CN101730711B - 降钙素原前体抗原t表位 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及降钙素原前体抗原T表位，其被表示为主要组织相容性复合体I(MHC I)。这些肽能够用于癌症免疫疗法。
Description
技术领域
本发明涉及降钙素原前体T表位及其在癌症免疫疗法中的应用。
背景技术
由具有不同实体瘤的病人衍生的肿瘤反应性CTL的分析已经导致有前景的对于恶性疾病的新治疗方法，新的治疗或者通过在用IL-2将它们转移进入病人体内以前体外发展T细胞(GATTINONI et al.，Nat Rev Immunol，6，383-93，2006)、或者通过鉴别它们的随后能够被应用于治疗性疫苗的靶Ag而进行。人们已经鉴定了大量被来自PBL、或者来自肿瘤渗透性淋巴细胞(TIL)的CTL识别的与肿瘤有关的Ag。大部分这种工作是用恶性黑色素瘤肿瘤进行的。不幸的是，临床研究表明，尽管抗肿瘤CD8T细胞的频数提高了，但当前的治疗性疫苗的效果仍然限于转移性的黑素瘤病人(ROSENBERG et al.，Nat Med，10，909-15，2004)。目前的研究集中在更好地了解观察到的稀有的肿瘤退化机制(GERMEAU et al.，JExp Med，201，241-8，2005；LURQUIN et al.，J Exp Med，201，249-57，2005)、抗疫苗CD8T细胞的激活状态和它们迁移至肿瘤位点的能力，并且集中在确定控制肿瘤特异性的T细胞与肿瘤细胞和平共存的局部机制。
人们极少知道人类肺肿瘤对CTL攻击的抗原性和敏感性。这些肿瘤大部分是非小细胞肺癌瘤(NSCLC)、包括鳞状细胞(SCC)、腺细胞(ADC)和大细胞(LCC)癌瘤的一个大组。NSCLC能够被TCRα/βT细胞渗透(ECHCHAKIR et al.，Int Immunol，12，537-46，2000)。经鉴别的T细胞标靶Ag包括：被HER2/neu原致癌基因编码的肽(YOSHINO et al.，Cancer Res，54，3387-90，1994)，该肽在许多肺肿瘤中被过表达；以及被数种基因编码的肽，该基因被发现含有相对于自体正常细胞的在肿瘤细胞中的点突变。这些突变基因包括：延伸因子2(HOGAN et al.，Cancer Res，58，5144-50，1998)、苹果酸酶(KARANIKAS et al.，Cancer Res，61，3718-24，2001)、突变α-辅肌动蛋白-4(ECHCHAKIR et al.，Cancer Res，61，4078-83，2001)和NFYC(TAKENOYAMA et al.，Int J Cancer，118，1992-7，2006)。另外，数种癌症/生殖系基因在NSCLC中被表达(WEYNANTS et al.，Int J Cancer，56，826-9，1994；SHICHIJO et al.，Int J Cancer，64，158-65，1995；YOSHIMATSU et al.，J Surg Oncol，67，126-9，1998；JANG et al.，Cancer Res，61，7959-63，2001；GRUNWALD et al.，Int J Cancer，118，2522-8，2006)，这将导致肿瘤特异性Ag存在于癌细胞的表面。然而，迄今尚未在肺癌病人中发现自发的抗MAGE型Ag的T细胞反应。因此，新的肺癌Ag、尤其是被数种病人的肿瘤共享的那些Ag的识别将有助于在肺癌中新颖的疫苗接种策略的设计和免疫学监控。
大多数被CD8T细胞识别的抗原性肽来源于胞内成熟蛋白质的蛋白酶体的降解和它们被与抗原加工相关转运体(TAP)从胞液进入ER(内质网)的输送(参见ROCK &GOLDBERG，Annu Rev Immunol，17，739-79，1999)。得到9至10个氨基酸(a.a.)的肽可结合I类MHC(MHC-I)分子，然后被输送至细胞表面。数量不断增加的被肿瘤反应性T细胞识别的表位已经被报道由非经典的机制所导致，该机制在转录、拼接或翻译水平上起作用(参见MAYRAND & GREEN，Immunol Today，19，551-6，1998)。值得注意的是，许多肿瘤表位很少被在加工Ag、以及激活CD8T细胞的能力是独特的DC加工，但是DC它们可组成性地表达免疫蛋白酶体(MOREL et al.，Immunity，12，107-17，2000；CHAPATTE et al.，Cancer Res，66，5461-8，2006)。
本发明人已鉴别出在人类非小细胞肺癌瘤上被自体肿瘤渗透性淋巴细胞衍生的细胞毒性T淋巴细胞克隆识别的肽表位。发明人发现这一被表示为HLA-A2的肽是由降钙素原前体信号肽的羧基端区域衍生得到的，并且被蛋白酶体和与抗原加工相关转运体不相关地加工。
