CN101718781A - 检测人血清IgG的同步散射光谱试剂盒及使用方法 - Google Patents

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孙双娇
李纪顺
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Abstract

本发明公开了一种用于检测人血清IgG的同步散射光谱试剂盒及使用方法，本试剂盒由下述三种试剂组成，其中试剂1含pH6.0～8.0的Tris-HCl缓冲溶液和30.0～50.0mg/mL PEG20000溶液，试剂2为250μg/ml羊抗兔IgG，试剂3为兔IgG校准品。本试剂盒的测试步骤为：(1)制备标准曲线；(2)制备检测样品测试体系；(3)用样品的最终同步散射值参照标准曲线，求到最终浓度值。本发明试剂盒可以精确定量检测IgG，具有操作简便、快速、灵敏、检出限低、线性范围宽，不需繁琐的相分离步骤，样品消耗量少的优点。

Description

检测人血清IgG的同步散射光谱试剂盒及使用方法
技术领域
本发明涉及生化分析技术领域，具体是一种用于检测人血清IgG的同步散射光谱试剂盒及使用方法。
背景技术
免疫球蛋白G(IgG)是血清中一类重要的免疫球蛋白。它具有中和毒素和病毒，激活补体，凝集等功能。目前测定IgG主要有化学发光法、电化学法等。同步散射(RS)光谱分析具有灵敏度高和简便等特点，已用于蛋白质分析、生化和纳米微粒研究等。在蛋白质的RS分析中，所用试剂多为磺酸基和羧基的酸性染料如酸性三苯甲烷类染料、酸性占吨染料、酸性偶氮染料，其灵敏度较高。但该类方法主要基于小分子的缔合作用，其选择性不好。因此，将高选择性反应与RS检测结合是提高其选择性的重要途径之一。已知免疫反应和催化反应具有较高的选择性。它们与RS检测结合可望获得高灵敏度和高选择性的分析新方法。目前，在众多检测IgG的方法中，只有免疫透射比浊法有商品化的试剂盒，该试剂盒使用简便，但是线性范围窄，而且灵敏度不高，限制了其在检测低浓度样品中的应用。
发明内容
本发明的目的是要提供一种用于检测人血清IgG的同步散射光谱试剂盒及该试剂盒的使用方法，这种试剂盒操作简便快速、灵敏，检出限低，检测浓度范围宽，且样品消耗量少。
实现本发明目的的技术方案是：
本发明的原理是：基于羊抗兔IgG与兔IgG发生特异性反应后，免疫复合物可聚集形成疏水的免疫复合物微粒，该免疫复合物与PEG之间存在较强的分子间作用力和疏水作用力而自动聚集形成免疫复合物-PEG颗粒和固液界面，从而使体系的散射信号增强，增强的同步散射强度增强值与IgG浓度成正比，通过测定同步散射强度增强值，可对照标准工作曲线确定样品中IgG的含量。
一种用于检测人血清IgG的免疫金同步散射光谱试剂盒，由下列三种试剂组成，其中试剂1含0.04～0.06mol/L Tris、0.0275～0.045mol/L HCl和30.0～50.0mg/mL PEG20000溶液；试剂2为250μg/ml羊抗兔IgG；试剂3为兔IgG校准品。
本试剂盒测定的线性范围为1.0μg/ml-133μg/ml，相关系数为0.9966，检出限为0.5μg/ml。
储存与有效期：试剂避光储存于4℃冰箱中，可稳定半年。
用于检测人血清IgG的免疫金同步散射光谱试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
1、制备标准曲线
(1)准备6支试管，每支试管加入800μL试剂1，混匀；
(2)每支试管加入300uL试剂2，混匀；
(3)各试管依次加入不同体积的试剂3，第一管不加IgG校准品作为空白对照管；
(4)每支试管加入蒸馏水定容，使每根试管溶液最终体积为3.0mL，混匀后，在超声波反应器中37℃温育30min后，取适量于石英池中，置于荧光分光光度计上，在激发波长等于发射波长的条件下同步扫描，得到体系的同步散射光谱，确定其同步散射峰，分别测定每一管同步散射峰处的同步散射光强度；
(5)结果处理：多点定标法，以第一管同步散射光强度作为试剂空白值Ib，每一个样本的同步散射值为I，最终同步散射值ΔI按下式计算：最终同步散射值ΔI＝I-Ib，以IgG浓度为横坐标，最终同步散射值ΔI为纵坐标绘制工作曲线；
2、制备检测样品测试体系
用步骤1的(1)～(4)测得样品测试体系的最终同步散射值ΔI样；
3、用样品的最终同步散射值参照标准曲线，求到最终浓度值。
本发明的优点是：本试剂盒操作简便、快速、灵敏、检出限低、检测浓度范围宽，不需繁琐的相分离步骤，样品消耗量少，适用于大多数生物样品分析。
具体实施方式：
下面用具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例
主要仪器和试剂：5mL刻度试管若干，可加0～1000μL的加样枪一支，RF-540型荧光分光光度计(日本岛津)。试剂1含0.045mol/L Tris和0.04mol/L HCl和40.0mg/mL PEG20000溶液，试剂2含250μg/ml羊抗兔IgG(上海午立生物技术公司)；试剂3含3000ug/mL的兔IgG校准品(上海午立生物技术公司)，所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。样品人血清由桂林市第五医院提供。
测定方法包括如下步骤：
1、制备标准曲线
(1)准备6支试管，每支试管加入800μL试剂1，混匀；
(2)每支试管加入300μL试剂2，混匀；
(3)各试管依次加入10.0μL、20.0μL、40.0μL、80.0μL、120.0uL浓度为3000μg/mL的试剂3兔IgG校准品，其中第一管不加兔IgG作为空白对照管；
(4)每支试管加入蒸馏水定容，使每根试管溶液最终体积为3.0mL，混匀后，在超声波反应器中37℃温育30min后，取适量于石英池中，置于荧光分光光度计上，用低灵敏档，纵坐标为6，同步扫描激发波长λex和发射波长λem(λex＝λem)，得到体系的同步散射光谱，确定其同步散射波峰为470nm，分别测定每一管同步散射峰处的同步散射光强度；
(5)以第一管同步散射光强度作为试剂空白值Ib，每一个样本的同步散射值为I，最终同步散射值ΔI按下式计算：最终同步散射值ΔI＝I-Ib。以IgG浓度为横坐标，最终同步散射值ΔI为纵坐标绘制工作曲线；回归方程为ΔI＝0.269c+0.34，线性范围是1.0～133μg/ml，相关系数为0.9966；
2、制备检测样品测试体系
取人血清样品和标准体系一样的顺序测定样品，求得其ΔI样；
3、根据同步散射值ΔI样对照标准曲线，求得最终浓度值；
本发明的检出限为0.5μg/ml。
对比试验，本发明血清样品测定结果与免疫比浊法测定结果相对照，结果基本一致，证明了本发明的可靠性。

