CN101784673A - 外遗传方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于获得多倍体受试者的外遗传信息的方法，该方法包括下列步骤：自所述受试者获得生物学样品，所述样品含有(i)至少一种父本衍生DNA分子和/或相关蛋白和/或(ii)至少一种母本衍生DNA分子和/或相关蛋白；对任一种或多种所述父本或母本衍生DNA分子或相关蛋白分析修饰的存在或缺失，其中所述分析步骤确定任两处修饰是以顺式存在于一条染色体上还是以反式存在于两条姐妹染色体间。

Description

外遗传方法
发明领域
本发明涉及遗传学(更明确的说，是外遗传学(epigenetics))领域。具体而言，本发明涉及用于调查生物体的单倍体状态的外遗传特征的方法。
发明背景
外遗传继承指信息自细胞或多细胞生物体传递给后代，该信息不是在基因的核苷酸序列中编码的。一种类型的外遗传继承是DNA甲基化，其已经被证明涉及多种人类疾病。例如，DNA甲基化谱型中的变化在诸如癌症、Beckwith-Wiedemann综合征、Prader-Willi综合征和Angelman综合征等病症中是常见的。还知道DNA甲基化涉及在人类发育过程中调控基因表达。认为启动子区的重度甲基化在转录下调中是重要的，由此提供基因表达的“开关”。
DNA甲基化是通常发生于CpG位点(即DNA序列中胞嘧啶后面直接跟着鸟嘌呤的地方)的外遗传修饰；所述甲基化导致胞嘧啶转变成5-甲基胞嘧啶。Me-CpG的形成是由酶DNA甲基转移酶催化的。CpG位点在脊椎动物基因组中是不常见的，但是常常以较高密度见于脊椎动物基因启动子附近，在那里它们统称为CpG岛。这些CpG位点的甲基化状态能具有对基因活性和/或表达的重大影响。
甲基化样式最近已经成为一项重要研究课题。例如，DNA低甲基化(甲基化减少)和DNA超甲基化(甲基化增多)都已经与检验在正常与癌性组织间差异甲基化的基因的研究联系起来。已经与改变的甲基化联系起来的癌症相关基因包括那些涉及细胞周期调控、DNA修复、RAS信号传导和侵入的。研究已经发现在正常组织中，基因的甲基化主要局限于编码区，其中CpG不多。相反，基因的启动子区是未甲基化的，尽管该区中有高密度的CpG岛。
甲基化的程度在基因调控中也可能是重要的。在癌症中，逐渐发生外遗传介导的基因沉默。它以转录的微小降低开始，促使对CpG岛免于侧翼异染色质和甲基化蔓延进入该岛的保护降低。此损失导致各CpG位点逐渐增多，其在相同基因在不同细胞中的拷贝间有变化。
另一种类型的外遗传继承源自DNA相关蛋白的影响。例如，已知组蛋白的乙酰化状态能影响与它们结合的基因的表达。认为某些组蛋白的乙酰化导致基因沉默，因为DNA在染色质结构中的包装更密。
虽然现有技术已经披露了对DNA和相关蛋白的外遗传修饰与表型之间的联系，但是该相互作用是复杂的且尚未完全阐明。本发明的一个方面是克服或减轻现有技术的问题来提供利用对DNA的外遗传修饰的样式和相关蛋白样式来将表型归于以前认为可能的生物体以外的生物体的方法。
仅仅出于为本发明提供背景的目的，在本说明书中包括关于文件、动作、材料、装置、制品等等的讨论。没有提示或表示任何或所有这些事物构成现有技术基础的一部分或是本发明相关领域的公知常识，就因为它在本申请每一项权利要求的优先权日之前就存在了。
发明概述
在第一个方面，本发明提供了一种用于获得多倍体受试者的外遗传信息的方法，该方法包括下列步骤：自所述受试者获得生物学样品，所述样品含有(i)至少一种父本衍生DNA分子和/或相关蛋白(at least one paternally-derivedDNA molecule and/or associated protein)和/或(ii)至少一种母本衍生DNA分子和/或相关蛋白(at least one maternally-derived DNA molecule and/or associatedprotein)；对任一种或多种所述父本或母本衍生DNA分子或相关蛋白分析修饰的存在或缺失，其中所述分析步骤确定任两处修饰是以顺式存在于一条染色体上还是以反式存在于两条姐妹染色体间。
申请人提出外遗传分析分开考虑母本衍生DNA(和相关蛋白)和父本衍生DNA(和相关蛋白)。这样，重要的是要测定受试者的确定性外遗传表征(definitive epigenetic characterization)，此表征提供例如疾病与受试者外遗传状态之间的新联系。相反，现有技术的方法提供“平均”结果，因为将母本和父本DNA和相关蛋白的外遗传修饰相加了。
在所述方法的一种形式中，所述分析步骤确定所述修饰可归于父本衍生DNA和/或相关蛋白还是母本衍生DNA和/或相关蛋白。在另一个实施方案中，所述修饰的存在或缺失能够在体内调控所述DNA分子的表达。
在所述方法的一种形式中，所述分析步骤包括使用物理方法自母本衍生DNA和/或相关蛋白实质性分离父本衍生DNA和/或相关蛋白。所述物理方法可以是自母本衍生DNA分子和/或相关蛋白激光介导地剥离父本衍生DNA分子和/或相关蛋白。
所述分析步骤也可包括能够与母本衍生DNA和/或相关蛋白相比选择性分析父本衍生DNA和/或相关蛋白的原位方法。所述原位方法容许探查多倍体材料来提供确定性单倍体外遗传信息，使之不必将母本与父本DNA分子物理分开。
在所述方法的另一种形式中，所述DNA分子或相关蛋白存在于二倍体细胞中或是自二倍体细胞获得的。虽然配子含有单倍体信息，但是这些细胞可能难以在临床中获得和/或提供关于体细胞中存在的外遗传修饰的不正确信息。
在本发明的另一种形式中，在所述分析步骤是对DNA实施的情况中，所述修饰是甲基化。所述分析可以使用任何合适的方法来执行，然而，通常，对一个或多个位点分析甲基化的存在或缺失的步骤包含选自下组的方法：使用亚硫酸氢盐处理进行的DNA测序(DNA sequencing using bisulfitetreatment)、限制性界标基因组扫描(restriction landmark genomic scanning)、甲基化敏感性任意引发PCR(methylation-sensitive arbitrarily primed PCR)、使用甲基化敏感性限制酶进行的Southern分析(Southern analysis using amethylation-sensitive restriction enzyme)、甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR)、自亚硫酸氢盐转变DNA扩增的PCR产物的限制酶消化(restriction enzyme digestion of PCR products amplified frombisulfite-converted DNA)、及其组合。在所述分析是对蛋白质实施的情况中，所述蛋白质可以是组蛋白且所述修饰可以是乙酰化。
