CN101768215B - 守宫糖肽及制备方法和其医药应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种守宫糖肽及制备方法和其医药应用，所述守宫糖肽，重均分子量大于2,000,000Da；组成糖含有鼠李糖，岩藻糖，甘露糖，葡萄糖，半乳糖，N-乙酰葡糖胺，糖醛酸；其结合型蛋白质含有16种氨基酸，质量百分含量为16.33％；硫酸基质量百分含量为14.7％；本发明在应用守宫多糖的基础上进一步研究，并得到科学验证；守宫糖肽较守宫多糖对恶性肿瘤有更高的疗效，能有效抑制肿瘤细胞的增殖和迁移；可单独用于恶性肿瘤的治疗，也可用于肿瘤手术、放疗、化疗与介入治疗的辅助治疗；以及艾滋病等病毒感染性疾病的防治；同时可作为一种新的免疫调节剂，用于肿瘤与慢性感染等疾病的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种动物中药材中具有很高药用价值的活性成分及制备方法和其医药应用，特别涉及一种守宫糖肽及制备方法和其医药应用。
背景技术
中医是我国的国粹，中药材是中医药理论的物质宝库，中药材分为植物中药材、动物中药材和矿物中药材；传统中医的理论、临床与现代研究均表明动物药材治疗恶性肿瘤是中医的一大特色，如在斑蝥中提取斑蝥素、斑蝥酸盐应用于治疗恶性肿瘤取得一定效果，并且还具有一定的抗病毒的作用。一般来说，多数动物中药对人体都具有一定的毒性，限制了这类药物在治疗时的用药量，使得治疗效果受到较大的影响。如何在保持药用活性的同时降低其对人体的不良影响，是药学家们研究的热点。同时，明确药物的活性成分以及其作用机理是天然药开发的首要任务。在有抗癌作用的动物中药中提取有抗癌作用的活性物质则是我国乃至世界各国的药学家、研发机构的工作重心。
守宫是传统的中药材，为壁虎科动物无蹼壁虎Gekko swinhonis Gūenther或其它几种壁虎[多疣壁虎Gekko japonicus(Duméril &Bibron)；无疣壁虎Gekko subpalmatus Güenther；蹼趾壁虎Gekko chinensis Gray]的全体，是中医传统的咸寒软坚药。中医长期以来使用守宫治疗瘰疬癌肿(《青囊杂篡》、《得配本草》、《四川中药志》)，国内较多医家使用守宫治疗恶性肿瘤也取得了很好的疗效。体外研究发现守宫水溶液可抑制人肝癌细胞的呼吸，并已明确守宫含有与马蜂毒相似的有毒物质及组织胺类物质、脂肪油、多种氨基酸、微量元素和维生素，但上述成分均不足以解释守宫的抗肿瘤作用，我们既往的研究发现守宫多糖具有抗肿瘤、抗病毒与免疫调节的活性成分；参见本申请人在先申请：ZL 200510065309.X，关于《守宫多糖及制备方法和其医药应用》的专利。
多糖或糖肽是一类天然大分子物质，是构成生命的基本物质之一。大量研究表明，多糖或糖肽具有抗病毒、抗肿瘤与免疫调节作用。一般情况下，多糖或糖肽是良好的免疫调节剂。多糖或糖肽可以活化巨噬细胞，促进淋巴细胞有丝分裂，增强NK细胞(自然杀伤细胞)与LAK细胞(淋巴因子活化的杀伤细胞)活性，增强TD细胞(迟发性超敏反应T细胞)功能，诱生白细胞介素(尤其是IL-1、IL-2)、IFN(干扰素)、TNF(肿瘤坏死因子)等细胞因子，活化补体，增强红细胞免疫，调节神经-内分泌-免疫网络。新近的研究表明：含硫酸根的多糖或糖肽能抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，其硫酸根离子不仅提高多糖或糖肽的水溶性，而且增强其抗肿瘤活性。此外，硫酸多糖或糖肽具有抗HIV的作用，因而硫酸多糖或糖肽已成为国内外研究的热点。
肿瘤的恶性增殖、复发与转移是恶性肿瘤治疗失败的主要原因，也是导致肿瘤患者最终死亡的重要原因。IL-8与肿瘤转移有非常密切的关系，IL-8能通过钙离子介导的细胞骨架蛋白actin的重组和分布促进肿瘤细胞迁移。细胞骨架蛋白为细胞的运动和迁移提供基本的结构基础。细胞内主要有三种骨架蛋白：actin微丝、微管和中间丝。肿瘤细胞的迁移主要依赖于atin微丝的重组和分布。钙离子通过调节acin结合蛋白的功能来调控actin微丝的重组和分布。新近的研究表明：降低细胞内钙离子的浓度和有效调节actin微丝的重组和分布常常能抑制肿瘤细胞的迁移。因此，有效调节肿瘤细胞actin的重组和分布以及抑制肿瘤细胞分泌促进侵袭与转移的细胞因子如IL-8具有重要科学意义与广泛应用前景。
因此，提供一种更加有效治疗人体恶性肿瘤及病毒感染性等疾病，增强人体免疫力的守宫糖肽及制备方法和其医药应用，造福于人类，将是该技术领域科研人员急需深入研究开发的新课题之一。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种应用效果非常显著即源自动物中药守宫的守宫糖肽及制备方法和其医药应用。该守宫糖肽对恶性肿瘤有很强的抑制作用，同时由于该守宫糖肽含有硫酸根对HIV等病毒性疾病有明显的抗病毒作用，守宫糖肽也是一具有广泛免疫调节作用的生物治疗剂；本发明的另一发明目的是提供制备该守宫糖肽的方法及守宫糖肽在医药领域的应用。
为实现上述目的本发明所采用的实施方式如下：
