响试验的所有相关因子保持在必需的参数之内的复杂性。因此，使用这种体内分析试验进行化合物的大规模筛选与体外筛选技术相比起来，是既费时、复杂又昂贵的。出乎意料的，本发明人现在已经发现MOD结构域既可以作为寡聚化结构域又可以作为多聚泛蛋白链结合结构域。所述的NEMO结构域的双重性允许人们搜索一些新的化合物，这些化合物通过调节(增强或破坏)NEMO寡聚化或通过调节(增强或破坏)NEMO和多聚泛蛋白链之间的相互作用，特异性地调节NF-κB信号传导途径。实际上，在LZ通过破坏NEMO寡聚化来抑制NF-κB活化的同时，DR NLM通过阻断多聚泛蛋白链与NEMO蛋白之间的相互作用而起到NF-κB抑制剂的作用。这些结果也对NEMO的NLM结构域提供了新的视野，NLM结构域对应着NEMO功能所必需的新的和关键的泛素(遍在蛋白)结合结构域。更加重要的是，这些结果使人们可以限定NEMO的“热点”区域，其可以被使用为病毒筛选的靶点。
以前描述过NEMO-多聚泛蛋白之间的相互作用；Godha等人(2007)描述过人T细胞白血病病毒类型1(Human T-cell Leukaemia Virus type 1，HTLV-1)激活NF-κB途径的机制的体内研究。作者的研究表明，MAP激酶TAK1诱导NEMO的K63多聚泛蛋白化，他们相信这至少是HTLV-1影响NF-κB途径的机制之一。
同样，周等人(2004)也描述了Bc110过量表达对NF-κB途径的影响的研究。尤其是，他们的研究显示了Bc110过量表达使得NEMO成为K63多聚泛蛋白化的靶点，并且使用了体外泛素化测试来证明了这一点。
Godha等人(2007)和周等人(2004)都使用了全长的NEMO作为多聚泛蛋白的靶点。
但是，本发明人在他们的工作中发现，只包含NEMO的基本的CC2和LZ结构域的肽可以被用在方法中来识别NEMO活性的调节剂。通过只使用NEMO的基本部分，这就允许进行更灵敏的测试来发现可与这些NEMO最重要部分和遍在蛋白相互作用的调节剂，而不是与NEMO其他的或许没有特定功能的部分之间的普通的相互作用。
考虑到NEMO在炎症反应、肿瘤发生和病毒感染以及NF-κB信号途径的复杂性上的作用，这就需要初步筛选能通过破坏任何NEMO与其他蛋白之间相互作用(即寡聚化或NEMO与多聚泛蛋白链之间的相互作用)而起作用的物质。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种用于选择特异性地调节(活化或抑制)NEMO与其他蛋白相互作用的分子的筛选测试方法。更具体地说，所述的筛选测试方法使用NEMO的MOD结构域来检测新的有效的和特异性的NF-κB途径活化的调节剂。
因此，本发明的第一个目的在于提供一种初步筛选NF-κB途径活化的潜在的调节剂的体外方法，其特征在于，其包括下列的步骤：
(a)在不存在被测试的物质S的情况下，将(i)由NEMO的CC2和LZ区域组成的肽P1与(ii)被标记的或没有被标记的肽P2相接触，所述的肽P1是被标记的或没有被标记的，所述肽P2选自下组：含有NEMO的LZ区域中至少10个氨基酸残基、优选NEMO的LZ区域中至少36个氨基酸残基的肽，含有NEMO的NLM区域中至少10个氨基酸残基、优选NEMO的NLM区域中至少21个氨基酸残基的肽，含有DR-NLM的肽，含有NEMO的CC2和LZ区域的肽，含有NEMO的CC2区域中至少10个氨基酸残基的肽，以及含有由K63联接的多聚泛蛋白化链的肽；
(b)在有被测定的物质S存在的情况下，将被标记的或没有被标记的所述肽P1与被标记的或没有被标记的所述肽P2相接触；
(c)通过测定合适的信号来检测步骤(a)中得到的P1与P2之间形成的复合物；
(d)通过测定合适的信号来检测步骤(b)中得到的P1与P2之间形成的复合物；
(e)比较(c)中检测的信号与(d)中检测的信号，并且选择(c)中检测的信号/(d)中检测的信号的比值不等于1的物质S。
根据本发明，术语“区域”和“结构域”是可互换的。NEMO的CC2和LZ区域(或结构域)如上所述。
优选地，P1选自下组：序列SEQ ID NO：17的肽sp CC2-LZ、序列SEQ ID NO：19的肽spCC2-LZ、序列SEQ ID NO：1的小鼠NEMO蛋白、序列SEQ ID NO：2的人NEMO蛋白、序列SEQ ID NO：28的生物素标记的CC2-LZ肽、序列SEQ ID NO：29的生物素标记的人源化CC2-LZ肽、序列SEQ ID NO：30的六聚组氨酸标记的(six his-tagged)CC2-LZ肽以及序列SEQ ID NO：31的六聚组氨酸标记的人源化CC2-LZ肽。
优选地，P2选自由序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6至12、SEQ ID NO：17至19、SEQ ID NO：28至31的肽所组成的组。
在根据本发明的方法中使用的肽可以如同在专利申请WO 2005/027959中和Agou等人(2004b)所描述的那样被合成。
前缀“sp”(synthetic polypeptide，合成的多肽)指的是上述肽是合成的，并且可被用来举例区分肽(例如spCC2)和NEMO蛋白中相应的区域(例如CC2区域)。然而，肽和sp肽指的都是相同的产物。
此外，在不精确地说明的情况下，不同的肽，小鼠的NEMO蛋白和人的NEMO蛋白没什么不同。
优选地，所述由K63联接的多聚泛蛋白化分子选自下组：由K63联接的多聚泛蛋白链，例如K63Ub2-7(Boston Biochem，Inc)；与由K63联接的多聚泛蛋白链相连接的蛋白，例如多聚泛蛋白化蛋白RIP1(受体相互作用蛋白激酶1)(Ea et al.，2006)；以及包含由K63联接的多聚泛蛋白化蛋白的细胞提取物，例如来源于在前被TNF-α刺激的JM4.5.2细胞的细胞提取物。
在所述方法的优选的实施方式中，所述肽P1被固定在固相载体上。优选地，所述固相载体由磁性小珠组成。优选地，肽P1连接至生物素基团并且被固定在链亲和素磁性小珠上。
优选地，通过蛋白质印迹、荧光各向异性、荧光共振能量转移(FRET)或者均相时间分辨荧光(HTRF)来检测步骤(c)和(d)中的信号。
在所述方法的优选的实施方式中，所述肽P1没有被标记，并且所述肽P2被荧光标记物M1标记。
优选地，所述标记物M1选自由绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白以及包含马来酰亚胺基团的荧光团所组成的组。在Shaner等人(Nat.Biotech.，2004，22，1567)中的文献描述过其他的荧光标记物的例子。其他可以被使用的荧光团包括CFP/ds红和/或GFP/ds红(Erickson et al.，Biophys J.，2003，85，599-611)以及橙色类型的青色变体(Karawawa et al.，Biochem J.，2004，381(Pt1)，307-12)。包含马来酰亚胺基团的荧光标记物的例子是FL N-(2-氨乙基)马来酰亚胺荧光团(分子探针)。
优选地，所述被标记的肽P2选自由序列SEQ ID NO：4、5和13至16的肽所组成的组。
在所述方法另一个优选的实施方式中，所述肽P1被标记物M2标记，并且所述肽P2被标记物M3标记，M2和M3是一对荧光团供体和荧光团受体。
荧光团供体-荧光发生团受体对的例子是铕穴状化合物-XL665(Cis-Bio)对和Cy5/5(GE Healthcare)-BHQ3(Biosearch Technologies)对。
优选地，使用的杂合蛋白构建体以便将肽P1和/或P2或直接连接至、或通过连接分子(例如短肽)连接至荧光蛋白。连接可以发生在肽的N末端和C末端，优选的情况是增加的连接并不妨碍P1和P2之间的结合。
例如使用FRET方法，能够通过直接检测由于两个不同的标记物(荧光团供体和荧光团受体)的靠近而产生的荧光团受体的荧光发射，来检测P1与调节(活化或抑制)其结合至P2的物质之间的相互作用。在物质S存在的情况下荧光团受体的荧光发射的减少，与在不存在所述物质S的情况下所述荧光团受体的荧光发射相比较表明，所述物质S妨碍了P1和P2之间的结合。因此，荧光发射的减少表明所述的物质S妨碍了P1和P2的结合，同时所述荧光发射的增加表明所述的物质S增强了P1和P2的结合。
优选地，M2由第一标签和抗所述第一标签并且被荧光团供体标记的抗体所组成，而M3由第二标签和抗所述第二标签并且被荧光团受体标记的抗体所组成，所述的两个标签是互不相同的。
优选地，标记物M2的所述标签是聚His序列，并且标记物M3的所述标签是生物素。
在所述方法的进一步优选的实施方式中，所述潜在的调节剂是潜在的活化剂，并且步骤(e)包括比较(c)中检测的信号与(d)中检测的信号、并且选择(c)中检测的信号/(d)中检测的信号的比值小于1的物质S。
在所述方法的另一个优选的实施方式中，所述潜在的调节剂是潜在的抑制剂，并且步骤(e)包括比较(c)中检测的信号与(d)中检测的信号、并且选择(c)中检测的信号/(d)中检测的信号的比值大于1的物质S。
在其中肽P2表示包含由K63联接的多聚泛蛋白链的肽的情况中，肽P1优选自由包含NEMO的NLM区域中至少10个氨基酸(优选至少21个氨基酸)的肽、以及包含DRNLM的肽所组成的组。优选地，所述肽P1选自由序列SEQ ID NO：1、2、10、17至19以及28至31的肽所组成的组。
因此，在这种情况下，一种初步筛选NF-κB途径活化的潜在的调节剂的方法，其特征在于，其包括下列的步骤：
(a)在不存在测定的物质S的情况下，将(i)选自由包含NEMO的NLM区域中至少10个氨基酸的肽(优选至少21个氨基酸)、包含DR NLM的肽所组成的组的肽P1，与(ii)包含由K63联接的多聚泛蛋白链的肽P2相接触，所述肽P1是被标记的或是没有被标记的，所述P2是被标记的或是没有被标记的；
(b)在有被测定的物质S存在的情况下，将被标记的或没有被标记的所述肽P1，与被标记的或没有被标记的所述肽P2相接触；
(c)通过测定合适的信号来检测步骤(a)中得到的P1与P2之间形成的复合物；
(d)通过测定合适的信号来检测步骤(b)中得到的P1与P2之间形成的复合物；
(e)比较(c)中检测的信号与(d)中检测的信号，并且选择(c)中检测的信号/(d)中检测的信号的比值不等于1的物质S。
优选地，所述肽P1选自由序列SEQ ID NO：1、2、10、17至19以及28至31的肽所组成的组。
优选地，所述包含由K63联接的多聚泛蛋白化链的肽P2，被固定在固相载体上，如上所述。
优选地，用荧光标记物M1标记所述肽P2，如上所述，并且检测步骤(c)和(d)中的信号，如上所述。
在所述方法的优选的实施方式中，所述潜在的调节剂是潜在的活化剂，并且步骤(e)包括比较(c)中检测的信号与(d)中检测的信号、并且选择(c)中检测的信号/(d)中检测的信号的比值小于1的物质S。
在所述方法的另一个优选的实施方式中，所述潜在的调节剂是潜在的抑制剂，并且步骤(e)包括比较(c)中检测的信号与(d)中检测的信号、并且选择(c)中检测的信号/(d)中检测的信号的比值大于1的物质S。
可供选择地，用于初步筛选NF-κB途径活化的潜在的调节剂的方法，包括下列的步骤：
(a)将包含NEMO的CC2和LZ区域的肽P1和要测定的物质S相接触，所述的肽P1用标记物荧光团供体M2和荧光团受体标记M3，即既连接荧光团供体又连接荧光团受体；
(b)在不存在被测试的物质S的情况下测定荧光发射；
(c)在有被测试的物质S存在的情况下测定荧光发射；
(d)比较(b)中检测的信号与(c)中检测的信号，并且选择(b)中检测的信号/
(c)中检测的信号的比值不等于1的物质S。
优选地，步骤(c)和(d)中的所述的信号如上所述用FRET或者HTRF来检测。
优选地，所述荧光团供体连接至CC2区域的N末端，并且所述荧光团受体连接至LZ区域的C末端。
在所述可供选择的方法的优选的实施方式中，所述潜在的调节剂是潜在的活化剂，并且步骤(d)包括比较(b)中检测的信号与(c)中检测的信号、并且选择(b)中检测的信号/(c)中检测的信号的比值小于1的物质S。
在所述可供选择的方法的的优选的实施方式中，所述潜在的调节剂是潜在的抑制剂，并且步骤(d)包括比较(b)中检测的信号与(c)中检测的信号、并且选择(b)中检测的信号/(c)中检测的信号的比值大于1的物质S。
可供选择地，用于初步筛选NF-κB途径活化的潜在的调节剂的方法，其特征在于，其包括下列的步骤：
a)提供至少一种内源NEMO不足的细胞，其被一个或多个多聚核苷酸转化，该多聚核苷酸表达至少如本发明第一个目的所限定的肽P1和肽P2；
b)将物质S施加于所述的至少一种细胞；
c)通过测定合适的信号，检测在不存在物质S的情况下P1和P2之间复合物的形成；
d)通过测定合适的信号，检测在存在物质S的情况下P1和P2之间复合物的形成；
e)比较(c)中检测的信号与(d)中检测的信号，并且选择(c)中检测的信号/(d)中检测的信号的比值不等于1的物质S。
在该可供选择的方法的优选的实施方式中，P1是融合蛋白GFP-NEMO并且P2是融合蛋白Flag-NEMO，Flag是亲水的8个氨基酸残基的肽(SEQ ID NO：23)。优选地，P1被限定为序列SEQ ID NO：27，并且P2被限定为序列SEQ ID NO：25。
在该可供选择的方法的另一个优选的实施方式中，步骤(c)和(d)包括：
c1)(或d1)细胞裂解，
c2)(或d2)使用抗Flag-NEMO中Flag部分的抗体，免疫沉淀结合于或没有结合于GFP-NEMO的Flag-NEMO，以及
c3)(或d3)检测结合于被免疫沉淀的Flag-NEMO的GFP-NEMO中GFP部分的荧光发射。
在所述可供选择的方法的优选的实施方式中，所述潜在的调节剂是潜在的活化剂，并且步骤(e)包括比较(c)中检测的信号与(d)中检测的信号、并且选择(c)中检测的信号/(d)中检测的信号的比值小于1的物质S。
在所述可供选择的方法的另一个优选的实施方式中，所述潜在的调节剂是潜在的抑制剂，并且步骤(e)包括比较(c)中检测的信号与(d)中检测的信号、并且选择(c)中检测的信号/(d)中检测的信号的比值大于1的物质S。
本发明的另一个目的在于提供一种第二次筛选NF-κB途径活化的抑制剂的方法，包括：
a)通过按如上本发明所述的任何用于初步筛选潜在的抑制剂的方法，选择可能抑制NF-κB途径活化的物质S，