由本方法提供的外遗传信息能够提供受试者的表型信息，诸如疾病、疾患、或病症的存在或缺失；对疾病、疾患、或病症的素因(predisposition)；有或没有能力响应潜在治疗性分子；有或没有能力发起针对外来抗原或自身抗原的免疫应答；变态反应的存在或缺失；或对变态反应的素因。
发明详述
在第一个方面，本发明提供了一种用于获得多倍体受试者的外遗传信息的方法，该方法包括下列步骤：自所述受试者获得生物学样品，所述样品含有(i)至少一种父本衍生DNA分子和/或相关蛋白和/或(ii)至少一种母本衍生DNA分子和/或相关蛋白；对任一种或多种所述父本或母本衍生DNA分子或相关蛋白分析修饰的存在或缺失，其中所述分析步骤确定任两处修饰是以顺式存在于一条染色体上还是以反式存在于两条姐妹染色体间。
就申请人所知，本文中公开的发明是首次领会到在经由DNA和蛋白质修饰研究外遗传继承时状态(phase)的重要性。首次在外遗传现象(诸如DNA的甲基化和DNA相关蛋白的乙酰化)上获得了状态特异性信息。因此，本发明提供了分辨位于两个位点处的外遗传修饰是存在于同一染色体上(即顺式关系)或者一个位点存在于父本衍生的染色体上而另一个位点存在于母本衍生的姐妹染色体上(即反式关系)的能力。申请人提出，通过提供“平均”结果，当前认可的使用母本衍生DNA和父本衍生DNA二者进行的外遗传分析方法导致信息丢失。此信息在鉴定个体和群体中的状态特异性外遗传效应等中是重要的。
外遗传学领域在遗传学领域中是相对较新的，指关于不依赖生物体DNA内特定核苷酸序列的基因组功能变化的研究。外遗传学包括关于自一个细胞世代继承给下一个世代的效应的研究，不管这些是在胚胎形态发生、再生、正常细胞周转、肿瘤、细胞培养、或单细胞生物体复制中发生的。感兴趣的具体外遗传过程包括副突变(paramutation)、书签(bookmarking)、基因沉默(gene silencing)、X染色体失活(X chromosome inactivation)、位置效应(positioneffect)、程序重排(reprogramming)、移位(transvection)、印记(imprinting)、母体效应(maternal effects)、致癌作用的进展(the progress of carcinogenesis)、许多致畸原的效应(the effects of many teratogens)、及对组蛋白修饰和异染色质的调控(the regulation of histone modifications and heterochromatin)。
在本发明的一种形式中，所述分析步骤确定所述修饰可归于父本衍生DNA和/或相关蛋白还是母本衍生DNA和/或相关蛋白。假定唯一需要的信息可以是任两处修饰是顺式还是反式存在的，那么这样的确定可能不是严格必需的。
在所述方法的另一种形式中，所述修饰的存在或缺失能够在体内调控所述DNA分子的表达。正如技术人员领会的，基因的表达(至少部分)受到外遗传修饰(诸如DNA甲基化)的控制。DNA甲基化是一种DNA外遗传修饰，有人提出它在真核生物中是普遍的。在人类中，大约1％的DNA碱基发生DNA甲基化。在成年身体组织中，DNA甲基化通常发生于CpG二核苷酸背景中；非CpG甲基化在胚胎干细胞中是盛行的。在植物中，胞嘧啶被对称地(CpG或CpNpG)和不对称地(CpNpNp)甲基化，其中N可以是任何核苷酸。
在哺乳动物中，所有CpG中60-70％是甲基化的。未甲基化的CpG在存在于许多基因的5′调控区中的、称作“CpG岛”的簇中成群。在许多疾病过程中，诸如癌症，基因启动子CpG岛获得异常超甲基化，这导致可遗传的转录沉默。转录沉默状态的强化是由能结合甲基化CpG的蛋白质介导的。这些称作甲基-CpG结合蛋白的蛋白质募集组蛋白脱乙酰基酶和其它能修饰组蛋白的染色质重建蛋白，由此形成致密的、无活性的染色质，称作异染色质。DNA甲基化与蛋白质之间经由染色质结构改变的这种联系与各种表型的形成有关。例如，已经将甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)的丢失与Rett综合征联系起来，而且甲基-CpG结合域蛋白2(MBD2)在癌症中介导超甲基化基因的转录沉默。虽然DNA相关蛋白与甲基化之间可能有相互作用，但是应当理解，本发明包括关于与DNA甲基化没有关系的DNA相关蛋白的分析。
如上所述，与DNA相关的蛋白质可能涉及对基因表达的调控。例如，DNA的物理结构(像它压实成染色质存在)能影响转录调控蛋白(称作转录因子)和RNA聚合酶找到特定基因的入口并自它们激活转录的能力。
染色质是指示DNA在细胞内存在的结构的术语。染色质的结构经由DNA与DNA结合蛋白的相互作用来确定和稳定。有2类DNA结合蛋白。组蛋白是涉及致密染色质结构维持的DNA结合蛋白的主要类别。有5种不同的组蛋白，鉴定为H1、H2A、H2B、H3和H4。
另一类DNA结合蛋白是一组多样的蛋白质，简单地称作非组蛋白蛋白质。此类蛋白质包括各种转录因子、聚合酶、激素受体和其它细胞核的酶。在任何给定细胞中，有超过1000种不同类型的非组蛋白蛋白质结合DNA。
组蛋白对DNA的结合产生称作核小体的结构。核小体核心含有八聚体蛋白质结构，其由H2A、H2B、H3和H4各2个亚基组成。组蛋白H1占据核小体间DNA，而且被鉴定为接头组蛋白。核小体核心含有大约150bp DNA。每个核小体之间的接头DNA可以有变化，自20bp至超过200bp。若将DNA拉成线性结构，则这些核小体核心结构看上去像串上的珠子。
核小体核心自身盘绕成螺线管形，其自身盘绕以进一步压实DNA。这些最终的盘绕进一步压实成在核型分析涂片中看到的特征性染色质。染色质的蛋白质-DNA结构通过附着至称作核基质的非组蛋白蛋白质支架而得到稳定。
本发明包括对与DNA相关的任何蛋白质的修饰，而且其中所述修饰能够调控与之相关的基因的表达。例如，组蛋白翻译后修饰(PTM)与阳性和阴性转录状态相关。关于这些PTM的作用的一种典型模型是响应通向转录因子的胞质信号传导，由结合至DNA的激活物和RNA聚合酶跨越启动子和可读框建立发挥正作用的PTM。由跨越基因组异染色质区的结合至DNA的阻抑物募集在阻抑期间跨越基因建立发挥负作用的标志。这两套修饰都改变核小体表面，这然后募集调控蛋白复合物。
在本发明的背景中，组蛋白PTM包括但不限于对组蛋白3(H3)、组蛋白4(H4)、组蛋白2A(H2A)、组蛋白2B(H2B)的乙酰化；对H3、H2A和H2B的磷酸化；对H3和H4的精氨酸甲基化；对H3和H4的赖氨酸甲基化；对H2A和H2B的赖氨酸遍在蛋白化；对H2A和H2B的赖氨酸苏素化；及H3中的脯氨酸异构化；ADP核糖基化脱亚氨基(精氨酸转变成瓜氨酸)。变体组蛋白H2AX、H3.1、H3.3和Hzt1也通过PTM来修饰。