守宫糖肽，其特征在于：重均分子量大于2,000,000Da；比旋光度为-60°；碳元素的质量百分含量为23.39％，氢元素的质量百分含量为4.925％，氮元素的质量百分含量为6.51％；其组成的糖部分含有鼠李糖，岩藻糖，甘露糖，葡萄糖，半乳糖，N-乙酰葡糖胺，摩尔比为：鼠李糖∶岩藻糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖∶N-乙酰葡糖胺＝1.334∶3.363∶3.375∶6.983∶10.480∶0.019；单糖的连接方式为：1，3-连接的鼠李糖，T-连接的岩藻糖，1，2，3，6-，1，3，4-连接的甘露糖，T-，1，4-连接的葡萄糖，T-，1，4-连接的的半乳糖和1，4-连接的N-乙酰葡糖胺；糖醛酸的质量百分含量为3.08％；其结合型蛋白质部分含有16种氨基酸，质量百分含量为16.33％；糖肽键的类型含有O-连接；硫酸基的质量百分含量为14.7％。
守宫糖肽的制备方法，其特征在于：将守宫干燥、破碎后用有机溶剂抽提出脂溶性物质，将脱脂后的药渣用按守宫质量的1-10倍热水在30-100℃条件下浸提2-12小时，水提液过滤后分次加入乙醇至15％-80％浓度(V/V)沉淀，将沉淀溶解于水，1000-10000r/min离心取上清，常规sevage法除去杂蛋白，透析，干燥成粉，复溶解于粉末质量30-180倍的含有0.5mol/L氯化钠，10mmol/L半胱氨酸，10mmol/L乙二胺四乙酸的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，pH6.5，加入粉末质量0.5％-4％的木瓜蛋白酶及0.5-2倍的甲苯，50℃-80℃水浴4h-48h后补加粉末质量0.2％-2％的木瓜蛋白酶，继续水浴4h-24h；水解液浓缩后以乙醇沉淀，收集沉淀，依次用无水乙醇，丙酮洗涤，复溶于水，过滤，常规sevage法除去杂蛋白，浓缩，透析，干燥，得守宫糖肽。
将守宫糖肽制成符合药剂学要求的注射剂型。
将守宫糖肽制成符合药剂学要求的口服剂型。
所述的守宫糖肽在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
所述的守宫糖肽在制备治疗肝癌的药物中的应用。
所述的守宫糖肽在制备治疗病毒感染性疾病的药物中的应用。
所述的守宫糖肽在制备治疗HIV感染的药物中的应用。
所述的守宫糖肽在制备免疫调节剂中的应用。
本发明的有益效果是：本发明深入研究发现守宫多糖是与肽牢固结合在一起的，进一步将天然守宫多糖与肽的复合物(简称守宫多糖)用蛋白酶水解，得到一新的守宫糖肽(简称守宫糖肽)，具有比天然守宫多糖更好的生物活性。守宫糖肽抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖作用优于守宫多糖。守宫糖肽高剂量(200μg/ml)、中剂量(100μg/ml)与低剂量组(10μg/ml)均对人肝癌SMMC-7721细胞增殖有明显抑制作用。而守宫多糖仅高剂量(200μg/ml)、中剂量组(100μg/ml)对人肝癌SMMC-7721细胞增殖有明显抑制作用，低剂量组(10μg/ml)对人肝癌SMMC-7721细胞增殖没有抑制作用。可见守宫糖肽在10μg/ml浓度即能抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖，而守宫多糖在100μg/ml浓度抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖。守宫糖肽抑制人肝癌SMMC-7721细胞迁移作用优于守宫多糖。守宫糖肽高剂量和中剂量组均对人肝癌SMMC-7721细胞分泌IL-8有明显抑制作用。而守宫多糖对人肝癌SMMC-7721细胞分泌IL-8没有抑制作用。守宫糖肽能抑制肿瘤细胞分泌IL-8，通过降低细胞内钙离子的浓度来促进actin微丝的重组和调控其重新分布至细胞浆，进而抑制肿瘤细胞迁移。以上结果表明守宫糖肽具有比守宫多糖更好的生物活性。
本发明在应用守宫多糖的基础上进一步研究，并得到科学验证；守宫糖肽较比守宫多糖对恶性肿瘤有更高的疗效，显示了极高的抑癌活性，守宫糖肽含有硫酸根，能有效抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，可单独用于恶性肿瘤的治疗，也可用于恶性肿瘤手术、放疗、化疗与介入治疗的辅助治疗；守宫糖肽含有硫酸根，在艾滋病等病毒感染性疾病的防治上具有极其光明的应用前景；糖肽通常具有良好的免疫调节作用，使用守宫治疗免疫低下也有很好的治疗效果，守宫糖肽可作为一种新的免疫调节剂，用于恶性肿瘤、慢性感染等疾病的治疗；守宫对人体的毒性限制了其临床大剂量应用，故守宫的日用量一般仅1.5～4.5g，守宫糖肽起到了很好的减毒增效作用。
附图说明
图1是守宫多糖的高效液相色谱图。
图2是守宫糖肽的高效液相色谱图。
图3是守宫糖肽的红外光谱图。
图4是标准糖样的糖腈乙酸酯衍生物的气相色谱图；
图中：1鼠李糖，2阿拉伯糖，3岩藻糖，4甘露糖，5葡萄糖，6半乳糖，7肌醇。
图5是守宫糖肽的糖腈乙酸酯衍生物的气相色谱图；
图中：1鼠李糖，2岩藻糖，3甘露糖，4葡萄糖，5半乳糖，6肌醇。
图6是标准糖样的糖醇乙酸酯衍生物的气相色谱图；
图中：1肌醇，2氨基半乳糖，3氨基葡萄糖。
图7是守宫糖肽的糖醇乙酸酯衍生物的气相色谱图；
图中：1肌醇，2氨基葡萄糖。
图8是守宫糖肽的总离子流图。
图9是守宫多糖对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响曲线分析示意图；
图中：1PBS阴性对照组，2守宫多糖高剂量组(200μg/ml)，3守宫多糖中剂量组(100μg/ml)，4守宫多糖低剂量组(10μg/ml)。
图10是守宫糖肽对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响曲线分析示意图；