b)在不存在或存在(a)中被选择的物质S的情况下，将NF-κB途径的活化剂施加于包含处于NF-κB诱导的启动子控制之下的报告基因的细胞；
c)在不存在物质S的情况下通过测定合适的信号来检测报告基因的表达；
d)在有物质S存在的情况下通过测定合适的信号来检测报告基因的表达；以及
e)比较(c)中检测的信号与(d)中检测的信号，并且选择(c)中检测的信号/(d)中检测的信号的比值大于1的物质。
优选地，步骤c)中使用的NF-κB途径的所述活化剂选自下组：TNF-α、IL-1β、PMA、离子霉素以及来自于流产沙门氏菌(Salmonella abortus)的LPS。
报告基因优选自由编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因、以及编码荧光素酶的luc基因所组成的组。报告基因优选处于包含SRE序列(Serum Response Element，血清效应元件)的启动子的控制之下。在专利申请WO 2005/027959和在agou等人2004b中描述过这种构建体。
在用于第二次筛选的该方法的优选实施方式中，所述的细胞是70Z/3-C3细胞，于2003年4月1日以保藏号I-3004保藏在法国培养物和微生物国家保藏中心(Collection Nationalede Cultures de Microorganismes，(C.N.C.M.))。
在另一个优选的实施方式中，所述细胞是T淋巴细胞或者MEF细胞(小鼠胚胎纤维原细胞)，其包括NF-κB途径的报告系统。
优选地，经过如同本发明所述方法选择的NF-κB途径活化的所述抑制剂，是NF-κB途径的特异性抑制剂，其并不抑制ERK和p38途径活化、NF-AT途径活化、以及AP1途径活化。
因此，用于筛选的第二个方法优选地包括附加的步骤来确定被选择的抑制剂是否作用于ERK和p38途径、NF-AT途径以及AP1途径。通过所述方法选择的抑制剂是那些不抑制ERK、p38、NF-AT以及AP1途径活化的抑制剂。
例如使用处于相应的途径诱导的启动子控制之下的报告基因，可以进行ERK和p38途径、NF-AT途径以及AP1途径的抑制测试。报告基因的例子如上所述。被ERK和p38途径、NFAT途径、以及AP1途径诱导的构建体的例子分别是SRE-luc(Courtois et al.，1997，Mol.Cell.Biol，17：1441-1449)、NF-AT-luc以及AP1-luc(Northrop et al.，1993，J.Biol.Cell.，268：2917-2923)。例如通过使用转化细胞，比如包含相应的构建体的、用PMA和离子霉素刺激的细胞，进行报告基因的表达测试。
本发明的另一个目的在于提供一种用于第二次筛选NF-κB途径活化的活化剂的方法，包括：
a)通过按如上本发明所述用于初步筛选潜在的活化剂的方法，选择可能激活NF-κB途径活化的物质S，
b)提供包含处于NF-κB诱导的启动子控制之下的报告基因的细胞；
c)在不存在物质S的情况下通过测定合适的信号来检测报告基因的表达；
d)在有物质S存在的情况下通过测定合适的信号来检测报告基因的表达；以及
e)比较(c)中检测的信号与(d)中检测的信号，并且选择(c)中检测的信号/(d)中检测的信号的比值小于1的物质。
报告基因优选自由编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因、以及编码荧光素酶的luc基因所组成的组。报告基因优选处于包含SRE序列(血清效应元件)的启动子的控制之下，如上所述。
在用于第二次筛选方法的优选实施方式中，所述的细胞是70Z/3-C3细胞，于2003年4月1日以保藏号I-3004保藏在法国培养物和微生物国家保藏中心(C.N.C.M.)。
附图说明
当通过参照以下的附图连同下面的详细说明更好地理解本发明时，可以容易地获得对本发明和其伴随的许多优点的更加完整的认识。
图1：肽DR NLM对NF-κB活化的抑制。A，经稳定转染的70Z/3-C3细胞在用15μg/mlLPS活化4小时之前，与bodipy标记的触角(Antennapedia)(BA)(黑三角形)、BA-NLM(实心的圆形)以及BA-DR NLM(实心的方形)(0-10μM)一起孵育2小时。用β-半乳糖苷酶(β-Gal)测试来检测NF-κB活性。插图，与或没有与(w/o)10μM BA-NLM或BA-DR NLM肽孵育、有(+)或没有(-)LPS活化之后的NF-κB活性。B，70Z/C3细胞和10μM BA-NLM或BA-DRNLM肽一起孵育2小时。细胞用(+)或不用(-)PMA或IL-1处理5小时。用β-半乳糖苷酶测试来检测NF-κB活性。
图2：肽BA-DR NLM与肽spCC2-LZ的体外结合。A，使用荧光各向异性分析BA-DRNLM：spCC2-LZ复合物的形成。插图：使用荧光各向异性分析BR7-DR NLM和spCC2-LZ复合物的形成。B，通过使用荧光各向异性的竞争性测试确定BA-DR NLM结合于spCC2-LZ的结合位点。荧光性BA-DR NLM(10μM)与spCC2-LZ(30μM)一起孵育形成BA-DRNLM：spCC2-LZ复合物。然后加入增加浓度的A-NLM(空心圆形)和融合于触角(antennapedia)序列的LZ的C末端部分(A-Cterm-LZ)(实心方形)，来取代结合于spCC2-LZ的BA-DR NLM。阴影线代表游离的BA-DR NLM的各向异性水平。
图3：肽DR NLM并不影响其他信号传导途径。BA-NLM和BA-DR NLM对AP1、Erk和P38MAPK途径以及NFAT途径的抑制影响。经不同的报告质粒(SRE-luc、AP1-luc、NFAT-luc)瞬时转染的Jurkat细胞与或没有与(w/o)5μM BA-NLM或BA-DR NLM一起孵育2小时，然后用PMA(100ng/ml)和离子霉素(1μg/ml)模拟刺激(-)或刺激(+)5小时。
图4：肽DRNLM与内源的NEMO相互作用。A，识别DRNLM肽的蛋白靶点的方法的总览。B，荧光测定Flag-Nemo覆盖的小珠。用Flag-NEMO(JM4.5.2/Flag-NEMO)重组的T淋巴细胞不用(w/o)或用显示的荧光肽处理2小时来使得肽内在化。对照肽(BA-LZ L322P/L329P)包含野生型NLM序列。接着几次洗涤细胞以除去多余的肽之后，细胞被裂解并且内源的Flag-NEMO经使用抗Flag的抗体分离出来。结合于NEMO的肽的量用荧光检测(上方左侧)。为了归一化所有的样品，覆盖在小珠上的NEMO的量通过使用抗NEMO的抗体的蛋白质印迹法来确定(上方右侧)，并被用来归一化所有的样品(下方)。
图5：基于细胞的测试(cell-based assay)探测不同的肽对NEMO寡聚化的影响的示意图。
图6：DR NLM肽并不抑制细胞中的NEMO寡聚化。A，GFP-NEMO和FLAG-NEMO形成异寡聚体。B、C，经GFP-NEMO和Flag-NEMO共转染的293T细胞用20μM的肽A-LZ、A-LZ L322P/L329P(B)、A-NLM或A-DR NLM(C)处理2小时。然后NEMO异寡聚体被免疫纯化，并且结合于异寡聚体的荧光NEMO亚基的量按实施例1.I中所描述的方法通过荧光来检测。
图7：DR NLM阻碍了细胞多聚泛蛋白化蛋白与包含NEMO的CC2和LZ结构域的肽CC2-LZ之间的相互作用。A，探测多聚泛蛋白化蛋白与肽spCC2-LZ之间的相互作用的方法的总览。B，结合于有或者没有被TNF-α刺激、以及有(+)或者没有(-)肽BA-NLM或BA-DR NLM的肽spCC2-LZ的多聚泛蛋白化蛋白的蛋白质印迹测试。
图8：HTRF测试的优化。A，确定GST-Ub4最优化的量。Biot-CC2-LZ和His-CC2-LZ(每个50nM)互相混合在结合缓冲溶液(20mM KPO4、100mM KF和0.1％BSA，pH 7)中，然后与Anti-His-XL665(7nM)和Streptavidin-EuK(2nM)一起孵育。接着5分钟孵化之后，加入不同浓度的GST-Ub4。1小时孵化之后监控FRET的信号。B，确定His-CC2-LZ和Biot-CC2-LZ最优化的量。Biot-CC2-LZ和His-CC2-LZ的总浓度通过化学计量比1比1在结合缓冲溶液中一起孵育，然后与Anti-His-XL665(7nM)、Streptavidin-EuK(2nM)和GST-Ub4(250nM)混合。1小时的孵化之后记录FRET的信号。C，DMSO对荧光信号的影响。类似于A的测试，使用浓度是250nM的GST-UB4，不同的是在结合缓冲溶液中使用了不同浓度的DMSO。
具体实施方式
以下将如同发明人所预期的那样通过举例特定的实施方式来描述。在下文的描述中，许多细节的陈述是为了提供一个深入的了解。但是很明显，对于本领域的技术人员，本发明可以不受这些特定的细节的限制而进行实施。在其他的情况下，没有描述那些为人们熟知的方法和结构，免得不必要地使说明书变得不清楚。
实施例
实施例1-材料和方法
A.-细胞培养、生物试剂和抗体
检测细胞培养中使用的RPMI1640培养基(Invitrogen)和胎牛血清(Biowest)中没有内毒素污染物。Jurkat(克隆20)细胞维持在添加了10％的胎牛血清的RPMI中。如Agou等人2004b所描述的那样，稳定的细胞系(70Z/3-C3，C.N.C.M.I-3004)是在70Z/3细胞存在cxl2lacZ-κB质粒的情况下经电穿孔之后获得的，该质粒在lacZ报告基因上游起的白介素-2启动子中含有三个串联拷贝的NF-κB结合位点。它们维持在添加了10％胎牛血清、50μMβ-巯基乙醇(Sigma)的RPMI1640中。稳定的细胞系(JM4.5.2/Flag-NEMO)是NEMO缺陷型T淋巴细胞(JM4.5.2，Harhaj et al.2000)在pcDNA3质粒存在的情况下经电穿孔后获得的，此质粒含有小鼠Flag-NEMO序列(Flag是Sigma提供的序列SEQ ID NO：23的亲水性的8个氨基酸的肽)。人的Jurkat白血病T细胞维持在添加了10％的胎牛血清的RPMI中。
人胚胎肾细胞系293T(美国典型培养物保藏中心；Manassas，弗吉尼亚州)在添加了100个单位/ml的青霉素和链霉素(Invitrogen)以及10％胎牛血清的DMEM培养基(Invitrogen)中培养。来源于流产沙门氏菌的LPS、佛波醇12-十四酸盐13-醋酸盐(PMA)和离子霉素购自Sigma公司，并且重组的小鼠IL-1β购自BD Pharmingen公司。多克隆的兔抗NEMO血清是来自于R.Weil的礼物，并且特异性抗体经免疫亲和被纯化。抗GFP的多克隆抗体来自于致癌基因。抗Flag M2单克隆抗体以及抗泛素抗体来自Sigma公司。
B.-肽合成和纯化
如以前所描述的那样合成肽(Agou et al.，2004b)。已经在国际专利申请W02005027959报道了肽的序列，并且它们中的一些表示在下面的表I中。
C.-FACS分析的条件
用FACS分析肽的内在化，如国际专利申请WO 2005/027959所描述的那样。
D.-NF-κB抑制测试
在450μl 10％FCS-RPMI(Invitrogen)中4.5x105个70Z/3-C3细胞与0-20μM肽BA-DR NLM或BA-NLM一起孵育。在37℃下2小时后，200μl的细胞样品被一式两份地转移至96孔微量滴定板上。一个孔用1μg/ml LPS、20ng/ml IL1-β或100ng/ml PMA处理4小时。对照孔不被处理。在37℃下4小时后，细胞在室温下以400xg离心5分钟，沉淀物用冷的PBS(200μl)洗涤三次，并且细胞在100μl的裂解缓冲液(25mM Tris-磷酸盐缓冲溶液，pH 7.8，含有8mM MgCl2、1mM二硫赤藓糖醇、1％Triton X-100、15％甘油和蛋白酶抑制剂混合物(Roche Applied Science，ref.1836145))中被裂解。裂解液在4℃下以1000xg离心20分钟，并且在进行β-半乳糖苷酶测试之前上清液被保存在冰上。用50μl的上清液在含有4μl的Galacton-star化学发光的底物和196μl的反应缓冲溶液(Clonetech)的测试混合物中进行β-半乳糖苷酶测试。用平板发光计(Berthold)来测定活性。
E.-其他信号传导途径的抑制测试
通过DEAE-葡聚糖方法用含有荧光素酶的报告质粒瞬时转染Jurkat T细胞(克隆20)，荧光素酶处于ERK和p38途径(SRE-luc；Courtois et al.，1997，Mol.Cell.Biol，17：1441-1449)、NF-AT途径或AP1途径(分别是NF-AT-luc和AP1-luc；Northrop et al.，1993，J.Biol.Cell.，268：2917-2923)诱导的启动子的控制之下。简而言之，细胞被洗涤并且以107个细胞/ml再悬浮在含有0.5mg/ml DEAE-葡聚糖(Pharmacia)的TBS中。加入1μg每2·106个细胞的报告质粒。在室温下45分钟后，用10个体积的TBS稀释细胞、离心、并且将细胞以106个细胞/ml再悬浮在10％FCS-RPMI中。24小时后，细胞与或没有与5μMNEMO衍生肽(BA-NLM或BA-DR NLM)孵育2小时。它们用100ng/ml PMA和1μg/ml离子霉素刺激或模拟刺激5小时，最后在荧光素酶缓冲溶液(25mM Tris-磷酸盐，pH 7.8，含有8mM MgCl2、1mM二硫赤藓糖醇、1％Triton X100、15％甘油)中裂解。用Berthold发光计进行荧光素酶的测定。
F.-荧光各向异性
用装配了用于激发和发射的偏振滤光镜的
荧光计(PTI)，并使用L构型的光电倍增管进行各向异性测定。所有的测试在22℃下微量比色池(60μl)中，激发和发射波长在495和513nm处进行。激发和发射波长的带通分别是2和4nm。如Agou人2004a所描述的那样测定表示为毫各向异性单位的稳定状态的荧光各向异性。在含有20mM KCl的pH8的等离子缓冲溶液(10mM乙酸、10mM MES、20mM Tris)进行测定。每个数据点是2分钟内采集的20个记录的结果。
G.-圆二色谱学
用Aviv215分光偏振计对稀释在pH 7的10mM NaPO4中的样品进行远紫外圆二色性(CD)测定。
H-识别结合于Bodipy连接的肽的蛋白
