CN101717759A - 利用干燥剂提高生物大分子结晶条件筛选成功率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用干燥剂提高生物大分子结晶条件筛选成功率的方法，首先用缓冲液溶解生物大分子，使生物大分子的终浓度达到2～40mg/ml；使用结晶筛选试剂与生物大分子溶液混合构建生物大分子结晶筛选溶液体系；使用干燥剂代替通常气相扩散法使用的池液，用于浓缩生物大分子结晶液滴，实现生物大分子的结晶。由于在气相扩散法中采用干燥剂代替池液进行浓缩结晶液滴的方式，可使蛋白质结晶条件筛选成功率由传统方法的4～10％提高至20～50％。同时，由于不再使用池液，以池液体积150微升计算，筛选试剂消耗成本大幅下降至原成本的百分之一以下。

Description

利用干燥剂提高生物大分子结晶条件筛选成功率的方法

技术领域

本发明涉及一种提高生物大分子结晶条件筛选成功率的方法，特别是利用干燥剂提高生物大分子结晶条件筛选成功率的方法。

背景技术

正在进行的结构基因组计划的数据显示，从基因克隆到解析出结构，成功率很低。其中限制成功率的关键问题之一是难以获得生物大分子的结晶条件。

为了获得生物大分子结晶条件，通常的做法是使用大量筛选试剂(即结晶剂)分别与生物大分子溶液混合，以试错方式寻找其中可以促使生物大分子结晶的溶液条件。文献“Sparsematrix sampling：a screening method for crystallization of proteins.1991，Vol.24：409-411”发展了至今广泛使用的以气相扩散法为主要手段的Sparse Matrix Sampling技术。该研究选择Hampton Research公司货号为HR2-110的Crystal Screen结晶试剂盒构建结晶溶液体系，统计了数种蛋白质在50种结晶剂缓冲液中的结晶成功率。筛选成功率为所用结晶条件中成功获得晶体的条件所占的比例。其中溶菌酶结晶成功率为10％，过氧化氢酶结晶成功率为10％，核糖核酸酶A结晶成功率为8％，胰岛素结晶成功率为4％。

气相扩散法是最常用的生物大分子结晶条件筛选手段，常用的具体方法是悬滴法和坐滴法。气相扩散法使用一个密封的气相扩散体系，该体系包含体积大、结晶剂浓度高的池液(不含生物大分子)，及体积小、结晶剂浓度低，但溶有生物大分子的液滴(称为液滴，下同)。由于液滴中结晶剂浓度低，其溶剂将向结晶剂浓度高的池液扩散，使液滴中生物大分子和结晶剂的浓度不断增加，直到液滴与池液的蒸汽压相等，达到平衡为止。在此过程中，液滴中生物大分子和结晶剂浓度增加到合适水平时，发生形核，从而实现结晶。

气相扩散法使用一定结晶剂浓度的池液，用以平衡液滴。如果该池液不能将液滴浓缩至生物大分子形核的过饱和度，则即使所使用的筛选试剂能在更高浓度下实现结晶，但在实际筛选时，由于浓度不能达到形核的过饱和度水平，因此得不到晶体。如此将导致结晶条件筛选时遗漏该条件，使最终的结晶成功率下降。

发明内容

为了克服现有技术生物大分子结晶条件筛选技术结晶成功率低的问题，本发明提供一种提高生物大分子结晶条件筛选成功率的方法。该方法利用干燥剂的强吸湿作用，在气相扩散法中，使用干燥剂代替池液，起到高度浓缩液滴的作用，使液滴的浓度范围大幅扩展，以此提高生物大分子结晶筛选的成功率。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：一种提高生物大分子结晶条件筛选成功率的方法，其特点是包括下述步骤：

(a)用缓冲液溶解生物大分子，使生物大分子的终浓度达到2～40mg/ml；

(b)用缓冲液对生物大分子溶液混合构建生物大分子结晶筛选溶液体系结晶条件进行筛选；

(c)使用坐滴板，在每深孔中加入干燥剂，使用自动移液系统将1μl筛选结晶剂和1μl蛋白质溶液混合为结晶液滴，滴在小坐滴孔中，密封结晶板；

(d)将结晶板放入控温箱，恒温20℃，放置4天后，在显微镜下观察，统计出获得溶菌酶晶体的条件数目。

本发明的有益效果是：在气相扩散法中采用干燥剂代替池液进行浓缩结晶液滴的方式，可使蛋白质结晶条件筛选成功率由传统方法的4～10％提高至20～50％。同时，由于不再使用池液，以池液体积150微升计算，筛选试剂消耗成本大幅下降至原成本的百分之一以下。

下面结合实施例对本发明作详细说明。

具体实施方式

实施例1：溶菌酶结晶条件的筛选。

第一步：将经过六次重结晶的日本Seikagaku公司的货号为100940的溶菌酶，溶于pH为7.00，0.025mol/L HEPES-Na缓冲液中，使其终浓度为10mg/ml，用0.22μm的滤膜滤去杂质。