图中：1PBS阴性对照组，2守宫糖肽高剂量组(200μg/ml)，3守宫糖肽中剂量组(100μg/ml)，4守宫糖肽低剂量组(10μg/ml)。
图11是守宫糖肽对人肝癌SMMC-7721细胞骨架蛋白actin的影响激光共聚焦图片；
1PBS阴性对照组，2守宫糖肽(200μg/ml)，3守宫糖肽(100μg/ml)，4守宫糖肽(10μg/ml)。
具体实施方式
以下结合附图和较佳实施例，对依据本发明提供的具体实施方式详述如下：
实施例1
守宫糖肽，其特征在于：重均分子量大于2,000,000Da；比旋光度为-60°；碳元素的质量百分含量为23.39％，氢元素的质量百分含量为4.925％，氮元素的质量百分含量为6.51％；其组成的糖部分含有鼠李糖，岩藻糖，甘露糖，葡萄糖，半乳糖，N-乙酰葡糖胺，摩尔比为：鼠李糖∶岩藻糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖∶N-乙酰葡糖胺＝1.334∶3.363∶3.375∶6.983∶10.480∶0.019；单糖的连接方式为：1，3-连接的鼠李糖，T-连接的岩藻糖，1，2，3，6-，1，3，4-连接的甘露糖，T-，1，4-连接的葡萄糖，T-，1，4-连接的的半乳糖和1，4-连接的N-乙酰葡糖胺；糖醛酸的质量百分含量为3.08％；其结合型蛋白质部分含有16种氨基酸，质量百分含量为16.33％；糖肽键的类型含有O-连接；硫酸基的质量百分含量为14.7％。
守宫糖肽的制备：取守宫全体1000g，切成0.3cm长的碎块，分别用4000ml，2000ml的甲醇浸泡3h，过滤，药渣于室温下置通风处晾干，然后用10000ml，8000ml，6000ml的热水100℃提取三次，提取时间分别为6h，4h，3h。合并提取液，过滤，浓缩至800ml，加入终浓度80％(V/V)的乙醇沉淀，离心(2000r/min，20min)，收集沉淀，将沉淀复溶于水，离心(2000r/min，20min)，取上清，常规sevage法除去游离蛋白10次，浓缩，透析，干燥。取干燥粉末24g溶解于3000ml含有0.5mol/L氯化钠，10mmol/L半胱氨酸，10mmol/L乙二胺四乙酸的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH6.5)，加入240mg木瓜蛋白酶及30ml甲苯，65℃水浴12h，后补加120mg的木瓜蛋白酶，继续65℃水浴12h。将酶解液过滤，减压浓缩至500ml，80％(V/V)乙醇沉淀，静置1h。收集沉淀，依次用无水乙醇，丙酮洗涤，65-70℃干燥成固体粉末。把粉末复溶于水，过滤，收集滤液，常规sevage法除去杂蛋白6次，减压浓缩，透析，干燥，得守宫糖肽。
实施例2
守宫糖肽的制备：取守宫全体1000g，切成0.2cm长的碎块，分别用6000ml，3000ml的甲醇浸泡2h，过滤，药渣于室温下置通风处晾干，然后用8000ml，6000ml，4000ml的热水100℃提取三次，提取时间分别为6h，4h，3h。合并提取液，过滤，浓缩至800ml，加入终浓度80％(V/V)的乙醇沉淀，离心(3200r/min，10min)，收集沉淀，将沉淀复溶于水，离心(3200r/min，10min)，取上清，常规sevage法除去游离蛋白10次，浓缩，透析，浓缩，干燥。取干燥粉末24g溶解于1200ml含有0.5mol/L氯化钠，10mmol/L半胱氨酸，10mmol/L乙二胺四乙酸的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH6.5)，加入120mg木瓜蛋白酶及10ml甲苯，60℃水浴48h，后补加60mg的木瓜蛋白酶，继续60℃水浴24h。将酶解液过滤，减压浓缩至500ml，80％(V/V)乙醇沉淀，静置12h。收集沉淀，依次用无水乙醇，丙酮洗涤，65-70℃干燥成固体粉末。把粉末复溶于水，过滤，收集滤液，常规sevage法除去杂蛋白6次，减压浓缩，透析，干燥，得守宫糖肽。其它参照实施例1。
实施例3
守宫糖肽的制备：取守宫全体1000g，粉碎为粗末，过1号筛，用3000ml的甲醇浸泡12h，过滤，药渣于室温下置通风处晾干，然后用10000ml的热水60℃提取三次，提取时间为6h。合并提取液，过滤，浓缩至1000ml，加入终浓度70％(V/V)的乙醇沉淀，4℃静置24h，离心(4000r/min，6min)，收集沉淀，将沉淀复溶于水，离心(4000r/min，6min)，取上清，透析，干燥。取干燥粉末24g溶解于4200ml含有0.5mol/L氯化钠，10mmol/L半胱氨酸，10mmol/L乙二胺四乙酸的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH6.5)，加入480mg木瓜蛋白酶及40ml甲苯，70℃水浴8h，后补加240mg的木瓜蛋白酶，继续70℃水浴4h。将酶解液过滤，减压浓缩至500ml，80％(V/V)乙醇沉淀，静置24h。收集沉淀，依次用无水乙醇，丙酮洗涤，真空干燥成固体粉末。把粉末复溶于水，过滤，收集滤液，常规sevage法除去杂蛋白4次，减压浓缩，透析，干燥，得守宫糖肽。其它参照实施例1。
实施例4