5·106个JM4.5.2/Flag-NEMO细胞接种于6孔板上(3ml/孔)并且在37℃下与20μMBodipy连接的肽(BA-NLM或BA-DR NLM)一起孵育4小时。细胞以400xg离心5分钟，再悬浮在低渗缓冲溶液(10mM TrisHCl pH 7.9、1.5mM MgCl2、10mM KCl)中，放置在冰上20分钟，并且通过26G针的几个通道来裂解细胞。裂解液以15000xg离心20分钟来澄清，并且80μg的总蛋白与40μl琼胶糖抗Flag M2小珠在4℃下一起孵育1小时。Flag-NEMO蛋白用琼胶糖抗Flag M2小珠通过离心1分钟被分离下来。小珠再悬浮在100μl低渗缓冲溶液中，并且NEMO连接的肽的荧光在SAFAS的酶标仪上进行读数。NEMO覆盖的小珠使用抗Flag M2单克隆抗体通过蛋白质印迹法进行分析，使用UN-SCAN-IT软件对样品进行归一化。
I.-细胞中NEMO寡聚化的抑制
通过钙-磷酸盐-DNA沉淀法用2μg含有FLAG-NEMO序列(序列SEQ ID NO：24的pcDNA3-Flag-NEMO)的质粒pcDNA3(Invitrogen)和0.7μg含有GFP-NEMO序列(序列SEQ ID NO：26的pcDNA3-GFP-NEMO)的质粒pcDNA3瞬时共转染293T细胞。每个6cm平皿加入空载体直至DNA的总量为4μg。转染后24小时，细胞再悬浮，并且在37℃下与或没有与20μM的肽(A-NLM或A-DR NLM)一起孵育7小时。细胞再悬浮，并且用PBS洗涤两次来去除多余的肽，并且如上所述(实施例1.D)在含有蛋白酶抑制剂混合物的150μl的裂解缓冲溶液中裂解细胞。裂解液在4℃下以15000xg离心20分钟来澄清。通过Bradford方法用DC Biorad试剂盒来测定澄清的裂解液中的蛋白的量。将100μg的总蛋白稀释于200μl相互作用缓冲溶液(50mM TrisHCl pH 7.5、1％triton X100、1mM DTE、300mM NaCl)中，并且在4℃下与40μl琼胶糖抗Flag M2小珠(Sigma)一起孵育1个小时。用抗Flag M2小珠将寡聚体Flag-NEMO/GFP-NEMO分离下来，并且用相互作用缓冲溶液洗涤两次。GFP-NEMO的荧光用荧光酶标仪SAFAS在小珠上直接读数，并且使用抗Flag、抗GFP和抗NDPK-B的抗体(Kraeft et al.，1996；Exp Cell Res；227：63-69)通过蛋白质印迹法对澄清的裂解液进行分析来使得结果归一化。
J.-识别结合于包含NEMO的CC2和LZ结构域的肽CC2-LZ的多聚泛蛋白化蛋白。
24·107个JM4.5.2细胞在37℃下用或不用10ng/ml TNFα刺激10分钟，用冷的PBS洗涤两次，并且按照在实施例1.D中所描述的方法在含有蛋白酶抑制剂混合物的900μl裂解缓冲溶液中裂解细胞。裂解液在4℃下以15000xg离心30分钟来澄清。150μl蛋白在4℃下与150μl的链亲和素磁性小珠(Mag
Novagen)孵育2小时，此链亲和素磁性小珠已经在4℃下与10μg生物素化的CC2-LZ在有或没有20μM肽(BA-NLM或BA-DRNLM)的情况下预孵育过1小时。小珠在缓冲溶液A(10mM Hepes pH 7.5、150mM NaCl、8mM MgCl2、10％甘油、0.1mM DDM和1mM DTE)中洗涤4次，并且再悬浮在30μl含有6M尿素的laemmli缓冲溶液中。样品用抗泛素抗体(Sigma)通过蛋白质印迹法进行分析，并且用抗NDPK-B抗体作为加样对照。
K.-搜索为被多聚泛蛋白链相互作用诱导的CC2-LZ二聚体化竞争的化合物。
均相时间分辨荧光
测试试剂，用XL665(MABHis6-XL)标记的抗(His)6单克隆抗体和链亲和素-铕穴状化合物(链亲和素-铕K)购自CIS-Bio。His-CC2-LZ肽(SEQID NO：30和31)如Agou等人2004a所描述的那样被纯化，并且生物素标记的CC2-LZ肽(SEQ ID NO：28和29)如Wyler等人2007所描述的那样被化学合成。
单遍在蛋白和由K63联接的多聚泛蛋白购自Boston Biochem。编码在其末端与GST蛋白融合的线性四聚遍在蛋白的cDNA是Y.Dikic的礼物。按照厂商(GE Healthcare)的产品说明，使用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4高流速(Glutathione Sepharose 4Fast Flow)来纯化GST-Ub4。使用酶标仪Mithras LB 940(Berthold Technologies)进行荧光共振能量转移(FRET)的所有测定。
在HTRF测试中，纯的His-CC2-LZ蛋白被抗His-XL665的单克隆抗体标记，并且biot-CC2-LZ被链亲和素-铕K标记。His-CC2-LZ和Biot-CC2-LZ的二聚化导致了供体(链亲和素-铕K)和受体(抗His-XL665)很接近。一旦铕穴状化合物在230nm处被激发之后，在这两个荧光团之间发生FRET，并且XL665在665nm处又发射出特定的长寿命的荧光。
所有的测试在25℃下黑色微量培养板Greiner(200μl)上进行。激发波长是320nm，并且荧光发射是在620nm处和665nm处进行测定以便对特定的信号归一化。荧光发射在50μs延迟之后在两个波长处记录下来，这会减少由培养基和游离的受体分子引起的背景噪音。FRET信号使用下面的公式进行计算：
(1)ΔF＝[(R-Rneg)/Rneg]*100
其中R是每个测试中计算的比值([在665nm处的发射/在620nm处的发射]*10000)，并且Rneg是阴性对照(即没有His-CC2-LZ)中相同的比值。
简而言之，His-CC2-LZ和biot-CC2-LZ(每个50nM)蛋白在含有100nM氟化钾和0.1％BSA的结合缓冲溶液pH7.0的20mM磷酸钾溶液中互相混合。孵育之后，将链亲和素-铕K(供体)和抗体抗-His-XL665(受体)分别以浓度2nM和7nM加入至混合物中。对于阴性对照，上面描述的所有的成分都存在于混合物中，除了His-CC2-LZ被结合缓冲溶液代替之外。在这些条件之下，没有检测到超过背景的FRET信号。
实施例2-DR NLM肽体外结合NEMO寡聚化结构域
以前的圆二色性和凝胶过滤研究表明，NLM和DRNLM肽没有形成寡聚化的卷曲螺旋结构，并且在肽的浓度最高达到100μM时仍表现为单体(数据没有显示)。那么，不像LZ肽，DR NLM肽以及NLM肽是不能自缔合的。LZ肽的自缔合如Agou等人2004b所描述的那样。
这里，本发明人确证了在用佛波酯(PMA)、促炎症细胞因子(IL-1)和内毒素(LPS)活化前B-70Z淋巴细胞之后，DRNLM抑制了NF-κB途径(图1A和1B)。对应于不同的刺激测定的IC50是相似的(0.9μM+/-0.1)。此外，使用各种内在化的肽(Tat、触角Antennapedia、R7、R9)产生了相似的IC50值，表明内在化不是限制步骤。
为了分析DRNLM是否与NEMO的MOD结合，荧光标记的BA-DRNLM(10μM)与增加浓度的spCC2-LZ孵育，并且用荧光偏振(P)来监控复合物的形成，结果根据公式A＝2P/(3-P)用各向异性(A)表示。SpCC2-LZ的浓度用氨基酸分析来确定(Vinolo et al；2006)。用等温结合方程来整合数据点，给出的解离常数是17μM。插图中，用BR7-DR NLM(10μM)进行相同的试验，给出相似的解离常数(KD＝21μM)。
DR NLM形成了亲合力是17μM并且化学计量是3∶1的稳定的MOD/肽复合物(图2)。这表明DRNLM肽优先地与MOD三聚体相互作用。这个相互作用并不依赖于细胞可渗透序列，因为与触角(肽(BA-DR NLM)或者多聚R7肽(BR7-DR NLM)融合于其N末端的DR NLM表现出相似的解离常数(图2A中插图)。使用模拟MOD数个区域的不同的肽通过荧光偏振来定位结合位点(图2B)。这个位点对应于NEMO的LZ亚结构域的C末端部分(残基315-336)。这个位点以前通过点突变分析被确定对于NEMO功能是必需的(Agou et al.，2004a)。
在不同的细胞类型中探测DR NLM诱导的NF-κB抑制的选择性的研究抓住了肽的最吸引人的性质。
在实施例1.E中描述的抑制测试的结果在图3中被描述。它们证明了NLM-DR并没有取消至少4个其他的途径，包括在T淋巴细胞中应答于PMA和离子霉素的AP1、ERK、p38和NF-AT途径，表明是DR NLM肽不是NLM肽特异性地抑制了NF-κ途径(图3)。
实施例3-DR NLM在细胞中与NEMO直接相互作用。
为了说明观察到的被DRNLM抑制是否是由于与NEMO的直接相互作用这个问题，我们使用了NEMO缺陷型T淋巴细胞(JM4.5.2细胞系)，其用Flag-NEMO蛋白基因(JM4.5.2/Flag-NEMO)稳定重组，如实施例1.A中描述的那样。在将细胞与BA-NLM-DR荧光标记的肽(20μM)或荧光标记的NLM对照(BA-LZ L322P/L329P)孵育4小时之后，细胞被裂解并且粗提取物与共价连接于琼脂糖小珠的抗Flag抗体一起孵育，如实施例1.H所描述的那样(见图4A方法的总览)。接着小珠的分离之后，检测附着于小珠的荧光，(实施例1.H)，用于分析结合于NEMO的肽的量(图4A和4B)。相对于每个样品中Flag-NEMO蛋白的表达水平，该测试通过蛋白质印迹法使用抗Flag M2单克隆抗体归一化。图4B显示，DR NLM特异性地结合于NEMO，表明给定的肽在抑制途径活化上的作用与它能与NEMO相互作用是完全相关的。
实施例4-DR NLM并不妨碍NEMO的寡聚化。
为了更好地分析DR NLM肽对NF-κB途径的抑制作用机理，本发明人开发了一种测试方法来探测细胞中NEMO的寡聚化，如实施例1.I所描述的那样(见图5基于细胞的测试的总览)。为此，使用了两个分别表达GFP-NEMO和FLAG-NEMO融合蛋白的质粒。该质粒共转染于人293T细胞中来过量表达外源的GFP-NEMO和Flag-NEMO融合蛋白，并且强化NEMO的寡聚化。细胞然后被送至去污剂裂解，并且如实施例1.I所描述的那样使用抗Flag琼脂糖小珠和Flag肽来免疫纯化Flag-NEMO蛋白。与小珠相关的荧光，其来源于异寡聚体中的Flag-NEMO和GFP-NEMO亚基的结合，可以估计细胞提取物中存在的寡聚物的量。对照物包括GFP-NEMO单独表达或Flag-NEMO和GFP蛋白的共表达，并不显示出任何与抗Flag小珠相关的荧光(图6A)。
BA-LZ肽在体外抑制NEMO的寡聚化(Agou et al.，2004b)。于是，BA-LZ被用作阳性对照来验证上述荧光细胞基测试。在这些测试条件下，Bodipy的荧光发射并没有干扰GFP的荧光发射的测定。如同图6B所示，与BA-LZ肽(20μM)一起孵育造成了荧光性NEMO亚基的量的急剧下降，表明BA-LZ肽抑制了细胞中的NEMO的寡聚化。相反的是，当使用在卷曲螺旋界面上含有双突变的同源的肽(BA-LZ L322P/L329P)时，或当没有用肽来处理细胞时，荧光性NEMO亚基的较高含量恢复了。有趣的是，NEMO寡聚物的形成在没有或有突变的肽(BA-LZ L322P/L329P)存在的情况下是一样的，表明使用该突变的肽没有观察到NEMO寡聚物的解离。
通过使用细胞水平测试，发明人检测了肽BA-DR NLM改变NEMO寡聚化的能力。图6C显示了在没有或有BA-DRNLM肽(20μM)的情况下相同的NEMO寡聚物的量，尽管BA-DR NLM能结合NEMO蛋白。总之，细胞中的试验指向了不依赖于其寡聚状态的NEMO抑制的一个新机制。
实施例5-DRNLM在细胞中抑制CC2-LZ与多聚泛蛋白化蛋白之间的相互作用。
最近的报告显示，NEMO也可以作为赖氨酸63联接的多聚泛蛋白化的传感蛋白(Eaet al.2006；Wu et al.，2006)。于是，本发明人研究了DR NLM是否阻碍了NEMO和K63多聚泛蛋白链之间的相互作用。为此目的，他们开发了一种分离测试方法，使用包含NEMO的CC2和LZ结构域的肽作为诱饵来分离出多聚泛蛋白化的蛋白，如实施例1.J所描绘的和图7A描绘的那样。覆盖在磁性小珠上的生物素化的CC2-LZ(Bio-CC2-LZ)在有或没有A-NLM或A-DR NLM肽的情况下与来自于被TNF-α刺激的或没有被刺激的NEMO缺陷型的T淋巴细胞(JM4.5.2细胞系)的粗提取物共孵育。在长时间洗涤小珠之后，所有的结合于CC2-LZ的单遍在蛋白化和多聚泛蛋白化的蛋白通过蛋白质印迹法使用抗遍在蛋白的抗体(Sigma)进行分析。如图7B所示，DR NLM肽在依赖于TNF-α的情况□下废除了CC2-LZ与细胞的多聚泛蛋白化的蛋白之间的相互作用，同时在没有或有NLM肽的情况下，没有观察到抑制。这些结果显示了多聚泛蛋白化的蛋白与CC2-LZ之间相互作用的大量减少，表明DR NLM肽通过阻断NEMO和多聚泛蛋白化蛋白之间的相互作用，来抑制NF-κB途径。相应地，使用荧光偏振的体外结合测试表明，无标记的DR NLM对于Lys63联接的多聚泛蛋白链的解离常数和协同性指数(希尔系数)(KD＝250μM，n＝1)比无标记的NLM(KD＝180μM，n＝8)要低。这表明NEMO的NLM肽代表新的遍在蛋白结合基序，并且在此基序中的简单的突变D→R导致了NEMO和多聚泛蛋白链之间相互作用的完全丧失。
以上概括的并结合于以前在国际专利申请WO2005027959中报道的那些结果表明，包含CC2和LZ结构域的NEMO区域可作为寡聚化结构域以及多聚泛蛋白链结合结构域。NEMO结构域的这些双重特性使得通过使用如实施例1.11a)、b)和c)中所描述的筛选测试方法来破坏NEMO寡聚化，或者通过使用如实施例1.12中所描述的筛选测试方法来破坏NEMO与多聚泛蛋白链之间的相互作用，可以搜索新的抑制NF-κB信号传导途径的化合物。
实施例6-以CC2-LZ寡聚化为基础的筛选测试
A.-搜索为LZ肽结合于包含NEMO的CC2和LZ结构域的肽CC2-LZ竞争的化合物
用SAFAS Xenius荧光计进行各向异性的测定。所有的测试在20℃下黑色微量培养板Greiner(100μl)上于激发和发射波长在495和515nm处进行。激发和发射波长的带通是8nm。Bodipy标记的R7-LZ(BR7-LZ)和R7-LZ肽显示在表I中，并且重组的His-CC2-LZ蛋白如Agou等人2004b所描述的那样被纯化。