此组蛋白PTM全集(称作“组蛋白代码”)充当供含有特定相互作用域的效应器蛋白质结合的结合表面。例如，乙酰化受到布罗莫结构域的识别，甲基化受到Royal家族(chromo、tudor、MBT)克罗莫样结构域和非相关PHD结构域的识别，而磷酸化受到14-3-3蛋白质内的结构域的识别。
感兴趣的组蛋白乙酰基转移酶(HAT)包括GNAT[GCN5(氨基酸合成普遍控制5)相关乙酰基转移酶]家族、CBP/P300(CREB结合蛋白)家族、和MYST(MOZ、YBF2/SAS3、SAS2、TIP60蛋白)家族。这些HAT及转录因子和核-激素相关组蛋白乙酰基转移酶还包括GCN5、PCAF(P300/CREB结合蛋白相关因子)、GCN5L(氨基酸合成普遍控制5样2)、ELP3、P300(ela结合蛋白p300)、CBP(CREB结合蛋白)、TIP60、MOF/MYST1、MOZ(单核细胞白血病锌指蛋白)/MYST3、MORF(MOZ相关因子)/MYST4、HB01(与ORC结合的组蛋白乙酰基转移酶)/MYST2、ATF2、TAF1(TATA框相关因子1)、GTF3C4：通用转录因子3c、多肽4)、ACTR：激活素受体、SRC-1(类固醇受体共活化物1)/NCOA1/2(核受体共活化物1)、ACTR(激活素受体)、SRC-1(类固醇受体共活化物1)、CDYL和HAT1(组蛋白乙酰基转移酶)。
感兴趣的组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)包括I类和II类HDAC(诸如HDAC 1至HDAC 8和HDAC 10)及Sir家族的III类NAD依赖性酶(诸如SirT2)。
感兴趣的组蛋白甲基转移酶(HMT)包括I型和II型精氨酸HMT(诸如PRMT1、PRMT4、PRMT5和PRMT7)及赖氨酸HMT。感兴趣的赖氨酸HMT包括MLL(混和谱系白血病)1至MLL 5、与酵母Set1蛋白具有同源性的Set1家族(包括SET1A和SET1B)、SET2、SYMD2、Pr-SET 7/8、CLL8、NSD1、DOT1、SUV42H1/2、EZH2、RIZ1、SUV39H1/2、EuHMTase、GLP、ESET、SETDB1、和G9a。
感兴趣的精氨酸和赖氨酸脱甲基酶包括蛋白质精氨酸甲基转移酶(PMRT4、PRMT5、和CARM1)、LSD1、JHDM1a、JHDM1b、JHDM2a、JHDM2b、JMJD2A/JHDM3A、JMJD2B、JMJD2C、和JMJD2D。
感兴趣的介导其它组蛋白PTM(诸如脱亚氨基、磷酸化、苏素化和遍在蛋白化)的酶是PADI4、Bmi/Ring 1A、RNF20/RNF40和UbcH6)、单-ADP-核糖基转移酶和多-ADP-核糖聚合酶、脯氨酸异构酶和激酶诸如单激酶、MSK1/2、CKII和Mst1。其它感兴趣的是结合甲基化DNA的蛋白质，诸如甲基-CpG结合域(MBD)蛋白，包括MeCP2、MBD1-4、和MBD3L-1、和MBD3L-2。
另外，由于RNAi在昆虫、植物和真菌中涉及异染色质形成，而且最近的工作提示脊椎动物中存在这些机制，因此本发明包括RNAi介导的染色质修饰。
技术人员熟悉用于分离DNA相关蛋白的方法。可以使用高效毛细管电泳、高效液相层析或质谱术来检验总体DNA 5-甲基胞嘧啶含量或组蛋白PTM。可以使用外遗传分析(诸如限制性界标基因组扫描)来检验单倍体遗传材料，然而，对利用靶序列扩增(通常通过聚合酶链式反应来进行)(诸如甲基化位点间扩增(AIMS))或差异甲基化杂交(DMH)的办法特别感兴趣。另外，那些利用检测信号(诸如促进杂交靶物滚环复制的P-LISA(下文讨论)的检测事件)放大的。
为了使单染色体甲基化分析小型化，有可能可以使用诸如邻近连接原位测定法(P-LISA)等技术，其能够检测蛋白质的zeptomole量(40x10-21mol)(Fredriksson S et al.(2002)Protein detection using proximity-dependent DNAligation assays.Nat Biotechnol.20(5)：473-7)。此办法利用针对感兴趣蛋白质的抗体(在一个例子中，针对甲基化蛋白质的抗体)，该抗体在通过结合它们的靶蛋白质而邻近时容许所偶联的寡核苷酸杂交，该寡核苷酸在酶促连接后充当滚环复制的模板。由于靶蛋白质的检测需要两个独立的识别事件，因此该检测是高度特异性的且能够检测各蛋白质复合物(Soderberg O(2006)Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ byproximity ligation.Nat Methods.20063(12)：995-1000)。此办法最近已经适应了研究蛋白质-DNA相互作用，而且已经适应了容许对DNA-蛋白质相互作用的原位分析，以进行局限检测(Gustafsdottir SM et al.(2007)In vitroanalysis of DNA-protein interactions by proximity ligation.Proc Natl Acad Sci US A.104(9)：3067-72)。
染色质免疫沉淀偶联基因阵列技术(芯片上的ChIP)。在此办法中，使用针对经翻译后修饰的感兴趣DNA结合蛋白的抗体来免疫沉淀经修饰的蛋白质及其DNA靶物二者。简言之，使用交联将DNA结合蛋白固定至DNA，并且在DNA断裂后，使用免疫沉淀来纯化具有由所使用的抗体决定的特异性的蛋白质-DNA片段。水解以逆转交联后，实施对DNA的扩增和标记，并随后将DNA杂交至微阵列并分析以鉴定受到DNA结合蛋白结合的区域。或者，可以使用基因特异性寡核苷酸通过PCR来检验感兴趣的基因(称作单基因ChIP)。
也可以使用差异甲基化杂交来鉴定甲基化DNA。在此办法中，利用包含所克隆的CpG岛的专用DNA微阵列。在本发明的情况中，将要比较的DNA样品(两份单倍体DNA样品(染色体、染色单体等))都用甲基化敏感性限制酶消化，然后将自每份样品衍生的聚合酶链式反应扩增子杂交至CpG岛阵列。在任一样品中具有更强杂交信号的阵列元件代表差异超甲基化CpG岛，其受到保护免于甲基化敏感性限制酶切割，且因此在样品中通过PCR得到扩增。
外遗传分析的其它进展容许使用减少的DNA量检验外遗传标志，诸如DNA甲基化。为了分析DNA甲基化，使用基于MBD2/MBD3L1复合物对甲基化DNA的高亲和力的甲基化CpG岛回收测定法(MIRA)来纯化甲基化DNA。简言之，将经过超声处理的DNA与含有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-MBD2b的基质一起在存在MBD3L-1(MBD2的结合配偶，其提高MBD2对甲基化DNA的亲和力)的情况中温育。自基质洗脱特异性结合的DNA，并实施基因特异性PCR反应以检测CpG岛甲基化。或者，可以使用微阵列分析来检验所结合的DNA。此技术早就能使用1ng DNA检测甲基化。通过此类“下拉”办法或涉及生物素来提高对下拉基质的亲和力的融合物，也可以利用涉及外遗传的其它蛋白质的GST融合物。定量甲基化分析(诸如MethyLight和Pryosequencing)的进展在偶联亚硫酸氢盐测序时容许检测甚至更小量的甲基化DNA，其中一种办法(即HeavyMethyl)容许检测30pg甲基化DNA。