守宫糖肽的制备：取守宫全体1000g，切成0.3cm长的碎块，分别用4000ml，2000ml的无水乙醇浸泡4h，过滤，药渣于室温下置通风处晾干，然后用10000ml的热水30℃提取三次，提取时间为12h。合并提取液，过滤，浓缩至800ml，加入终浓度30％(V/V)的乙醇沉淀，4℃静置24h，离心(10000r/min，5min)，收集沉淀，将沉淀复溶于水，离心(10000r/min，5min)，取上清，常规sevage法除游离蛋白4次，浓缩，透析，浓缩，干燥。取干燥粉末24g溶解于3000ml含有0.5mol/L氯化钠，10mmol/L半胱氨酸，10mmol/L乙二胺四乙酸的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH6.5)，加入240mg木瓜蛋白酶及30ml甲苯，60℃水浴12h，后补加120mg的木瓜蛋白酶，继续60℃水浴24h。将酶解液过滤，减压浓缩至500ml，40％(V/V)乙醇沉淀，静置12h。收集沉淀，依次用无水乙醇，丙酮洗涤，冻干成固体粉末。把粉末复溶于水，过滤，收集滤液，常规sevage法除去杂蛋白8次，减压浓缩，透析，干燥，得守宫糖肽。其它参照实施例1。
守宫糖肽结构分析
(一)守宫多糖纯度分析
1、材料与方法：
采用高效液相色谱法(HPLC)检测守宫多糖纯度。液相色谱柱为ShodexKS-805，流动相为双蒸馏水，流速为1ml/min，柱温35℃。配制样品的水溶液，进样。
2、结果：
参见图1，在5.883分钟出现单一对称峰，提示守宫多糖是均一组分。
(二)守宫糖肽纯度分析及相对分子质量测定
1、材料与方法：
采用高效液相色谱法(HPLC)检测守宫糖肽纯度及相对分子质量。采用标准葡聚糖Dextran T系列制作标准曲线，根据守宫糖肽样品在相同色谱条件下的保留时间，用标准曲线计算该样品的相对分子质量。液相色谱柱为ShodexKS-805，流动相为双蒸馏水，流速为1ml/min，柱温为35℃。配制葡萄糖，各个标准T10，T40，T70，T110，T500，2000，蓝色葡聚糖的2％(W/V)溶液，各溶液进样后得到相应的液相图谱，绘制出保留时间与分子量关系的标准曲线，得出回归方程。根据守宫糖肽的保留时间，从回归方程上求得分子量。
2、结果：
2.1纯度：
参见图2，在7.980分钟出现单一对称峰，提示守宫糖肽是均一组分。守宫多糖的出峰时间为5.883分钟(见图1)，提示守宫糖肽较守宫多糖的分子量小，说明守宫糖肽是守宫多糖经过蛋白酶水解得到的新化合物。
2.2分子量：
根据回归方程求得守宫糖肽重均分子量(Mw)大于2,000,000Da。
(三)守宫糖肽比旋光度的测定
1、材料与方法：
取守宫糖肽4mg，溶于2ml双蒸水，用自动旋光仪测量旋光度，用公式[α]＝α/(l×C)计算比旋光度。[a]为比旋光度，a为旋转角，1为池长(dm)、c为浓度(g/ml)。
2、结果如下表：
| 旋转角 | 浓度(g/ml) | 比旋光度 | |
| 守宫糖肽 | -0.03 | 2 | -60° |
(四)守宫糖肽元素分析如下表：
(五)守宫糖肽红外光谱
1、材料与方法：
取1-2mg守宫糖肽，用溴化钾压片后进行红外光谱分析。
2、结果：
参见图3，在3421.4cm-1处出现的宽峰为羟基的O-H的伸缩振动引起，2929.5cm-1处左右出现的比较弱吸收峰，为甲基的C-H伸缩振动引起，1409.8cm-1处出现的吸收峰为甲基的C-H变角振动引起，此3组吸收峰是糖类物质的特征峰。1601.8cm-1处出现的强吸收峰为氨基的N-H变角振动引起，提示含有葡糖胺。1256.7cm-1出现的吸收峰是硫酸基的S＝O的伸缩振动引起的；859.2cm-1处吸收峰是由硫酸基的C-O-S伸缩振动引起，提示含有硫酸基。
(六)守宫糖肽单糖的组成与连接方式
1、单糖的组成及比例
1.1、薄层层析(TLC)
1.1.1、材料与方法：
为检测守宫糖肽的中性糖和氨基糖的组成，样品分别用三氟乙酸和盐酸水解。三氟乙酸的水解条件为：称取守宫糖肽6mg，加入4mol/L三氟乙酸6ml，封管，105℃水解4h；盐酸的水解条件为：称取守宫糖肽10mg，加入6mol/L盐酸10ml，封管，105℃水解8h。然后分别反复加入甲醇45℃减压蒸干，以完全除去三氟乙酸和盐酸。再分别向样品中加入少量的水使样品溶解，取少量在硅胶板上进行薄层层析，采用标准单糖对照以初步确定样品单糖组成。中性糖的标准单糖对照为：阿拉伯糖，葡萄糖，甘露糖，半乳糖，岩藻糖，鼠李糖；氨基糖的标准单糖对照为：葡萄糖醛酸，半乳糖醛酸，N-乙酰葡糖胺，氨基半乳糖，氨基葡萄糖。乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸∶水(12ml∶3ml∶3ml∶2ml)展开，苯胺-邻苯二甲酸显色。根据标准单糖和样品的Rf值(比移值)的比较来确定样品中组成单糖的种类。
1.1.2、结果：
1.1.2.1、守宫糖肽中性糖的组成如下表：
样品经展开显色后，有两个点，其Rf值与葡萄糖和岩藻糖相同，提示样品中含有葡萄糖和岩藻糖。
1.1.2.2、守宫糖肽氨基糖的组成如下表：
样品经展开显色后，有两个点，其中一个点的Rf值与氨基葡萄糖相同，提示样品中含有氨基葡萄糖。另外一个点的Rf值接近葡萄糖醛酸，提示样品中可能含有糖醛酸。
1.2、气相
1.2.1、中性糖的检测
1.2.1.1、材料与方法：
样品：精密称取守宫糖肽8.4mg，加入4mol/L三氟乙酸，封管，105℃水解4h，反复加甲醇于45℃减压浓缩至干。加1mg肌醇，16mg盐酸羟胺，1ml吡啶，90℃加热反应30分钟。取出冷却至室温，加入1ml乙酸酐，90℃继续加热反应30分钟，反复加甲醇于45℃减压浓缩至干，然后将乙酰化后的样品溶于氯仿中，再加入等体积的蒸馏水洗涤氯仿层3次，除尽水层，制备糖腈乙酸酯的衍生物，反应产物用0.2ml氯仿溶解，进样1μl。混标：精密称取鼠李糖，阿拉伯糖，甘露糖，岩藻糖，葡萄糖，半乳糖各1mg，肌醇1mg，加盐酸羟胺14mg，吡啶1ml，同上操作，反应产物用0.2ml氯仿溶解，进样1μl。根据标准单糖和样品的保留时间的比较来确定样品中组成单糖的种类。根据标准单糖和样品的峰面积和进样量来计算样品中组成单糖的摩尔比。