降钙素原前体被CALCA基因编码，CALCA基因还编码与α-降钙素基因相关的肽(α-CGRP)。该CALCA基因包括5个内含子和6个外显子，并且其最初的RNA转录产物显示出组织特异性的可选的拼接性(JONAS et al.，Proc Natl Acad Sci USA，82，1994-8，1985；ROSENFELD et al.，Nature，304，129-35，1983)。在甲状腺丙细胞中外显子1、2、3和4连接产生降钙素mRNA，同时外显子1、2、3、5和6形成在神经元细胞中的α-CGRPmRNA(MORRIS et al.，Nature，308，746-8，1984)。成熟的α-CGRP是内源的有37个氨基酸的血管舒张肽，其广泛分布在身体内(ZAIDI et al.，Crit Rev Clin Lab Sci，28，109-74，1990)。降钙素mRNA编码有141个氨基酸的前体蛋白质--降钙素原前体，其包括有25个残基的N-末端信号序列。信号序列的切割得到降钙素原，其含有116个氨基酸，包括N-末端区域(57个氨基酸)、降钙素本身(32个氨基酸)、以及C-末端肽-下钙素(katacalcin，21个氨基酸)(ROSENFELD et al.，Nature，304，129-35，1983)。降钙素原前体的信号序列还存在于α-CGRP前激素原。
降钙素是一种在“钙胁迫”(calcium stress)比如生长、怀孕和哺乳期间主要与保护骨骼有关的激素(STEVENSON et al.，Lancet，2，769-70，1979；AUSTIN & HEATH，N Engl JMed，304，269-78，1981)。已知降钙素可以被甲状腺髓样癌(MTC)并被一些肺癌瘤以较高水平产生(COOMBES et al.，Lancet，1，1080-3，1974；MILHAUD et al.，Lancet，1，462-3，1974)。提高的降钙素血浆水平在这些肿瘤中是诊断和预示性症状的指标(COOMBES et al.，Lancet，1，1080-3，1974)。基因CALCA在肺癌细胞中的异常表达不好理解，但其部分地由启动子脱甲基化(BAYLIN et al.，Cancer Res，46，2917-22，1986)以及转录抑制的丧失(SYMES et al.，FEBS Lett，306，229-33，1992)所导致。
已经有人建议使用随成熟降钙素多肽波动的树状细胞(DC)用于MTC的免疫疗法(SCHOTT et al.，Cancer Immunol Immunother，51，663-8，2002)。然而，直到现在不曾有人建议降钙素前体的其他区域可以扮演诱导抗肿瘤免疫反应的角色。
发明内容
因此，本发明的主题涉及构成被表示为MHC I的T表位的分离的免疫原性肽，其特征在于，其由降钙素原前体、并且更具体地说其信号肽中8至11个连续氨基酸的片段组成。
根据本发明优选的实施方式，所述肽包含序列(氨基酸为单字母代码)VLLQAGSLHA(SEQ ID NO：1)。优选地，所述肽选自下组：具有序列VLLQAGSLHA(SEQ ID NO：1)的肽、以及具有序列LVLLQAGSLHA(SEQ ID NO：2)的肽。
该肽能够任选地进一步被修饰，以便提高其免疫原性。例如，通过天然序列的一个或多个氨基酸被一个以上有利于对HLA-A2的亲合性和/或有利于肽/HLA-A2分子复合物的稳定性的氨基酸取代而进行修饰。
有利于对给定的MHC I分子的亲合性和/或有利于肽/HLA-A2分子复合物的稳定性的氨基酸可以，例如，由已知用于HLA-A2等位基因的锚定残基(anchor residues)、并且尤其是二级锚定残基组成。这些锚定残基能够通过查阅可利用的数据库比如SYFPEITHI base(Rammensee et al.，Immunogenetics，50，213-219，1999)、或者BIMAS base(Parker et al.，J.immunol.152，163，1994)而被容易地鉴别。
举例来说，取代有可能提高本发明的肽的免疫原性，述及的取代由下述方案组成：
-所述肽的N-末端氨基酸用酪氨酸，如PCT申请WO 02/08716所述、或者(就肽SEQID NO：1而言)用亮氨酸取代；
-肽SEQ ID NO：1的C-末端丙氨酸用缬氨酸或亮氨酸取代。
尤其优选的是，由SEQ ID NO：1衍生的修饰的肽是选自下组：YLLQAGSLHV(SEQID NO：10)、VLLQAGSLHV(SEQ ID NO：11)、VLLQAGSLHL(SEQ ID NO：12)和LLLQAGSLHV(SEQ ID NO：13)。
本发明的主题还涉及包含至少一种根据本发明的免疫原性肽的组合物。
它们可以是能够产生多特异性CTL反应的多表位组合物，并且同样地，它们还包含一个以上其他免疫原性表位。
这些其他免疫原性表位可以是被表示为MHC的肽，例如，由降钙素或α-CGRP、或者由一种以上其他抗原例如HER2/neu分离的免疫原性肽。
根据本发明的多表位组合物可以包含被表示为各种MHC I分子的表位，以使得它们能够在其个体携带不同HLA等位基因的种群上被广泛使用。另外，它们还可以包含至少一个被表示为MHC II分子、并且能够诱导T辅助反应的表位。
根据本发明的组合物的优选实施方式，其包含至少一种嵌合的多肽，所述多肽包含一个以上拷贝的融合于异源多肽(即，不是降钙素的一部分信号肽的多肽)的、根据本发明的免疫原性肽。