Claims (3)

1.一种检测人血清IgG的同步散射光谱试剂盒，其特征是：它由下述三种试剂组成，其中试剂1含0.04～0.06mol/L Tris、0.0275～0.045mol/L HCl和30.0～50.0mg/mL PEG20000溶液，试剂2为250μg/ml羊抗兔IgG；试剂3为兔IgG校准品。
2.权利要求1所述的试剂盒的使用方法，其特征是：包括以下步骤：
(1)制备标准曲线
1)准备6支试管，每支试管加入800μL试剂1，混匀；
2)每支试管加入300μL试剂2，混匀；
3)各试管依次加入不同体积的试剂3，第一管不加IgG作为空白对照管；
4)每支试管加入蒸馏水定容，使每根试管溶液最终体积为3.0mL，混匀后，在超声波反应器中37℃温育30min后，取适量于石英池中，置于荧光分光光度计上，在激发波长等于发射波长的条件下同步扫描，得到体系的同步散射光谱，确定其同步散射峰，分别测定每一管同步散射峰处的同步散射光强度；
5)结果处理：多点定标法，以第一管同步散射光强度作为试剂空白值Ib，每一个样本的同步散射值为I，最终同步散射值ΔI按下式计算：最终同步散射值ΔI＝I-Ib，以IgG浓度为横坐标，最终同步散射值ΔI为纵坐标绘制工作曲线；
(2)制备检测样品测试体系
用步骤(1)的1)～4)测得样品测试体系的最终同步散射值ΔI样；
(3)用样品的最终同步散射值参照标准曲线，求到最终浓度值。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是：本试剂盒测定的线性范围为1.0μg/ml-133μg/ml，相关系数为0.9966，检出限为0.5μg/ml。
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