CN101730842A - 通过核磁共振检测目标物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了一种通过包含在目标物质中的预选核素的核磁共振(NMR)检测样品中已知目标物质的方法。该方法包括以下步骤:a)提供已知或怀疑包含所述目标物质的初始样品;b)向所述初始样品中加入一定量的同位素标记的目标物质,从而获得复合样品,所述同位素标记的目标物质可通过将目标物质的至少一个核用其另外的同位素替代从所述目标物质获得,其中所述替代使所述目标物质的至少一个NMR信号的位置或多重态发生改变;c)从所述复合样品中获得所述预选核素的NMR信号;d)测定所述同位素标记的目标物质的NMR信号副集的实际位置;e)由所述信号副集的实际位置以及由同位素标记的目标物质信号的相对位置与目标物质信号的相对位置之间的预定关系来计算目标物质的NMR信号主集的实际位置;f)检测目标物质位于由步骤e)计算的实际位置上的至少一个信号。
Description
发明技术领域
本发明涉及通过核磁共振检测样品中目标物质的方法。
背景技术
核磁共振波谱法是众所周知的广泛应用于多种样品定性和定量分析的技术。该技术通常涉及在对具有非零自旋角动量的预选核同位素(如1H、13C或许多其他同位素)有选择性的条件下记录核磁共振谱,下文称为NMR谱。通常,从含有分子种类的样品中获得的NMR谱包含源自预选同位素的核的多个信号峰。每一个信号峰对应于一个特定的共振频率,所述特定的共振频率可归属于经历了作为特定分子环境结果的特定局部磁场的一个或数个核。因而,观察到NMR信号峰的共振频率(通常表示为所谓的化学位移,其以相对于参比信号每百万的份数(ppm)给出)主要是引起该信号峰的一个和多个核的分子定位的指示,但也取决于诸如pH值、盐含量等的样品条件。
和许多其他分析技术相比,NMR波谱法的一个重要的优点在于:在某些熟知条件下,信号峰的积分直接与共振核的数目成正比(参见,例如R.R.Ernst,G.Bodenhausen and A.Wokaun,Principles of NuclearMagnetic Resonance in One and Two Dimensions,Oxford SciencePublication,1988,91-157)。因此,NMR谱中不同信号峰的积分反映出对每一个信号峰做出贡献的核的数目。因为上述信号峰积分和共振核数目之间的比例性,NMR信号峰的绝对积分与NMR谱仪检测体积中含有共振核的分子的数目直接相关。然而,给定样品中所有NMR信号峰的绝对积分通常将在许多实验条件下以相同方式起反应。不过,如果目的物质的积分信号可以与已知浓度参比物质的积分信号相比较的话,则可以相当直接的方式来进行依靠NMR波谱法的定量分析。
在NMR波谱法的许多分析应用中的问题是:目的物质的NMR信号可能与其他物质的信号交叠,从而使定量变得困难甚至不可能。生物样品尤其经常遇到该问题,其中密集的NMR谱使得出现不期望的信号交叠的可能性相当大。然而,在许多情况下,可以将目的信号的位置从密集的波谱区域移动到基本空的波谱区域。例如,溶液中物质的NMR信号位置可能取决于诸如溶液的pH、离子强度、盐组成和盐浓度等多种因素。因而,通过改变任何这些参数或者通过加入已知的改变信号位置的试剂就可以实现期望的信号位置的移动。
上述信号移动方法的难点是:在许多情况下不能明确地鉴别移动的信号,这是因为信号移动的量可能取决于数个参数并因而不可能精确地预测。此外,在样品中存在的其他核素的信号还经常引起信号位置的同时移动。因此,已知的信号移动方法的不利之处是目的移动信号可能非常接近于本应与其区别的至少一个其他信号。
发明概述