例如，就多表位组合物而言，所述异源序列还包含一个以上拷贝的至少一个其他免疫原性肽表位。而且，根据本发明的免疫原性肽能够被插入百日咳杆菌腺苷酸环化酶(CyA)中。由于CyA的受体是CD11b受体，并且因为树状细胞可表达CD11b受体，故这样一种构建体允许免疫原性肽被直接地靶向至树状细胞(DADAGLIO et al.，Int.Immunol，15，1423-1430，2003)。
通过本来已知的方法、尤其通过普通的重组DNA技术能够容易地获得嵌合多肽。
本发明还包括编码根据本发明的免疫原性肽或嵌合多肽的多聚核苷酸。
这些多聚核苷酸能够插入合适的表达载体中，在合适启动子的转录控制下，以便允许免疫原性肽或者嵌合多肽在寄主细胞或者生物体中表达。表达载体的选择取决于期望在其中进行表达的寄主细胞或者生物体。例如，对于在细菌中或者在真核生物中产生多肽，将使用分别具有细菌启动子或真核生物启动子的载体。假如意欲将多聚核苷酸给药于病人进行治疗，一个方案将优选裸露的DNA质粒、或者可引起瞬时表达的病毒载体比如腺病毒衍生载体、慢病毒衍生载体、或牛痘病毒衍生载体。
本发明的组合物还可以包含随本发明的肽或多表位组合物波动的、或者用本发明的多聚核苷酸转化、插入合适表达载体的树状细胞。
本发明的主题还涉及根据本发明的免疫原性肽表位、组合物或多聚核苷酸的应用，用于获得药用产物、尤其是打算用于抗癌免疫疗法的药用产品，并且尤其用于表达降钙素和/或α-CGRP的肿瘤的治疗。这尤其包括肺癌瘤，包括小细胞肺癌瘤以及非小细胞肺癌瘤和甲状腺髓样癌。
本发明的肽尤其能够用于获得打算用于HLA-A*0201病人治疗的药用产品。本发明还包括药用产品，其包含：作为有效物质的根据本发明的至少一种免疫原性肽，一种组合物或者一种多聚核苷酸。根据本发明的优选实施方式，所述药用产品是用于抗肿瘤免疫疗法的疫苗。根据本发明的药用产品还可以包含普通的赋形剂，并且还可以包含在免疫疗法中惯常使用的、并有可能例如促进有效物质给药的、使其稳定化的、提高其免疫原性等的辅助剂。合适的辅助剂的例子包括：CpG寡聚脱氧核苷酸、程序性细胞死亡诱导因子(AIF)、热休克蛋白(HSP)、用于激活未成熟树状细胞的Toll样受体(TLR)、以及细胞因子和趋化因子比如IL-7、IL-12、IL-15和粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
为了进一步改进由本发明的免疫原性肽引起的抗肿瘤反应，本发明的免疫原性肽能够进一步与其他抗肿瘤试剂组合使用。
作为非限定的实施例，它们能够与下述物质进行组合：
-趋化因子比如MIP3α(CCL20)和/或RANTES(CCL5)，其能够被注射在待治疗的肿瘤位点处，以便促进CTL朝向肿瘤迁移；
-使肿瘤细胞对凋亡诱导更敏感的细胞毒试剂，并且更多具体地讲，是：被EGF-R(表皮生长因子受体)启动的信号路径的抑制剂，例如野生型蛋白质p53、趋化因子SDF-1、1-甲基色氨酸(吲哚胺2-3二氧化酶抑制剂)；酪氨酸激酶抑制剂，比如埃罗替尼(erlotinib)；或者抗EGF-R的抗体，比如爱必妥(cetuximab)。
根据下述进一步的描述，本发明将被更彻底地理解。下述内容指的是非限制性实施例，其显示了在肺或MTC细胞中被CTL识别的降钙素原前体表位的鉴别。
附图说明
图1：A.CTL克隆Heu161对于肿瘤细胞IGR-Heu、自体的EBV转化的B细胞(Heu-EBV)和K562的细胞毒活性。在普通的4-h51Cr释放测定中一式三份进行溶细胞活性测量。显示了E/T比率。B.编码被CTL克隆识别的Ag的cDNA克隆的鉴别。Heu161被与含有cDNA克隆150的载体pCEP4和含有HLA-A*0201序列的载体pcDNA3.1共转染的293-EBNA细胞刺激。对照刺激细胞包括IGR-Heu、以及用cDNA 150或HLA-A2单独转染的293-EBNA。使用对TNF敏感的WEHI-164cl13细胞，测量在培养基中释放的TNFβ浓度。
图2：A.与降钙素和α-CGRP基因相比cDNA 150的表现以及转录产物。被标号的盒代表外显子。箭头指示在RT-PCR分析中使用的正向(O)和反向(R)引物。B.用于鉴别编码抗原性肽的区域的小基因(minigene)。制备平截的构建体系列，并且与HLA-A2cDNA共转染入293-EBNA细胞。对应的编码序列显示为：对应于SEQ ID NO：14的肽片段1-47、对应于SEQ ID NO：15的肽片段1-41、对应于SEQ ID NO：16的肽片段1-35、对应于SEQ ID NO：17的肽片段1-29、对应于SEQ ID NO：18的肽片段7-47、对应于SEQ ID NO：19的肽片段9-47、对应于SEQ ID NO：20的肽片段12-47、对应于SEQ IDNO：21的肽片段17-47、对应于SEQ ID NO：22的肽片段9-38、对应于SEQ ID NO：23的肽片段9-37。通过TNFβ分泌测定法评估CTL克隆Heu161的识别。
