CN101735235B - 一种阻止Aβ聚集的化合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种化合物。本发明提供的化合物的结构如式I所示，本发明提供的化合物，具有抑制淀粉样蛋白β聚集作用，预示对治疗老年痴呆症有一定的作用，
Description
技术领域
本发明涉及一种阻止Aβ聚集的小分子化合物及其制备方法与应用。
背景技术
老年痴呆症(AD)是在老年人群中引起痴呆的一种渐进性的神经变性疾病。不同的病理学信号和渐进性的老年斑沉积以及导致神经元退化神经元纤维缠结伴随着认知力和记忆力的衰退。AD的一个典型特征是跨膜糖蛋白β-淀粉体前身蛋白(βAPP)水解而来的amyloid-βpeptide(Aβ)(淀粉样-β肽链(Aβ))累积。两种主要的A β(Alzheimer’sβ-amyloid)变体分别由40和42个氨基酸构成，他们促进前炎症反应，激活神经毒害通路，导致脑细胞功能异常甚至死亡。有关研究表明当Aβ以纤丝形式聚合时，其在细胞和体内均有神经毒害作用。因此，找到可以阻止Aβ聚集的小分子化合物在AD治疗中变得很有价值(Ce′line Rivie`re etc，Inhibitory activity of stilbenes on Alzheimer’s -amyloid fibrils in vitro，Bioorganic & Medicinal Chemistry 15(2007)1160-1167)。
目前对老年痴呆症的治疗主要有四大类药物，分别为胆碱脂酶抑制剂、抗氧化剂药物、激素替代治疗药物及非甾体抗炎药，但这些药物在一定程度上都存在风险或限制。目前筛选研究具有抑制A β聚集的小分子先导化合物，成为研制治疗老年痴呆症的热点之一。
鸢尾科鸢尾属植物。在我国主要分布在西南、西北和东北地区。该属约有300个种，广泛的分布于世界各地，中国约有60个种及13个变种，(Mahmood U，Kaul VK，Jirovetz L.Alkylated benzoquinones from Iris kumaonensis.Phytochemistry，2002，2(61)：923-926.Qin MJ，Xu LS，Tanaka T，et al.A preliminarystudy on the distribution pattern of isoflavones in rhizomes of Iris from China and its systematic significance.Acta Phyto Sinica，2000，38：343-349.)该属植物已被作为传统的民间药物，用来治疗多种疾病，例如，癌症、炎症、细菌和病毒感染。目前，从鸢尾属分离得到的化合物具有抗肿瘤、抗氧化、抗疟原虫和抗结核等作用(1.Atta-ur-Rahmn M，et al.Anti-inflammatory isoflavonoids from the rhizomes of Iris germanica.Journal of Ethnopharmacology，2003，86：177-180.2.Bonfils JP et al.Cytotoxicity of iridals，triterpenoidsfrom Iris.on human tumor cell lines A2780 andK562.Planta Med，2001，67：79-82)。