此外，自上而下蛋白质组学(分析完整蛋白质，而非首先将它们消化成肽)的最新进展可容许检验指定核小体中不同组蛋白的完整修饰样式。
虽然已经有关于外遗传机制的许多研究，但是现有技术尚未充分领会同时考虑对母本衍生DNA分子或蛋白质及对父本衍生DNA分子或蛋白质的外遗传修饰时的混杂效应。这是因为现有技术的方法使用二倍体材料分析外遗传修饰而发生的。
申请人在此提出，受试者的外遗传状态的确定性表征只能通过在单倍体状态中分开分析对DNA和相关蛋白的外遗传修饰来提供。例如，在外遗传修饰是甲基化的情况中，单倍体材料的使用为杂合现象的认识解析了状态特异性效应，而且甚至为单CpG位点处的变异提供了关于构成(单一功能性)“岛”的多个CpG位点上的定量变异的分析。此确定性表征产生更精确的表型信息，诸如某些疾病的存在和/或个体对某些疾病的素因或个体响应某些治疗性分子的能力。
考虑一个更加特定的例子，DNA甲基化是一项被认为是涉及癌症发病机制的外遗传特征。下表描述了被认为是对甲基化敏感的癌症相关基因。
  基因   图   甲基化的   注释
  14-3-3Sigma   1p   乳腺和胃癌
  ABL1(P1)   9q34.1   50-100％的CML，一些ALL   只在部分bcr-abl易位时甲基化
  ABO   9q34   细胞系
  APC   5q21   结肠、胃和食管癌   只有一个启动子。与表达的相关性未建立。A型
  AR(雄激素受体)   Xq11-12   前列腺癌细胞系，结肠ACF
  BLT1(白三烯B4受体)   多种细胞系
  BRCA1   17q21   10-20％的乳腺癌，一些卵巢   这些细胞中转录沉默的起因
  CALCA(降钙素)   11p15   25-75％的结肠、肺、造血赘生物   最早证明在癌症中超甲基化的启动子-CpG岛之一
  CASP8(胱天蛋白酶8)   2q33-34   成神经细胞瘤   与MycN扩增有关
  窖蛋白1   7q31.1   乳腺癌细胞系
  基因   图   甲基化的   注释
  CD44   11pter-p13   前列腺癌
  CFTR   7q31.2   细胞系   无原发瘤的报告
  COX2   1a25.2-q25.3   结肠、乳腺和前列腺细胞系。15％的原发性结肠癌   完全甲基化时与表达有关
  CSPG2(多能聚糖)   5q12-14   AGING结肠。70％的结肠   分泌型蛋白聚糖，受Rb调控
  CX26(连接蛋白26)   13q11-q12   乳腺癌细胞系
  细胞周期蛋白A1   13q12.3-q13   多种细胞系
  DBCCR1   9q32-33   50％的膀胱癌   在正常膀胱中轻微甲基化
  ECAD(E-钙粘蛋白)   16q22.1   20-70％的乳腺、胃、甲状腺、SCC、白血病和肝ca.   甲基化常常是异质的且并非总是与沉默有关。还存在于一些正常胃和肝样品中
  内皮缩血管肽受体B   13q22   60-70％的前列腺癌
  基因   图   甲基化的   注释
  EPHA3   3p11.2   白血病
  EPO(红细胞生成素)   7q21   HeLa细胞   正常和原发瘤
  ER(雌激素受体)   6q25.1   AGING结肠、肝、心肌、AoSMC(培养的)、脑、AoEC。100％的结肠癌20-30％的ER乳腺癌60-70％的AML/ALL 20-50％的CML-BC 20％的肺(NSCLC)60％的GBM   上游启动子不在CpG岛中。无论如何，与表达丧失有好的相关性。
  FHIT   3p14.2   10-20％的食管SCC
  GPC3(磷脂酰肌醇聚糖3)   Xq26   间皮瘤和卵巢癌细胞系
  GST-pi   11q13   80-100％的前列腺、肝。30-60％的结肠、乳腺、肾。   DNA修复/解毒酶
  H19   11p15.5   20-50％的维尔姆斯瘤   印记的基因。超甲基化与维尔姆斯瘤中IGF2基因的表观印记丢失有关，但与其它无关。
  基因   图   甲基化的   注释
  H-钙粘蛋白(CDH13)   16q24.1-24.2   45％的肺癌，一些卵巢癌
  HIC1   17p13.3   前列腺、乳腺和脑。80-100％的结肠癌、前列腺、乳腺、GBM。20-50％的肺、肾、液体瘤。   候选肿瘤抑制基因。基于发现癌症中超甲基化的CpG岛而克隆的第一种基因
  hMLH1   2p22   10-20％的结肠、子宫内膜和胃癌。0％的肺、乳腺、GBM、液体瘤等。   几乎总是与微卫星不稳定性和细胞系中的错配修复缺陷有关。
  HOXA5IGF2(胰岛素   7p15-p14.211p15.5   乳腺癌AGING结肠100％的结肠癌50％的 IGF2有一个大CpG岛，其含有印记
  样生长因子II)   AML   的P2-4启动子
  IGFBP7   4q12   鼠SV40 T/t抗原诱导的肝癌发生   正常和原发瘤
  IRF7   11   多种细胞系
  LKB1   19p13.3   少数结肠、睾丸和乳腺(髓)原发瘤
  基因   图   甲基化的   注释
  LRP-2(巨蛋白)   2q24-31   多种细胞系
  MDG1(乳腺衍生生长抑制剂)   1p35-33   50-70％的乳腺癌
  MDR1   7q21.1   药物敏感性白血病细胞系。   原发瘤
  MDR3(PGY3)   7q21.1   多种细胞系
  MGMT(O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶)   10q26   25-50％的脑、结肠、肺、乳腺、NHL等。   与MER表型有关
  MT1a(金属硫蛋白1)   16q13   大鼠肝瘤   正常和原发瘤
  MUC2   11p15.5   结肠癌细胞系   原发瘤
  MYOD1   11p15.4   AGING结肠。100％的结肠，30％的乳腺，还有膀胱、肺、液体瘤。
  基因   图   甲基化的   注释
  N33   8p22   AGING结肠。60-80％的结肠、前列腺、脑。   寡糖基转移酶
  NEP(中性内肽酶24.1)/CALLA   3q21-27   前列腺癌(约10％)
  NF-L(轻-神经丝编码基因)   8p21   大鼠神经胶质瘤细胞系
  NIS(碘化钠同向转运物基因)   19p13.2-p12   甲状腺癌细胞系   原发瘤中的异质甲基化