图3：被CTL克隆Heu161识别的抗原性肽的鉴别。A.用纯化的合成肽刺激CTL。在添加CTL克隆Heu161之前，在室温下肽被加载于异源的HLA-A2+MZ2-MEL.3.1黑素瘤细胞上60分钟。16h后测量TNF的释放。空心圆代表用肽SEQ ID NO：1获得的结果；实心圆代表用肽SEQ ID NO：2获得的结果；空心方块代表用肽SEQ ID NO：24获得的结果；实心方块代表用肽SEQ ID NO：25获得的结果；并且空心菱形代表用肽SEQ IDNO：26获得的结果。B.CTL克隆在随肽波动的细胞上的溶解活性。在以10∶1的E/T细胞比率添加CTL克隆Heu161之前，用被显示浓度的肽孵育用51Cr标记的Heu-EBV-B细胞60分钟。在4h后测量铬释放。空心圆代表用肽SEQ ID NO：1获得的结果；实心圆代表用肽SEQ ID NO：2获得的结果。
图4：降钙素原前体16-25肽的加工与蛋白酶体和TAP无关。A.在存在或者不含蛋白酶体特异性的抑制剂Epoxomicin的情况下于37℃下孵育IGR-Heu靶细胞2h，并且然后加入Heu161细胞。自体的Heu127克隆可在IGR-Heu上识别依赖蛋白酶体的突变α-辅肌动蛋白-4肽，其被包括作为阳性对照。按上述方法测量在培养24h后在培养基中释放的TNFβ。B.293-EBNA细胞用含有cDNA 150(上侧栏)或突变的α-辅肌动蛋白-4cDNA(下侧栏)的pCEP4、含有HLA-A*0201构建体的pcDNA3.1、以及不同含量的含有IPC47 cDNA的载体pBJi-neo共转染。然后加入CTL克隆Heu161(上侧栏)或者Heu127(下侧栏)。对照样包括用HLA-A2或者pBJi-neo-IPC47单独转染的293-EBNA细胞，并且转染子与降钙素原前体或α-辅肌动蛋白-4肽一起孵育。显示的数据代表四个独立实验。
图5：降钙素原前体16-25抗原性肽的加工涉及SP和SPP。
A.在添加抗降钙素原前体(左侧栏)或抗α-辅肌动蛋白-4(右侧栏)CTL克隆之前，IGR-Heu肿瘤细胞于37℃下与250μM的丝氨酸蛋白酶抑制剂二氯异香豆素(DCI)一起孵育2h。B.通过实时RT-PCR分析法来分析SPP mRNA的表达。从经电穿孔的或者不具有靶向SPP的siRNA(siRNA-S1、siRNA-S2)的IGR-Heu肿瘤细胞中萃取的总RNA通过在“材料和方法”部分所描述的TaqMan进行反转录并定量。C.在肿瘤细胞识别时SPP消失的效果。CTL克隆Heu161和Heu127抗经电穿孔的或不具有siRNA-S1、siRNA-S2或对照siRNA的IGR-Heu靶细胞的溶解活性。通过普通的4h51Cr释放测定法以标明的E/T比率来确定溶解活性。对于CTL克隆Heu161，显示了六个实验中两个有代表性的实验。D.通过用经电穿孔的或者不具有siRNA-S1或对照siRNA的肿瘤细胞刺激的Heu161和Heu127CTL克隆来生产IFNγ。E.降钙素原前体16-25抗原性肽定位于降钙素激素前体的信号序列的C端。被CTL克隆Heu161识别的最佳的肽被框了起来。箭头显示了信号肽酶(SP)和近似的信号肽肽酶(SPP)切割位点。通过使用SignalP 3.0软件预测在降钙素原前体信号肽中的n、h和c区域。
图6：A.CTL Heu161抗异源的MTC(TT)和SCLC(DMS53)细胞系的细胞毒活性。自体的IGR-Heu肿瘤细胞被包括作为阳性对照。B.通过CTL克隆Heu161识别被HLA-A2转染的DMS53细胞。在加入CTL克隆Heu161之前，DMS53细胞用含有HLA-A*0201的pcDNA3.1载体转染。C.表达降钙素的成熟DC的识别。通过使用磁珠，从HLA-A2健康供体的血液中分离单核细胞，并且在重组体IL-4(100ng/ml)和GM-CSF(250ng/ml)存在的条件下培养6天。在通过加入TNFα(20ng/ml)熟化另一个3天后，DC用载体pCEP4中的cDNA克隆150转染，并且24h后测量被Heu161释放的TNFβ的量。
具体实施方式
实施例1：材料和方法
NSCLC肿瘤细胞系和自体的CTL克隆的衍生物
按照之前报道的方法(ECHCHAKIR et al.，Cancer Res，61，4078-83，2001)，由病人Heu(HLA-A2、A68、B7、B35、C4、C7)的LCC样本衍生得到IGR-Heu NSCLC细胞系，并且保持在培养液中。按照文献(ECHCHAKIR et al.，Int Immunol，12，537-46，2000)描述的方法，由自体的TIL衍生得到Heu161克隆，并且在96孔V形的微量滴定板(Nunc，Roskilde，丹麦)中扩增。
细胞毒性测定和TNFβ释放
在圆形底部的96孔板中使用一式三份培养液，通过普通的4-h51Cr释放测定法来测量细胞毒活性。通常计算出比细胞毒性百分比；SD(标准偏差)＜5％。在细胞毒性测定中，IGR-Heu、Heu-EBV、K562(来源于慢性粒性白血病病人)、TT(HLA-A2.1+MTC；ECACC，萨利斯布里，英国)和DMS53(HLA-A2-SCLC；ECACC)细胞系被用作标靶。
用MTT比色测定法(ESPEVIK & NISSEN-MEYER，J Immunol Methods，95，99-105，1986)，通过测量培养基在对TNF敏感的WEHI-164c13上的细胞毒性来检测TNFβ。
cDNA文库的构建和筛选
