CN101797393A - 一种恶性淋巴瘤放射性靶向分子显像剂或/和靶向治疗剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种融合多肽在制备肿瘤放射性靶向分子显像剂或放射性靶向治疗剂中的用途，和一种放射性靶向分子显像剂或放射性靶向治疗剂，所述的融合多肽是由单抗的重链可变域(或轻链可变域)的骨架区2(V_HFR₂或V_LFR₂)连接一个重链可变域的互补决定区1或3(V_HCDR₁或V_HCDR₃)和一个轻链可变域的互补决定区1或3(V_LCDR₁或V_LCDR₃)组成，其分子量为3～4kDa，所述的单抗是识别EB病毒表面抗原gp350/220抗原决定簇的单克隆抗体，所述的肿瘤为EB病毒所致的恶性肿瘤。本发明制备的放射性免疫显像剂或治疗剂具有分子量小、肿瘤穿透力强及靶向性好、肿瘤浓聚高、血液中清除快、肿瘤外非靶器官如肝脏及脾脏等无明显放射性分布、无免疫原性、安全等优点。

Description

一种恶性淋巴瘤放射性靶向分子显像剂或/和靶向治疗剂

技术领域

本发明涉及一种放射性靶向分子显像剂和/或放射性靶向治疗新药，特别是一种放射性核素标记的小分子肽肿瘤靶向分子显像剂和/或治疗新药及其制备方法和在肿瘤靶向分子诊断和/或靶向治疗方面的应用。

背景技术

目前，基于抗体的靶向治疗获得空前成功。美国FDA已批准22个单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)应用于临床，数以百计的单克隆抗体正用于治疗包括癌症、免疫系统疾病和感染性疾病的临床前研究。排前五位的治疗抗体(Rituxan、Remicade、Herceptin、Humira和Avastin)的收入已从2004年的64亿美元上升到2006年的117亿美元，翻了近一番。这些治疗和商业成功反映过去三十年抗体工程在制备安全、特异性、高亲和力及无免疫原性抗体方面所取得的重大进展，因此，研究基于抗体的靶向治疗药物的前景已被人们充分认识到[1]。

近年来，对淋巴瘤包括Hodgkin lymphoma(HL)和non-Hodgkinlymphoma(NHL)的临床分类随着人们在对淋巴瘤发病机制与其区分免疫表型、基因型、临床和病理特点之间的关系的理解方面所取得的进展而有所变化。这些进展使得通过更有效地选择并组合化疗、放射治疗和生物治疗等多种手段，降低传统疗法的长期毒性而不牺牲效能，从而显著改善患者的生存状况。然而，淋巴瘤的成功治疗取决于早期对患者进行准确的分期和预后评估，以及选取并实施某种治疗方案后，应该尽早评价患者对该治疗方案的反应，便于识别患者对治疗是否有效，并对治疗无效者及时调整治疗方案，即个体化诊疗。因此，研发高敏感性和高特异性的显像方法对HL/NHL患者的治疗尤为重要。

Epstein-Barr病毒(EB病毒)是第一种被确认可引起人体恶性肿瘤的病毒，其所致非洲儿童恶性淋巴瘤、Hodgkin’s淋巴瘤和鼻咽癌以及近年来发现部分AIDS病人所患肉瘤的肿瘤细胞表面均带有特异性EB病毒表面抗原gp350/220。因此，可以认为EB病毒表面抗原gp350/220就是该类肿瘤细胞的一种特异性标志物[2-4]，针对此特异性标志物，可设计基于“抗原-抗体”结合反应模式的抗体或抗体片段替代物，研制一系列放射免疫显像或放射免疫治疗的放射性新药用于EB病毒表面抗原gp350/220阳性肿瘤(包括淋巴瘤)的核医学分子显像及放射性靶向治疗。

理想状态下，靶向分子显像剂或放射性内照射靶向治疗药物首先应在肿瘤靶组织有高度浓聚，并且未与肿瘤结合部分能从正常组织及血液循环中快速清除。虽然全抗体在血液循环中可长时间滞留(1～3周)，有充裕的时间与肿瘤接触，但其分子量大，肿瘤穿透力差，且未结合部分从正常组织及血液循环中清除需要数天才能降至正常本底水平，从而造成正常组织不必要的辐射损伤，这些缺点都决定了全抗体不是用放射性核素标记的理想靶向分子显像剂或放射性内照射靶向治疗药物。因此，抗体的研究经历了多克隆抗体、单克隆抗体、单克隆抗体片段包括单链抗体片段(Single chain variable fragments，ScFv)、抗原结合片段(antigen-binding fragment，Fab)等“减少分子量”的多个阶段，目前已经跨入基因水平操作抗体变构体的阶段，其主要目的是为了克服分子量大、肿瘤穿透力差等缺陷，提高对肿瘤的穿透力。

目前，临床上用于淋巴瘤患者的功能分子显像方法主要有⁶⁷Ga-枸橼酸SPECT显像和¹⁸FDG PET/CT显像，但⁶⁷Ga-枸橼酸和¹⁸FDG都不是淋巴瘤特异性显像剂，它们同时也可用于炎症显像，因而特异性降低。