  P14/ARF   9p21   结肠癌细胞系(不常见)   不如P16甲基化频繁，但是通常与P16甲基化有关。
  P15(CDKN2B)   9p21   80％的AML/ALL 2-20％的GBM0％的结肠/肺/乳腺   P15在物理上接近P16，但是这两种基因的同时甲基化是罕见的。
  基因   图   甲基化的   注释
  P16(CDKN2A)   9p21   20-30％的肺(NSCLC)25-35％的结肠5-25％的淋巴瘤(依赖于阶段)0-5％的膀胱。许多其它(食管、胃等)   甲基化像删除一样频繁，而且比突变更频繁。
  P27KIP1   12p13   啮齿类垂体癌细胞系   没有原发瘤的报告
  p57KIP2   11p15.5   胃癌细胞系
  PAX6   11p13   结肠癌细胞系和70％的原发瘤
  PgR(孕酮受体)   11q22   10-20％的乳腺癌   影响转录
  RAR-β2   3p24   结肠、乳腺、肺癌
  RASSF1   3p21.3   肺癌   只有一个启动子
  RB1(成视网膜细胞瘤)   13q14   10-20％的成视网膜细胞瘤0％的肺/白血病/结肠一些垂体腺瘤
  TERT   5p15.33   许多细胞系中的异质甲基化
  TESTIN   7q31.2   造血恶性肿瘤   只有一个启动子
  基因   图   甲基化的   注释
  TGFBRITHBS1(血小   9q33-q3415q15   胃癌细胞系和原发瘤(10％)5-10％的结肠癌30-40％的GBM 血管发生抑制剂，在一些系统中受
  板反应蛋白-1)   20-30％的AML 0％的子宫内膜/乳腺   P53和Rb调控。
  TIMP3   22q12.1-13.2   人脑(10-50％)和肾(20％)癌，小鼠模型
  TLS3(T-丝束蛋白)   X   白血病细胞系
  尿激酶(uPA)VHL   10q243p25-25   乳腺癌细胞系10-20％的肾细胞癌0％的常见实 与突变一样的肿瘤选择性
  (Von-Hippel1Lindau)   体瘤和液体瘤
  WT1   11p13   90％的乳腺癌，20-50％的结肠，5-10％的维尔姆斯   与表达有关
  ZO2(闭锁小带2)   胰腺癌细胞系
自上表可知，现有技术已经领会了甲基化在癌症的发病机制中是重要的，然而，至今只使用了二倍体材料。申请人提出，现有技术的方法容易提供不够精确的信息。例如，在分析指定启动子在肿瘤制品中的谱型后，可记录到中等程度的甲基化。在实项中，测量得出的甲基化程度是母本衍生的启动子序列和父本衍生的启动子序列的甲基化的平均值，因为所述肿瘤当然是二倍体。虽然此平均结果在有些情况中可以是真的(因为母本和父本衍生的启动子都被相同程度地甲基化)，但是这不会普遍是真的。例如，母本启动子序列可以是完全未甲基化的，而父本序列可以是重度甲基化的。若就启动子活性而言，母本衍生的序列相对于父本序列是显性的，则分开分析母本和父本序列的重要性就变得显而易见了。
自上文会理解，关于细胞的单倍体状态来分析外遗传修饰的存在或缺失。如此，对于所考虑指定DNA位点处的甲基化的存在或缺失可以确定母本衍生的外遗传特征与对应的父本衍生的外遗传特征是否是实质性分开的。这样，可以在父本衍生的外遗传特征缺失的情况中确定母本衍生的外遗传特征的影响，反之亦然。申请人提出，通过在分析二倍体材料的情况中消除所提供的潜在不精确的(或至少不够确定性的)结果，得到更精确的甲基化图。
技术人员会领会，本发明不同于基因组印记的天然过程(由此，一些基因的表达水平取决于它们是否是自母本或父本基因组继承的)。例如，胰岛素样生长因子-2(IGF2)是一种其表达是正常胎儿发育和生长所需要的基因。IGF2的表达唯一地源自该基因的父本拷贝。所印记的基因以它们的甲基化状态来“标记”。在IGF2的情况中，父本基因座中的一种称作绝缘子元件的元件被甲基化，阻断其功能。未甲基化绝缘子的功能是结合在结合后阻断IGF2表达激活的蛋白质。在甲基化后，该蛋白质不能结合绝缘子，如此容许远端增强子元件驱动IGF2基因表达。在母本基因组中，绝缘子是未甲基化的，如此蛋白质结合它并阻断远端增强子元件的作用。相反，本发明关注通过提供关于甲基化的状态特异性信息来提供母本DNA、父本DNA或二者的确定性单倍体甲基化指派。
“确定性的”意味着在将某种外遗传修饰样式指派给某种表型时不涉及可能性或概率的评估或推断或确定。现有技术中记载的分析外遗传修饰的方法因父本修饰与母本修饰的组合存在而混乱。如此，虽然可以使用某些算法来推导或推断给定甲基化样式与表型之间的可能指派，例如在分析非单倍体材料的情况中，这些指派必然会有缺陷。有人提出，在将甲基化样式指派给表型时常常记录到的所述混乱至少部分源自二倍体材料的混乱影响。
依照本方法，自受试者的生物学样品获得DNA和/或相关蛋白。所述生物学样品可以是含有DNA和/或相关蛋白的任何材料，包括但不限于全血、血清、血细胞、皮肤细胞、唾液、尿液、毛发、趾甲/指甲、泪液、趾甲/指甲、诸如此类。
在所述分析步骤包括自母本衍生DNA实质性分离父本衍生DNA的情况中，技术人员可使用他或她知道的任何合适方法。应当理解，用于实现实质性分离的手段对本发明的范围没有限制作用，但是在所述方法的一种形式中，所述实质性分离父本或母本衍生DNA和/或相关蛋白的步骤是通过物理手段进行的。由物理手段提供的、胜过非物理手段(诸如选择性探查二倍体材料)的优点在于避免了与辨别母本衍生的材料与父本衍生的材料有关的问题。例如，在使用选择性探针的情况中，可能的是，交叉杂交是有问题的，导致不确定的结果。虽然可以改变杂交条件来限制交叉杂交，但是这需要实施进一步的实验。
在本发明的一种形式中，用于提供唯一含有父本衍生DNA或母本衍生DNA的单倍体DNA的物理方法是染色体显微剥离(microdissection)。所述单倍体DNA可以是整个母本或父本染色体、染色单体或染色单体片段。
方便的是，可以在着丝粒远端做一染色体中的切口，用以将p臂与q臂分开，每个都是单倍体DNA分子。技术人员能够鉴定染色体中感兴趣的物理区域并使适宜方法适应自二倍体、三倍体、四倍体、或具有更高水平倍性的任何其它样品分离单倍体DNA。
技术人员熟悉用于显微操作的平台和工具。虽然技术上是严格的，但是显微剥离是例行可实现的。设备要求包括配备有显微操作器和旋转载物台的显微镜(或是立式的或是倒置的)和移液管拔具(用于生成显微针)。推荐用于显微镜的振动分离。虽然不需要专用洁净室，但是显微剥离的染色体片段只含有飞(10-15)克数量的DNA，而且必须控制外来DNA的污染。
在所述方法的一种形式中，可使用用于分离单倍体DNA分子的非接触方法。此办法的一个例子是使用激光微束。激光微束显微剥离可涉及使用与显微镜连接的高束品质的脉冲紫外激光。可以使用例如商品化P.A.L.M.
