CN101773070B - 红景天愈伤组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种红景天愈伤组织培养方法，它包括如下步骤：植物体的选择及无菌处理、愈伤组织诱导培养和大规模培养三个环节，其核心技术是愈伤组织诱导培养，是在基本培养基MS+蔗糖0～50g/L+琼脂0～10g/L+α-萘乙酸0.1～5.0mg/L+6-苄氨基嘌呤0.1～5.0mg/L的基础上，加入非生物诱导子硝普钠SNP和硝酸银AgNO3，其中硝普钠SNP10～80μmol/L+硝酸银AgNO310～80μmol/L。该方法易操作，有效成分含量高，生产成本低，不污染环境，可达到产业化水平。用本发明方法培养技术生产红景天苷，不变性、含量高、成本低、周期短、极具市场竞争力。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种红景天愈伤组织培养方法。
背景技术
高山红景天(Rhodiola sachalinensis A.Bor)又叫库页红景天，为景天科(Crassulaceae)红景天属(Rhodiola L.)多年生草本或亚灌木植物，是一种濒危珍稀药用植物，也是一种很有发展前途的环境适应性药物。我国已有悠久的红景天应用历史。20世纪60年代起，红景天开始得到前苏联科学家的极大重视，现代药理学研究表明，红景天具有抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗辐射等功效，是一种具有良好发展前途的环境适应性药物。目前红景天由于其自然生存环境恶劣，生长缓慢且年产量低，加上红景天需求量的日益增大，使得原本就稀少的野生资源受到了前所未有的威胁。大量无限制的开发利用将使得红景天这一濒稀药用植物物种近于灭绝，红景天产区的生态环境不断恶化。
目前高山红景天的细胞培养主要集中在愈伤组织诱导、基本培养条件筛选和理化因子的考查等方面，还没有非生物诱导子对红景天苷生物合成的调控以及代谢途径关键酶做系统研究。国内外已上市的红景天类保健品及药品均为天然提取的红景天制剂，由于其具有很高的药用价值，深受患者喜爱。然而由于其成分复杂，有效成分含量低，大大影响了该药的临床疗效以及市场的进一步扩大。特别是天然红景天已作为濒临灭绝的植物种受到世界以及我国政府的重点保护，严禁采摘。为此研究红景天的替代产品，特别是如何提高红景天中红景天苷的含量显得十分重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种繁殖速度快，红景天苷含量高的红景天愈伤组织培养方法。
本发明的目的是这样实现的：1、一种红景天愈伤组织培养方法，它包括如下步骤：
a、植物体的选择及无菌处理：
选择6～8月份海拔2500m以上的野生高山红景天新鲜植株，取其幼茎及叶片进行清洗和无菌处理，制得0.3～0.5cm2大小的红景天组织；
b、愈伤组织诱导培养：
将经过无菌处理后的红景天组织在诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，培养时间：8～12天，培养温度：20～22℃，光照时间：6～8小时/天，光照强度：40～50μmo l/m2·s；所述的诱导培养基为：基本培养基MS+蔗糖18～20g/L+琼脂4.5～5g/L+α-萘乙酸2～3mg/L+6-苄氨基嘌呤2～3mg/L+硝普钠SNP20～30μmol/L+硝酸银AgNO330～40μmol/L，pH值为6.0；
c、大规模培养：
选取经过诱导培养产生的紫红色愈伤组织，在大规模培养基中进行大规模培养，培养时间：18～20天，培养温度：22～23℃，光照时间：6～8小时/天，光照强度：40～50μmol/m2·s；所述的大规模培养基为：基本培养基MS+蔗糖15～20g/L+琼脂4～4.5g/L+α-萘乙酸3～4mg/L+6-苄氨基嘌呤3～4mg/L+硝普钠SNP40～45μmol/L+硝酸银AgNO350～55μmol/L，pH值为6.0。
在诱导培养基中加入非生物诱导子是本发明的重点内容，其中所述的非生物诱导子包括硝普钠SNP和硝酸银AgNO3。非生物诱导子硝普钠SNP和硝酸银AgNO3的制备方法是：将硝普钠SNP用二甲基亚砜DMSO溶解，经0.22μm滤膜过滤制得一氧化氮NO的供体；将AgNO3用蒸馏水溶解经0.22μm滤膜过滤制得AgNO3诱导子。
非生物诱导子可以直接加入到诱导培养基中，也可以在愈伤组织诱导培养过程的不同时期添加到培养基中。
植物体的的无菌处理是本发明的技术环节，无菌处理的方法包括如下步骤：
a)将选取的植物体用水清洗泥土，再浸泡于蒸馏水中；
b)将清洗的植物体用70～80％的酒精浸泡10～20秒进行表面灭菌；