按照之前报道的方法(ECHCHAKIR et al.，Cancer Res，61，4078-83，2001)，构建来自IGR-Heu肿瘤细胞的cDNA文库。简言之，使用Fastrack试剂盒(Invitrogen，Groningen，荷兰)，从IGR-Heu中萃取多聚(A)+RNA，并采用Superscript Choice System(Gibco BRL)，使用寡聚(dT)引物将其转变为cDNA。然后按照文献描述的方法(ECHCHAKIR et al.，CancerRes，61，4078-83，2001)，将cDNA连接至pCEP4质粒(Invitrogen)。重组质粒经电穿孔进入大肠杆菌DH5α，并且用氨苄青霉素筛选。该文库被分成大约100个cDNA克隆的池。每一个池被扩增，并且使用QIAprep8质粒试剂盒(QIAGEN Gmbh有限公司，Hilden，德国)萃取质粒DNA。使用LipofectAMINE试剂(Life Technologies)，用每个cDNA文库池的质粒DNA和含有HLA-A*0201 cDNA克隆的表达载体pcDNA1/Amp(Invitrogen)来共转染293-EBNA细胞(Invitrogen)。在24h后，加入CTL克隆Heu161(3,000个细胞/孔)。在另一个24h后，收集一半培养基，并且通过使用MTT比色测定法用WEHI-164c13细胞来测量其TNFβ含量。
序列分析和编码外显子的定位
在ABI 310自动DNA测序仪(Perkin Elmer Applied Biosystems，Warrington，英国)中，使用双脱氧链式法(dideoxy chain method)，对cDNA克隆150测序。在网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi上使用可利用的程序进行序列同源性的计算机检索。用软件(Intelligenetics，Mountain View，加利福尼亚州)进行系列比对。为了鉴别抗原性肽的编码区域，使用一系列引物对，通过PCR由cDNA克隆150来扩增一组cDNA片段。PCR条件是：94℃下3min；接着，94℃下1min、60℃下2min和72℃下3min，30个循环；以及最终的72℃下10min的延伸步骤。使用Eukaryotic TOPOTA克隆试剂盒(Invitrogen)，将这些PCR产物克隆入表达质粒pcDNA3.1。然后将构建体亚克隆进入pCEP4表达载体以便允许过量表达，并且与HLA-A2 cDNA克隆一起共转染进入293-EBNA细胞。
化学试剂和RNA干扰
对于蛋白酶体和SP抑制，106个肿瘤细胞被再悬浮于300μL含有或不含特定抑制剂的培养基中。简言之，将细胞与epoxomicin或DCI(Sigma，圣路易斯，密歇根州)一起于37℃下孵育2h，在磷酸缓冲盐水中洗涤，并且再悬浮于175μL的“酸性缓冲液”(0.263M柠檬酸和0.132M NaH2PO4按1∶1的混合物，pH 2.5)中50秒。然后通过加入RPMI 1640来中和细胞，离心，并且在含有或不含抑制剂的情况下于37℃下额外孵育3h。台盼蓝染色检验证实，在给定的浓度下，抑制剂都没有毒性。
对于SPP抑制，我们首先试验了半胱氨酸蛋白酶抑制剂Z-LL2酮(Calbiochem，Darmstadt，德国)，据报道其可特异性地阻断SPP活性(WEIHOFEN et al.，J Biol Chem，275，30951-6，2000)。在功能性测定中没有得到决定性的结果。因此我们使用可靶向人类SPP的siRNA--购自Ambion(Austin，得克萨斯州，美国)的siRNA-S1(5-GACAUGCCUGAAACAAUCAtt-3；SEQ ID NO：3)和siRNA-S2(5-UGAUUGUUUCAGGCAUGUCtg-3；SEQ ID NO：4)。无靶向性的siRNA(Ambion)被用作阴性对照(siRNA对照)。简言之，按照此前描述的方法(LE FLOC′H et al.，J Exp Med，2007)，通过电穿孔技术，在基因脉冲器Xcell电穿孔技术系统(Bio-Rad；300V，500F)中用50nM siRNA转染IGR-Heu细胞，然后允许培育72h。
RT-PCR分析
按照文献描述的方法(LAZAR et al.，J Clin Endocrinol Metab，84，3228-34，1999)，进行总RNA萃取和RT。使用位于开放阅读框(ORF)5′端的正向引物O(5′-ggt gtc atg ggc ttc caaaagt；SEQ ID NO：5)和位于ORF的3′端的反向引物R(5′-atc agc acattc aga agc agg a；SEQ ID NO：6)，用DNA聚合酶TaKaRaTaq(Takara Biomedicals，Shiga，日本)进行PCR扩增(图2A)。PCR条件是：94℃下5min；接着，94℃下1min、63℃下2min、72℃下2min，30个循环；和最后的72℃下10min的延伸步骤。我们检验发现，在这些条件中，我们的结果处于DNA扩增的线性范围内。用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶目测检验扩增DNA的数量。