1.2.1.2、结果如下表：
| 单糖 | 保留时间(min) | 摩尔比 |
| 鼠李糖 | 9.748 | 1.334 |
| 岩藻糖 | 10.477 | 3.636 |
| 甘露糖 | 16.844 | 3.375 |
| 葡萄糖 | 17.171 | 6.983 |
| 半乳糖 | 18.085 | 10.480 |
样品含鼠李糖，岩藻糖，甘露糖，葡萄糖，半乳糖。
摩尔比为：鼠李糖，岩藻糖，甘露糖，葡萄糖，半乳糖＝1.334∶3.363∶3.375∶6.983∶10.480，参见图4、图5。
1.2.2、氨基糖的检测
1.2.2.1、材料与方法：
样品：精密称取守宫糖肽8mg，加入6mol/L盐酸，封管，105℃水解8h，反复加入甲醇45℃减压蒸干，以完全除去盐酸。再加入1mg肌醇，四氢硼钠20mg，双蒸水2ml，室温还原3h，再用25％乙酸(V/V)中和过量的四氢硼钠，反复加甲醇于45℃减压浓缩至干，然后置P2O5的干燥器中过夜，次日在80℃加热15min除去水分。加3ml乙酸酐，封管，100℃加热反应1h，反复加入甲苯45℃减压蒸干，除去乙酸酐，然后将乙酰化后的样品溶于氯仿中，再加入等体积的蒸馏水洗涤氯仿层3次，除尽水层，制备糖醇乙酸酯的衍生物，反应产物用0.2ml氯仿溶解，进样1μl。混标：精密称取氨基葡萄糖，氨基半乳糖，肌醇各1mg，四氢硼钠20mg，同上操作，反应产物用0.1ml氯仿溶解，进样1μl。根据标准单糖和样品的保留时间的比较来确定样品中组成单糖的种类。根据标准单糖和样品的峰面积和进样量来计算样品中组成单糖的摩尔比。
1.2.2.2、结果：
样品含氨基葡萄糖。保留时间14.151min，摩尔数为0.019，参见图6、图7。
1.3、糖醛酸含量测定
1.3.1、材料与方法：
0.15％(W/V)间羟联苯，用0.5％(W/V)氢氧化钠配置，在冰箱中避光保存，1月内稳定；
四硼酸钠-硫酸溶液：0.0125mol/L四硼酸钠的硫酸溶液；
半乳糖醛酸标准溶液：60μg/ml；
精密量取标准溶液0，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25ml值试管中，用双蒸水补加至0.25ml，在冰浴中预冷后加入1.5ml的四硼酸钠-硫酸溶液。混匀，在沸腾水浴中加热5min，用冰浴冷却至室温后，加25μl的间羟联苯试剂，混匀，在520nm处测定光吸收。吸取样品溶液(1mg/ml)0.25ml，同前操作，为避免样品中非己糖醛酸成分与四硼酸钠-硫酸溶液反应的干扰，以25μl的0.5％(W/V)氢氧化钠代替间羟联苯试剂，测得的光吸收值从样品吸收值中扣除。根据标准品糖醛酸的含量和其对应的吸光度绘制出标准曲线，得出回归方程。根据守宫糖肽的吸光度，从回归方程上求得糖醛酸的含量。
1.3.2、结果：
根据回归方程求得守宫糖肽的糖醛酸质量百分含量：3.08％。
2、单糖的连接方式——甲基化
2.1、材料与方法：
2.1.1、甲基化反应：
称取守宫糖肽8mg，加入2ml二甲基亚砜溶解。加入干燥的氢氧化钠20mg，超声10min，室温下静置90min。在冰浴下逐滴加入碘甲烷1ml，直至反应物成为亮黄色溶液。然后恢复至室温，继续超声10min，减压蒸馏除尽过量的碘甲烷，用氯仿3ml溶解，转移至分液漏斗中，然后加入等体积的水，洗涤3次，去除水层。反复甲基化7次，经IR分析，在3500cm-1左右强而宽的羟基吸收峰基本消失，而2900cm处的甲基峰显著增强时，提示多糖上的羟基已经被甲基化。
2.1.2、甲基化的多糖解聚，水解，制备糖醇乙酸酯的衍生物。
将甲基化的样品加入90％甲酸(V/V)4ml，封管，100℃水解6h，向反应瓶中加入2～3ml甲醇，45℃下减压浓缩蒸干，重复以上操作以除尽过量甲酸。再加入4mol/L三氟乙酸4ml溶解，密封，105℃水解4h，向反应瓶中加入2～3ml甲醇，45℃下减压浓缩蒸干，重复以上操作以除尽过量三氟乙酸。水解后样品加入四氢硼钠20mg，双蒸水2ml，室温还原3h，25％乙酸中和，向反应瓶中加入2～3ml甲醇，45℃下减压浓缩蒸干，重复以上操作以除尽过量乙酸。剩余物在80℃加热15min除去水分。加3ml乙酸酐，100℃加热反应1h，向反应液中加入2ml甲苯，振荡后45℃下减压蒸去未反应的醋酐，如此重复多次以除尽醋酐。然后将乙酰化后的样品溶于氯仿中，再加入等体积的蒸馏水洗涤氯仿层3次，除尽水层，制备糖醇乙酸酯的衍生物，反应产物用0.1ml氯仿溶解，进行气质联用分析(GC-MS)。
2.2、结果：
2.2.1总离子流图，参见图8。
2.2.2、甲基化分析如下表：
| 甲基化的糖(糖醇乙酸酯) | 连接类型 |
| 2，4-甲基化的鼠李糖 | 1，3-连接的鼠李糖 |
| 2，3，4-甲基化的岩藻糖 | T-连接的岩藻糖 |
| 4-甲基化的甘露糖 | 1，2，3，6-连接的甘露糖 |
| 2，6-甲基化的甘露糖 | 1，3，4-连接的甘露糖 |
| 2，3，4，6-甲基化的葡萄糖 | T-连接的葡萄糖 |
| 2，3，6-甲基化的葡萄糖 | 1，4-连接的葡萄糖 |
| 2，3，4，6-甲基化的半乳糖 | T-连接的半乳糖 |
| 2，3，6-甲基化的半乳糖 | 1，4-连接的的半乳糖 |
| 3，6-甲基化的N-乙酰葡糖胺 | 1，4-连接的N-乙酰葡糖胺 |