c)将经过酒精灭菌的植物体置于0.05～0.2％氯化汞溶液中浸泡3～6分钟，浸泡过程中不断轻轻搅拌使植物体表面充分接触到氯化汞溶液；
d)将经过氯化汞溶液浸泡灭菌的植物体用高温灭菌处理的蒸馏水漂洗3～6遍，将植物体表面粘附的氯化汞溶液漂洗干净，再将植物体用无菌滤纸吸干水分；
e)用无菌剪刀将叶片剪成0.3～0.5cm2大小，无菌条件下，将上述表面灭菌处理的材料，每瓶接种5块接种于诱导培养基中培养。
本发明的优点在于：该方法易操作，有效成分含量高，生产成本低，不污染环境，可以实现批量生产。用本发明方法培养技术生产红景天苷，不变性、含量高、成本低、周期短、极具市场竞争力。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：一种红景天愈伤组织培养方法，它包括如下步骤：
a、植物体的选择及无菌处理：
a)选择7月份海拔2500m以上的野生高山红景天新鲜植株，用水清洗泥土，再浸泡于蒸馏水中，置于超净工作台内待用；b)将清洗的植物体取出放入无菌空瓶，用75％的酒精浸泡15秒进行表面灭菌；c)将经过酒精灭菌的植物体置于0.1％氯化汞溶液中浸泡5分钟，浸泡过程中不断轻轻搅拌使植物体表面充分接触到氯化汞溶液；d)将经过氯化汞溶液浸泡灭菌的植物体用高温灭菌处理的蒸馏水漂洗5遍，将植物体表面粘附的氯化汞溶液漂洗干净，再将植物体用无菌滤纸吸干水分；e)用无菌剪刀将叶片剪成0.3～0.5cm2大小，无菌条件下，将上述表面灭菌处理的材料，每瓶接种5块接种于诱导培养基中培养；
b、愈伤组织诱导培养：
将经过无菌处理后的红景天组织在诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，培养时间：12天，培养温度：22℃，光照时间：6小时/天，光照强度：50μmol/m2·s；所述的诱导培养基为：基本培养基MS+蔗糖18g/L+琼脂5g/L+α-萘乙酸3mg/L+6-苄氨基嘌呤3mg/L+硝普钠SNP 20μmol/L+硝酸银AgNO330μmol/L，pH值为6；
其中，硝普钠SNP和硝酸银AgNO3是非生物诱导子，非生物诱导子的制备方法是：将硝普钠SNP用二甲基亚砜DMSO溶解，经0.22μm滤膜过滤制得一氧化氮NO的供体，将AgNO3用蒸馏水溶解经0.22μm滤膜过滤制得AgNO3诱导子；将制得的两种非生物诱导子直接加入到灭菌后的培养基中；
c、大规模培养：
选取经过诱导培养产生的紫红色愈伤组织，在大规模培养基中进行大规模培养，培养时间：18天，培养温度：22℃，光照时间：6小时/天，光照强度：40μmol/m2·s；所述的大规模培养基为：基本培养基MS+蔗糖15g/L+琼脂4.5g/L+α-萘乙酸3mg/L+6-苄氨基嘌呤4mg/L+硝普钠SNP 40μmol/L+硝酸银AgNO350μmol/L，pH值为6。
实施例2：一种红景天愈伤组织培养方法，它包括如下步骤：
a、植物体的选择及无菌处理：
a)选择8月份海拔2500m以上的野生高山红景天新鲜植株，用水清洗泥土，再浸泡于蒸馏水中，置于超净工作台内待用；b)将清洗的植物体取出放入无菌空瓶，用75％酒精中浸泡15秒进行表面灭菌；c)将经过酒精灭菌的植物体置于0.1％氯化汞溶液中浸泡5分钟，浸泡过程中不断轻轻搅拌使植物体表面充分接触到氯化汞溶液；d)将经过氯化汞溶液浸泡灭菌的植物体用高温灭菌处理的蒸馏水漂洗5遍，将植物体表面粘附的氯化汞溶液漂洗干净，再将植物体用无菌滤纸吸干水分；e)用无菌剪刀将叶片剪成0.3～0.5cm2大小，无菌条件下，将上述表面灭菌处理的材料，每瓶接种5块接种于诱导培养基中培养；
b、愈伤组织诱导培养：
将经过无菌处理后的红景天组织在诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，培养时间：8天，培养温度：20℃，光照时间：8小时/天，光照强度：40μmol/m2·s；所述的诱导培养基为：基本培养基MS+蔗糖20g/L+琼脂4.5g/L+α-萘乙酸2mg/L+6-苄氨基嘌呤2mg/L+硝普钠SNP 30μmol/L+硝酸银AgNO340μmol/L，pH值为6；
其中，硝普钠SNP和硝酸银AgNO3是非生物诱导子，非生物诱导子的制备方法是：将硝普钠SNP用二甲基亚砜DMSO溶解，经0.22μm滤膜过滤制得一氧化氮NO的供体，在第6天加入到培养基中；将AgNO3用蒸馏水溶解经0.22μm滤膜过滤制得AgNO3诱导子，在第7天加入到培养基中；
c、大规模培养：
选取经过诱导培养产生的紫红色愈伤组织，在大规模培养基中进行大规模培养，培养时间：20天，培养温度：23℃，光照时间：8小时/天，光照强度：50μmol/m2·s；所述的大规模培养基为：基本培养基MS+蔗糖20g/L+琼脂4g/L+α-萘乙酸4mg/L+6-苄氨基嘌呤3mg/L+硝普钠SNP 45μmol/L+硝酸银AgNO355μmol/L，pH值为6。
