CN101724609B - 一种提高发酵法生产pva降解酶产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高发酵法生产PVA降解酶产量的方法。通过在发酵过程中添加1，4-丁二醇，提高了PVA降解酶的产量。通过两步发酵法、三步发酵法，发酵结束后，PVA降解酶产量分别达到2.92U/mL和3.43U/mL，与不添加1，4-丁二醇相比，产量分别提高了2.6倍和3倍。本发明还具有操作简单、原料价格便宜等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高发酵法生产PVA降解酶产量的方法，属于发酵工程领域，具体来说是一种通过添加1，4-丁二醇提高发酵法生产PVA降解酶产量的方法。
背景技术
PVA降解酶是一个酶系，它们作用的共同效果是能降解PVA。目前已正式报道的PVA降解酶主要包含三个种类：PVA氧化酶(仲醇氧化酶)(EC1.1.3.30)、PVA脱氢酶(EC1.1.99.23)和氧化型PVA水解酶(β-双酮水解酶)(EC3.7.1.7)。近年还发现了专一性比较高的降解低醇解度PVA长链上残存乙酸酯键的PVA酯酶。目前对于PVA降解的研究主要集中在三个方面：1.筛选能够降解PVA的微生物；2.纯化PVA降解酶；3.克隆与PVA降解相关的基因。目前研究中的一个难点是PVA降解酶的酶活较低。现在主要有两种提高PVA降解酶产量的方法：1.筛选高产PVA降解酶的微生物；2.优化发酵条件。在PVA降解酶高产微生物的基础上，本技术通过一种特殊碳源(1，4-丁二醇)显著提高了PVA降解酶的产量，使其酶活水平达到了国内先进。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种提高发酵法生产PVA降解酶产量的方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：在微生物发酵生产PVA降解酶过程中，添加1，4-丁二醇。
所述1，4-丁二醇的添加方式为：以5.0g/L PVA和5.1g/L 1，4-丁二醇作为初始复合碳源。
所述1，4-丁二醇的添加方式为：以5.0g/L PVA作为唯一初始碳源，在发酵36h添加5.1g/L1，4-丁二醇；
所述1，4-丁二醇的添加方式为：以5.0g/L PVA作为唯一初始碳源，在发酵36h添加5.1g/L1，4-丁二醇，在发酵48h，添加5.0g/L PVA。
所述微生物为从无锡太平洋纺织厂PVA退浆车间下水道口筛选出一个可以彻底降解培养基中1g/L PVA的混合微生物体系(Chen J，Zhang Y，Du G-C，Hua Z-Z，Zhu Y，Biodegradation of polyvinyl alcohol by a mixed microbial culture，Enzyme Microb.Technol.，2007，40(7)，1686-1691)。
微生物发酵产PVA降解酶的培养基组成为：
基础培养基(g/L)：PVA 1799(平均分子量：113kDa，醇解度：99.0％)5.0，酵母粉2.0，K2HPO4 1.0，KH2PO4 0.125，MgSO4·7H2O 0.1，FeSO4·7H2O 0.05，CaCl2 0.025，NaCl 0.01，pH 7.5，121℃灭菌15min；
微生物发酵产酶的过程为：
液体种子培养方法：500mL三角瓶装50mL基础培养基，接种后在旋转式摇床上200r/min，30℃振荡培养36h；
两步发酵法：第一步，500mL三角瓶装50mL基础培养基，接种后在旋转式摇床上200r/min，30℃振荡培养；第二步，发酵36h添加5.1g/L 1，4-丁二醇；
三步发酵法：第一步，500mL三角瓶装50mL基础培养基，接种后在旋转式摇床上200r/min，30℃振荡培养；第二步，发酵36h添加5.1g/L 1，4-丁二醇；第三步，发酵48h添加5.0g/L PVA。
PVA含量测定采用Finley法，其具体方法为：
将发酵液离心(10000r/min，10min)，弃去沉淀，收集上清液。将上清液经微孔滤膜(孔径0.45μm，直径50mm)过滤，然后用0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH 8.0)透析24h，即为粗酶液。在5×15试管中加入0.5mL粗酶液和0.5mL底物(1g/L PVA1799溶于pH 8.0的磷酸钾缓冲液中)，将此混合体系于35℃反应6h，分别测定反应前后反应混合液所对应PVA含量的吸光度。每分钟吸光度下降0.001定义为一个酶活单位。
细胞干重测定方法为：
将每个三角瓶中的发酵液过滤，收集菌体于滤纸上，去离子水洗两次，在105℃烘箱中烘至恒重，称量所得数值减去预先称量好的滤纸的重量即为细胞干重。
发明的技术原理：
本发明采用的原料1，4-丁二醇是PVA的结构类似物，它在细胞内的代谢途径和PVA类似，因此它不会抑制PVA降解酶的产生；同时它作为一种小分子碳源容易被微生物吸收利用，能提高微生物的生物量。所以1，4-丁二醇通过提高微生物的生物量，从而显著提高PVA降解酶的产量。
本发明的有益效果：
本发明提高发酵法生产PVA降解酶的产量，PVA降解酶产量从1.11U/mL高到3.43U/mL，为PVA降解酶的工业化生产提供了一种方法。本发明还具有操作简单、原料价格便宜、效果明显等优点。
具体实施方式
对比例1
培养基组成：
基础培养基(g/L)：PVA 1799(平均分子量：113kDa，醇解度：99.0％)5.0，酵母粉2.0，K2HPO4 1.0，KH2PO4 0.125，MgSO4·7H2O 0.1，FeSO4·7H2O 0.05，CaCl2 0.025，NaCl 0.01，pH 7.5，121℃灭菌15min。