本发明的主要目的是克服目前已知的用于定性和定量检测物质(特别是生物样品中物质)的NMR方法的局限性和缺点。
上述目的和其他目的通过本发明的方法来实现。
根据权利要求1,提供一种通过包含在目标物质中的预选核素的核磁共振(NMR)来检测样品中已知目标物质的方法,该方法包括以下步骤:
a)提供已知或怀疑包含目标物质的初始样品;
b)向所述初始样品中加入一定量的同位素标记的目标物质,从而获得复合样品,所述同位素标记的目标物质能够通过将所述目标物质的至少一个核用其另外的同位素替代从所述目标物质获得,其中所述的替代使目标物质的至少一个NMR信号的位置或多重态发生改变;
c)从复合样品中获得所述预选核素的NMR信号;
d)测定所述同位素标记的目标物质的NMR信号副集的实际位置;
e)由所述信号副集的实际位置以及由所述同位素标记的目标物质信号的相对位置和所述目标物质信号的相对位置之间的预定关系来计算所述目标物质的NMR信号主集的实际位置;
f)检测所述目标物质位于由步骤e)计算的实际位置上的至少一个信号。
本文所用的术语“NMR”或“核磁共振”包括但不限于一维NMR(例如,1H NMR)、二维NMR(例如,HSQC或HMQC、NOESY、TOCSY、COSY)、三维NMR(例如,NOESY-TOCSY,HMQC-TOCSY)和磁共振成像(MRI)。该技术通常包括建立预选核素在磁场中的共振条件。如本领域所已知的,NMR要求所述预选核素为具有非零核自旋角动量的同位素,如1H、13C或许多其他同位素。
术语“同位素”通常用来区别具有相同质子数但具有不同中子数的核。然而,在化学和生物学的情境中,术语“同位素”通常延伸包括具有某些同位素核的原子。
本文所用的术语“目标物质”是指下文进一步解释的能被NMR检测和能用同位素标记的任何物质。目标物质的分子量不受限制,只要该目标物质能被NMR检测到即可。目标物质的分子量优选低于40kDa,更优选低于5kDa,并且甚至更优选低于500Da。目标物质包括但不限于蛋白质、多肽、肽、氨基酸、碳水化合物、有机酸、基因、核酸、化合物和聚合物。目标物质优选为氨基酸,并且目标物质更优选为甘氨酸。在一个实施方案中,目标物质可以是标记,如用于诊断的标记、用于研究药物处置(例如,吸收、分布、代谢、排泄)的标记、用于研究治疗或药物的功效或副作用的标记。
本文所用的术语“样品”是指包含目标物质或具有包含目标物质可能性的任何样品。通常,样品为混合物并且不仅包含目标物质,还包含其他物质。样品包括但不限于从哺乳动物中分离的生物样品、细胞培养上清液、细菌发酵产物、植物提取物、原核细胞提取物、真核单细胞提取物和动物细胞提取物。在一个优选实施方案中,在本发明方法中所用的样品为从哺乳动物中分离的生物样品。所述哺乳动物包括但不限于人、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠)、猴、狗和猫。优选从人分离的生物样品。生物样品包括但不限于血液、间质液、血浆、尿、血管外液、脑脊髓液(CSF)、滑液、关节液、胸膜液、血清、淋巴液、精液和唾液。在一个实施方案中,所述样品可以是从已接受或将接受药疗或治疗的哺乳动物中分离的样品。
本发明的方法是从已知或怀疑包含目标物质的样品开始的。为清楚起见,将其称为“初始样品”。接着,加入已知量的同位素标记的目标物质,从而获得被称为“复合样品”的样品。应当强调,并非必需混合同位素标记的目标物质。换句话说,复合样品可以通过存在于两个单独相或者容器中的初始样品和标记的目标物质来形成。然而,优选的加入步骤确实包括所述混合步骤。