实施例3：对野生红景天、实施例1和实施例2培养得到的愈伤组织进行检测。运用HPLC色谱检测法在色谱柱为Diamonsil ODS C-18烷基硅胶柱、流动相为4.6mm×250mm、甲醇∶水为1∶20～35∶100、紫外检测波长为275nm、柱温为10～40℃、进样量为1～5μl、流速为0.1～2.0ml/分钟的条件下检测红景天苷的含量。检测方法包括如下步骤：
a)红景天苷标准溶液的配制：红景天苷标准品购自辽宁省药检所(编号：110818)。精密称取红景天苷标准品5.0mg于10ml容量瓶中，流动相溶解，配成0.5mg/L的对照品储备液；
b)红景天苷标准曲线的绘制：分别吸取上述储备液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、3.00ml置于5ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，取稀释液各5μl进样。以红景天苷浓度(C)对峰面积(A)做线性回归。回归方程为C＝A×7×10-7+0.004，R2＝0.9993；
c)红景天苷含量检测：干燥至恒重的细胞粉末，过三号筛(50目)后，称取0.1g，用10ml蒸馏水浸提24小时，超声30分钟，4000rpm离心15分钟，移出上清，滤渣再力10ml蒸馏水超声30分钟，4000rpm离心15分钟，移出上清，将两次上清合并，定容至25ml。从中取10ml提取液于60℃下蒸干水分，再用2ml流动相溶解，过0.45μm滤膜后，再用高效液相色谱法(HPLC)进行含量测定。所得供试品分别于0小时、2小时、4小时、7小时进样，读取峰面积，计算RSD。通过代入标准曲线计算样品红景天苷的含量。
表一：不同形态愈伤细胞生长和红景天苷含量比较
由表一可知本方法培育出的红景天不同形态愈伤细胞生长量和红景天苷含量紫红色致密的愈伤组织最好。
表二：野生高山红景天与高山红景天培养物两个实施例样品中红景天苷产量的比较
由表二可知本方法培育出的红景天的红景天苷含量明显高于野生高山红景天。
Claims (3)
1.一种红景天愈伤组织培养方法，它包括如下步骤：
a、植物体的选择及无菌处理：
选择6～8月份海拔2500m以上的野生高山红景天新鲜植株，取其幼茎及叶片进行清洗和无菌处理，制得0.3～0.5cm2大小的红景天组织；
b、愈伤组织诱导培养：
将经过无菌处理后的红景天组织在诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，培养时间：8～12天，培养温度：20～22℃，光照时间：6～8小时/天，光照强度：40～50μmol/m2·s；所述的诱导培养基为：基本培养基MS+蔗糖18～20g/L+琼脂4.5～5g/L+α-萘乙酸2～3mg/L+6-苄氨基嘌呤2～3mg/L+硝普钠SNP20～30μmol/L+硝酸银AgNO3 30～40μmol/L，pH值为6.0；
c、大规模培养：
选取经过诱导培养产生的紫红色愈伤组织，在大规模培养基中进行大规模培养，培养时间：18～20天，培养温度：22～23℃，光照时间：6～8小时/天，光照强度：40～50μmol/m2·s；所述的大规模培养基为：基本培养基MS+蔗糖15～20g/L+琼脂4～4.5g/L+α-萘乙酸3～4mg/L+6-苄氨基嘌呤3～4mg/L+硝普钠SNP40～45μmol/L+硝酸银AgNO350～55μmol/L，pH值为6.0。
2.按照权利要求1所述的红景天愈伤组织培养方法，其特征在于：非生物诱导子硝普钠SNP和硝酸银AgNO3的制备方法是：将硝普钠SNP用二甲基亚砜DMSO溶解，经0.22μm滤膜过滤制得一氧化氮NO的供体；将AgNO3用蒸馏水溶解经0.22μm滤膜过滤制得AgNO3诱导子。
3.按照权利要求1所述的红景天愈伤组织培养方法，其特征在于：植物体的无菌处理方法包括如下步骤：
a)将选取的植物体用水清洗泥土，再浸泡于蒸馏水中；
b)将清洗的植物体用70～80％的酒精浸泡10～20秒进行表面灭菌；
c)将经过酒精灭菌的植物体置于0.05～0.2％氯化汞溶液中浸泡3～6分钟，浸泡过程中不断轻轻搅拌使植物体表面充分接触到氯化汞溶液；
d)将经过氯化汞溶液浸泡灭菌的植物体用高温灭菌处理的蒸馏水漂洗3～6遍，将植物体表面粘附的氯化汞溶液漂洗干净，再将植物体用无菌滤纸吸干水分；
e)用无菌剪刀将叶片剪成0.3～0.5cm2大小，无菌条件下，将上述表面灭菌处理的材料，每瓶接种5块接种于诱导培养基中培养。
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