当样品用6mol/L盐酸水解时，N-乙酰葡糖胺的N-乙酰基被破坏。因此在薄层层析和气相实验中，样品被检测出含有氨基葡萄糖。而在甲基化反应中，样品未用盐酸水解，故样品被检测出含有N-乙酰葡糖胺。
(七)蛋白质组成和含量分析
1、材料与方法：
取适量守宫糖肽，加盐酸，封管，110℃水解24h，浓缩，调节pH值为6.2-6.3，经氨基酸自动分析仪测定氨基酸组成和含量。
2、结果：
| 氨基酸名称 | 守宫糖肽(μg/mg) |
| 天冬氨酸 | 29.9 |
| 苏氨酸 | 7.12 |
| 丝氨酸 | 8.58 |
| 谷氨酸 | 32.68 |
| 甘氨酸 | 27.26 |
| 丙氨酸 | 8.56 |
| 缬氨酸 | 2.58 |
| 蛋氨酸 | 0.9 |
| 异亮氨酸 | 4.94 |
| 亮氨酸 | 4.86 |
| 酪氨酸 | 1.48 |
| 苯丙氨酸 | 0.9 |
| 赖氨酸 | 13.74 |
| 组氨酸 | 3.96 |
| 精氨酸 | 11.2 |
| 脯氨酸 | 4.62 |
| 总量 | 163.28 |
表中：表明守宫糖肽含有16种氨基酸，氨基酸的质量百分含量为16.33％。
(八)糖肽键的类型——β消去反应
1、材料与方法：
称取守宫糖肽4mg，溶解于2ml 0.3mol/L的氢氧化钠-1mol/L四氢硼钠中，加一滴甲苯，45℃水解24h，加入25％乙酸(V/V)中和稀碱溶液以终止反应，取0.5ml检测氨基酸的组成与含量，配制相同浓度的样品水溶液作为空白对照。
2、结果：
守宫糖肽经β消去反应前后氨基酸组成及含量比较(μg/mg)
| 氨基酸名称 | 守宫糖肽(不加氢氧化钠) | 守宫糖肽(加氢氧化钠) |
| 天冬氨酸 | 29.9 | 27.62 |
| 苏氨酸 | 7.12 | 3.64 |
| 丝氨酸 | 8.58 | 6.32 |
| 谷氨酸 | 32.68 | 29.46 |
| 甘氨酸 | 27.26 | 25.98 |
| 丙氨酸 | 8.56 | 6.88 |
| 缬氨酸 | 2.58 | 2.16 |
| 蛋氨酸 | 0.9 | 0.88 |
| 异亮氨酸 | 4.94 | 4.22 |
| 亮氨酸 | 4.86 | 4.02 |
| 酪氨酸 | 1.48 | 1.14 |
| 苯丙氨酸 | 0.9 | 0.6 |
| 氨基丁酸 | 0 | 1.16 |
| 赖氨酸 | 13.74 | 13.24 |
| 组氨酸 | 3.96 | 3.62 |
| 精氨酸 | 11.2 | 8.38 |
| 脯氨酸 | 4.62 | 5.98 |
守宫糖肽经β消去反应后，每毫克守宫糖肽中，苏氨酸的含量由7.12mg下降为3.64mg，氨基丁酸的含量由0mg上升为1.16mg。提示守宫糖肽键的类型含有O-连接。
(九)硫酸基的测定
1、材料与方法：
明胶：2g明胶在60-70℃溶解于400ml水中，4℃保存；
氯化钡明胶试剂：0.5g氯化钡溶解于100ml明胶溶液中，4℃保存；
三氯乙酸：8％水溶液(W/V)；
硫酸盐的标准品：400μg/ml；
所有器具用HNO3洗后，再用去离子水冲洗。
精密吸取标准品0，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4ml，用水补足至0.4ml，分别加入0.35ml三氯乙酸，0.25ml氯化钡明胶试剂，混匀，静置15min，在360nm处测定浊度。精密称取守宫糖肽2mg，6mol/L盐酸水解6h，反复加入甲醇45℃减压蒸干，残渣各用1ml水溶解，守宫糖肽吸取0.4ml×2份。取1份加入0.35ml三氯乙酸，0.25ml氯化钡明胶试剂；另1份加入0.35ml三氯乙酸，0.25ml明胶试剂，混匀，静置15min，在360nm处测定浊度。有氯化钡存在时的吸光度减去无氯化钡存在时的吸光度，用这项对照消除水解液中含有的紫外吸收物质的影响。根据标准品硫酸基的含量和其对应的吸光度绘制出标准曲线，得出回归方程。根据守宫糖肽的吸光度，从回归方程上求得硫酸基的含量。
2、结果：
根据回归方程求得守宫糖肽的硫酸基质量百分含量：14.7％
守宫糖肽与守宫多糖对比活性分析
1、守宫多糖与守宫糖肽对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响
我们原有的研究观察了守宫多糖对人肝癌BEL-7402细胞增殖的影响，发现守宫多糖可抑制人肝癌BEL-7402细胞的增殖。本研究同时观察守宫多糖与守宫糖肽对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响。
1.1、守宫多糖对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响
1.1.1、材料与方法：
SMMC-7721细胞购自中国协和医科大学基础医学院细胞中心；DMEM高糖培养基，美国GIBCO公司产品；守宫多糖用PBS缓冲液溶解，超滤除杂，配制成2mg/ml的储备液。
SMMC-7721细胞在5％CO2孵箱中培养，培养基为含10％灭活胎牛血清的DMEM高糖，含1％双抗(青霉素和链霉素)。每3～4天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。12孔板每孔接种0.5×104/ml个细胞(2ml培养体系)，共接种84孔。接种后24小时加药培养，分设守宫多糖高(200μg/ml)、中(100μg/ml)、低剂量组(10μg/ml)与PBS阴性对照组。分别于加药后30分钟、1～6天每组分别收集3孔细胞，台盼蓝染色，计数活细胞和死细胞，作生长曲线，计算细胞存活率。以下式计算细胞存活率：细胞存活率(％)＝(活细胞/活细胞+死细胞)×100％。统计方法采用双因素方差分析，全部统计由统计软件包SPSS(version：16.0，Chicago，USA)完成。