使用位于外显子2的5′端的正向引物5′-atc ttg gtc ctg ttg cag gc(SEQ ID NO：7)、以及位于CALCA基因中外显子3的3′端的反向引物5′-tgg agc cct ctc tct ctt gct(SEQ ID NO：8)，进行定量PCR分析(Taq-man)。该Taq-man探针引物是Fam 5’-cct cct gct ggc tgc actggt g(SEQ ID NO：9)-3′Tamra。使用Primer Express(APPLIED BIOSYSTEM，Foster City，加州)和Oligo 4(National Biosciences，Plymouth，明尼苏达州)软件设计引物和探针。通过扩增内源的对照物(18S)，将RNA样本的量归一化。使用标准曲线方法(AppliedBiosystems User Bulletin 2，ABI PRISM 7700序列检测系统)推定出相对定量的转录产物。根据制造商的说明书，使用18SRNA引物和探针。根据生产厂商的说明书(LAZAR et al.，JClin Endocrinol Metab，84，3228-34，1999)，通过使用Taq-man Universal Master Mix以标准条件进行PCR扩增。
对于SPP mRNA表达，从用或未用可靶向SPP的siRNA-S1和siRNA-S2转染的IGR-Heu细胞中萃取总RNA。通过实时RT-PCR分析(TaqMan)进行反转录和定量。通过APPLIED BIOSYSTEM设计、并根据生产厂商的推荐使用PCR引物和探针。通过扩增内源的对照物(18S)，将RNA样本的量归一化。
实施例2：可识别自体肺癌瘤细胞的CTL克隆
病人Heu(HLA-A2+)是个在原发瘤切除11年后的目前无病的肺癌病人。LCC细胞系IGR-Heu来源于病人在1996年切除的肿瘤。分离可渗透原发瘤的单核细胞，并且用经辐照的IGR-Heu肿瘤细胞--经辐照的自体EBV转化的B细胞、以及IL-2进行刺激。通过限制稀释度来克隆应答的淋巴细胞，并且用肿瘤细胞和EBV-B细胞的相同混合物进行刺激。得到了数个肿瘤特异性的CTL克隆，并且基于它们的TCRVβ序列(ECHCHAKIR et al.，Int Immunol，12，537-46，2000)区分为三个组。我们先前报道说，头两组克隆(被表示为Heu127和Heu171)识别被α-辅肌动蛋白-4(ACTN4)基因中突变序列编码的抗原性肽(ECHCHAKIR et al.，Cancer Res，61，4078-83，2001；ECHCHAKIR et al.，Proc Natl Acad SciUSA，99，9358-63，2002)。此处，我们分析了第三组克隆，包括克隆Heu161，其可表达Vβ3-Jβ1.2TCR重排。CTL克隆Heu161溶解自体肿瘤细胞系，但是不溶解自体EBV-B细胞，也不溶解NK-靶K562(图1A)。抗HLA-A2mAb MA2.1抑制了CTL克隆对IGR-Heu的识别(数据未显示)。
实施例3：编码被HEU161克隆识别的抗原的基因的鉴别
用多聚(A)+RNA从IGR-Heu细胞中制备的cDNA文库被克隆入表达质粒pCEP4(ECHCHAKIR et al.，Cancer Res，61，4078-83，2001)。将该文库分成264个含有大约100个重组体克隆的池，并且由每个池制备DNA。用来自每个池的DNA和HLA-A*0201构建体共转染293-EBNA细胞。在24h后，将CTL克隆Heu161加至转染子；在又一个24h之后，收集上清液，并且用对TNF敏感的WEHI-164c13细胞测量它们的TNFβ含量(ESPEVIK& NISSEN-MEYER，J Immunol Methods，95，99-105，1986)。很大比例(85/264)的cDNA池证明呈阳性，该结果建议，惊人的高频率的大约0.4％的cDNA克隆编码Ag。一个cDNA池被亚克隆，并且称为150的cDNA克隆被分离(图1B)。
cDNA 150长956bp，并且含有聚腺苷酸化信号和聚(A)尾部。其序列对应于基因CALCA的序列，其编码降低钙量的激素降钙素和与降钙素基因相关的肽α(α-CGRP)。通过组织特异性的可选的RNA加工(AMARA et al.，Nature，298，240-4，1982)，将最初的转录产物拼接入降钙素或α-CGRP mRNA。cDNA 150含有完整的降钙素编码序列，其跨越基因CALCA的外显子2、3和4(图2A)。然而，其5′端不同于存在于数据库中的降钙素cDNA序列的5′端，不同之处在于存在213个核苷酸的内含子序列(数据未显示)。
实施例4：抗原性肽的鉴别
用克隆入表达质粒(参见材料和方法部分)的平截的cDNA片段鉴别编码抗原性肽的区域，并且与HLA-A2构建体共转染入293-EBNA细胞。如图2B所示，编码降钙素原前体中初始的41个残基的片段转移了Ag的表达，反之编码初始的35个残基的片段则没有转移Ag的表达。该结果建议，抗原性肽被包含于跨越蛋白质的残基27至41的区域中。然而，该区域不包含任何可识别的HLA-A2结合性基序，并且没有一组覆盖该区域的合成肽被CTL克隆识别(数据未显示)。