微生物培养方法：
500mL三角瓶装50mL基础培养基，接种后在旋转式摇床上200r/min，30℃振荡培养36h。
结果见表1，在不添加1，4-丁二醇的情况下，混合体系发酵结束后，菌体干重达到1.17g/L，PVA降解酶活力为1.11U/mL。
表1混合碳源对混合微生物产PVA降解酶的影响
DCW：细胞干重，PVADE：PVA降解酶。
对比例2：
培养基组成：
PVA和葡萄糖培养基(g/L)：PVA 1799(平均分子量：113kDa，醇解度：99.0％)5.0，葡萄糖6.8，酵母粉2.0，K2HPO4 1.0，KH2PO4 0.125，MgSO4·7H2O 0.1，FeSO4·7H2O 0.05，CaCl2 0.025，NaCl 0.01，pH 7.5，121℃灭菌15min。
微生物培养方法：
500mL三角瓶装50mL PVA和葡萄糖培养基，接种后在旋转式摇床上200r/min，30℃振荡培养36h。
结果见表1，在以PVA和葡萄糖作为复合碳源的情况下，混合体系发酵结束后，菌体干重达到0.98g/L，PVA降解酶活力为1.16U/mL。
对比例3：
培养基组成：
PVA和淀粉(g/L)：PVA 1799(平均分子量：113kDa，醇解度：99.0％)5.0，可溶性淀粉6.2，酵母粉2.0，K2HPO4 1.0，KH2PO4 0.125，MgSO4·7H2O 0.1，FeSO4·7H2O 0.05，CaCl20.025，NaCl 0.01，pH 7.5，121℃灭菌15min。
微生物培养方法：
500mL三角瓶装50mL PVA和淀粉培养基，接种后在旋转式摇床上200r/min，30℃振荡培养36h。
结果见表1，在以PVA和可溶性淀粉作为复合碳源的情况下，混合体系发酵结束后，菌体干重达到0.99g/L，PVA降解酶活力为1.33U/mL。
实施例1：含有1，4-丁二醇的复合碳源培养基
培养基组成：
PVA和1，4-丁二醇培养基(g/L)：PVA 1799(平均分子量：113kDa，醇解度：99.0％)5.0，1，4-丁二醇5.1，酵母粉2.0，K2HPO4 1.0，KH2PO4 0.125，MgSO4·7H2O 0.1，FeSO4·7H2O 0.05，CaCl2 0.025，NaCl 0.01，pH 7.5，121℃灭菌15min。
微生物培养方法：
培养方法：500mL三角瓶装50mL PVA和1，4-丁二醇培养基，接种后在旋转式摇床上200r/min，30℃振荡培养36h。
结果见表1，在以PVA和葡萄糖作为复合碳源的情况下，混合体系发酵结束后，菌体干重达到1.40g/L，PVA降解酶活力为2.12U/mL，相对于对比例，菌体干重与PVA降解酶活力均有较大幅度提高。
实施例2：
培养基组成：
基础培养基(g/L)：PVA 1799(平均分子量：113kDa，醇解度：99.0％)5.0，酵母粉2.0，K2HPO4 1.0，KH2PO4 0.125，MgSO4·7H2O 0.1，FeSO4·7H2O 0.05，CaCl2 0.025，NaCl 0.01，pH 7.5，121℃灭菌15min。
微生物培养方法：
两步发酵法：第一步，500mL三角瓶装50mL基础培养基，接种后在旋转式摇床上200r/min，30℃振荡培养；第二步，发酵36h添加5.1g/L1，4-丁二醇。
结果见表1，发酵结束后，细胞干重和PVA降解酶的产量都得到了提高，菌体干重达到1.66g/L，PVA降解酶的活力达到2.92U/mL。
实施例3：
培养基组成：
基础培养基(g/L)：PVA 1799(平均分子量：113kDa，醇解度：99.0％)5.0，酵母粉2.0，K2HPO4 1.0，KH2PO4 0.125，MgSO4·7H2O 0.1，FeSO4·7H2O 0.05，CaCl2 0.025，NaCl 0.01，pH 7.5，121℃灭菌15min。
微生物培养方法：
三步发酵法：第一步，500mL三角瓶装50mL基础培养基，接种后在旋转式摇床上200r/min，30℃振荡培养；第二步，发酵36h添加5.1g/L 1，4-丁二醇；第三步，发酵48h添加5.0g/L PVA。
结果见表1，发酵结束后，菌体干重达到1.88g/L，PVA降解酶酶活达到了3.43U/mL，与起始的1.11U/mL相比提高了3倍。
Claims (4)
1.一种提高发酵法生产PVA降解酶产量的方法，采用可以彻底降解培养基中1g/L PVA的混合微生物体系，其特征在于，以PVA为初始碳源在微生物发酵生产PVA降解酶过程中添加1，4-丁二醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述添加1，4-丁二醇的方法为：以5.0g/L PVA和5.1g/L 1，4-丁二醇作为初始碳源。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述添加1，4-丁二醇的方法为：以5.0g/L PVA作为唯一初始碳源，在发酵36h向发酵液中添加5.1g/L 1，4-丁二醇。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述添加1，4-丁二醇的方法为：以5.0g/L PVA作为唯一初始碳源，在发酵36h向发酵液中添加5.1g/L 1，4-丁二醇，在发酵48h向发酵液中添加5.0g/L PVA。
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