放射免疫显像或治疗有关抗体变构体的研究集中在设计分子量为20～30kDa的抗体变构物，但肝脏摄取较多，血本底高为其主要缺点。如国外有专利文献报道了抗CD137抗体、IRTA2抗体、抗CD22抗体、抗CD20抗体等抗体与放射性核素嵌合用于恶性淋巴瘤诊治的研究[4-9]，但其所用抗体或抗体片段的分子量都大于20kDa甚或达数万kDa。

从理论上说，完美的放射性显像或治疗药物在静脉给药后，将经血液循环到达靶细胞，并通过理想的分子通路只与靶分子发生特异性结合。而任何没有达到靶细胞或没有与靶分子结合的放射性药物都将尽快被排出体外，从而使生物体内只在靶点有放射性药物聚集。因此，放射性显像剂或治疗药物设计的目标要尽可能接近这种理想状况。

然而，要达到这个目标却面临诸多困难。首先，据文献报道，肾脏对抗体片段多肽的清除阈值分子量介于60kDa～80kDa之间。分子量＜肾脏清除阈值(～60-kDa)的抗体片断虽然比全抗体有更好的肿瘤穿透性，但由于肽类药物与肿瘤靶分子“受体”(抗原)的结合需要一定时间，若清除过快，这些片断因很快被肾脏清除导致放射标记的抗体片断在肿瘤部位不能有效聚集而难于成功显像或有效杀灭肿瘤细胞[6]；而分子量＞80kDa时，虽可减少肾脏对抗体片段的快速清除，增加其血液循环的有效半衰期，但同时又因肝脏摄取增高、血液循环清除减慢、腹部本底增高而使靶/非靶放射性比值低，不利于获得高质量影像[7](C.Van De Wiele，H.Revets，N.Mertens，Radioimmunoimagingadvances And Prospects.The Quarterly Journal Of NuclearMedicine And Molecular Imaging.2004：48(4)：321-322)。

另有报道，单链的Fv抗体片断(25kD)很快被肾脏清除，到达肿瘤组织的量低，双亚基的ScFv可以显著提高血清半衰期和肿瘤聚集量。通过分子生物学手段也可以制备融合蛋白scFv-CH3(80kD)和scFv-Fc片断(105kDa)，不过在肝脏和肾脏中可以观察到显著的非特异性摄入从而干扰腹部显像(AnnaM.Wu，Tove Olafse.Antibodies for Molecular Imaging of Cancer.The CancerJournal.2008：14(3)：193-194)。

因此，目前免疫显像剂或治疗剂面临的困难是，当抗体片断分子量小时，对肿瘤的穿透力强，但是如果分子量小于肾脏清除阈值(60kD～80kD)，则很容易被清除，肿瘤组织的放射免疫显像剂积累量低，诊断治疗效果不理想；而当抗体分子量大于肾脏清除阈值(60kD～80kD)时，虽不易被清除，却使得肝脏和脾脏的非特异性摄入高，造成显像本底高，干扰诊断结果，同时，分子量大的抗体难以穿透肿瘤，肿瘤部位摄取显像剂或治疗剂少，从而不能形成有效浓聚，因而肿瘤显像或治疗效果都不佳。

对EB病毒所致的肿瘤如恶性淋巴瘤来说，目前临床上虽有多种技术方法可用于诊断恶性淋巴瘤，但尚未见有恶性淋巴瘤的特异性靶向分子显像技术的相关报道。本发明旨在提供一种源于EB病毒表面抗原gp350/220抗原决定簇的单克隆抗体的靶向放射性小分子抗体拟似肽，用于EB病毒表面抗原gp350/220阳性肿瘤(包括淋巴瘤)的核医学分子显像及放射性靶向治疗。该靶向放射性小分子抗体拟似肽的发明，将有助于恶性淋巴瘤的早期诊断、分期、治疗方案选择、疗效评价及预后判断。

发明内容

本发明通过进一步改造全抗体的结构，寻求更小的肿瘤抗体或抗体片段替代物(分子量＜10kDa)。一方面，既能大力提高其对肿瘤的穿透力；另一方面，又能保留其与肿瘤分子靶点的高亲和力及其在体内的高度稳定性，以保证其在肿瘤部位的有效聚集。同时制备方便容易，成本低廉，容易产业化。

本发明提供一种融合多肽在制备放射性靶向肿瘤分子显像剂或放射性内照射治疗药物中的用途，所述的融合多肽是由单抗的重链可变域(或轻链可变域)的骨架区2(V_HFR₂或V_LFR₂)连接一个重链可变域的互补决定区1或3(V_HCDR₁或V_HCDR₃)和一个轻链可变域的互补决定区1或3(V_LCDR₁或V_LCDR₃)组成，其分子量为3～4kD，所述的单抗是识别EB病毒表面抗原gp350/220抗原决定簇的单克隆抗体，所述的肿瘤为EB病毒所致的EB病毒表面抗原gp350/220阳性的恶性肿瘤。