BR7-LZ(5μM)和R7-LZ(20μM)在25℃下在含有50mM KCl、pH值是8的100μl Tris/MES缓冲溶液(10mM乙酸，10mM MES)中与靶目标His-CC2-LZ(10μM)一起孵育，诱导形成稳定的复合物。非荧光肽显示出与荧光肽一样的亲合力，使得可以增加连接于靶目标的肽的量。在这些测试条件下，His-CC2-LZ的添加导致了各向异性相对于游离的R7-NLM-LZ*BR7-LZ肽(77mA)的各向异性的信号增加了20％，表明了复合物His-CC2-LZ:BR7-LZ的形成。His-CC2-LZ/R7-LZ/BR7-LZ混合物然后放置于含有候选药物化合物的96孔塑料板上。那些能减少荧光各向异性、反应了肽从His标记的CC2-LZ靶目标上解离的化合物被选中。
B-搜索诱导含有NEMO的CC2和LZ结构域的肽CC2-LZ的构象转换至无活性的构象的化合物
为了开发该筛选测试方法，使用了荧光共振能量转移方法(FRET)。CC2-LZ肽在其N末端连接了荧光团供体例如Cy5/5(GE Healthcare)并且在其C末端连接了荧光团受体比如BHQ3(Biosearch Technologies)。使该双重连接的CC2-LZ与要被测试的分子相接触，并且测定荧光。那些引起荧光发射增强的化合物将被选中。
C.-搜索抑制CC2-LZ寡聚化的化合物
为了更高的通量，也可以建立依赖于均相时间分辨荧光(HTRF)的筛选测试方法。可分别识别生物素和(His)6标记的与铕-穴状化合物(荧光供体)和XL665(荧光受体)连接的抗体是可以从市场上买到的(Cis-Bio inc.)。His标记的CC2-LZ肽的纯化如Agou等人2004b所描述的那样。生物素标记的CC2-LZ肽是化学合成的或是从重组的大肠杆菌例如AviTag中纯化的(Avidity，inc)。此方法的主要的好处是可以支付得起，并且减少了假阳性的风险。
实施例7-以多聚泛蛋白结合CC2和LZ结构域的性质为基础的筛选测试
A.-初步筛选测试
第一步，由K63联接的多聚泛蛋白链(K63Ub2-7，Boston Biochem，Inc.)被固定在Ni-NTA HisSord板上(96孔板，Qiagen，Inc)。添加荧光标记的CC2-LZ(例如B-CC2-LZ)或荧光性NLM肽(例如B-DR NLM)，与K63多聚泛蛋白链形成荧光性蛋白复合物。那些为CC2-LZ或NLM结合K63多聚泛蛋白链竞争的化合物被认为是阳性的并且被选中。
B.-第二次筛选测试
第二步，上述的来源于初步筛选的所有的阳性化合物被送至第二次筛选，如WO2005027959专利所描述的那样使用基于细胞的测试来研究它们对NF-κB抑制的影响。
使用的缩写体：BA-肽，用细胞渗透性序列触角(antennapedia)融合于其N末端并与bodipy荧光团联接的肽；A-肽，触角(Antennapedia)标记的肽；R7-肽，用细胞渗透性聚阳离子肽RRRRRRR融合于其末端的肽；Tat，含有序列YGRKKRRQRRR的细胞渗透性肽；R9，含有九个精氨酸残基的细胞渗透性阳离子型肽；spCC-LZ，合成的多肽亚结构域CC2-LZ；DDM，十二烷基麦芽糖苷；MES，吗啉代乙磺酸；DTE，二硫苏糖醇。
实施例8-搜索与多聚泛蛋白链相互作用诱导的CC2-LZ二聚体化竞争的化合物。
本发明人还使用了与设计的锚蛋白锚蛋白重复序列蛋白(Designed Ankyrin RepeatProteins，DARPins)(Wyler et al.，2007)结合的CC2-LZ二聚体的很好表征的复合物。这些复合物对于CC2-LZ显示了nM的亲合力，并且被用作阳性对照。在这个测试中，His标记的蛋白CC2-LZ被His标记的DARPin 1D5(KD＝22nM)或His标记的DARPin 2F6(KD＝8nM)取代。如同表II所示，可以观察到FRET信号，具有1D5(290％)和2F6(2749％)DARPins，表明FRET用于识别nM蛋白复合物的作用。
表II：在HTRF测试中使用的阴性和阳性对照
| 链亲和素- 铕(2nM) | 抗His-XL (7nM) | 生物素 -CC2-LZ (50nM) | His-CC2-LZ (50nM) | His-1DS (50nM) | His-2F6 (50nM) | FRET (ΔF ％) |
| + | + | - | - | - | - | ≤0 |
| + | + | + | - | - | - | ≤0 |
| + | + | - | + | - | - | ≤0 |
| + | + | + | + | - | - | ≤0 |
| + | + | + | - | + | - | 290％ |
| + | + | + | - | - | + | 2749％ |
测试中不同的蛋白样品组合用(+)和(-)表示，被用来测定荧光共振能量转移(FRET)。FRET百分比的计算如上面实施例1中所描述的那样。
因为CC2-LZ二聚体的亲合力与DARPin:CC2-LZ复合物的亲合力相比较低(KD＝22μM)，所以当CC2-LZ的每个亚基以nM的浓度孵育时没有观察到FRET信号(见表II)。但是，当相同的混合物在GST-四聚体遍在蛋白存在的情况下孵育时，就能监控到特定的FRET信号，表明与四聚遍在蛋白的结合诱导了CC2-LZ二聚体的形成。用单遍在蛋白或只用GST来进行同样的测试。但是，只使用GST或单遍在蛋白没有检测到FRET信号(图8和表III)，表明FRET信号来自于CC2-LZ二聚体和GST-四聚遍在蛋白链的特定的相互作用。
表III：GST-Ub4的结合在CC2-LZ二聚体的形成上的作用。
| 链亲和素 -铕 (2nM) | 抗 His-XL (7nM) | 生物素 -CC2-LZ (50nM) | His-CC2-LZ (50nM) | 单遍在蛋 白(1μM) | 多聚遍在 蛋白 (12.5 μM) | GST-Ub4 (12.5 μM) | FRET (Δ F％) |
| + | + | + | + | + | - | - | ≤0 |
| + | + | + | + | - | + | - | ≤0 |
| + | + | + | + | - | - | + | 373％ |
为了优化HTRF测试，本发明人还使用了不同浓度的His-CC2-LZ、Biot-CC2-LZ和GST-Ub4。图8A和8B显示的结果表明，HTRF试验中强烈的显著的FRET信号的最佳条件是40nM生物素-CC2-LZ、40nM His-CC2-LZ和250nM GST-Ub4。此外，本发明人还显示了存在高达5％的DMSO最时也不破坏荧光信号(图8C)。
总之，本发明人已经开发了强大的和耐用的FRET测试，其使得可以搜索那些为CC2-LZ二聚化和/或为CC2-LZ二聚体特异性结合多聚泛蛋白链竞争的小化合物。
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序列表
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法国国家科学研究中心
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弗朗索瓦.巴勒克斯
阿兰.伊斯拉埃尔
米歇尔.韦龙
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<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>412
<212>PRT
<213>小家鼠
<400>1
Met Asn Lys His Pro Trp Lys Asn Gln Leu Ser Glu Thr Val Gln Pro
1 5 10 15
Ser Gly Gly Pro Ala Glu Asp Gln Asp Met Leu Gly Glu Glu Ser Ser
20 25 30
Leu Gly Lys Pro Ala Met Leu His Leu Pro Ser Glu Gln Gly Thr Pro
35 40 45
Glu Thr Leu Gln Arg Cys Leu Glu Glu Asn Gln Glu Leu Arg Asp Ala
50 55 60
Ile Arg Gln Ser Asn Gln Met Leu Arg Glu Arg Cys Glu Glu Leu Leu
65 70 75 80
His Phe Gln Val Ser Gln Arg Glu Glu Lys Glu Phe Leu Met Cys Lys
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Phe Gln Glu Ala Arg Lys Leu Val Glu Arg Leu Ser Leu Glu Lys Leu
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Asp Leu Arg Ser Gln Arg Glu Gln Ala Leu Lys Glu Leu Glu Gln Leu
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Lys Lys Cys Gln Gln Gln Met Ala Glu Asp Lys Ala Ser Val Lys Ala
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Gln Val Thr Ser Leu Leu Gly Glu Leu Gln Glu Ser Gln Ser Arg Leu
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Glu Ala Ala Thr Lys Asp Arg Gln Ala Leu Glu Gly Arg Ile Arg Ala
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Val Ser Glu Gln Val Arg Gln Leu Glu Ser Glu Arg Glu Val Leu Gln
180 185 190
Gln Gln His Ser Val Gln Val Asp Gln Leu Arg Met Gln Asn Gln Ser
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Val Glu Ala Ala Leu Arg Met Glu Arg Gln Ala Ala Ser Glu Glu Lys
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Arg Lys Leu Ala Gln Leu Gln Ala Ala Tyr His Gln Leu Phe Gln Asp
225 230 235 240
Tyr Asp Ser His Ile Lys Ser Ser Lys Gly Met Gln Leu Glu Asp Leu
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Arg Gln Gln Leu Gln Gln Ala Glu Glu Ala Leu Val Ala Lys Gln Glu
260 265 270
Leu Ile Asp Lys Leu Lys Glu Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val Met
275 280 285
Glu Thr Val Pro Val Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp
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Tyr Leu Gln Glu Gln Leu Glu Gln Leu Gln Arg Glu Phe Asn Lys Leu
325 330 335
Lys Val Gly Cys His Glu Ser Ala Arg Ile Glu Asp Met Arg Lys Arg
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His Val Glu Thr Pro Gln Pro Pro Leu Leu Pro Ala Pro Ala His His
355 360 365
Ser Phe His Leu Ala Leu Ser Asn Gln Arg Arg Ser Pro Pro Glu Glu
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Pro Pro Asp Phe Cys Cys Pro Lys Cys Gln Tyr Gln Ala Pro Asp Met
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<213>人
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Met Asn Arg His Leu Trp Lys Ser Gln Leu Cys Glu Met Val Gln Pro
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Glu Thr Leu Gln Arg Cys Leu Glu Glu Asn Gln Glu Leu Arg Asp Ala
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100 105 110
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Lys
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<212>PRT
<213>人工序列
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Lys Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp Phe Gln Ala Glu