根据本发明,加入初始样品中的同位素标记的目标物质必须能够通过将其至少一个核用其另外的同位素替代从所述目标物质获得,其中所述替代使所述目标物质的至少一个NMR信号的位置或多重态发生变化。如同下文中将解释的那样,这样的同位素替代通常导致NMR信号的变化,即,与目标物质相比,在同位素标记的目标物质中至少一个NMR信号具有不同的线位置和/或多重态。必须理解,特定情形中最适合的同位素替代类型的选择应当使得对所检测的NMR信号具足够强的同位素效应。
优选地,所述同位素替代包括至少一个12C被13C替代或者至少一个1H被2H替代。然而,其他替代也是可能的。原则上,原来的或替代的同位素或其二者都可以是放射性的。然而,在大多数情况下,优选排他地使用稳定的同位素。例如,同位素替代可以包括引入13C、2H、15N、17O、33S、7Li、11B、29Si或31P。优选地,包括引入13C、2H或15N。此外,优选的是同位素替代涉及的至少一个核具有非零核自旋,使得位置或多重态的所需改变由J-偶合引起。然而,即使具有零核自旋的核被同样具有零自旋的其同位素替代,也能引起可在本发明意义上使用的化学位移的轻微改变。
根据本发明的方法还包括从复合样品获得预选核素的NMR信号并且确定同位素标记的目标物质的NMR信号副集(auxiliary set)的实际位置。其后,通过使用同位素标记的目标物质信号的相对位置或多重态与目标物质信号的相对位置或多重态之间的预定关系,从信号副集的实际位置来计算目标物质的NMR信号主集(principal set)的实际位置。该关系的一个实例是目标物质NMR谱中的单峰,其在同位素标记的目标物质的NMR谱中分裂成双重峰,其中双重峰中央的波谱位置与单峰的中心位置基本相同。在此简单实例中,加入同位素标记的目标物质将导致一对新信号的出现;然后通过选择位于所述新信号对之间的中心线的信号,从多个紧密间隔的信号中容易地识别出未标记的目标物质的相应单峰。因而,这就允许检测目标物质位于通过上述关系计算的实际位置处的至少一个信号,并随后用于定性或定量分析。
因此,本发明方法克服了在特别是具有密集波谱的生物样品或其他样品中进行NMR检测的现有技术方法的缺点。
在从属权利要求中定义了有利的实施方案。
根据一个实施方案,所述方法还包括在步骤a)和b)之间进行的如下步骤:a1)获得初始样品对于预选核素的NMR信号,并且通过从步骤c)获得的NMR信号中扣除步骤a1)获得的NMR信号来进行步骤d)。使用该扣除步骤,能快速获得随后方法步骤所需的同位素标记的目标物质的实际NMR谱。在应用背景技术中提及的数种移位技术以便将未标记的目标物质的一个或多个信号移动到相对不密集的波谱区域的情况中,这尤为有用。因为所得到的移位还发生在同位素标记的目标物质的NMR谱线中,该扣除步骤对于发现移位线有实质性帮助。
根据另一个实施方案,通过选择性抑制未标记目标物质的NMR信号的同位素编辑技术来进行步骤d)。
根据一个特别优选的实施方案,所述方法还包括基于NMR信号的主集和副集的相对信号强度,相对于所加同位素标记的目标物质的量,来确定目标物质的量。该实施方案需要在信号峰积分与共振核数目成正比的状况下进行NMR测量。明显地,如果所加同位素标记的目标物质的量是绝对已知的,那么该方法将允许对于目标物质的绝对量化。
根据本发明的方法适用于各种类型的NMR,包括但不限于:一维NMR、二维NMR和核磁共振成像(MRI)。
加入到样品中的同位素标记的目标物质的量可以在宽范围内选择并且将通常取决于多种因素,如样品量、样品中目标物质的量、同位素类型、目标物质的分子量、NMR方法或装置的类型。优选地,同位素标记的目标物质的浓度尽可能地低,但是它必须高至足以使得同位素标记的目标物质能容易地通过NMR测量来检测。加入样品中的同位素标记的目标物质的量优选为0.01mM~100mM,更优选为0.1mM~10mM。