所述融合多肽的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.1～4所示的序列：

SEQ ID NO.1DYYLHWVKQRTEQGLEWIGQHIRELTRS

SEQ ID NO.2SFGMHWVRQAPEKGLEWVAGQGYSYPYT

SEQ ID NO.3DYNMHWVKQSHGKSLEWIGQQNNEDPYT

SEQ ID NO.4GYWMSWVRQAPGKGLEWVAQQLVEYPFT

所述融合多肽的对照28C的氨基酸序列是SEQ ID NO.5所示的序列：SEQ ID NO.5DYYLHQHIRELTRSWVKQRTEQGLEWIG

所述优选的融合多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO.1的序列。

本发明还提供一种放射性靶向肿瘤分子显像剂或放射性靶向肿瘤内照射治疗药物，其包含上述的融合多肽以及可直接或间接与多肽偶联标记的放射性核素。

所述放射性核素包括¹⁹⁸Au、³²P、¹²⁵I、¹³¹I、¹²³I、¹²⁴I、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁶⁸Ca、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、²¹¹At、²¹³Bi、²²⁴Ac、²²³Ra、²²⁵Ac、¹⁷⁷Lu、^99mTc、¹⁸F、⁷⁶Br、¹¹¹In、⁸⁹Sr、⁹⁰Y、¹⁶⁶Ho、¹⁶⁵Dy、⁷⁷Br、¹¹¹In、^195mPt。

优选的放射性核素是用于放射显像和/或放射治疗的¹²³I、¹³¹I、¹²⁴I、^99mTc、¹⁸⁸Re、¹¹¹In、¹⁸F、⁷⁶Br、⁶⁸Ca或⁶⁴Cu。

优选的放射性核素是用于放射性内照射治疗的²¹¹At、²¹³Bi、²²³Ra、²²⁵Ac、³³P、¹⁷⁷Lu、⁶⁷Cu、¹³¹I、¹⁸⁶Re、¹⁶⁵Dy、⁸⁹Sr、³²P、¹⁶⁶Ho、¹⁸⁸Re、⁹⁰Y、¹²⁵I、¹²⁴I、⁷⁷Br、¹¹¹In、^195mPt

更优选的放射性核素是¹³¹I、¹²³I、¹²⁴I。

进一步的，本发明提供的放射性肿瘤靶向分子显像剂或/和放射性肿瘤靶向内照射治疗药物，其包含用放射性核素直接标记上述融合多肽的酪氨酸，或者通过核医学上常用的偶联剂与上述融合多肽的N末端或/和C末端偶联后再间接用放射性核素标记所形成的放射性复合物。

本发明设计的小分子抗体拟似物包含一个由来自重链可变域的同源骨架区氨基酸序列(V_HFR)将一个重链可变域的互补决定区(V_HCDR)和一个轻链可变域的互补决定区(V_LCDR)两个相互作用的互补决定区(CDR)连接起来的核心结构：“V_HCDR-V_HFR-V_LCDR”，考虑到重、轻链的相互作用，较单链抗体片段可能更有利于提高其与抗原的亲和力，而目前其它抗体变构体的研究仅考虑的是单链抗体片段。

本发明制备的放射性免疫显像剂或治疗剂具有分子量小、肿瘤穿透力强及靶向性好、肿瘤浓聚高、血液中清除快、肿瘤外非靶器官如肝脏及脾脏等无明显放射性分布、机体不会对该类小分子化合物分子(3～4kDa)产生免疫反应(无免疫原性)、安全等优点，初步研究证实：¹³¹I标记V_HCDR₁-V_HFR₂-V_LCDR₃具有高度恶性淋巴瘤靶向性(特异性)、高亲和力及高度体内稳定性。这些正好克服了当今放射性核素标记多肽、放射性核素标记单克隆抗体或单链抗体片段等所具有肿瘤穿透力差、肝脏等非特异性结合高、血液清除慢、易产生免疫反应、难于在肿瘤形成有效聚集等关键技术难题，必将进一步丰富放射免疫显像及放射免疫治疗的理论及临床实践。

本发明的分子量为3～4kDa的融合多肽，较分子量为数万的原始单抗或分子量为20～30kDa的抗体变构物可具有更强的肿瘤穿透力。前期用¹³¹I标记V_HCDR₁-V_HFR₂-V_LCDR₃已成功完成荷恶性淋巴瘤裸鼠体内显像，初步证实其恶性淋巴瘤靶向性。

以下的具体实施方式是对本发明的进一步详细说明，但并非对本发明的限制，任何基于本发明实质内容作出的变形都属于本发明保护的范围。

附图说明

图1合成28P(SEQ ID NO.1)质谱图：纯度为95％。其中各特征峰的保留时间、峰面积如下：

图2 NBS用量与标记率的关系：当¹²⁵I用量为1.5mCi时，NBS用量达到10μg时标记率达到最高，再增加无明显变化。

图3 28P用量与标记率的关系：¹²⁵I用量为1.5mCi、NBS用量为10μg时，28P的量为20μg时标记率达到最高，再增加无明显变化。

图4反应时间对标记率的影响：28P在数秒内与¹²⁵I发生结合反应。

图5pH值对标记率的影响：最佳pH值为7.5(5～8)。

图6温度对标记率的影响：本实验的最佳温度为22℃(18～25℃)。

图7标记物的放射化学纯度测定：97％

图8标记物的体外稳定性：将制备的放射性药物在常温下放置1、2、4、8、12、24、48、168、720h其放化纯度基本稳定，在168h时仍然保持在84％左右。甚至放置30天后其放化纯仍保持在80％左右。