然后我们制备一系列在5′端平截的降钙素cDNA片段，并且设计成包含起始密码子和Kozak共有序列。用CTL克隆的筛选表明，抗原性肽被包含在残基9-47内(图2B)。另外，修剪(trimming)使得编码肽的区域变窄为残基9-38(图2B)。在一组覆盖该区域的重叠肽当中，仅两个被CTL克隆Heu161识别：VLLQAGSLHA(SEQ ID No：1)和LVLLQAGSLHA(SEQ ID No：2)，除了在后面的肽中具有附加的亮氨酸外，它们是相同的。如图3A所示，两种肽使HLA-A2+黑素瘤细胞对于被CTL Heu161识别变得敏感，用约10nM肽所获得最大值一半的效果。在溶解测定中，十聚体的肽比十一聚体的肽略微更有效，高大约三倍(图3B)。我们得出结论，被CTL克隆Heu161识别的最佳抗原性肽是VLLQAGSLHA(SEQ ID No：1)或降钙素原前体16-25。该肽精确地对应于降钙素原前体信号肽的C-末端部分(LE MOULLEC et al.，FEBS Lett，167，93-7，1984)。
实施例5：抗原性肽的加工
肽在蛋白质中的这种定位建议，其能够在ER(内质网)中被加工，与细胞质的蛋白酶体和TAP转运蛋白无关。为了检验蛋白酶体的参与，将IGR-Heu肿瘤细胞用特异性的蛋白酶体抑制剂epoxomicin处理(图4A)。使用10μM，我们观察到对抗降钙素原前体CTL克隆Heu161的识别无影响(图4A)。相反，epoxomicin强烈地抑制另一个自体CTL克隆Heu127的刺激，Heu127可识别突变的α-辅肌动蛋白-4肽(ECHCHAKIR et al.，CancerRes，61，4078-83，2001)。这是期望的，因为α-辅肌动蛋白-4是一种在蛋白酶体中至少部分地被降解的胞质蛋白质(GOLDBERG & ROCK，Nature，357，375-9，1992)。这些结果建议，降钙素原前体16-25肽的加工不需要蛋白酶体活性。
通过与编码抗原性肽、HLA-A2、以及1型单纯疱疹病毒的直接早期蛋白ICP47的构建体共转染入293-EBNA细胞，测试了TAP的参与。其中1型单纯疱疹病毒可结合并抑制人类TAP(BANKS et al.，Virology，200，236-45，1994)。如图4B所示，共转染ICP47对于抗降钙素原前体CTL识别转染子没有可检测到的影响，反之，其强烈地抑制抗α-辅肌动蛋白-4CTL克隆的识别。这些结果强烈地建议，降钙素原前体16-25表位的加工是不取决于TAP的。
而抗原性肽VLLQAGSLHA(SEQ ID No：1)的C端对应于降钙素原前体信号序列的C端(LE MOULLEC et al.，FEBS Lett，167，93-7，1984)。其被期望通过I型信号肽酶(SP)产生，I型信号肽酶可从在内质网膜上网眼(luminal)一侧分泌的蛋白质上切除信号肽(DALBEY et al.，Protein Sci，6，1129-38，1997)。使用丝氨酸蛋白酶抑制剂二氯异香豆素(DCI)测试了SP的参与，DCI可抑制从前体蛋白质上释放信号序列(RUSBRIDGE &BEYNON，FEBS Lett，268，133-6，1990)。显著地，IGR-Heu肿瘤细胞用DCI预孵育致使它们全部对抗降钙素原前体CTL克隆的溶解性有耐抗力(图5A)。相同的处理对于被抗α-辅肌动蛋白-4CTL克隆识别仅有中等的影响(图5A)，并且这可能是由MHC-I分子在经DCI处理的肿瘤细胞表面上降低的表达所导致的(数据未显示)。这些结果与SP在加工降钙素原前体16-25肽中的参与是相一致的。
在被SP切割后，一些呈II型、或环状、定向地插入内质网膜的信号序列能够被膜内丁氨二酸蛋白酶信号肽肽酶(SPP)进一步切割(参见文献(MARTOGLIO & DOBBERSTEIN，Trends Cell Biol，8，410-5，1998)中的综述)。因此我们试着用短干扰(si)RNA(参见材料和方法部分)特异性地破坏在IGR-Heu肿瘤细胞中的SPP表达。siRNA-S1和siRNA-S2可特异性地在RNA(图5B)和蛋白质(数据未显示)两种水平上抑制在IGR-Heu中的SPP表达。SPP的下调导致肿瘤细胞对于被抗降钙素原前体CTL克隆溶解的灵敏度急剧降低、但对于被抗α-辅肌动蛋白-4CTL克隆溶解的灵敏度没有降低(图5C)。当肿瘤细胞被用于通过CTL刺激IFNγ的产生时，观察到类似的抑制(图5D)。同时，这些结果表明，降钙素原前体16-25肽在被加载于HLA-A2分子上之前很可能在内质网内部被SP和SPP加工(图5E)。
实施例6：降钙素基因产物在肿瘤样本中的表达
按照材料和方法部分中描述的方法，通过RT-PCR分析，在一组肺癌瘤样本和细胞系中测试了降钙素转录产物的表达。通过用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶筛选出阳性样本。在209个肿瘤样本中有27个、并且在38个细胞系中有5个呈阳性(表I)。
表I：降钙素转录产物在肺肿瘤中的表达