细叶鸢尾(Iris tenuifolia)，为鸢尾科鸢尾属植物，其化学成分已有一定的报道，(1.Kojima，K.，Gombosurengyin，P.，Ondogyni，P.，Begzsurengyin，D.，Zevgeegyin，O.，Hatano，K.，Ogihara，Y.Flavanones from Iris tenuifolia.Phytochemistry，1997，44(4)：711-714；2.M.I.Choudhary，S.Hareem and H.Siddiqui，et al.A benzil andisoflavone from Iris tenuifolia，Phytochemistry，2008，69，1880-1885)。我们继续研究该植物的化学成分，分离、鉴定了一个新的化合物；生物活性实验表明：该化合物能够阻止Aβ聚集，预示对老年痴呆症有一定的疗效。
发明内容
本发明的目的在于提供一个化合物，该化合物具有抑制淀粉样蛋白β聚集的作用。
本发明提供的化合物，结构如式I所示：
本发明的另一目的在于提供上述化合物的制备方法。
本发明提供的制备方法包括如下的步骤：
1)取细叶鸢尾地下部分，用无水甲醇提取，收集提取液，再去除所述提取液中的无水甲醇，得到细叶鸢尾地下部分总提取物；
2)将步骤1)得到的细叶鸢尾地下部分总提取物溶于水中，再加入氯仿进行氯仿萃取，收集氯仿相，再去除所述氯仿相中的氯仿，得到氯仿提取物；
3)将步骤2)得到的氯仿提取物用甲醇溶解后，在硅胶G中进行以下两次梯度洗脱：
a、依次用体积比分别为10∶0，9.5∶0.5，9∶1，8∶2和0∶10的氯仿与甲醇组成的五个洗脱液进行梯度洗脱，依次获得第一至第五个洗脱液洗脱出的组分；
b、将步骤a获得的第一至第五个洗脱液洗脱出的组分中的第四个组分用体积比分别为9.5∶0.5，9∶1，8∶2和0∶10的氯仿与甲醇组成的四个洗脱液进行梯度洗脱，依次获得第一至第四个洗脱液洗脱出的组分；取第三个洗脱液洗脱出的组分，得到本发明保护的化合物。
进一步，上述步骤1)中，所述提取重复3次。
上述步骤2)中，氯仿萃取可重复5次。
上述步骤3)中，硅胶G的目数是100-200目。
上述的化合物在制备阻止Aβ聚集(缠结)的产品中的应用也属于本发明的保护范围之内。
进一步，上述产品可以是药物。
上述的化合物在制备治疗老年痴呆症的药物中的应用也属于本发明的保护范围之内。
本发明的又一目的在于提供一种治疗老年痴呆症的药物。
本发明提供的治疗老年痴呆症的药物，其活性成分是上述的化合物。
实验证明：化合物1可以阻止Aβ聚集。因为Aβ聚集是老年痴呆症的一个典型特征，因此预示化合物1可用来治疗老年痴呆症。
附图说明
图1为本发明中化合物制备流程图。
图2为化合物1双分子叠合图。
图3为单分子的立体结构投影图。
图4为分子晶胞堆积图。
图5为本发明的化合物使Aβ缠结程度下降的结果图，其中aggregates表示未加化合物1的对照组，5为本发明的化合物1，图5的纵坐标是将对照组的荧光强度记作1，其余组的荧光强度与对照组的荧光强度的比为相应纵坐标。
具体实施方式
实施例1、一种具有抑制淀粉样蛋白β聚集作用的化合物1的制备：
一、化合物1的制备
制备流程如图1所示。
1)无水甲醇浸泡
取1661g新鲜细叶鸢尾的地下部分，用无水甲醇室温浸泡处理三次(每次5L无水甲醇/1kg材料)，三次提取液合并，用旋转蒸发仪回收甲醇，得到细叶鸢尾地下部分的总提取物241.8g。
2)氯仿萃取
将步骤1)得到的提取物溶解于300mL蒸馏水，移入1000mL分液漏斗中，加入等体积的氯仿进行萃取，萃取共进行5次，合并氯仿萃取液，用旋转蒸发仪回收氯仿，得到细叶鸢尾地下部分的氯仿提取物198.6g。
3)柱层析分离
取步骤2)得到的氯仿提取物15g，用1.5mL无水甲醇充分溶解，用硅胶G(100-200目，青岛海洋化工公司)700g进行常压柱层析分离。按照溶剂极性递增的原则，依次用体积比分别为10∶0，9.5∶0.5，9∶1，8∶2，0∶10(每个比例溶剂用量150mL)的氯仿与甲醇组成的五个洗脱液进行梯度洗脱，依次获得第一至第五个洗脱液洗脱出的组分；