图9本发明显像剂对荷淋巴瘤裸鼠显像实验结果(28P即：SEQ ID NO.1及其对照28C即：SEQ ID NO.5)。初步证实：¹³¹I标记28P具有恶性淋巴瘤靶向特性。abc、def分别为¹³¹I标记28P、¹³¹I标记28C(阴性对照)在荷恶性淋巴瘤裸鼠模型经尾静脉注射后24h的体内显像。其中，a、d分别为荷恶性淋巴瘤裸鼠模型的光学照片，b、e分别为¹³¹I标记28P、¹³¹I标记28C在荷恶性淋巴瘤裸鼠模型体内的SPECT影像，c、f分别为a、d光学照片与相应b、eSPECT影像的融合影像。

图10本发明显像剂(¹³¹I标记28P)对荷恶性淋巴瘤及荷非小细胞肺癌裸鼠显像结果：初步证实¹³¹I标记28P具有恶性淋巴瘤高度靶向性(特异性)、高亲和力及高度体内稳定性。恶性淋巴瘤高度浓聚¹³¹I标记28P，注射后24h肿瘤/对侧肌肉放射性比值达3.73，显像剂经肾脏清除，肝脏、血循环及正常组织无摄取；恶性淋巴瘤未摄取¹³¹I标记28C(对照)；非小细胞肺癌未摄取¹³¹I标记28P。abc、def、ghi分别为¹³¹I标记28P、¹³¹I标记28C(阴性对照)、¹³¹I标记28P注射后24h在荷恶性淋巴瘤、荷恶性淋巴瘤及荷非小细胞肺癌裸鼠的体内显像。其中，a、d、g分别为荷恶性淋巴瘤、荷恶性淋巴瘤及荷非小细胞肺癌裸鼠模型的光学照片，b、e、h分别为¹³¹I标记28P、¹³¹I标记28C及¹³¹I标记28P在荷恶性淋巴瘤、荷恶性淋巴瘤及荷非小细胞肺癌裸鼠模型体内的SPECT影像，c、f、i分别为a、d、g光学照片与相应b、e、h SPECT影像的融合影像。

图11荷恶性淋巴瘤裸鼠模型

图12荷非小细胞肺癌裸鼠模型

图13.恶性淋巴瘤组织的病理学切片(倒置显微镜HEX400倍)

图14.非小细胞肺癌组织的病理学切片(倒置显微镜HEX400倍)

上述附图均为黑白图片，为了更清除的说明本发明的靶向分子显像剂或治疗剂的特征，发明人同时提交图9～14的彩色图片作为参考。

实施例1小分子融合肽的制备

按照丘小庆等在文献中(Xiao-Qing Qiu，He Wang，Bei Cai，Lan-Lan Wang&Shi-Tao Yue.Small antibody mimetics comprising twocomplementarity-determining regions and a framework region for tumortargeting.NATURE BIOTECHNOLOGY，2007：25(8)：921-928)公开的方法制备的小分子融合肽，或者按照SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5公开的氨基酸序列由西安联美生物制品有限公司合成。

实施例2制备本发明的显像剂

1.1材料

28P(SEQ ID NO.1)由西安联美生物制品有限公司合成，纯度＞95％(见图1)。

用BALB/c小鼠24只，体重约20g，雌雄不限，分为7组，每组5只(四川大学实验动物中心提供)；Na¹²⁵I/Na¹³¹I由成都中核高通同位素股份有限公司生产(无载体、无还原剂、放射化学纯度≥96％，pH值7.0～8.0，γ杂质＜0.1％)；N-溴代琥珀酰亚胺为sigma产品(USA)，HAS(上海)，分析纯；丙酮(成都新川化学试剂有限责任公司)，γ计数仪(国营二六二厂)，ESJ120-4电子分析天平(沈阳)，漩涡混合器XW-80A(上海医科大学)。

2.1 28P的¹²⁵I标记及最佳标记条件的确定

采用N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)作为氧化剂，NBS以三蒸水溶解，浓度为0.5mg/ml；28P的浓度为1mg/ml；固定¹²⁵I的用量，改变28P及NBS的用量，以取得最佳标记条件。各反应管内先¹²⁵I溶液0.5μl(约1.5mCi)，然后加入NBS溶液0.1、1、3、5、7、10、20μl室温下，最后各加入28P 20μl，分别加入100μl的0.05mol/L的磷酸盐缓冲液，盖紧管口。漩涡混合器混匀。反应约3分钟后，加入10μl 2％的HSA溶液终止反应。

采用相同方法，固定¹²⁵I及NBS的用量，改变28P的量分别为0.2、2、5、10、20、40、100μl，反应3分钟后，取样测标记率。保持其它条件不变，再分别考察反应时间、pH值、温度对¹²⁵I-28P标记率的影响。

2.1.1 28P用量及NBS用量与标记率的关系

¹²⁵I用量为1.5mCi时标记率较高；NBS用量达到10μg时标记率达到最高，再增加无明显变化(见图2)，28P的量为20μg时标记率达到最高(见图3)，再增加无明显变化因此，反应最佳条件为：20μg 28P(1mg/ml/mL)、1.5mCi7.4MBq ¹²⁵I、10μg NBS。标记率可达到97.8％。

2.1.2反应时间对标记率的影响(见图4)

标记率在0.5min内迅速升高，以后随时间延长标记率无明显变化，因此28P能够很快速与¹²⁵I发生结合反应。

2.1.3pH值对标记率的影响(见图5)

保持其它条件不变时，pH在0.1～14时标记率随pH值增高呈抛物线型变化，到pH值7.5时标记率最高，确定本实验的最佳pH值为7.5。

2.1.4温度对标记率的影响(见图6)