Figure GPA00001009630600131
RobotMicrobeam(P.A.L.M.GmbH Bernried，Germany)来实施激光束显微剥离。激光优选是不损伤或破坏基因组区段的波长的，诸如337nm，其远离核酸(诸如DNA)的最大吸收。
另一种对于染色体激光显微剥离有用的系统是Leica激光显微剥离显微镜。该系统使用DMLA直立显微镜，包括电动物镜旋座、电动载物台、xyz控制元件和新DMLA显微镜的所有其它优点。所使用的激光是337nm波长的紫外激光。切割期间的移动是由光学进行的，而载物台保持静止。感兴趣区域可以在监视器上标记，并通过PC控制来切割。样品下落入PCR管中，无需额外的力。切割的结果能通过自动化检查模式容易地检查。
对单倍体DNA分子的分离可以通过例如显微剥离来实现，其使用PALM激光进行对染色体区段的激光弹射。在此情况中，非接触过程涉及靶定染色体元件周围的激光消融，接着将限定元件以激光力弹射到管帽(诸如微量离心管帽)上，用于后续分析单臂DNA。
可以使用激光压力弹射来回收所得分离的单倍体DNA分子。激光压力弹射可以如下实现，即在例如一段或多段感兴趣单倍体基因组区段下聚焦激光微束，并作为高光子密度的结果生成力，其形成所需要的单倍体材料并引起所需要的单倍体材料自不需要的基因组区段弹射出来。样品在光子波的顶部上移动并被弹射入收集管中。合适的收集管是本领域技术人员知道的，而且包括诸如常用的聚合酶链式反应(PCR)反应管或微量离心管等管。
可以通过制备性流式细胞术使用能够区分母本与父本DNA的探针来实质性分离父本或母本衍生DNA。另一种方法是通过使用辐射杂种，其中二倍体材料的发育涉及人类染色体，只是每对染色体中的一条。另一种策略是使用由GMP Technologies Inc.开发的“转变技术”。GMP转变技术
Figure GPA00001009630600141
利用将成对染色体分开成单个染色体的过程。在分开后，可以使用鉴定基因序列的遗传探针分别分析各等位基因。此技术可用于基因、染色体、或整个人类基因组。
在所述方法的另一种形式中，将污染物遗传材料灭活或消融，使得它不再实施该污染物遗传材料的功能。例如，在期望分离母本衍生DNA的情况中，可以灭活或消融父本贡献。这可以通过破坏同源染色体来实现，其例如使用小心指导的激光束来进行。
用于选择性分析父本或母本衍生DNA分子的另一种方法是使用PCR选择性扩增单倍体序列，使得单倍体DNA的拷贝数相对于污染物DNA的拷贝数大大过量。然后可以用核酸酶部分消化DNA分子混合物，使得基本上所有污染物DNA被消化掉，剩下低水平的单倍体DNA。
还存在如下的可能，即通过长PCR使用掺有标签的引物选择性扩增单倍体DNA，并使用该标签分离出所述拷贝。
一旦实质性分离父本或母本衍生DNA，那么进行分析来测定外遗传修饰的存在或缺失。
在外遗传修饰是DNA甲基化的情况中，可以通过对胞嘧啶嘧啶环第5位碳分析甲基的存在或缺失来检测甲基化。
所述方法可以使用任何合适的方法来执行，然而，典型的是，所述对一个或多个位点分析甲基化的存在或缺失的步骤包含选自下组的方法：使用亚硫酸氢盐处理进行的DNA测序、限制性界标基因组扫描、甲基化敏感性任意引发PCR、使用甲基化敏感性限制酶进行的Southern分析、甲基化特异性PCR、自亚硫酸氢盐转变DNA扩增的PCR产物的限制酶消化、及其组合。
亚硫酸氢盐测序涉及使单链DNA与亚硫酸氢钠反应，后者将胞嘧啶选择性脱氨基成尿嘧啶，但是不与甲基胞嘧啶反应。通过PCR扩增在亚硫酸氢盐反应中生成的经修饰DNA序列，然后将扩增得到的DNA连接入质粒载体，用于克隆和测序。对DNA测序时，只有完整的甲基化胞嘧啶残基作为胞嘧啶被扩增。
亚硫酸氢盐测序可使用自少于100个细胞分离的DNA来实施，这是此工具的重大优势之一，因为肿瘤标本通常很小。亚硫酸氢盐测序的其它好处包括它分析长段基因组以测定非常清楚的DNA中甲基化样式的能力，而且它产生5-甲基胞嘧啶残基的定量正显示(quantitative positive display)。
MSP是一种非常快速且灵敏的甲基化筛选技术。MSP使用亚硫酸氢钠来实施，其修饰DNA并将未甲基化的胞嘧啶转变成尿嘧啶。用对甲基化较之非甲基化DNA特异性的引物实施后续扩增，并用简单凝胶电泳实施分析。MethyLight是MSP测定法的下一代。样品的准备和测定法的前提是相同的。MethyLight办法是一项进步：在维持由标准MSP提供的敏锐灵敏度的同时，通过引入实时“TaqMan”PCR形式，该测定法变得更加定量，而且劳动密度降低。
影响甲基化特异性PCR特异性的最关键参数是由引物设计决定的。在实践中，常常优选只处理一条链，最常见的是有义链。在所述方法的一种形式中，引物设计成扩增长度为20-30bp的一个区域，而且应当在原始序列中掺入足够的胞嘧啶以确保未修饰的DNA不会充当引物的模板。另外，CpG二核苷酸内的胞嘧啶的位置和数目决定引物对甲基化的或未甲基化的模板的特异性。典型的是，在每种引物中包括1-3个CpG位点，而且集中在每种引物的3′区中。这提供了最佳特异性并将错误引发所致假阳性降至最低。为了便于在同一热循环仪中同时分析指定基因的U和M反应，我们调整了引物的长度以给出几乎相等的解链/退火温度。这通常导致U产物比M产物大少数碱基对，这提供了在电泳后识别每条泳道的便利方式。
由于甲基化特异性PCR利用特异性引物识别来区分甲基化的与未甲基化的位点，优选的是，为扩增维持严格条件。这意味着退火温度应当接近容许退火和后续扩增的最大温度。在实践中，通常用比计算解链温度低5-8度的初始退火温度测试新引物。非特异性可以通过在退火温度中的轻微升高来矫正，而缺或弱PCR产物可以通过温度下降1-3摄氏度来改进。对于所有PCR方案，应当小心确保模板DNA和试剂不受外源DNA或PCR产物的污染。
MSP利用亚硫酸氢钠处理后发生的甲基化等位基因与未甲基化等位基因之间的序列差异。CpG中CpG位点的频率促成此序列差异。为指定基因座设计引物，其在经亚硫酸氢盐修饰的DNA中将甲基化的DNA自未甲基化的DNA区分出来。由于区别是PCR扩增的一部分，因此能在维持特异性的同时实现格外的灵敏度，通常是检测0.1％的等位基因。在PCR扩增和凝胶电泳后立即得到结果，无需进一步限制性或测序分析。MSP还容许分析很小的样品，包括石蜡包埋的和显微剥离的样品。
在所述方法的一个实施方案中，所述对一个或多个位点分析甲基化的存在或缺失的步骤包括：(a)使单倍体DNA样品与亚硫酸氢钠反应以将未甲基化的胞嘧啶残基转变成尿嘧啶残基，同时保留任何5-甲基胞嘧啶残基不变以创建暴露的亚硫酸氢盐转变DNA样品，其具有供对亚硫酸氢盐转变DNA样品特异性的引物结合的位点；(b)使用上链或下链特异性引物实施PCR扩增规程；(c)分离PCR扩增产物；(d)使用Ms-SNuPE引物、dNTP和Taq聚合酶实施引物延伸反应，其中所述Ms-SNuPE引物包含与所述亚硫酸氢盐转变DNA样品互补的约15聚物至约22聚物长度引物序列且刚好在要测定的一个或多个CpG二核苷酸序列的胞嘧啶残基的5′终止；并(f)通过测定第一引物延伸碱基的身份来确定所述一个或多个CpG二核苷酸序列的甲基化状态。
可通过使用高通量方法鉴定潜在甲基化位点来促进甲基化分析。筛选可用的技术包括限制性界标基因组扫描(RLGS)；基因表达阵列，其可用作替代来看哪些基因在暴露于DNA甲基转移酶抑制剂(像氮杂胞苷，也称作阿扎胞苷)后表达。