取上述第一至第五个洗脱液洗脱出的组分中的第四个组分2.6g重新用130g的硅胶G(100-200目)进行常压柱层析分离。按照溶剂极性递增的原则，依次用体积比分别为：9.5∶0.5，9∶1，8∶2，0∶10(每个比例溶剂用量100mL)的氯仿与甲醇组成的四个洗脱液进行梯度洗脱，依次获得第一至第四个洗脱液洗脱出的组分；取第三个洗脱液洗脱出的组分(即化合物1)。
二、结构的确认
1、化合物1的物理性质及波谱数据如下：
无色透明片状晶体，易溶于氯仿。
分子式：C17H16O5
分子量：300
ESI-MS(m/z)：337(M+Na，100％)，301(M-CH3)，242，205，147。
化合物1的核磁共振(NMR)数据：
1HNMR(DMSO-d6，500MHz)δppm：5.34(1H，br，s，H-2)，2.09(1H，m，H-3a)，2.15(1H，m，H-3b)，5.62(1H，br，s，H-4)，6.11(1H，d，J＝2.3Hz，H-8)，6.70(1H，d，J＝1.62Hz，H-4′)，6.68(1H，d，J＝7.4Hz，H-5′)，6.80(1H，dd，J＝1.5，7.2Hz，H-6′)，3.67(3H，s，5-OCH3)，3.80(3H，s，7-OCH3)。
13CNMR(DMSO-d6，125MHz)δppm：66.71(C-2)，26.01(C-3)，60.99(C-4)，158.77(C-5)，91.32(C-6)，161.43(C-7)，92.86(C-8)，154.50(C-9)，103.05(C-10)，121.98(C-1′)，145.62(C-2′)，141.71(C-3′)，116.01(C-4′)，119.63(C-5′)，120.94(C-6′)，56.13(5-OCH3)，55.62(7-OCH3)。
化合物1的主要HMBC(H→C)相关
2、化合物1单晶结构分析
1)衍射实验
化合物1晶体呈无色透明柱状，衍射分析使用晶体尺寸为0.20×0.27×0.48mm，属正交晶系，空间群为P212121，晶胞参数：a＝8.154(1)，b＝14.158(1)，
晶胞体积
晶胞内分子数Z＝8。
用日本Rigaku MicroMax 002+单晶衍射仪收集衍射强度数据，CuKα辐射，共聚焦单色器，准直光管直径ф＝0.30mm，晶体与CCD探测器距离d＝50mm，管压45kV，管流0.88mA，ω与κ扫描方式，最大2θ角141.38°，摄取774幅衍射图象，总衍射点11019个，独立衍射点5053个，可观察点(|F|2≥2σ|F|2)4818个，数据完整度为96.6％。
2)结构计算
使用直接法shelxs-97解析晶体结构，从E图上获得全部44个非氢原子位置，采用最小二乘法修正结构参数和判别原子种类，用几何计算法获得全部氢原子位置，最终可靠因子R1＝0.0433，wR2＝0.1213，S＝1.074。最终确定不对称单位化学计量式为(C17H16O5)2，计算分子量为600.60，计算晶体密度1.364g/cm3。晶态下分子排列属于第一类空间群，故样品应具有旋光活性。计算晶体结构构型的Flack系数为0.17(18)，获得该化合物分子的绝对构型如式I所示。图2为双分子叠合图，图3为单分子的立体结构投影图，图4为分子晶胞堆积图。
3)结构分析
结构分析表明：SAMP5112分子为含氧螺环类化合物。该分子骨架由4个六元环组成：A和D(苯环)、B和C(含氧杂环)。其中A环与D环呈平面，B环与C环呈半椅式构象，B/C环为顺式连接。单晶结构分析证明样品在一个不对称单位中存在有两个分子相同手性化合物分子，但在侧链构象上存在一定差异，其中C16A、C17A、C16B、C17B原子存在无序现象，造成原子的温度因子较高。计算双分子各环间平均二面角值分别为：A/B：7.5°，A/D：81.0°，B/C：91.3°，C/D：9.5°。晶态下分子内存在氢键联系为：O5B…O2B：分子间存在氢键联系为：O5A…O4B(-x，y+1/2，-z-1/2)：晶态下分子以氢键作用力与范德华力维系其在空间的稳定排列。