保持其它条件不变时，温度在0～50℃时标记率随温度增高呈抛物线型变化，到温度为室温时(22℃)标记率最高，确定本实验的最佳温度为22℃。

2.1.5反应体积对标记率的影响

本次实验通过往反应体系中加入一定量的磷酸盐缓冲液调节反应体积及pH值，发现当反应体积过小时标记率不高，可能由于溶液的缓冲能力不够，pH值未调节到有利于标记的范围；随反应体积的增大标记率也随之增大，之后随反应体积增大，标记率反而下降。可能由于体积过度增大时，反应物的有效浓度降低，分子间相互作用减弱，标记率降低。本实验的最佳选择体积为120μl。

2.2放射性药物的质量控制

¹²⁵I-28P的质量控制(¹³¹I-28P的质量控制同¹²⁵I-28P的质量控制)

1.一般理化性质：观察标记产物的澄明度、色泽、外观及pH值。

观察标记产物为无色透明液体，反应终pH值为：7.5。

2.放射化学纯度

纸层析法测标记率，固定相为新华I号纸，展开剂为丙酮∶生理盐水＝1∶1(体积比)，测定标记物及游离¹²⁵I的Rf值，并计算¹²⁵I-28P的标记率，通过TLC扫描仪对标记物放射化学纯度进行鉴定，¹²⁵I-28P的Rf＝0.5～0.6，游离¹²⁵I的Rf＝0.8～1.0，放射化学纯度为97％，见图7。

3.体外稳定性实验将标记物放置在常温下，用纸层析法测定标记物于标记后1、2、4、8、12、24、48、168、720h内不同时间的放射化学纯度(RCP)，观察其体外稳定性。制备的放射性药物放置室温下24h内放射化学纯度大于95％，一周后RCP仍大于90％，室温放置168h后，其RCP仍然保持在84％左右，甚至放置30天后其RCP仍保持在80％左右，具有良好的体外稳定性(见图8)。

4.标记物免疫活性测定

按以下方法进行¹²⁵I-28P的免疫活性测定

(1)在0.5ml的eppendorf管内加入Raji细胞悬液25μl(4×10⁷个/ml)

(2)加入已标记的¹²⁵I-28P 25μl(稀释至25μl约5×10⁴个计数/10秒范围内不影响结果)

(3)旋涡混合器振荡30s后，置4℃，每15min震荡一次，共2h。

(4)r计数仪测量总放射性活度(T)。

(5)离心2000g，3min。

(6)吸弃上清(避免吸出细胞)。

(7)加入2％FCS一PBS200μl洗细胞，振荡30s，同上离心，吸弃上清200μl，重复3次。

(8)第三次吸出200pl后，r计数仪测量放射性活度(B)。

(9)计算B/T(％)。

按上述方法测得¹²⁵I-28P B/T(％)为38.2％。

5.无菌、无热源实验

5.1无菌、无热源¹³¹I-28P的制备

参照《中华人民共和国药典》之规定进行，经无菌条件下制备的¹³¹I-28P各项技术指标均符合药典体内诊断试剂之规定。制备¹³¹I-28P时严格无菌操作。使用无菌、无热源真空瓶及一次性无菌注射器，所使用的微量移液器在每次使用前后均需用75％的乙醇(优级纯G.R无水乙醇配置)溶液浸泡过夜。所配置的¹³¹I-28P需经0.2μm的无菌无热源滤器滤过，收集到的即为无菌无热源的¹³¹I-28P，备用。

5.2细菌检查及热源鉴定

细菌检查：取3瓶新鲜配置的完全RPMI1640培养液放入培养瓶内过夜，第二天观察培养瓶内无污染、无细菌生长，然后将严格无菌操作条件下制备的¹³¹I-28P 0.37MBq放入培养瓶内继续培养，连续观察7天，培养瓶内无细菌生长。

热源鉴定：取三只新西兰大白兔(雌2只，雄1只，体重：2-2.5kg)，于20℃室温环境常规培养三天，监测肛温，第四天，每只大白兔于耳缘静脉注射¹³¹I-28P，剂量为106MBq/kg。于注射后0、30、60、90、120、150和180分钟分别测定其肛温，并作记录。热源鉴定阴性。

6.急性毒性实验：按体重60kg的患者每人/次注射6mCi ¹³¹I-28P(含28P：80μg)计算：选择健康昆明小鼠15只(雌性，18～22g)，随机分为A、B、C 3组，每组5只。A组：每只小鼠经尾静脉注射0.3mCi/0.1ml放射化学纯度为97％的¹³¹I-28P(含28P：6μg)，其放射性活度为同比体重患者的150倍，28P的用量为同比体重患者的230倍；B组每只小鼠经尾静脉注射无放射性标记溶于PBS的28P 20μg/0.1ml，28P的用量为同比体重患者的769倍；C组每只小鼠经尾静脉注射0.1ml生理盐水作对照。观察并记录注射后14天内小鼠的饮食量、活动度、反应、体重，上述指标无异常，小鼠体重增加。14天后取小鼠肝脏及肾脏，光镜下观察未见细胞变性及坏死。急性毒性实验阴性。

用SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.5制备显像剂或治疗剂方法与上述方法相同，用其中放射性核素标记的SEQ ID NO.5序列作为对照。