在本发明的方法中,可以检测单一的目标物质,但也可以同时检测两种或更多种不同的目标物质。加入到样品中的同位素标记的目标物质的数目不受限制,只要至少一种同位素标记的目标物质被加入到样品中即可。如果两种或更多种目标物质被同时检测,则可以向样品中加入两种或更多种不同的同位素标记的目标物质。
原则上,对同位素标记的目标物质中被同位素取代的原子数目不作限制,只要至少一个原子被该原子的同位素原子所取代即可。如果目标物质包含两种或更多种同位素替代原子,这些同位素可以是相同的同位素或不同的同位素。例如,如果13C用于标记目标物质并且目标物质包含数个碳原子,则仅有一个碳原子可以被13C所替代,或者多于一个碳原子(甚至所有的碳原子)都可以被13C所替代。此外,除了被13C替代,目标物质还可以被诸如15N的其它类型的同位素替代。如上所述,同位素替代的目的是导致NMR谱中出现新的信号模式,以便鉴别未标记目标物质的至少一个信号。
同位素标记的目标物质可以通过本领域技术人员已知的常规方法来制备。例如,可以通过在包含同位素的培养介质中培养产生目标物质的细胞或微生物来制备同位素标记的目标物质。同位素标记的目标物质还可以通过使用同位素或同位素标记的化合物作为主要原料的化学合成来制备。大量同位素标记的目标物质是商业上可得到的并且因而可用于本发明的方法中。
本发明的方法可用于多种目的。例如,它可以通过检测作为目标物质的诊断标记而用于诊断疾病。许多诊断标记在本领域是已知的,并且本领域技术人员可以容易地使用诊断标记作为目标物质。
而且,本发明的方法可以通过检测药物或其代谢产物而用于研究药物处置,如吸收、分布、代谢或排泄。本发明方法所用的样品可以在给药后从哺乳动物中分离出来。给药前从哺乳动物中分离出来的样品也可以用作对照样品。
此外,本发明的方法可以用于研究治疗或药物的功效或副作用。在该情形中,在治疗或给药前从哺乳动物中分离出的样品以及在治疗或给药后从哺乳动物中分离出的样品可以用作样品。特别是,由本发明方法检测的目标物质可以是当药物起作用或者产生了副作用时浓度或量在样品中发生变化的物质。
附图简述
结合附图并参照以下对本发明不同实施方案的描述,本发明的上述及其他特征和目的以及实现它们的方式将变得更加清楚,并且本发明自身也更容易理解,其中:
图1示出了具有整数或半整数自旋的核的一维NMR谱的示意图,所述核与至少一种作为同位素标记而引入的具有自旋为1/2的其他核相互作用;
图2示出了具有整数或半整数自旋的核的一维NMR谱的示意图,所述核与至少一种作为同位素标记而引入的具有自旋为1的其他核相互作用;
图3示出了包含13C甘氨酸的CSF样品的1H NMR谱(主图)以及在12C信号周围的波谱区域的放大图(插入图,上线)、对峰进行高斯函数拟合的去褶合的结果(插入图,中线)和13C过滤的NMR谱的结果(插入图,下线);
图4示出了应用于二维NMR波谱法的量化方法的示意图;和
图5示出了应用于磁共振成像的量化方法的示意图。
发明详述
实施例1
可用于鉴别和量化密集NMR谱中已知目标物质的不同自旋体系拓扑学的概述示于图1和图2中。在这些实施例中,以粗体字示于以下结构式的所检测到的自旋(整数或半整数,如自旋为1/2的1H或者自旋为1的2H)导致在目标物质情况下的NMR单峰。通过改变样品条件(pH、盐、T),该目的信号可以被移动到不交叠的波谱区。然而,并非总是直接鉴别移位线。在同位素标记的目标物质中,相同自旋与其中替代的同位素核相互作用。该相互作用可用来鉴别目的信号并且量化相同类型的未标记的对应分子的量。
特别地,图1示出了其中同位素标记为自旋1/2核的情形。始于未标记的目标物质(1),
通过NMR观察到具有确定化学位移特征的相关核自旋(即1H或2H,以粗体示于结构中)。该自旋不通过J-偶合与任何其他自旋相互作用。剩余的R1到R4不具有任何自旋。NMR谱为单峰,如图1(a)所示。