实验例2、化合物1抑制淀粉样蛋白β聚集作用的活性评价
试剂来源：Aβ蛋白(1-40，M＝4329.84)购自瑞士Bachem公司，硫磺素T(Tht)购自Sigma公司
活性评价实验方法参照文献Ce′line Rivie`re etc.Inhibitory activity of stilbenes onAlzheimer’s-amyloid fibrils in vitro，Bioorganic & Medicinal Chemistry15：1160-1167(2007)进行，具体步骤如下：
1、Aβ缠结
1mgAβ蛋白+2mlPBS(磷酸缓冲液，PH＝7.4)，得到0.5mg/ml的Aβ溶液，加入EDTA(1mM)促进缠结，在37℃，300rmp，孵育72h，在-80℃冰箱中保存。
2、硫磺素T(Tht)的配制
配成300uM的Tht，备用，在4℃冰箱中保存，荧光测量时，需要稀释到3uM。
3、样品+Aβ
向tube管中加入20ul浓度为20uM的Aβ溶液(步骤1保存的Aβ溶液稀释成20uM)和2ul浓度为10ug/ml化合物1溶液(该溶液的溶剂是二甲基亚砜(DMSO)，溶质是化合物1)，充分混匀，37℃，孵育30分钟。
4、荧光测量
取1500ul的3uM的Tht于新的tube管中，加入15ul步骤3中孵育好的混合物，然后进行荧光测量。激发波长：442nm，测定波长：480nm。
统计方法：用SPSS统计软件方差分析*P＜0.05。
实验重复3次，实验结果如图5所示，与未加化合物1的对照组相比，加了化合物1的实验组中Aβ的缠结度显著下降，说明化合物1可以阻止Aβ聚集。因为Aβ聚集是老年痴呆症的一个典型特征，因此化合物1可用来治疗老年痴呆症。
Claims (9)
1.一种化合物，结构如式I所示：
2.权利要求1所述化合物的制备方法，包括如下的步骤：
1)取细叶鸢尾地下部分，用无水甲醇提取，收集提取液，再去除所述提取液中的无水甲醇，得到细叶鸢尾地下部分总提取物；
2)将步骤1)得到的细叶鸢尾地下部分总提取物溶于水中，再加入氯仿进行氯仿萃取，收集氯仿相，再去除所述氯仿相中的氯仿，得到氯仿提取物；
3)将步骤2)得到的氯仿提取物用甲醇溶解后，在硅胶G中进行以下两次梯度洗脱：
a、依次用体积比分别为10∶0，9.5∶0.5，9∶1，8∶2和0∶10的氯仿与甲醇组成的五个洗脱液进行梯度洗脱，依次获得第一至第五个洗脱液洗脱出的组分；
b、将步骤a获得的第一至第五个洗脱液洗脱出的组分中的第四个组分用体积比分别为9.5∶0.5，9∶1，8∶2和0∶10的氯仿与甲醇组成的四个洗脱液进行梯度洗脱，依次获得第一至第四个洗脱液洗脱出的组分；取第三个洗脱液洗脱出的组分，得到权利要求1所述的化合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述提取重复3次。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述氯仿萃取重复5次。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述硅胶G的目数是100-200目。
6.权利要求1所述的化合物在制备阻止Aβ聚集产品中的应用；所述Aβ为淀粉样-β肽链。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述产品是药物。
8.权利要求1所述的化合物在制备治疗老年痴呆症的药物中的应用。
9.一种治疗老年痴呆症的药物，其活性成分是权利要求1所述的化合物。
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