实施例3检测碘-125标记28P在正常小鼠的体内分布

碘-125标记28P的制备：取10μl Na¹²⁵I(约1.5mCi)，再加入10μl(1μg/μl)NBS溶液，然后加入预先分装好的1μg/μl 28P，最后加入100μl0.05mol/L PBS缓冲液(pH7.2～7.4)混匀，缓慢振荡混匀，反应3min，加入50μl 2％HSA溶液终止反应30sec，标记完成。纸层析法测标记率，固定相为新华I号纸，展开剂为丙酮∶生理盐水＝1∶1(体积比)，¹²⁵I-28P的Rf＝0.4～0.6，游离¹²⁵I的Rf＝0.8～1.0，通过TLC扫描仪对标记率进行鉴定。获得的¹³¹I-28P的放化纯度96.8％。

¹²⁵I-28P标记物在正常小鼠体内的生物学分布选择健康昆明小鼠35只，随机分为7组，每组5只。每只小鼠经尾静脉注射0.1ml放射化学纯度为97％的¹²⁵I-28P。另取两个0.1mL作为标准源。分别于注射后30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h取出一组小鼠断头取血，解剖取出各主要脏器：血、甲状腺、脑、心、肺、肝、脾、胃、肠、肾、骨、肌肉、皮肤等，称重并测定其放射性计数。结果以每克组织放射性摄取百分比(％ID/g)表示。每克组织百

药物静脉注射后4h、24h每克血、肝组织放射性计数占注入量的百分数分别为0.2％、0.06％和0.17％、0.04％，说明药物从血中清除快，肝脏摄取非常低(见表1)。

表1 ¹²⁵I-28P标记物在正常小鼠体内的生物学分布

¹²⁵I-28P的正常小鼠体内分布(

n＝5)

放射性核素标记的SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.4序列的融合肽在体内分布与上述实验类似。

实例4利用本发明显像剂诊断淋巴癌：

项目组前期研究已初步获得¹³¹I标记28P(V_HCDR₁-V_HFR₂-V_LCDR₃)荷恶性淋巴瘤裸鼠靶向显像的直接证据，研究结果显示：¹³¹I标记28P具有恶性淋巴瘤高度靶向性(特异性)、高亲和力及高度体内稳定性。(见图9、图10)

放射性同位素活度计(CRC-15R，美国Capintec公司生产)，γ放射免疫计数仪(FJ 20201，西安二六二仪器厂)，Na¹³¹I溶液(成都中核高通同位素股份有限公司，放射化学纯度≥96％，放射性浓度≥2.5GBq/mL，pH＝8.0，γ杂质＜0.1)，28P由西安联美生物制品有限公司合成，纯度＞95％；，N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)(Sigma公司，纯度≥99％，分析纯)，RPMI1640培养基(上海博生生物科技有限公司)，BALB/C-nu/nu裸鼠(SPF级，雌雄不限，鼠龄6周～8周，体重20g～25g)，四川大学华西实验动物中心提供。

碘-131标记28P的制备：根据由Na¹³¹I标记28P所获得的最佳标记条件。取10μl Na¹³¹I(约1.5mCi)，再加入10μl(1μg/μl)NBS溶液，然后加入预先分装好的1μg/μl 28P，最后加入100μl 0.05mol/L PBS缓冲液(pH7.2～7.4)混匀，缓慢振荡混匀，反应3min，加入50μl 2％HSA溶液终止反应30s，标记完成。纸层析法测标记率，固定相为新华I号纸，展开剂为丙酮∶生理盐水＝1∶1(体积比)，¹³¹I-28P的Rf＝0.4～0.6，游离¹³¹I的Rf＝0.8～1.0，通过TLC扫描仪对标记率进行鉴定。

获得的¹³¹I-28P的放化纯度96.8％。

荷淋巴瘤裸鼠模型的建立：选择指数期生长Raji细胞计数达10⁶～10⁷cells/ml、1000r/min离心5min，弃去上清，用PBS将细胞重悬为浓度5×10⁶～1×10⁷cells/ml的单细胞悬液，按0.2ml/只快速将单细胞悬液接种10只裸鼠右前肢内侧腋窝皮下。实验步骤严格遵循无菌原则，在华西医学实验动物中心饲养，SPF级。6周左右，肿瘤长至约0.8cm×1.0cm，用于显像实验(见图11)。同时按上述相同方法，利用A549细胞建立5只非小细胞肺癌荷瘤鼠模型(见图12)，为加以区别，将非小细胞肺癌荷瘤鼠模型建于左前肢内侧腋窝皮下。

荷瘤小鼠显像为避免显像过程中甲状腺对¹³¹I-28P脱落的¹³¹I的大量摄取而影响肿瘤的显像，实验前7天在小鼠饮水中加入0.1％的碘化钾以封闭甲状腺对放射性碘的摄取。随机抽取5只荷瘤鼠分别从尾静脉注射7.4MBq的¹³¹I-28P，另外5只则从尾静脉注射乱码氨基酸序列的对照组(¹³¹I-28C)7.4MBq，同样将标记物¹³¹I-28P 7.4MBq经尾静脉注入非小细胞肺癌荷瘤鼠体内，经腹腔注射0.75％戊巴比妥钠注射液，按剂量45mg/kg给予麻醉。于注射后0.5、1、2、4、8、12、24h对每只荷瘤鼠行全身平面显像。利用感兴趣区技术(ROI)计算最佳显像时间时肿瘤/非肿瘤组织相应部位的放射性摄取比值(T/NT)。显像条件：采用高能针孔真空准直器；静态扫描；矩阵128×128；能峰140KeV；窗宽：20％；放大倍数1.44倍；采集30K的计数。采用相同的方法，对非小细胞肺癌荷瘤鼠进行显像，作为对照组。