1.1.2、结果：
守宫多糖高剂量、中剂量组对人肝癌SMMC-7721细胞增殖有明显抑制作用，但低剂量组对人肝癌SMMC-7721细胞增殖没有抑制作用，参见图9。
1.2、守宫糖肽对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响
1.2.1、材料与方法：
SMMC-7721细胞购自中国协和医科大学基础医学院细胞中心；DMEM高糖培养基，美国GIBCO公司产品；守宫糖肽用PBS缓冲液溶解，超滤除杂，配制成2mg/ml的储备液。
SMMC-7721细胞在5％CO2孵箱中培养，培养基为含10％灭活胎牛血清的DMEM高糖，含1％双抗(青霉素和链霉素)。每3～4天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。12孔板每孔接种0.5×104/ml个细胞(2ml培养体系)，共接种84孔。接种后24小时加药培养，分设守宫糖肽高(200μg/ml)、中(100μg/ml)、低剂量组(10μg/ml)与PBS阴性对照组。分别于加药后30分钟、1～6天每组分别收集3孔细胞，台盼蓝染色，计数活细胞和死细胞，作生长曲线，计算细胞存活率。以下式计算细胞存活率：细胞存活率(％)＝(活细胞/活细胞+死细胞)×100％。统计方法采用双因素方差分析，全部统计由统计软件包SPSS(version：16.0，Chicago，USA)完成。
1.2.1、结果：
守宫糖肽高剂量、中剂量与低剂量组均对人肝癌SMMC-7721细胞增殖有明显抑制作用。以上结果表明守宫糖肽对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的抑制作用优于守宫多糖，参见图10。
2、守宫糖肽对人肝癌SMMC-7721细胞迁移的影响
2.1、材料与方法：
取对数生长期的SMMC-7721细胞，细胞接种的密度为0.5×104/ml，接种后24小时加药培养，分设守宫糖肽高(200μg/ml)、中(100μg/ml)、低剂量组(10μg/ml)与PBS阴性对照组。于加药后96h换液(含守宫糖肽的无血清的DMEM)，24h后收集各组细胞，重悬于无血清的DMEM。每组取1×105个细胞接种于24孔板transwell的上室，下室加入含10％胎牛血清的DMEM和CXCL12(100ng/ml)，每组平行设三孔，继续于37℃孵育48h，用棉签擦去transwell小室膜内侧的细胞，穿越至膜外侧的细胞用4％的多聚甲醛固定，结晶紫染色，计数。统计方法采用单因素方差分析，全部统计由统计软件包SPSS(version：16.0，Chicago，USA)完成。
2.2、结果：
守宫糖肽对人肝癌SMMC-7721细胞迁移的影响
P＜0.001
●与PBS阴性对照组比较，P＜0.001
□与中剂量组比较，P＝0.001
■与低剂量组比较，P＜0.001
○与PBS阴性对照组比较，P＜0.001
▲与低剂量组比较，P＝0.01
与PBS阴性对照组比较，P＝0.001
守宫糖肽高剂量、中剂量组与低剂量组均能显著抑制人肝癌SMMC-7721细胞的迁移。
3、守宫多糖与守宫糖肽对人肝癌SMMC-7721细胞分泌白细胞介素8(IL-8)的影响
3.1、守宫多糖对人肝癌SMMC-7721细胞分泌白细胞介素8(IL-8)的影响
3.1.1、材料与方法：
取对数生长期细胞用于实验。12孔板每孔接种0.5×104/ml个细胞(2ml培养体系)，接种后24小时加药培养，分设守宫多糖高(200μg/ml)、中(100μg/ml)、低剂量组(10μg/ml)与PBS阴性对照组。于加药后120h收集各组细胞上清，离心，取上清。用双抗体夹心法检测IL-8的表达。IL-8的标准品的浓度梯度设置为500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.25pg/ml，15.625pg/ml，7.8pg/ml，0pg/ml，每个剂量组平行设2孔。样品每个剂量组平行设3孔。根据标准品的各个浓度与其对应的吸光度(OD值)拟合曲线方程，再将样品的OD值代入方程计算其浓度。统计方法采用单因素方差分析，全部统计由统计软件包SPSS(version：16.0，Chicago，USA)完成。
3.1.2、结果：
守宫多糖对人肝癌SMMC-7721细胞分泌IL-8的影响
| 分组 | 均数±标准差 |
| PBS阴性对照组 | 249.337±13.052 |
| 高剂量组(200μg/ml) | 224.577±15.275 |
| 中剂量组(100μg/ml) | 229.420±5.082 |
| 低剂量组(10μg/ml) | 249.940±17.811 |
P＝0.108
表明守宫多糖对人肝癌SMMC-7721细胞分泌IL-8没有抑制作用。
3.2、守宫糖肽对人肝癌SMMC-7721细胞分泌白细胞介素8(IL-8)的影响
3.2.1、材料与方法：