现在来看同位素标记的物质(2),其中自旋1/2核(即13C)已被引进分子中,
所观察到的自旋经历了单一异核J-偶合,其作为双重峰可见于NMR中。现在总的信号波幅分配到图1(b)所示的两个信号上。
对于未标记物质(1)和标记物质(2)的1∶1的混合物,得到了示于图1(c)的波谱,其中未标记物质的化学位移(单峰)在两个双重峰信号的中央(箭头)。因而可以鉴别未标记化合物的单峰信号,此外,如果已知标记化合物的量,还可以量化该物质的量。顺便提及,通过波谱编辑技术(参见:G.Otting,H.Senn,G.Wagner,K.Wüthrich,(1986)J.Magn.Reson.70,500;和G.Otting,K.Wüthrich,(1989)J.Magn.Reson.85,586),可以将图1(c)的波谱简化为示于图1(b)的双重峰。
然而,如图1(d)所示,在实际的混合物中,由于同位素位移,单峰信号并非正好在双重峰的中央(箭头)。不过,这样的同位素位移很小并且是先验地已知的。因而,仍然可进行信号鉴别和物质的量化。
如果向标记物质中引入多于一种自旋为1/2的偶合对,则可以看到更复杂的多重峰。图1(e)示出了未标记的和13C双重标记的物质(3)的实际混合物的情形,其产生双重峰的二重峰。以上关于同位素位移的评述仍然适用;仍然可进行信号鉴别和物质的量化。
如果剩余的R1-R4包含通过J-偶合与所检测到的自旋相互作用的其他自旋,如同在诸如(4)的物质中的情形,则在未标记的和标记的物质中都将看到所有信号的其它分裂,如图1(f)所示。以上关于同位素位移的评述仍然适用;仍然可进行信号鉴别和物质的量化。
相反,图2示出了其中同位素标记是自旋为1的核的情况。始于未标记的目标物质(5),
13C-NMR波谱显示出来自单一自旋为-1/2的J-偶合的双重峰,如图2(a)所示。
如果检测到的自旋与自旋为1的核(例如2H)相互作用,例如在氘标记的物质(6)中,在波谱中将见到三重峰,如图2(b)所示。
在未标记目标物质(5)和经标记目标物质(6)的1∶1混合物中,属于未标记物质的双重峰的化学位移可以通过利用属于经标记物质的三重峰的位置来鉴别。而且,如果已知经标记目标物质的量,则可以量化未标记目标物质的量。
在实际混合物中,需要考虑同位素位移(参见图2(c)),但是因为该位移是已知的,所以仍然可能鉴别属于经标记物质的三重峰的位置。而且,如果已知经标记目标物质的量,则可以量化未标记目标物质的量。
应当指出,尽管在上示的实施例中,同位素标记的物质比相应的未标记目标物质具有更复杂的NMR信号(即信号具有更高的多重态),但这并非强制性的要求。至少在原则上可以使用替代方案,其中带自旋的核被具有较小自旋或者甚至零自旋的同位素替代,从而产生较少线的NMR谱。谱图中的变化仍然可有助于鉴别未标记目标物质的信号。
实施例2
将上述检测方法用于检测从成年Wistar雄性大鼠(在3~5%的气态异氟烷麻醉下)的小脑延髓池收集的脑脊髓液(CSF)中的甘氨酸。收集之后,立即将CSF在-80℃储存。将适当等分量的CSF与6μL的8.5N NaOD、10μL的1mM13C-甘氨酸(两个碳原子都用13C标记)和20%D2O在80%水中的溶液混合,得到200μL的总体积。在涡旋30秒后,将溶液在13000rpm下离心1分钟并且将上清液转移到3mmNMR管中。在测量前新制样品。
在配备了5mm冷冻探针(CryoProbe)并用XWINNMR 3.5(Bruker BioSpin,瑞士)控制的Bruker Avance-II 600MHz仪器上测量CSF的1H NMR谱。手动调谐并匹配每个样品,并且用厂商的梯度匀场程序来匀场。在8012.82Hz宽度的谱窗内获得32k的数据点,导致在300K温度下2.045秒的采集时间。通过在弛豫延迟期间照射1.9秒抑制了水的共振。对于每一个样品,为提供信噪比足够高的谱图,需要加入许多瞬时程序(通常大约1024次扫描)。在傅里叶变换之前,应用lb=-1.95Hz和gb=0.16的高斯窗口函数。接着进行手动调相和基线校正。相对于定义在1.31ppm的乳酸盐双重峰的中点来进行参比。