静脉注射¹³¹I标记28P(V_HCDR₁-V_HFR₂-V_LCDR₃)24h荷恶性淋巴瘤裸鼠肿瘤/对侧肌肉放射性比值高达3.73，药物从血液循环中清除快，肝脏及脾脏无明显放射性分布。而同等条件下¹³¹I标记28C(V_HCDR₁-V_LCDR₃-V_HFR₂对照，氨基酸序列为：SEQ ID NO：5)静脉注射24h内始终未见肿瘤聚集显像剂。此外，项目组已完成¹³¹I标记28P荷非小细胞肺癌(NSCLC)裸鼠的体内显像研究：静脉注射¹³¹I标记28P后，于24h内完成的系列静态显像也始终未见肿瘤组织摄取¹³¹I标记28P。证实¹³¹I标记28P具有恶性淋巴瘤高度靶向性(特异性)、高亲和力及高度体内稳定性。

根据本领域的常识，¹³¹I、¹²⁴I等核素是公知的放射性治疗剂，因此，当28P标记适当的放射性核素时，即可以作为恶性淋巴瘤的靶向治疗剂。放射性核素标记的SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.4序列的融合肽也具有类似的靶向显像和靶向治疗效果。

实施例5病理组织学检查：取荷瘤裸鼠的新鲜肿瘤组织置于10％福尔马林溶液固定48h，石蜡包埋切片、HE染色，光镜下观察各实验组恶性淋巴瘤组织的病理学表现并采集图片。

淋巴瘤组织的病理学表现(见图13)：瘤细胞大小和形态一致，相互粘连，主要由小无裂细胞组成，瘤细胞胞界不清，胞质少，核圆或卵圆形，核膜厚，染色质较粗，核仁明显，可贴近核膜，核有丝分裂象多见。特殊的是瘤细胞迅速死亡，被成熟的巨细胞吞噬，这些含有吞噬碎片和包涵体样颗粒的巨细胞淡染，均匀地散布于瘤细胞之间呈现所谓的“满天星”图像，是本病的组织学特点。

非小细胞肺癌组织的病理学切片(见图14)：其表现为癌细胞内有空腔形成，表面有微绒毛，胞质内可见分泌颗粒，细胞间可见连接复合体。

统计分析  结果均采用平均值±标准差

来表示，利用SPSS软件利用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。统计T和NT的放射性计数的差异是否有统计学意义。

对SPECT采集荷瘤裸鼠的图像，通过勾画感兴趣区(ROI)技术测得：¹³¹I-28P组肿瘤(T)与NT的计数分别为：724±145和235±48，n＝5，t检验可得P＝0.000，药物分布有显著统计学差异。

¹³¹I-28C组T与NT的计数分别为：159±32和150±26，t检验可得P＝0.658，药物分布无显著统计学差异。

而非小细胞肺癌组其T与NT的计数分别为：101±10和91±17，t检验可得P＝0.286，药物分布无显著统计学差异。

上述结果说明本发明的恶性淋巴瘤靶向放射性药物能在肿瘤部位高度浓聚而未见肿瘤摄取其对照药物，非小细胞肺癌组织也不摄取该恶性淋巴瘤靶向放射性药物。证实¹³¹I标记28P具有恶性淋巴瘤高度靶向性(特异性)、高亲和力及高度体内稳定性。

本发明研制的碘化(¹³¹I)抗EB病毒表面抗原gp350/220抗原决定簇的单克隆抗体拟似物具有如下特色及创新之处：1)分子量小(3～4kDa)，肿瘤穿透力强。注射后1h即可见肿瘤显影，继后见肿瘤摄取逐渐增浓，首次成功完成荷恶性淋巴瘤裸鼠靶向分子显像。而前期研究的基于单克隆抗体及抗体片段的放射性靶向分子显像剂及放射性靶向治疗药物的总体临床效果并不理想[7]；2)亲和力高、靶向性强，稳定性好，靶/非靶组织放射性比值高。注射后24h肿瘤/对侧肌肉放射性比值高达3.73，可完成肿瘤部位的有效聚集特异性高，而肝脏、脾脏及其余正常组织器官未见摄取；3)经肾脏从血循环中清除快。该研究打破抗体变构体药物的分子量要大于肾脏清除阈值(60kDa～80kDa)的传统观念，首次证实了：131I标记的3kDa抗EB病毒表面抗原gp350/220单克隆抗体的拟似物28P具有恶性淋巴瘤高度靶向性(特异性)、高亲和力及高度体内稳定性；4)本研究抗体拟似物包含分别来自来自单克隆抗体重链可变域和轻链可变域的互补决定区以及来自重链可变域的同源骨架区的氨基酸序列，考虑到重、轻链的相互作用较单链抗体片段可能更有利于提高其与抗原的亲和力。而目前其它抗体变构体的研究仅考虑的是单链抗体片段，它仍需要依靠内部的二硫键来维持其稳定性，现已被证明有许多缺陷。