然后在一些阳性样本上进行降钙素转录产物的定量基因表达分析，并且结果被归一化成18S RNA(表II)。在3个测试的细胞系(即LCC IGR-Heu、SCLC DMS53、以及甲状腺髓样癌(MTC)TT)中降钙素基因表达的水平比在正常人甲状腺中发现的水平高至少100倍。值得注意的是，在两个肺癌瘤细胞系中观察到的表达水平与在MTC细胞系中观察到的水平相似(表II)。在病人Heu(Heu-T)的肿瘤活检样本、以及在数种其他肺癌瘤样本比如ADC 8和ADC 14中也检测到降钙素转录产物的高水平表达(表II)。
表II：在肿瘤细胞系和活检样本中降钙素转录产物的相对表达。
接下来，我们希望证实CTL克隆Heu161还可以识别其他过表达降钙素基因产物的HLA-A2+细胞。如图6A所示，CTL Heu161有效地溶解HLA-A2+MTC细胞系TT。与IGR-Heu相比TT的较弱水平的溶解不能被解释为在CALCA基因表达水平中的差异(表II)，但可以解释为在粘附/共刺激的分子表面表达中的差异(LE FLOC′H et al.，J Exp Med，2007)。如期望的那样，CTL Heu161不会溶解HLA-A2-SCLC DMS53细胞，但是在用HLA-A2构建体转染后确实可识别这些细胞(图6B)。最后，来自于健康HLA-A2+供体的血液单核细胞的和用降钙素cDNA克隆转染的成熟DC强烈地激活CTL克隆Heu161(图6C)。我们由这些结果得出结论，在所有测试细胞，即NSCLC以及SCLC细胞、MTC细胞、黑素瘤细胞、293胚肾细胞和DC中，会发生抗原性肽降钙素原前体16-25的加工。因此，显然，以高水平表达降钙素转录产物的所有细胞能够被在此描述的CTL克隆识别。
在此我们使用定量RT-PCR分析证实，在数种NSCLC和SCLC细胞系中和在肺肿瘤活检样本中基因CALCA被以高水平表达。值得注意的是，降钙素和α-CGRP前激素原共享它们的被CALCA外显子2和3编码的75个N-末端残基，并且肽降钙素原前体16-25也是α-CGRP16-25肽原前体。因此，可能表达α-CGRP、但是不表达降钙素转录产物的细胞也可以被CTL比如Heu161识别。由于这个缘故，我们在外显子2和3中使用PCR引物，检测两种类型的CALCA转录产物。我们观察到，按照MTC细胞中描述的方法(MINVIELLEet al.，J Biol Chem，266，24627-31，1991)，IGR-Heu细胞还表达高水平的标准的α-CGRPmRNA、以及可选地拼接的对应于外显子1-3、外显子4的一部分以及外显子5-6的mRNA。
Claims (12)
1.组成被表示为MHC I的T表位的免疫原性肽，其特征在于，其选自下组：
a)肽序列：VLLQAGSLHA(SEQ ID NO：1)；
b)肽序列：LVLLQAGSLHA(SEQ ID NO：2)；
c)它们的具有下述取代的至少一种的衍生物：
-SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的N-末端氨基酸用酪氨酸取代，或者SEQ ID NO：1的N-末端缬氨酸用亮氨酸取代；
-SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的C-末端丙氨酸用缬氨酸或亮氨酸取代。
2.如权利要求1所述的免疫原性肽，其特征在于，其选自下组：YLLQAGSLHV(SEQID NO：10)、VLLQAGSLHV(SEQ ID NO：11)、VLLQAGSLHL(SEQ ID NO：12)和LLLQAGSLHV(SEQ ID NO：13)。
3.一种包含至少一个拷贝的如权利要求1或2所述肽的融合于异源多肽的嵌合多肽。
4.编码如权利要求1或2所述肽或者如权利要求3所述嵌合多肽的多聚核苷酸。
5.包含如权利要求1或2所述肽或者如权利要求4所述多聚核苷酸的组合物。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，其为多表位组合物，其还包括一个以上其他免疫原性肽或者一个以上编码所述其他免疫原性肽的多聚核苷酸。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，其包含如权利要求3所述的嵌合多肽或者编码所述嵌合多肽的多聚核苷酸，所述嵌合多肽包含至少一个拷贝的如权利要求1或2所述的肽和至少一个拷贝的另一种免疫原性肽。
8.包含树状细胞的组合物，其特征在于，所述树状细胞随如权利要求1或2所述的肽波动，并且任选地随一种以上其他免疫原性肽波动；或者被如权利要求4所述的多聚核苷酸转化。
9.如权利要求1或2所述肽、或者如权利要求3所述嵌合多肽、或者如权利要求4所述多聚核苷酸、或者如权利要求5至7中任一项所述组合物的应用，用于药物的制备。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物可用于抗肿瘤免疫疗法。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述药物可用于表达降钙素原前体和/或α-CGRP的肿瘤的免疫疗法。
12.如权利要求9至11中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物可用于HLA-A*0201病人的治疗。
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