为了测定甘氨酸浓度,通过对峰进行高斯函数拟合来使所得的NMR谱去褶合。对交叠的峰应用该程序,使用高斯线形来确定每个单个峰的比例(图3,放大图的中线)。对于所有的谱图,应用相同的处理参数以确保通过该方法获得的比例可以进行对比。使用去褶合步骤的结果(即未标记12C甘氨酸和所加13C甘氨酸的峰面积)来计算CSF样品的甘氨酸浓度。对此考虑了该信号下的质子数、比较所加13C甘氨酸的浓度和用于测量的CSF的初始体积。
具体地,使用标准NMR处理软件(例如XWIN-NMR,Topspin,Amix;Bruker Biospin AG,Switzerland),通过积分未标记目标物质的信号得到IT并且通过积分经标记目标物质的信号得到Is来进行量化。从所测的未标记目标物质的积分(IT)和同位素标记物质的积分(Is),使用下式可以计算目标物质的浓度:
CT=(ns/nT)*Cs*(IT/Is)
其中CT为未标记目标物质的浓度,Cs为同位素标记的目标物质的浓度,nT为未标记目标物质积分的NMR信号下的质子数,ns为同位素标记的目标物质积分的NMR信号下的质子数。
必须指出,使用该程序仅量化了没有结合到生物流体的其他组分上的自由甘氨酸。
实施例3
图4中示出了应用于二维NMR波谱法的量化策略的示意图。取决于样品条件,待量化的目标化合物具有化学位移为3.7~3.8ppm的信号。在生物基体上获得的一维1H NMR谱(图3,左图)表现出严重的信号交叠。应用二维TOCSY波谱法(参见A.Bax和D.G.Davis(1985),J.Magn.Reson.65,355),这种情形通过隔离已知自旋体系拓扑的非对角线信号而得到了改善,但是用小框标记的两个三重峰信号仍然不清楚(图3,中图)。只有在13C标记物质的尖峰形成之后(图3,右图),才明确鉴别了目的三重峰为较低的那个,现在明显地是作为三重峰的双重峰。通过对图3右图小框中所示的提取线中的NMR三重峰信号积分,取得附属三重峰信号和中央三重峰信号的比例,使得对目标物质的量化变得可能。如果需要,可以获得仅含经标记化合物信号的简化的13C编辑的参比波谱(参见G.Otting(1986)loc.cit.和G.Otting(1989),loc.cit)。
实施例4
图5中示出的量化策略的示意图用于磁共振成像(MRI)(参见,P.G.Morris(1986)Imaging Nuclear Magnetic Resonance in Medicineand Biology,Clarendon Press,Oxford;和P.T.Callaghan(1991)Micro-Imaging Principles of Nuclear Magnetic Resonance Microscopy,Clarendon Press,Oxford;和P.Mansfield,P.G.Morris(1982)NMRImaging in Biomedicine,Adv.Magn.Reson.(Suppl.2)Academic Press,N.Y.;和D.M.Kramer(1981)Nuclear Magnetic Resonance Imaging inMedicine:L.Kaufman,L.E.Crooks,A.R.Margulis(eds.);Iguku-Shoin,N.Y.,184)。