第二步：本实施例用Hampton公司货号为HR2-110的Crystal Screen试剂盒的50种结晶缓冲液对溶菌酶结晶条件进行筛选。

第三步：使用坐滴板，每深孔中加入5mg的硅胶变色干燥剂代替池液。使用自动移液系统将1μl筛选结晶剂和1μl蛋白质溶液混合为结晶液滴，滴在小坐滴孔中，密封结晶板。

第四步：将结晶板放入控温箱，恒温20℃，放置4天后，在显微镜下观察，统计出获得溶菌酶晶体的条件数目。

经过统计得到如下结果：筛选条件中的25种条件出现溶菌酶晶体，结晶成功率为50％，与文献报道的传统气相扩散法结晶条件的结果相比，成功率提高至原水平的5倍。

实施例2：过氧化氢酶结晶条件的筛选。

第一步：将美国Sigma公司货号为C0615的过氧化氢酶，溶于pH为7.00，0.025mol/LHEPES-Na缓冲液中，使其终浓度为10mg/ml，用0.22μm的滤膜滤去杂质。

第二步：本实施例用Hampton公司货号为HR2-110的Crystal Screen试剂盒的50种结晶缓冲液对过氧化氢酶的结晶条件进行筛选。

第三步：使用坐滴板，每深孔中加入5mg的硅胶变色干燥剂代替池液。使用自动移液系统将1μl筛选结晶剂和1μl蛋白质溶液混合为结晶液滴，滴在小坐滴孔中，密封结晶板。

第四步：将结晶板放入控温箱，恒温20℃，放置4天后，在显微镜下观察，统计出获得过氧化氢酶晶体的条件数目。

经过统计得到如下结果：有16种结晶条件出现了过氧化氢酶晶体，结晶成功率为32％。与文献报道的传统气相扩散法结晶条件的结果相比，成功率提高至原水平的3.2倍。

实施例3：核糖核酸酶A结晶条件的筛选。

第一步：将美国Sigma公司货号为R5500的核糖核酸酶A，溶于pH为7.00，0.025mol/LHEPES-Na缓冲液中，使其终浓度为10mg/ml，用0.22μm的滤膜滤去杂质。

第二步：本实施例用Hampton公司货号为HR2-110的Crystal Screen试剂盒的50种结晶缓冲液对核糖核酸酶A的结晶条件进行筛选。

第三步：使用坐滴板，每深孔中加入5mg的硅胶变色干燥剂代替池液。使用自动移液系统将1μl筛选结晶剂和1μl蛋白质溶液混合为结晶液滴，滴在小坐滴孔中，密封结晶板。

第四步：将结晶板放入控温箱，恒温20℃，放置4天后，在显微镜下观察，统计出获得核糖核酸酶A晶体的条件数目。

经过统计得到如下结果：有7种结晶条件出现了核糖核酸酶A晶体，结晶成功率为14％。与文献报道的传统气相扩散法结晶条件的结果相比，成功率提高至原水平的1.75倍。

实施例4：胰岛素结晶条件的筛选。

第一步：将美国Sigma公司货号为I5500的胰岛素，溶于1mol/L的氨水中，使其终浓度为20mg/ml，用0.22μm的滤膜滤去杂质。

第二步：本实施例用Hampton公司货号为HR2-110的Crystal Screen试剂盒的50种结晶缓冲液对胰岛素的结晶条件进行筛选。

第三步：使用坐滴板，每深孔中加入5mg的硅胶变色干燥剂代替池液。使用自动移液系统将1μl筛选结晶剂和1μl蛋白质溶液混合为结晶液滴，滴在小坐滴孔中，密封结晶板。

第四步：将结晶板放入控温箱，恒温20℃，放置4天后，在显微镜下观察，统计出获得胰岛素晶体的条件数目。

经过统计得到如下结果：筛选条件中的26种条件出现胰岛素酶晶体，结晶成功率为52％。与文献报道的传统气相扩散法结晶条件的结果相比，成功率提高至原水平的13倍。

Claims (1)

1.一种利用干燥剂提高生物大分子结晶条件筛选成功率的方法，其特征在于包括以下步骤：

(a)用缓冲液溶解生物大分子，使生物大分子的终浓度达到2～40mg/ml；

(b)用缓冲液对生物大分子溶液混合构建生物大分子结晶筛选溶液体系结晶条件进行筛选；

(c)使用坐滴板，在每深孔中加入干燥剂，使用自动移液系统将1μl筛选结晶剂和1μl蛋白质溶液混合为结晶液滴，滴在小坐滴孔中，密封结晶板；

(d)将结晶板放入控温箱，恒温20℃，放置4天后，在显微镜下观察，统计出获得溶菌酶晶体的条件数目。