高度平行基因组范围测定法是本领域已知的，许多此类测定法披露于Fan et al，Nat Rev Genet 2006，7(8)632-44，将其内容完整收入本文。许多此类方法作为约定劳务是技术人员可得的，例子有Golden Gate甲基化解决方案，诸如由Illumina Inc(San Diego，CA)提供的。Illumina系统能够以单位点分辨率在96份样品间在数以百计的基因上分析多至1,536个CpG位点。此系统因此能每次测定提供多至147,456项定量DNA甲基化测量。
还能获得人CpG岛文库，然后排列。数据库构建以粗制层析图开始。消除复制品后，将所有6,800个元件针对加利福尼亚大学(Santa Cruz)高通量基因组和nr DNA序列数据库进行基本局部比对搜索工具(BLAST)分析，并测序。在CpG岛文库中，给每个克隆指派识别号，并列出其特征，包括诸如其染色体位置、它是启动子或是在5′侧翼区中找到的、它的GC含量、和该克隆中存在什么限制性位点等信息。后一项信息对于确定限制酶分析的效用和实际序列是有用的。
CGI微阵列技术在本方法的背景中也是有用的。此技术容许在单一芯片上同时评估数以千计的潜在DNA甲基化靶物。它包括在玻璃载玻片上排列CpG岛克隆，制备靶物样品扩增子，并将扩增子杂交到CGI微阵列上。例如，可使用肿瘤衍生基因组DNA样品实施该技术，所述样品是使用能够刚好在CpG岛外切割的限制酶(Mse1)获得的。接着，将携带PCR引物序列的捕捉接头添加至Mse1片段。将样品分拆成参照部分(其充当分母(denominator)来确定基因组扩增运行如何)和测试部分(其用McrBC(一种甲基化敏感的限制酶，只在DNA是甲基化的情况中消化该区域)消化)。通过PCR扩增这两部分，然后用Cy5红色(测试)或Cy3绿色(参照)荧光染料直接标记DNA。测试样品中未被McrBC消化的DNA片段生成Cy5标记的PCR产物，而如果有被McrBC消化的甲基化片段，那么不生成带标记物的PCR产物。将带标记物的测试和参照PCR产物混和并点样到玻璃载玻片上。扫描杂交后的载玻片，并分析所获得的图像以鉴定甲基化信号。
正如技术人员会领会的，本发明会在生物学(特别是医学)领域中具有许多用途。如上所述，癌症被认为是一种外遗传。事实上，外遗传变化(特别是DNA甲基化)易于变化，而且是解释某些环境因素如何提高癌症风险的卓越候选者。甲基化和染色质的精致组织调控基因表达样式的正常细胞稳态，其在癌细胞中变得无法识别。转化细胞的基因组可同时经历整体基因组低甲基化和与基因调控区有关的CpG岛稠密超甲基化。这些显著变化可导致染色体不稳定性、内源寄生序列激活、印记丢失、不正常的表达、非整倍性、和突变，而且可促成肿瘤抑制基因的转录沉默。超甲基化相关失活可影响细胞网络中的许多途径，诸如DNA修复(hMLH1、BRCA1、MGMT、em前导)、细胞周期(p16(INK4a)、p14(ARF)、p15(INK4b))、和凋亡(DAPK、APAF-1)。异常CpG岛甲基化还能用作恶性细胞的生物标志物及其行为的预测物。
在本发明的一种形式中，单倍体DNA是存在于二倍体细胞中的或是自二倍体细胞获得的。该方法可使用体细胞的常染色体。术语“常染色体”指正常体细胞或生殖细胞内的、除性染色体以外的任何染色体。例如，在人类中，染色体1至22是常染色体。申请人提出，避免天然单倍体材料(诸如精子和卵子中所含有的)是有利的，因为外遗传修饰(诸如甲基化)至少被部分消除，而且常常是被完全消除。这是因为，甲基化样式通常在减数分裂期间重设。如此，对精子细胞或卵子细胞的分析不会提供容许确定受试者表型的有用信息。
由于在临床中获得这些性细胞的问题，也要避免天然单倍体材料(诸如精子细胞或卵子细胞)的使用。获得卵子是一种对任何年龄女性的侵入性规程，而自儿科男性收获精子细胞也需要医学干预。
在外遗传单体型分型中避免性细胞具有另一项优点，即认为减数分裂过程期间可发生重组事件，使得原来以顺式连锁的基因座变成以反式连锁。如此，分析配子的外遗传单体型会给出与自二倍体细胞获得的单倍体DNA不同的(即不正确的)单体型信息。
在所述方法的一种形式中，对父本衍生和母本衍生二者DNA和/或相关蛋白分析外遗传修饰。虽然可以通过调查(例如)母本或父本任一DNA的甲基化样式来获得信息，但是通过对来自这两种来源的DNA分子分析甲基化会获得更多的信息。
在本发明的一个实施方案中，对同一DNA分子上的两个或更多个位点分析甲基化。所述方法的这种形式在确定两个甲基化位点是以顺式还是以反式天然存在于细胞中的DNA分子上是有用的。这可以通过只考虑单一染色体(或是母本衍生的或是父本衍生的)上的甲基化位点来实现，例如用以证明两个甲基化位点以顺式存在，因为它们二者都出现在同一染色体上。也可能必须分析母本和父本染色体来证明两个甲基化位点以反式存在。
或者，可以在DNA和/或相关蛋白在物理上没有分离成父本与母本衍生成分的情况中实践所述方法。通过使用原位方法，会有可能选择性探查父本DNA或母本DNA，使得不必在物理上分离这两种分子。这样，二倍体材料可用于提供关于细胞单倍体状态的信息。通过选择性鉴定母本或父本DNA，由此容许将外遗传修饰定位至母本或父本染色体，诸如原位标记引发(PRINS)等方法在这点上会是有用的。所述方法已经与对某些染色体特异性的引物一起成功使用，其中使用分裂中期和分裂间期两种细胞核(Hindkjaer et al，Methods Mol Biol.1994；33：95-107)。
染色体原位鉴定可利用PNA探针。可使用PNA化学来制作小寡聚物。当用染料标记后，这些寡聚物成为卓越的探针，而且提供超过常规核酸的独特优势。PNA探针通常很小(12-20聚物)，而且展示强的信号和很低的背景。PNA探针能在荧光原位杂交(PNA-FISH)的背景中使用，作为强大的技术来探索分裂中期和分裂间期染色体上的染色体结构。PNA-FISH是一种使用小PNA寡聚物探针以序列特异性方式标记染色体的方法，其容许鉴定特定染色体中的隐藏序列。用于PNA-FISH的方法披露于Strauss 2002(″PNA-FISH″inFISH Technology.Rautenstrauss/Liehr编Springer Verlag.Heidelberg)。
会理解，本文所述方法可用于生物学的任何领域，其中必须与基因表达一起考虑甲基化和其它蛋白质修饰的影响。这些用途不限于动物(人类或其它)，而且还可应用于植物。
自本方法获得的表型信息包括疾病、疾患、或病症的存在或缺失；对疾病、疾患、或病症的素因；有或没有能力响应治疗性分子；有或没有能力发起针对外来抗原或自身抗原的免疫应答；变态反应的存在或缺失；对变态反应的素因。
下面会通过参照下列非限制性实施例更完整地描述本发明。
实施例1：单倍体DNA上的甲基化特异性PCR
组织制备
通过标准核型分析方法在PEN膜载玻片上制备自人类受试者获得的外周血细胞的中期涂片。制备标准Giemsa染色剂并用于鉴定制备物中的染色体。
染色规程
步骤  过程                                      时间
1.    磷酸盐缓冲液pH 6.8                        1分钟
2.    含0.025％胰蛋白酶的磷酸盐缓冲液pH 6.8     2分钟
3.    磷酸盐缓冲液pH 6.8                        1分钟
4.    Giemsa染色剂，工作溶液                    15分钟
5.    蒸馏水                                    浸2-3次