通过使用化学位移成像CSI)(参见T.R.Brown,B.M Kincaid and K.Ugurbil(1982)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 79,3523;和W.T.Dixon(1984)Simple proton spectroscopic imaging.Radiologie152,189),空间分辨的NMR信息可以从非均匀对象上采集(例如,生物样品或NMR管束(参见A.Ross,G.Schlotterbeck,H.Senn and M.von Kienlin(2001),Angew.Chem.,Int.Ed.,40,3243-3245;和A.Ross,G.Schlotterbeck and H.Senn(2003),美国专利6504368B2)。结果,化合物的化学位移和检测灵敏度可能依赖于所提取谱图的空间位置。通过谱图中心的小位移和波幅的变化,这在以上画出的36幅谱图中得到了显示。只要获得了均匀分布,无论是由于化合物浓度的实际差别还是由于检测灵敏度的差别导致的波幅差异,都可以通过同位素标记化合物形成尖峰来解决。波谱位移的幅度还包含样品基体上局部化的信息(例如局部pH值)。
Claims (13)
1.一种通过包含在目标物质中的预选核素的核磁共振(NMR)检测样品中已知目标物质的方法,所述方法包括以下步骤:
a)提供已知或怀疑包含所述目标物质的初始样品;
b)向所述初始样品中加入一定量的同位素标记的目标物质,从而获得复合样品,所述同位素标记的目标物质能够通过将所述目标物质的至少一个核用其另外的同位素替代从所述目标物质获得,其中所述替代使所述目标物质的至少一个NMR信号的位置或多重态发生改变;
c)从所述复合样品中获得所述预选核素的NMR信号;
d)测定所述同位素标记的目标物质的NMR信号副集的实际位置;
e)由所述信号副集的实际位置以及由所述同位素标记的目标物质信号的相对位置与所述目标物质信号的相对位置之间的预定关系来计算所述目标物质的NMR信号主集的实际位置;
f)检测所述目标物质位于由步骤e)计算的实际位置上的至少一个信号。
2.权利要求1的方法,其中在步骤b)的所述替代中,所述核和替代所述核的所述其同位素中的至少一个具有非零核自旋。
3.权利要求1的方法,其中所述步骤b)包括将所述同位素标记的目标物质与所述初始样品混合。
4.权利要求1~3中任何一项的方法,还包括在步骤a)和步骤b)之间进行的以下步骤:
a1)获得所述初始样品对于所述预选核素的NMR信号,
其中通过从步骤c)获得的NMR信号中扣除步骤a1)获得的NMR信号来进行步骤d)。
5.权利要求1~3中任何一项的方法,其中通过选择性抑制所述目标物质NMR信号的同位素编辑技术来进行步骤d)。
6.权利要求1~5中任何一项的方法,还包括基于NMR信号主集和副集的相对信号强度,相对于所加同位素标记的目标物质的量,确定所述目标物质的量的步骤。
7.权利要求1~6中任何一项的方法,其中所述NMR信号副集包括所述同位素标记的目标物质的至少两个信号,并且其中所述NMR信号主集包括所述目标物质的单独信号。
8.权利要求1~7中任何一项的方法,其中所述预选核素是1H或13C。
9.权利要求1~8中任何一项的方法,其中所述初始样品是生物样品。
10.权利要求1~9中任何一项的方法,其中所述同位素标记的目标物质的另外的同位素选自13C、2H和15N。
11.权利要求1~10中任何一项的方法,其中NMR是一维NMR。
12.权利要求1~10中任何一项的方法,其中NMR是二维NMR。
13.权利要求1~10中任何一项的方法,其中NMR是核磁共振成像。
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