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Arg Gln Ala Arg Glu Lys Leu Ala Glu Lys Lys Glu Leu Leu Gln Glu
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Gln Leu Glu Gln Leu Gln Arg Glu Tyr Ser Lys Leu
50 55 60
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<212>PRT
<213>人工序列
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<213>人工序列
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<220>
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Arg Gln Ala Arg Glu Lys
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Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
Leu Ala Glu Lys Lys Glu Leu Leu Gln Glu Gln Leu Glu Gln Leu Gln
20 25 30
Arg Glu Tyr Ser Lys Leu
35
<210>22
<211>60
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>BA-LZ L322P/L329P
<400>22
Cys Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys
1 5 10 15
Lys Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp Phe Gln Ala Glu
20 25 30
Arg His Ala Arg Glu Lys Leu Val Glu Lys Lys Glu Tyr Pro Gln Glu
35 40 45
Gln Leu Glu Gln Pro Gln Arg Glu Phe Asn Lys Leu
50 55 60
<210>23
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>Flag
<400>23
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210>24
<211>2787
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pcDNA3-Flag-NEMO
<220>
<221>CDS
<222>(911)..(2209)
<400>24
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccta gaactagtgg 900
atccgccacc atg gac tac aag gac gac gat gac aaa gat ccc ccg atc 949
Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Pro Pro Ile
1 5 10
tct cga gga tcc gaa ttc ctc gac aac aag cac ccc tgg aag aac cag 997
Ser Arg Gly Ser Glu Phe Leu Asp Asn Lys His Pro Trp Lys Asn Gln
15 20 25
ctg agt gag atg gtg cag ccc agt ggt ggc cca gca gag gac cag gac 1045
Leu Ser Glu Met Val Gln Pro Ser Gly Gly Pro Ala Glu Asp Gln Asp
30 35 40 45
atg ctg ggt gaa gaa tct tct ctg ggg aag cct gca atg cta cat ctg 1093
Met Leu Gly Glu Glu Ser Ser Leu Gly Lys Pro Ala Met Leu His Leu
50 55 60
cct tca gag cag ggt act cct gag acc ctc cag cgc tgc ctg gaa gag 1141
Pro Ser Glu Gln Gly Thr Pro Glu Thr Leu Gln Arg Cys Leu Glu Glu
65 70 75
aat caa gag ctc cga gac gct atc cgg cag agc aat cag atg ctg agg 1189
Asn Gln Glu Leu Arg Asp Ala Ile Arg Gln Ser Asn Gln Met Leu Arg
80 85 90
gaa cgc tgt gag gag ctg ctg cat ttc cag gtc agc cag cgg gag gag 1237
Glu Arg Cys Glu Glu Leu Leu His Phe Gln Val Ser Gln Arg Glu Glu
95 100 105
aag gag ttc ctt atg tgc aaa ttc cag gaa gcc cgg aag ctg gtg gag 1285
Lys Glu Phe Leu Met Cys Lys Phe Gln Glu Ala Arg Lys Leu Val Glu
110 115 120 125
aga ctg agc ttg gag aag ctt gat ctt cgg agt cag agg gaa cag gcc 1333
Arg Leu Ser Leu Glu Lys Leu Asp Leu Arg Ser Gln Arg Glu Gln Ala
130 135 140
tta aag gag ttg gag caa ctg aag aaa tgc caa cag cag atg gct gag 1381
Leu Lys Glu Leu Glu Gln Leu Lys Lys Cys Gln Gln Gln Met Ala Glu
145 150 155
gac aag gcc tct gtg aaa gtt cag gtg aca tca ttg ctc gga gaa ctc 1429
Asp Lys Ala Ser Val Lys Val Gln Val Thr Ser Leu Leu Gly Glu Leu
160 165 170
cag gag agc cag agc cgt ttg gag gct gcc acc aag gat cgg caa gct 1477
Gln Glu Ser Gln Ser Arg Leu Glu Ala Ala Thr Lys Asp Arg Gln Ala
175 180 185
tta gag gga agg att cga gca gtt agt gag cag gtc aga cag ctg gag 1525
Leu Glu Gly Arg Ile Arg Ala Val Ser Glu Gln Val Arg Gln Leu Glu
190 195 200 205
agt gag cgg gag gtg cta cag cag cag cac agc gtc cag gtg gac cag 1573
Ser Glu Arg Glu Val Leu Gln Gln Gln His Ser Val Gln Val Asp Gln
210 215 220
ctg cgt atg cag aac cag agc gtg gag gct gcc ttg cga atg ggg cgg 1621
Leu Arg Met Gln Asn Gln Ser Val Glu Ala Ala Leu Arg Met Gly Arg
225 230 235
cag gct gct tca gag gag aag cgg aag ctg gct cag ttg cag gca gcc 1669
Gln Ala Ala Ser Glu Glu Lys Arg Lys Leu Ala Gln Leu Gln Ala Ala
240 245 250
tat cac cag ctc ttc caa gac tac gac agc cac att aag agc aac aag 1717
Tyr His Gln Leu Phe Gln Asp Tyr Asp Ser His Ile Lys Ser Asn Lys
255 260 265
ggc atg cag ctg gaa gat ctg agg caa cag ctc cag caa gct gag gag 1765
Gly Met Gln Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gln Leu Gln Gln Ala Glu Glu
270 275 280 285
gcc ctg gta gcc aaa cag gaa ttg att gat aag ctg aaa gag gag gct 1813
Ala Leu Val Ala Lys Gln Glu Leu Ile Asp Lys Leu Lys Glu Glu Ala
290 295 300
gag cag cac aag att gtg atg gag act gtg cca gtc ttg aag gcc cag 1861
Glu Gln His Lys Ile Val Met Glu Thr Val Pro Val Leu Lys Ala Gln
305 310 315
gcg gat atc tac aag gct gac ttc caa gct gag agg cat gcc cgg gag 1909
Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp Phe Gln Ala Glu Arg His Ala Arg Glu
320 325 330
aag ctg gtg gag aag aag gag tat ttg cag gag cag ctg gag cag ctg 1957
Lys Leu Val Glu Lys Lys Glu Tyr Leu Gln Glu Gln Leu Glu Gln Leu
335 340 345
cag cgc gag ttc aac aag ctg aaa gtt ggc tgc cat gag tca gcc agg 2005
Gln Arg Glu Phe Asn Lys Leu Lys Val Gly Cys His Glu Ser Ala Arg
350 355 360 365
att gag gat atg agg aag cgg cat gta gag act ccc cag cct act tta 2053
Ile Glu Asp Met Arg Lys Arg His Val Glu Thr Pro Gln Pro Thr Leu
370 375 380
ctc cct gct cca gct cac cac tcc ttt cat ttg gcc ttg tcc aac cag 2101
Leu Pro Ala Pro Ala His His Ser Phe His Leu Ala Leu Ser Asn Gln
385 390 395
cgg agg agc cct cct gaa gaa cct cct gac ttc tgt tgt ccg aag tgc 2149
Arg Arg Ser Pro Pro Glu Glu Pro Pro Asp Phe Cys Cys Pro Lys Cys
400 405 410
cag tat cag gct cct gat atg gac act cta cag ata cat gtc atg gag 2197
Gln Tyr Gln Ala Pro Asp Met Asp Thr Leu Gln Ile His Val Met Glu
415 420 425
tgc ata gag tag gggcagcaga tgcaaggcca cttgcagtac tatgtcctga 2249
Cys Ile Glu
430
tctgtgtgac ttgtgctttc ctgttttacc tgcatagtcc acacttaagg gcttgcttta 2309
gccctttggt cccccattta gggtagacag ccccattcag ggcttttttt tttttctgtg 2369
tgcctgatcc agtttgcctc tggtggcttc ttccctcttc tcccatagtc ctagggagtc 2429
tagagggccc tattctatag tgtcacctaa atgctagagc tcgctgatca gcctcgactg 2489
tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg 2549
aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga 2609
gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg 2669
aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa 2729
ccagctgggg ctctaggggg tatccccacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggc 2787
<210>25
<211>432