综上所述，本发明已成功用¹²⁵I、¹³¹I标记28P(V_HCDR₁-V_HFR₂-V_LCDR₃实验)及其乱码肽拟似物28C(V_HCDR₁-V_LCDR₃-V_HFR₂对照)，其放射化学纯度(RCP)大于96％，室温放置48小时后其放射化学纯度仍然大于90％，体外稳定。我们及项目合作者前期用¹²⁵I标记28P完成了健康小鼠的体内分布研究及用¹³¹I标记28P分别完成了荷恶性淋巴瘤裸鼠和荷非小细胞肺癌裸鼠体内显像研究，初步结果显示：¹³¹I标记28P分子量小、亲和力高、特异性强、体内稳定和肿瘤穿透力强，从血循环中清除快，主要经肾脏清除。¹³¹I标记28P具有高度恶性淋巴瘤靶向性、高亲和力及高度体内稳定性，是一种潜在的恶性淋巴瘤特异性靶向分子显像剂。

                       Untitled.ST25.txt

SEQUENCE LISTING

<110>四川大学华西医院

<120>一种恶性淋巴瘤放射性靶向分子显像剂或/和靶向治疗剂

<130>CD520-09P106337

<160>5

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>28

<212>PRT

<213>融合肽

<400>1

Asp Tyr Tyr Leu His Trp Val Lys Gln Arg Thr Glu Gln Gly Leu Glu

1               5                   10                  15

Trp Ile Gly Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser

            20                  25

<210>2

<211>28

<212>PRT

<213>融合肽

<400>2

Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu

1               5                   10                  15

Trp Val Ala Gly Gin Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr

            20                  25

<210>3

<211>28

<212>PRT

<213>融合肽

<400>3

Asp Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu

1               5                   10                  15

Trp Ile Gly Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr

            20                  25

<210>4

<211>28

<212>PRT

<213>融合肽

<400>4

Gly Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

1               5                   10                  15

Trp Val Ala Gln Gln Leu Val Glu Tyr Pro Phe Thr

            20                  25

<210>5

<211>28

<212>PRT

<213>乱码结构

<400>5

Asp Tyr Tyr Leu His Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser Trp Val

1               5                   10                  15

Lys Gln Arg Thr Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

            20                  25

Claims (10)

1.一种融合多肽在制备肿瘤放射性靶向分子显像剂或放射性靶向治疗剂中的用途，所述的融合多肽是由单抗的重链可变域(或轻链可变域)的骨架区2(V_HFR₂或V_LFR₂)连接一个重链可变域的互补决定区1或3(V_HCDR₁或V_HCDR₃)和一个轻链可变域的互补决定区1或3(V_LCDR₁或V_LCDR₃)组成，其分子量为3～4kDa，所述的单抗是识别EB病毒表面抗原gp350/220抗原决定簇的单克隆抗体，所述的肿瘤为EB病毒所致的恶性肿瘤。

2.根据权利要求1所述用途，其特征是：所述融合多肽的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.1～4所示的序列。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征是：所述融合多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO.1的序列。

4.一种放射性靶向分子显像剂或放射性靶向治疗剂，其特征是：包含权利要求1～3所述的融合多肽以及可直接或间接与多肽偶联标记的放射性核素。

5.根据权利要求4所述的放射性靶向分子显像剂或放射性靶向治疗剂，其特征是：所述放射性核素包括¹⁹⁸Au、³²P、¹²⁵I、¹³¹I、¹²³I、¹²⁴I、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁶⁸Ca、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、²¹¹At、²¹³Bi、²²⁴Ac、²²³Ra、²²⁵Ac、¹⁷⁷Lu、^99mTc、¹⁸F、⁷⁶Br、¹¹¹In、⁸⁹Sr、⁹⁰Y、¹⁶⁶Ho、¹⁶⁵Dy、⁷⁷Br、¹¹¹In、^195mPt。

6.根据权利要求5所述的放射性靶向分子显像剂或放射性靶向治疗剂，其特征是：所述放射性核素是用于放射显像的¹²³I、¹³¹I、¹²⁴I、^99mTc、¹⁸⁸Re、¹¹¹In、¹⁸F、⁷⁶Br、⁶⁸Ca或⁶⁴Cu。

7.根据权利要求6所述的放射性靶向分子显像剂或放射性靶向治疗剂，其特征是：所述放射性核素是用于放射显像的¹²³I、¹³¹I、¹²⁴I。

8.根据权利要求5所述的放射性靶向分子显像剂或放射性靶向治疗剂，其特征是：所述放射性核素是用于放射治疗的²¹¹At、²¹³Bi、²²³Ra、²²⁵Ac、³³P、¹⁷⁷Lu、⁶⁷Cu、¹³¹I、¹⁸⁶Re、¹⁶⁵Dy、⁸⁹Sr、³²P、¹⁶⁶Ho、¹⁸⁸Re、⁹⁰Y、¹²⁵I、¹²⁴I、⁷⁷Br、¹¹¹In、^195mPt。

9.根据权利要求8所述的放射性靶向分子显像剂或放射性靶向治疗剂，其特征是：所述放射性核素是用于放射治疗的¹²⁵I、¹³¹I、¹²⁴I。

10.根据权利要求4所述的放射性靶向分子显像剂或放射性靶向治疗剂，其特征是：所述放射性核素是直接与融合多肽的酪氨酸偶联，或者通过核医学上常用的偶联剂与融合多肽的N末端或/和C末端相连后再标记。

Images