取对数生长期细胞用于实验。12孔板每孔接种0.5×104/ml个细胞(2ml培养体系)，接种后24小时加药培养，分设守宫糖肽高(200μg/ml)、中(100μg/ml)、低剂量组(10μg/ml)与PBS阴性对照组。于加药后120h收集各组细胞上清，离心，取上清。用双抗体夹心法检测IL-8的表达。IL-8的标准品的浓度梯度设置为500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.25pg/ml，15.625pg/ml，7.8pg/ml，0pg/ml，每个剂量组平行设2孔。样品每个剂量组平行设3孔。根据标准品的各个浓度与其对应的吸光度(OD值)拟合曲线方程，再将样品的OD值代入方程计算其浓度。统计方法采用单因素方差分析，全部统计由统计软件包SPSS(version：16.0，Chicago，USA)完成。
3.2.2、结果：
守宫糖肽对人肝癌SMMC-7721细胞分泌IL-8的影响
| 分组 | 均数±标准差 |
| PBS阴性对照组 | 269.183±33.716 |
| 高剂量组(200μg/ml) | 185.773±11.470●▲ |
| 中剂量组(100μg/ml) | 202.543±7.665○ |
| 低剂量组(10μg/ml) | 230.400±21.341 |
P＝0.006
●与PBS阴性对照组比较，P＝0.001
○与PBS阴性对照组比较，P＝0.005
▲与低剂量组比较，P＝0.032
说明守宫糖肽高剂量、中剂量组均对人肝癌SMMC-7721细胞分泌IL-8有明显抑制作用。以上结果表明守宫糖肽具有守宫多糖不具备的抑制人肝癌SMMC-7721细胞分泌IL-8的功能。
4、守宫糖肽对人肝癌SMMC-7721细胞细胞内钙离子浓度的影响
4.1、材料与方法：
取对数生长期的SMMC-7721细胞，细胞接种的密度为0.5×104/ml，接种后24小时加药培养，分设守宫糖肽高(200μg/ml)、中(100μg/ml)、低剂量组(10μg/ml)与PBS阴性对照组。于加药后120h收集各组细胞，Fluo-3AM酯(5μmol/L)于37℃标记40分钟，用流式细胞仪检测细胞内钙离子的浓度。
4.2、结果：
守宫糖肽对人肝癌SMMC-7721细胞细胞内钙离子浓度的影响
P＜0.001
●与PBS阴性对照组比较，P＜0.001
□与中剂量组比较，P＝0.002
■与低剂量组比较，P＝0.001
○与PBS阴性对照组比较，P＝0.003
守宫糖肽高剂量、中剂量组与低剂量组均能显著抑制人肝癌SMMC-7721细胞细胞内钙离子浓度。
5、守宫糖肽对人肝癌SMMC-7721细胞骨架蛋白actin的影响
5.1、材料与方法：
取对数生长期的SMMC-7721细胞，6孔板每孔接种0.5×104/ml个细胞(3ml培养体系)，接种后24小时加药培养，分设守宫糖肽高(200μg/ml)、中(100μg/ml)、低剂量组(10μg/ml)与PBS阴性对照组。于加药后120h收集各组细胞，4％多聚甲醛固定，0.1％Triton X-100穿透，罗丹明标记的鬼笔环肽标记细胞，于共聚焦显微镜下检测F-actin的定位与分布。
5.2、结果：
PBS阴性对照组的细胞呈多边形，骨架蛋白actin沿着细胞膜分布，经200μg/ml和100μg/ml守宫糖肽作用后，细胞呈纺锤状，actin微丝聚合增加，主要分布在细胞浆。守宫糖肽低剂量组与阴性对照组相比，没有差异。参见图11。
应用实施例1：
将守宫糖肽制成符合药剂学要求的注射剂型。
含守宫糖肽的注射液的制备：
守宫糖肽，蒸馏水溶解，过滤，透析3次，调整浓度为10mg/ml，除菌，除热原，无菌分装为2ml/瓶。
应用实施例2：
将守宫糖肽制成符合药剂学要求的口服剂型。
含守宫糖肽口服胶囊的制备：
守宫糖肽，装入空心胶囊，每粒50mg，封口，除粉，装瓶。
含守宫糖肽口服片剂的制备：
守宫糖肽，加糊精2份，淀粉2份，糖粉1份，氢氧化凝胶达总量的3％，压片为50mg/片，装瓶。
所述的守宫糖肽在制备治疗恶性肿瘤的药物中的应用。
所述的守宫糖肽在制备治疗肝癌的药物中的应用。
所述的守宫糖肽在制备治疗病毒感染性疾病的药物中的应用。
所述的守宫糖肽在制备治疗HIV感染的药物中的应用。
所述的守宫糖肽在制备免疫调节剂中的应用。
上述参照实施例对该守宫糖肽及制备方法和其医药应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种守宫糖肽的制备方法，其特征在于：将守宫干燥、破碎后用有机溶剂抽提出脂溶性物质，将脱脂后的药渣用按守宫质量的1－10倍热水在30－100℃条件下浸提2－12小时，水提液过滤后分次加入乙醇至15%－80%浓度（V/V）沉淀，将沉淀溶解于水，1000－10000 r/min离心取上清，常规sevage法除去杂蛋白，透析，干燥成粉，复溶解于粉末质量30－180倍的含有0.5mol/L 氯化钠，10mmol/L半胱氨酸，10mmol/L乙二胺四乙酸的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，pH6.5, 加入粉末质量0.5％－4％的木瓜蛋白酶及0.5－2倍的甲苯，50℃－80℃水浴4h－48h后补加粉末质量0.2％－2％的木瓜蛋白酶，继续水浴4h－24 h；水解液浓缩后以乙醇沉淀，收集沉淀，依次用无水乙醇，丙酮洗涤，复溶于水，过滤，常规sevage法除去杂蛋白，浓缩，透析，干燥，得守宫糖肽。
2.根据权利要求1所述方法制备的守宫糖肽。
3.根据权利要求2所述的守宫糖肽，其特征在于：将其制成符合药剂学要求的注射剂型。
4.根据权利要求2所述的守宫糖肽，其特征在于：将其制成符合药剂学要求的口服剂型。
5.根据权利要求2所述的守宫糖肽在制备治疗肝癌的药物中的应用。
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