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>25
Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Pro Pro Ile Ser Arg Gly
1 5 10 15
Ser Glu Phe Leu Asp Asn Lys His Pro Trp Lys Asn Gln Leu Ser Glu
20 25 30
Met Val Gln Pro Ser Gly Gly Pro Ala Glu Asp Gln Asp Met Leu Gly
35 40 45
Glu Glu Ser Ser Leu Gly Lys Pro Ala Met Leu His Leu Pro Ser Glu
50 55 60
Gln Gly Thr Pro Glu Thr Leu Gln Arg Cys Leu Glu Glu Asn Gln Glu
65 70 75 80
Leu Arg Asp Ala Ile Arg Gln Ser Asn Gln Met Leu Arg Glu Arg Cys
85 90 95
Glu Glu Leu Leu His Phe Gln Val Ser Gln Arg Glu Glu Lys Glu Phe
100 105 110
Leu Met Cys Lys Phe Gln Glu Ala Arg Lys Leu Val Glu Arg Leu Ser
115 120 125
Leu Glu Lys Leu Asp Leu Arg Ser Gln Arg Glu Gln Ala Leu Lys Glu
130 135 140
Leu Glu Gln Leu Lys Lys Cys Gln Gln Gln Met Ala Glu Asp Lys Ala
145 150 155 160
Ser Val Lys Val Gln Val Thr Ser Leu Leu Gly Glu Leu Gln Glu Ser
165 170 175
Gln Ser Arg Leu Glu Ala Ala Thr Lys Asp Arg Gln Ala Leu Glu Gly
180 185 190
Arg Ile Arg Ala Val Ser Glu Gln Val Arg Gln Leu Glu Ser Glu Arg
195 200 205
Glu Val Leu Gln Gln Gln His Ser Val Gln Val Asp Gln Leu Arg Met
210 215 220
Gln Asn Gln Ser Val Glu Ala Ala Leu Arg Met Gly Arg Gln Ala Ala
225 230 235 240
Ser Glu Glu Lys Arg Lys Leu Ala Gln Leu Gln Ala Ala Tyr His Gln
245 250 255
Leu Phe Gln Asp Tyr Asp Ser His Ile Lys Ser Asn Lys Gly Met Gln
260 265 270
Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gln Leu Gln Gln Ala Glu Glu Ala Leu Val
275 280 285
Ala Lys Gln Glu Leu Ile Asp Lys Leu Lys Glu Glu Ala Glu Gln His
290 295 300
Lys Ile Val Met Glu Thr Val Pro Val Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile
305 310 315 320
Tyr Lys Ala Asp Phe Gln Ala Glu Arg His Ala Arg Glu Lys Leu Val
325 330 335
Glu Lys Lys Glu Tyr Leu Gln Glu Gln Leu Glu Gln Leu Gln Arg Glu
340 345 350
Phe Asn Lys Leu Lys Val Gly Cys His Glu Ser Ala Arg Ile Glu Asp
355 360 365
Met Arg Lys Arg His Val Glu Thr Pro Gln Pro Thr Leu Leu Pro Ala
370 375 380
Pro Ala His His Ser Phe His Leu Ala Leu Ser Asn Gln Arg Arg Ser
385 390 395 400
Pro Pro Glu Glu Pro Pro Asp Phe Cys Cys Pro Lys Cys Gln Tyr Gln
405 410 415
Ala Pro Asp Met Asp Thr Leu Gln Ile His Val Met Glu Cys Ile Glu
420 425 430
<210>26
<211>3541
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pcDNA3-GFP-NEMO
<220>
<221>CDS
<222>(1000)..(2964)
<400>26
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gcttgcttac 900
atttgcttct gacacaactg tgttcactag caacctcaaa cagacaccat gagatcttat 960
ccatatgatg tgccagatta tgcagccatg gccggatcc atg gtg agc aag ggc 1014
Met Val Ser Lys Gly
1 5
gag gag ctg ttc acc ggg gtg gtg ccc atc ctg gtc gag ctg gac ggc 1062
Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly
10 15 20
gac gta aac ggc cac aag ttc agc gtg tcc ggc gag ggc gag ggc gat 1110
Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp
25 30 35
gcc acc tac ggc aag ctg acc ctg aag ttc atc tgc acc acc ggc aag 1158
Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys
40 45 50
ctg ccc gtg ccc tgg ccc acc ctc gtg acc acc ctg acc tac ggc gtg 1206
Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val
55 60 65
cag tgc ttc agc cgc tac ccc gac cac atg aag cag cac gac ttc ttc 1254
Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe
70 75 80 85
aag tcc gcc atg ccc gaa ggc tac gtc cag gag cgc acc atc ttc ttc 1302
Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe
90 95 100
aag gac gac ggc aac tac aag acc cgc gcc gag gtg aag ttc gag ggc 1350
Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly
105 110 115
gac acc ctg gtg aac cgc atc gag ctg aag ggc atc gac ttc aag gag 1398
Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu
120 125 130
gac ggc aac atc ctg ggg cac aag ctg gag tac aac tac aac agc cac 1446
Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His
135 140 145
aac gtc tat atc atg gcc gac aag cag aag aac ggc atc aag gtg aac 1494
Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn
150 155 160 165
ttc aag atc cgc cac aac atc gag gac ggc agc gtg cag ctc gcc gac 1542
Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp
170 175 180
cac tac cag cag aac acc ccc atc ggc gac ggc ccc gtg ctg ctg ccc 1590
His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro
185 190 195
gac aac cac tac ctg agc acc cag tcc gcc ctg agc aaa gac ccc aac 1638
Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn
200 205 210
gag aag cgc gat cac atg gtc ctg ctg gag ttc gtg acc gcc gcc ggg 1686
Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly
215 220 225
atc act ctc ggc atg gac gag ctg tac aag gaa ttc ctc gac aac aag 1734
Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Glu Phe Leu Asp Asn Lys
230 235 240 245
cac ccc tgg aag aac cag ctg agt gag atg gtg cag ccc agt ggt ggc 1782
His Pro Trp Lys Asn Gln Leu Ser Glu Met Val Gln Pro Ser Gly Gly
250 255 260
cca gca gag gac cag gac atg ctg ggt gaa gaa tct tct ctg ggg aag 1830
Pro Ala Glu Asp Gln Asp Met Leu Gly Glu Glu Ser Ser Leu Gly Lys
265 270 275
cct gca atg cta cat ctg cct tca gag cag ggt act cct gag acc ctc 1878
Pro Ala Met Leu His Leu Pro Ser Glu Gln Gly Thr Pro Glu Thr Leu
280 285 290
cag cgc tgc ctg gaa gag aat caa gag ctc cga gac gct atc cgg cag 1926
Gln Arg Cys Leu Glu Glu Asn Gln Glu Leu Arg Asp Ala Ile Arg Gln
295 300 305
agc aat cag atg ctg agg gaa cgc tgt gag gag ctg ctg cat ttc cag 1974
Ser Asn Gln Met Leu Arg Glu Arg Cys Glu Glu Leu Leu His Phe Gln
310 315 320 325
gtc agc cag cgg gag gag aag gag ttc ctt atg tgc aaa ttc cag gaa 2022
Val Ser Gln Arg Glu Glu Lys Glu Phe Leu Met Cys Lys Phe Gln Glu
330 335 340
gcc cgg aag ctg gtg gag aga ctg agc ttg gag aag ctt gat ctt cgg 2070
Ala Arg Lys Leu Val Glu Arg Leu Ser Leu Glu Lys Leu Asp Leu Arg
345 350 355
agt cag agg gaa cag gcc tta aag gag ttg gag caa ctg aag aaa tgc 2118
Ser Gln Arg Glu Gln Ala Leu Lys Glu Leu Glu Gln Leu Lys Lys Cys
360 365 370
caa cag cag atg gct gag gac aag gcc tct gtg aaa gtt cag gtg aca 2166
Gln Gln Gln Met Ala Glu Asp Lys Ala Ser Val Lys Val Gln Val Thr
375 380 385
tca ttg ctc gga gaa ctc cag gag agc cag agc cgt ttg gag gct gcc 2214
Ser Leu Leu Gly Glu Leu Gln Glu Ser Gln Ser Arg Leu Glu Ala Ala
390 395 400 405
acc aag gat cgg caa gct tta gag gga agg att cga gca gtt agt gag 2262
Thr Lys Asp Arg Gln Ala Leu Glu Gly Arg Ile Arg Ala Val Ser Glu