甩掉载玻片上过量的水，用Kimwipe弄干背面，并风干。
激光显微剥离
使用PALMTM显微剥离系统(P.A.L.M.Microlaser Technologies GmbH，Germany)。使用P.A.L.M.显微镜在100倍物镜下使用中期涂片(如上制备的)进行激光捕捉。使用标准P.A.L.M.显微镜方案将与它们的姐妹染色体在空间上分开的单个中期染色体(包括单个染色体)弹射入装有6ul 0.1％(v/v)Triton-X-100的200ul UltraFlux Flat Cap PCR管的帽中。通过离心将所弹射的材料转移至管的底部，用于进行甲基化分析。获得了母本衍生和父本衍生二者DNA样品。
DNA提取
使用PicoPure DNA提取试剂盒(Arcturus Inc，CA)遵循试剂盒方案自CapSure Macro LCM帽上的显微剥离的染色体片段提取DNA。
甲基化检测
通过亚硫酸氢钠处理来修饰DNA，将未甲基化的而非甲基化的胞嘧啶转变成尿嘧啶。清除亚硫酸氢盐和化学转变完成后，使用此经修饰DNA作为PCR模板。对于感兴趣的基因，对每份DNA样品实施两个PCR反应，一个是对最初甲基化的DNA特异性的，另一个是对最初未甲基化的DNA特异性的。在6-8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上将PCR产物分开，并通过溴化乙啶染色来显性各条带。适宜分子量的一条带的存在指示初始样品中未甲基化的和/或甲基化的等位基因的存在。
为了制备混合物，将10x PCR缓冲液、NTP和引物融化。确定要分析的样品的数目，包括未甲基化的和甲基化的二者反应的阳性对照及水对照。制备每个PCR反应(甲基化的和未甲基化的)的基本混合物。对于每50μl反应，应使用如下量：
10x PCR缓冲液                5μl
25mM 4种NTP混合物            2.5μl
有义引物(300nμl)            1μl
反义引物(300ng/μl)          1μl
无菌蒸馏水                   28.5μl
将38μl 此PCR混合物分配入为每份样品标记的各个PCR管(0.5ml管或条)中。在分配前将各成分充分混和。
向每个管添加2μl经亚硫酸氢盐修饰的DNA模板。每份样品包括未甲基化的和甲基化的反应，以及阳性对照和无DNA对照。
向每个管添加1-2滴矿物油(约25-50μl)，之后放置在热循环仪中。矿物油完全覆盖反应混合物的表面以防止蒸发。
然后在热循环仪中扩增PCR产物。PCR以5分钟95℃变性启动。初始变性后添加Taq聚合酶：将1.25个单位的Taq聚合酶稀释入10μl无菌蒸馏水中。将此10μl穿过油通过温和吹打混和入40μl中。扩增以如下参数持续35个循环：
30秒95℃(变性)
30秒对引物特异的(变性)
30秒72℃(延伸)
最后步骤：4分钟72℃(延伸)
保存于40℃，直至分析。
如下通过凝胶电泳分析PCR产物。
制备6-8％非变性聚丙烯酰胺凝胶。1x TBE提供更好的缓冲容量和更锐利的条带来解析这些产物。通常通过MSP分析生成的产物的大小在80-200bp范围内，使得丙烯酰胺凝胶对于大小解析是最适的。高百分比水平琼脂糖凝胶可作为备选使用。
一起运行来自每份样品的反应以容许直接比较未甲基化的与甲基化的等位基因。包括阳性和阴性对照。垂直凝胶以10V/cm运行1-2小时。将凝胶在溴化乙啶中染色，并在紫外照射下显现。对指定的DNA区域进行母本衍生DNA与父本衍生DNA的甲基化状态比较。
最后，要理解，可以在不背离本文所述发明的精神的情况中进行各种其它改良和/或改变。
未来可以在澳大利亚或海外提交新的专利申请，其以本申请为基础或要求本申请的优先权。要理解，所附临时权利要求仅仅作为举例而提供，而非意图限制在任何此类未来申请中可能要求保护的范围。可以后来相对于临时权利要求添加或省略特征以便进一步限定或重新限定一项或多项发明。

Claims (15)

1.一种用于获得多倍体受试者的外遗传信息的方法，该方法包括下列步骤：自所述受试者获得生物学样品，所述样品含有(i)至少一种父本衍生DNA分子和/或相关蛋白和/或(ii)至少一种母本衍生DNA分子和/或相关蛋白；对任一种或多种所述父本或母本衍生DNA分子或相关蛋白分析修饰的存在或缺失，其中所述分析步骤确定任两处修饰是以顺式存在于一条染色体上还是以反式存在于两条姐妹染色体间。
2.依照权利要求1的方法，其中所述分析步骤确定所述修饰可归于父本衍生DNA和/或相关蛋白还是母本衍生DNA和/或相关蛋白。
3.依照权利要求1或权利要求2的方法，其中所述修饰的存在或缺失能够在体内调控所述DNA分子的表达。
4.依照权利要求1的方法，其中所述分析步骤包括使用物理方法自母本衍生DNA和/或相关蛋白实质性分离父本衍生DNA和/或相关蛋白。
5.依照权利要求4的方法，其中所述物理方法包括自母本衍生DNA分子和/或相关蛋白激光介导地剥离父本衍生DNA分子和/或相关蛋白。
6.依照权利要求1-5任一项的方法，其中所述分析步骤包括能够与母本衍生DNA和/或相关蛋白相比选择性分析父本衍生DNA和/或相关蛋白的原位方法。
7.依照权利要求1-6任一项的方法，其中所述DNA分子或相关蛋白存在于二倍体细胞中或是自二倍体细胞获得的。
8.依照权利要求1-7任一项的方法，其中在所述分析步骤是对DNA实施的情况中，所述修饰是甲基化。
9.依照权利要求8的方法，其中所述分析包括测定二核苷酸CpG的甲基化。
10.依照权利要求8或权利要求9的方法，其中所述分析包括选自下组的方法：使用亚硫酸氢盐处理进行的DNA测序、限制性界标基因组扫描、甲基化敏感性任意引发PCR、使用甲基化敏感性限制酶进行的Southern分析、甲基化特异性PCR、自亚硫酸氢盐转变DNA扩增的PCR产物的限制酶消化、及其组合。
11.依照权利要求10的方法，其中在所述分析包括使用亚硫酸氢盐处理进行的DNA测序的情况中，所述分析包括：(a)使DNA与亚硫酸氢钠反应以将未甲基化的胞嘧啶残基转变成尿嘧啶残基，同时保留任何5-甲基胞嘧啶残基不变以创建暴露的亚硫酸氢盐转变DNA样品，其具有供对亚硫酸氢盐转变DNA样品特异性的引物结合的位点；(b)使用上链或下链特异性引物实施PCR扩增规程；(c)分离PCR扩增产物；(d)使用Ms-SNuPE引物、dNTP和Taq聚合酶实施引物延伸反应，其中所述Ms-SNuPE引物包含与所述亚硫酸氢盐转变DNA样品互补的约15聚物至约22聚物长度引物序列且刚好在要测定的一个或多个CpG二核苷酸序列的胞嘧啶残基的5′终止；并(f)通过测定第一引物延伸碱基的身份来确定所述一个或多个CpG二核苷酸序列的甲基化状态。
12.依照权利要求11的方法，其中所述dNTP是经过标记的，且测定第一引物延伸碱基的身份是通过经标记dNTP的掺入来测量的。
13.依照权利要求1-7任一项的方法，其中在所述分析是对蛋白质实施的情况中，所述蛋白质是组蛋白且所述修饰是乙酰化。
14.依照权利要求1-13任一项的方法，其中所述外遗传信息能够提供所述受试者的表型信息。
15.依照权利要求14的方法，其中所述表型信息选自下组：疾病、疾患、或病症的存在或缺失；对疾病、疾患、或病症的素因；有或没有能力响应潜在治疗性分子；有或没有能力发起针对外来抗原或自身抗原的免疫应答；变态反应的存在或缺失；对变态反应的素因。
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