410 415 420
cag gtc aga cag ctg gag agt gag cgg gag gtg cta cag cag cag cac 2310
Gln Val Arg Gln Leu Glu Ser Glu Arg Glu Val Leu Gln Gln Gln His
425 430 435
agc gtc cag gtg gac cag ctg cgt atg cag aac cag agc gtg gag gct 2358
Ser Val Gln Val Asp Gln Leu Arg Met Gln Asn Gln Ser Val Glu Ala
440 445 450
gcc ttg cga atg ggg cgg cag gct gct tca gag gag aag cgg aag ctg 2406
Ala Leu Arg Met Gly Arg Gln Ala Ala Ser Glu Glu Lys Arg Lys Leu
455 460 465
gct cag ttg cag gca gcc tat cac cag ctc ttc caa gac tac gac agc 2454
Ala Gln Leu Gln Ala Ala Tyr His Gln Leu Phe Gln Asp Tyr Asp Ser
470 475 480 485
cac att aag agc aac aag ggc atg cag ctg gaa gat ctg agg caa cag 2502
His Ile Lys Ser Asn Lys Gly Met Gln Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gln
490 495 500
ctc cag caa gct gag gag gcc ctg gta gcc aaa cag gaa ttg att gat 2550
Leu Gln Gln Ala Glu Glu Ala Leu Val Ala Lys Gln Glu Leu Ile Asp
505 510 515
aag ctg aaa gag gag gct gag cag cac aag att gtg atg gag act gtg 2598
Lys Leu Lys Glu Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val Met Glu Thr Val
520 525 530
cca gtc ttg aag gcc cag gcg gat atc tac aag gct gac ttc caa gct 2646
Pro Val Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp Phe Gln Ala
535 540 545
gag agg cat gcc cgg gag aag ctg gtg gag aag aag gag tat ttg cag 2694
Glu Arg His Ala Arg Glu Lys Leu Val Glu Lys Lys Glu Tyr Leu Gln
550 555 560 565
gag cag ctg gag cag ctg cag cgc gag ttc aac aag ctg aaa gtt ggc 2742
Glu Gln Leu Glu Gln Leu Gln Arg Glu Phe Asn Lys Leu Lys Val Gly
570 575 580
tgc cat gag tca gcc agg att gag gat atg agg aag cgg cat gta gag 2790
Cys His Glu Ser Ala Arg Ile Glu Asp Met Arg Lys Arg His Val Glu
585 590 595
act ccc cag cct act tta ctc cct gct cca gct cac cac tcc ttt cat 2838
Thr Pro Gln Pro Thr Leu Leu Pro Ala Pro Ala His His Ser Phe His
600 605 610
ttg gcc ttg tcc aac cag cgg agg agc cct cct gaa gaa cct cct gac 2886
Leu Ala Leu Ser Asn Gln Arg Arg Ser Pro Pro Glu Glu Pro Pro Asp
615 620 625
ttc tgt tgt ccg aag tgc cag tat cag gct cct gat atg gac act cta 2934
Phe Cys Cys Pro Lys Cys Gln Tyr Gln Ala Pro Asp Met Asp Thr Leu
630 635 640 645
cag ata cat gtc atg gag tgc ata gag tag gggcagcaga tgcaaggcca 2984
Gln Ile His Val Met Glu Cys Ile Glu
650
cttgcagtac tatgtcctga tctgtgtgac ttgtgctttc ctgttttacc tgcatagtcc 3044
acacttaagg gcttgcttta gccctttggt cccccattta gggtagacag ccccattcag 3104
ggcttttttt tttttctgtg tgcctgatcc agtttgcctc tggtggcttc ttccctctct 3164
cccatagtcc tagggagtct agagggccct attctatagt gtcacctaaa tgctagagct 3224
cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc 3284
gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa 3344
attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac 3404
agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg 3464
gcttctgagg cggaaagaac cagctggggc tctagggggt atccccacgc gccctgtagc 3524
ggcgcattaa gcgcggc 3541
<210>27
<211>654
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>27
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Glu
225 230 235 240
Phe Leu Asp Asn Lys His Pro Trp Lys Asn Gln Leu Ser Glu Met Val
245 250 255
Gln Pro Ser Gly Gly Pro Ala Glu Asp Gln Asp Met Leu Gly Glu Glu
260 265 270
Ser Ser Leu Gly Lys Pro Ala Met Leu His Leu Pro Ser Glu Gln Gly
275 280 285
Thr Pro Glu Thr Leu Gln Arg Cys Leu Glu Glu Asn Gln Glu Leu Arg
290 295 300
Asp Ala Ile Arg Gln Ser Asn Gln Met Leu Arg Glu Arg Cys Glu Glu
305 310 315 320
Leu Leu His Phe Gln Val Ser Gln Arg Glu Glu Lys Glu Phe Leu Met
325 330 335
Cys Lys Phe Gln Glu Ala Arg Lys Leu Val Glu Arg Leu Ser Leu Glu
340 345 350
Lys Leu Asp Leu Arg Ser Gln Arg Glu Gln Ala Leu Lys Glu Leu Glu
355 360 365
Gln Leu Lys Lys Cys Gln Gln Gln Met Ala Glu Asp Lys Ala Ser Val
370 375 380
Lys Val Gln Val Thr Ser Leu Leu Gly Glu Leu Gln Glu Ser Gln Ser
385 390 395 400
Arg Leu Glu Ala Ala Thr Lys Asp Arg Gln Ala Leu Glu Gly Arg Ile
405 410 415
Arg Ala Val Ser Glu Gln Val Arg Gln Leu Glu Ser Glu Arg Glu Val
420 425 430
Leu Gln Gln Gln His Ser Val Gln Val Asp Gln Leu Arg Met Gln Asn
435 440 445
Gln Ser Val Glu Ala Ala Leu Arg Met Gly Arg Gln Ala Ala Ser Glu
450 455 460
Glu Lys Arg Lys Leu Ala Gln Leu Gln Ala Ala Tyr His Gln Leu Phe
465 470 475 480
Gln Asp Tyr Asp Ser His Ile Lys Ser Asn Lys Gly Met Gln Leu Glu
485 490 495
Asp Leu Arg Gln Gln Leu Gln Gln Ala Glu Glu Ala Leu Val Ala Lys
500 505 510
Gln Glu Leu Ile Asp Lys Leu Lys Glu Glu Ala Glu Gln His Lys Ile
515 520 525
Val Met Glu Thr Val Pro Val Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys
530 535 540
Ala Asp Phe Gln Ala Glu Arg His Ala Arg Glu Lys Leu Val Glu Lys
545 550 555 560
Lys Glu Tyr Leu Gln Glu Gln Leu Glu Gln Leu Gln Arg Glu Phe Asn
565 570 575
Lys Leu Lys Val Gly Cys His Glu Ser Ala Arg Ile Glu Asp Met Arg
580 585 590
Lys Arg His Val Glu Thr Pro Gln Pro Thr Leu Leu Pro Ala Pro Ala
595 600 605
His His Ser Phe His Leu Ala Leu Ser Asn Gln Arg Arg Ser Pro Pro
610 615 620
Glu Glu Pro Pro Asp Phe Cys Cys Pro Lys Cys Gln Tyr Gln Ala Pro
625 630 635 640
Asp Met Asp Thr Leu Gln Ile His Val Met Glu Cys Ile Glu
645 650
<210>28
<211>84
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>生物素-CC2-LZ
<400>28
Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gln Leu Gln Gln Ala Glu Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Ala Lys Gln Glu Leu Ile Asp Lys Leu Lys Glu Glu Ala Glu Gln His
20 25 30
Lys Ile Val Met Glu Thr Val Pro Val Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Asp Phe Gln Ala Glu Arg His Ala Arg Glu Lys Leu Val
50 55 60
Glu Lys Lys Glu Tyr Leu Gln Glu Gln Leu Glu Gln Leu Gln Arg Glu
65 70 75 80
Phe Asn Lys Leu
<210>29
<211>84
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人源化生物素-CC2-LZ
<400>29
Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gln Leu Gln Gln Ala Glu Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Ala Lys Gln Glu Leu Ile Asp Lys Leu Lys Glu Glu Ala Glu Gln His
20 25 30
Lys Ile Val Met Glu Thr Val Pro Val Leu Lys Ala Gln Ala Asp Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Asp Phe Gln Ala Glu Arg Gln Ala Arg Glu Lys Leu Ala
50 55 60
Glu Lys Lys Glu Leu Leu Gln Glu Gln Leu Glu Gln Leu Gln Arg Glu
65 70 75 80
Tyr Ser Lys Leu
<210>30
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>His-CC2-LZ
<400>30
Met Gly Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg
1 5 10 15
Gly Ser His Met Ala Ser Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gln Leu Gln Gln
20 25 30
Ala Glu Glu Ala Leu Val Ala Lys Gln Glu Leu Ile Asp Lys Leu Lys
35 40 45
Glu Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val Met Glu Thr Val Pro Val Leu
50 55 60
Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp Phe Gln Ala Glu Arg His
65 70 75 80
Ala Arg Glu Lys Leu Val Glu Lys Lys Glu Tyr Leu Gln Glu Gln Leu
85 90 95
Glu Gln Leu Gln Arg Glu Phe Asn Lys Leu
100 105
<210>31
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人源化His-CC2-LZ
<400>31
Met Gly Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg
1 5 10 15
Gly Ser His Met Ala Ser Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gln Leu Gln Gln
20 25 30
Ala Glu Glu Ala Leu Val Ala Lys Gln Glu Leu Ile Asp Lys Leu Lys
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Glu Glu Ala Glu Gln His Lys Ile Val Met Glu Thr Val Pro Val Leu
50 55 60
Lys Ala Gln Ala Asp Ile Tyr Lys Ala Asp Phe Gln Ala Glu Arg Gln
65 70 75 80
Ala Arg Glu Lys Leu Ala Glu Lys Lys Glu Leu Leu Gln Glu Gln Leu
85 90 95
Glu Gln Leu Gln Arg Glu Tyr Ser Lys Leu
100 105
Claims (34)
1.一种初步筛选NF-κB途径活化的潜在的调节剂的体外方法，其特征在于，其包括下列的步骤：
(a)在不存在被测定的物质S的情况下，将(i)由NEMO的CC2和LZ区域所组成的肽P1与(ii)被标记的或没有被标记的肽P2，相接触，所述肽P1是被标记的或没有被标记的，所述肽P2选自下组：含有NEMO的LZ区域中至少10个氨基酸残基的肽、含有NEMO的NLM区域中至少10个氨基酸残基的肽、含有DR-NLM的肽、含有NEMO的CC2和LZ区域的肽、含有NEMO的CC2区域中至少10个氨基酸残基的肽、以及含有由K63联接的多聚泛蛋白化链的肽；
(b)在有被测定的物质S存在的情况下，将被标记的或没有被标记的所述肽P1与被标记的或没有被标记的所述肽P2相接触；
(c)通过测定合适的信号来检测步骤(a)中得到的P1与P2之间形成的复合物；
(d)通过测定合适的信号来检测步骤(b)中得到的P1与P2之间形成的复合物；
(e)比较(c)中检测的信号与(d)中检测的信号，并且选择(c)中检测的信号/(d)中检测的信号的比值不等于1的物质S。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，P1选自由序列SEQ ID NO：1、2、17、19、28、29、30、31的肽所组成的组。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，P2选自由序列SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：6至12、SEQ ID NO：17至19、SEQ ID NO：28至31的肽所组成的组。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述肽P1被固定在固相载体上。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述肽P1连接至生物素基团上，并且所述固相载体由链亲和素小珠组成。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)和(d)中的信号通过蛋白质印迹、通过荧光各向异性、通过荧光共振能量转移(FRET)或者通过均相时间分辨荧光(HTRF)来检测。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述肽P1没有被标记，所述肽P2被荧光标记物M1标记。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述标记物M1选自由绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白以及包含马来酰亚胺基团的荧光团所组成的组。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，被所述标记物M1标记的所述肽P2选自由序列SEQ ID NO：4、5和13至16的肽所组成的组。
10.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述肽P1被标记物M2标记，所述肽P2被标记物M3标记，M2和M3是一对荧光团供体和荧光团受体。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，标记物M2由第一标签和抗所述第一标签且被荧光团供体标记的抗体组成，标记物M3由第二标签和抗所述第二标签且被荧光团受体标记的抗体组成，所述的两个标签互不相同。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，标记物M2的所述标签是聚His序列，所述标记物M3的所述标签是生物素。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，所述潜在的调节剂是潜在的活化剂，并且步骤(e)包括比较(c)中检测的信号与(d)中检测的信号、以及选择(c)中检测的信号/(d)中检测的信号的比值小于1的物质S。
14.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，所述潜在的调节剂是潜在的抑制剂，并且步骤(e)包括比较(c)中检测的信号与(d)中检测的信号、以及选择(c)中检测的信号/(d)中检测的信号的比值大于1的物质S。
15.一种初步筛选NF-κB途径活化的潜在的调节剂的方法，其特征在于，其包括下列的步骤：
(a)在不存在要测定的物质S的情况下，将(i)肽P1与(ii)包含由K63联接的多聚泛蛋白链的肽P2相接触，所述肽P1选自由包含NEMO的NLM区域中至少10个氨基酸的肽、包含DR NLM的肽所组成的组，所述肽P1是被标记的或是没有被标记的；所述P2是被标记的或是没有被标记的；
(b)在有被测定的物质S存在的情况下，将被标记的或没有被标记的所述肽P1，与被标记的或没有被标记的所述肽P2相接触；
(c)通过测定合适的信号来检测步骤(a)中得到的P1与P2之间形成的复合物；
(d)通过测定合适的信号来检测步骤(b)中得到的P1与P2之间形成的复合物；
(e)比较(c)中检测的信号与(d)中检测的信号，以及选择(c)中检测的信号/(d)中检测的信号的比值不等于1的物质。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述肽P1选自由序列SEQ ID NO：1、2、10和17至19的肽所组成的组。
17.如权利要求1、15和16中任一项所述的方法，其特征在于，所述包含由K63联接的多聚泛蛋白化链的肽P2被固定在固相载体上。
18.如权利要求15至17中任一项所述的方法，其特征在于，所述潜在的调节剂是潜在的活化剂，步骤(e)包括比较(c)中检测的信号与(d)中检测的信号、以及选择(c)中检测的信号/(d)中检测的信号的比值小于1的物质S。
19.如权利要求15至17中任一项所述的方法，其特征在于，所述潜在的调节剂是潜在的抑制剂，步骤(e)包括比较(c)中检测的信号与(d)中检测的信号、以及选择(c)中检测的信号/(d)中检测的信号的比值大于1的物质S。
20.一种初步筛选NF-κB途径活化的潜在的调节剂的方法，包括下列步骤：
(a)将包含NEMO的CC2和LZ区域的肽P1与要测定的物质S相接触，所述肽P1被标记物荧光团供体M2和荧光团受体M3标记；
(b)在不存在被测试的物质S的情况下测定荧光发射；
(c)在有被测试的物质S存在的情况下测定荧光发射；
(d)比较(b)中检测的信号与(c)中检测的信号，选择(b)中检测的信号/(c)中检测的信号的比值不等于1的物质S。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述P1选自由序列SEQ ID NO：1、2、17、19、28、29、30、31的肽所组成的组。
22.如权利要求20或21所述的方法，其特征在于，所述荧光团供体M2连接至CC2结构域的N末端，所述荧光团受体M3连接至LZ结构域的C末端。
23.如权利要求20至22中任一项所述的方法，其特征在于，所述潜在的调节剂是潜在的活化剂，步骤(d)包括比较(b)中检测的信号与(c)中检测的信号、以及选择(b)中检测的信号/(c)中检测的信号的比值小于1的物质S。
24.如权利要求20至22中任一项所述的方法，其特征在于，所述潜在的调节剂是潜在的抑制剂，步骤(d)包括比较(b)中检测的信号与(c)中检测的信号、以及选择(b)中检测的信号/(c)中检测的信号的比值大于1的物质S。
25.一种初步筛选NF-κB途径活化的潜在的调节剂的方法，其特征在于，其包括下列的步骤：
a)提供至少一种内源NEMO缺乏的细胞，其被一个或多个多聚核苷酸转化，该多聚核苷酸至少表达如权利要求1至3中任一项所述的肽P1和肽P2；
b)将物质S施加于所述的至少一种细胞；
c)检测在没有物质S存在的情况下P1和P2之间复合物的形成；
d)检测在有物质S存在的情况下P1和P2之间复合物的形成；
e)比较(c)中检测的信号与(d)中检测的信号，以及选择(c)中检测的信号/(d)中检测的信号的比值不等于1的物质S。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述肽P1是融合蛋白GFP-NEMO，所述肽P2是融合蛋白Flag-NEMO。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，步骤(c)和(d)包括：
c1)(或d1)细胞裂解，
c2)(或d2)使用抗Flag-NEMO的Flag部分的抗体，使结合于或没有结合于GFP-NEMO的Flag-NEMO免疫沉淀，以及
c3)(或d3)检测结合于被免疫沉淀的Flag-NEMO的GFP-NEMO中GFP部分的荧光发射。
28.如权利要求25至27中任一项所述的方法，其特征在于，所述潜在的调节剂是潜在的活化剂，步骤(e)包括比较(c)中检测的信号与(d)中检测的信号，以及选择(c)中检测的信号/(d)中检测的信号的比值小于1的物质S。
29.如权利要求25至27中任一项所述的方法，其特征在于，所述潜在的调节剂是潜在的抑制剂，步骤(e)包括比较(c)中检测的信号与(d)中检测的信号、以及选择(c)中检测的信号/(d)中检测的信号的比值大于1的物质S。
30.一种第二次筛选NF-κB途径活化的抑制剂的方法，包括：
a)通过如权利要求14、19、24和29中任一项所述的方法，选择可能抑制NF-κB途径活化的物质S，
b)在(a)中被选择的物质S不存在或存在的情况下，将NF-κB途径的活化剂施加于包含处于NF-κB诱导的启动子控制之下的报告基因的细胞；
c)在没有物质S存在的情况下通过测定合适的信号来检测报告基因的表达；
d)在有物质S存在的情况下通过测定合适的信号来检测报告基因的表达；以及
e)比较(c)中检测的信号与(d)中检测的信号，选择(c)中检测的信号/(d)中检测的信号的比值大于1的物质。
31.一种第二次筛选NF-κB途径活化的活化剂的方法，包括：
a)通过如权利要求13、18、23和28中任一项所述的方法，选择可能激活NF-κB途径活化的物质S；
b)提供包含处于NF-κB诱导的启动子控制之下的报告基因的细胞；
c)在物质S不存在的情况下通过测定合适的信号来检测报告基因的表达；
d)在有物质S存在的情况下通过测定合适的信号来检测报告基因的表达；以及
e)比较(c)中检测的信号与(d)中检测的信号，选择(c)中检测的信号/(d)中检测的信号的比值小于1的物质。
32.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述的NF-κB活化剂选自由TNF-α、IL-1β、PMA、离子霉素、以及来自于流产沙门氏菌的LPS所组成的组。
33.如权利要求30至32中任一项所述的方法，其特征在于，所述的报告基因是编码β-半乳糖苷酶的基因lacZ或者编码荧光素酶的基因luc。
34.如权利要求30至33中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞是70Z/3-C3细胞，其于2003年4月1日以保藏号I-3004保藏在法国培养物和微生物国家保藏中心(C.N.C.M.)。
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