CN101717736A - 一种超高通透性面包酵母及其制备方法 - Google Patents

一种超高通透性面包酵母及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101717736A
CN101717736A CN200910272505A CN200910272505A CN101717736A CN 101717736 A CN101717736 A CN 101717736A CN 200910272505 A CN200910272505 A CN 200910272505A CN 200910272505 A CN200910272505 A CN 200910272505A CN 101717736 A CN101717736 A CN 101717736A
Authority
CN
China
Prior art keywords
minutes
gene
bread
cwp2
yeast
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN200910272505A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101717736B (zh
Inventor
肖伟
戴和平
张敏
张晓华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Hydrobiology of CAS
Original Assignee
Institute of Hydrobiology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Hydrobiology of CAS filed Critical Institute of Hydrobiology of CAS
Priority to CN 200910272505 priority Critical patent/CN101717736B/zh
Publication of CN101717736A publication Critical patent/CN101717736A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101717736B publication Critical patent/CN101717736B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种超高通透性面包酵母及其制备方法，涉及模式生物面包酵母，可用于检测环境遗传毒性致癌物。该酵母通过遗传基因技术改造，提高了通透性，使其对环境污染物的检测范围更广、灵敏度更高。通过基因敲除技术，失活编码面包酵母细胞壁重要结构蛋白甘露糖蛋白的基因CWP1和CWP2，提高面包酵母细胞对环境致癌物的通透性；以及失活编码面包酵母细胞膜上外排泵蛋白的基因SNQ2和PDR5，提高面包酵母细胞对环境污染物在细胞内的积累。将上述两种改造策略整合，在cwplcwp2snq2pdr5四基因敲除面包酵母菌中构建RNR3-lacZ系统，可提高该系统检测环境中遗传毒性致癌物的灵敏度。

Description

一种超高通透性面包酵母及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，尤其涉及经过遗传基因改造的微生物对环境污染物的监测。
背景技术：
面包酵母是一种简单真核生物，单细胞，遗传改造操作简单，培养简便快速且环境友好。面包酵母不仅是发酵工业中主导菌种，也是一种模式生物被广泛地应用于生命科学研究中。目前在环境污染检测技术领域中，面包酵母作为一种简单真核生物越来越被受到重视，一些以面包酵母为模式生物的检测系统得到了发展。但是酵母细胞的通透性问题却是限制发展酵母细胞应用于环境污染检测的瓶颈。
环境中的污染物大分子通常以较低浓度存在，由于面包酵母细胞壁的通透性障碍以及细胞膜的多药性耐受途径能够将细胞内毒性物质排出，限制了环境大分子污染物在面包酵母细胞内的积累，从而降低了以面包酵母为模式生物的环境污染检测系统的灵敏度；一些分子量大的化学物甚至不能自由通过面包酵母细胞壁，无法被该系统检测到。因此如何提高酵母细胞的通透性，又不影响细胞的活力，是解决问题的关键。
酵母细胞具有细胞壁，可维持细胞的一定形态、增强细胞的机械强度，并且与细胞的通透性有关。面包酵母细胞壁的厚度为25～70nm，重量约占细胞干重的25％，主要成分为葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质和几丁质，另有少量脂质。它们在细胞壁上自外至内的分布次序是甘露聚糖、蛋白质、葡聚糖。葡聚糖(glucan)位于细胞壁的内层，是赋予面包酵母细胞机械强度的主要物质。甘露聚糖(mannan)是甘露糖分子以α-(1→6)相连的分枝状聚合物，位于细胞壁外侧，呈网状，若把它去除后，细胞仍维持正常形态。且更为重要的是，外层甘露聚糖决定细胞壁的通透性。CWP1基因和CWP2基因编码面包酵母细胞壁的甘露糖蛋白，通过基因敲除技术，敲除CWP1基因和CWP2基因，可抑制甘露糖蛋白的合成，从而提高面包酵母细胞壁的通透性。
面包酵母表现出同哺乳动物类似的多药耐受性。六十年代中期，科学家们认识到肿瘤细胞能够同时对各不同化学结构的化疗药物产生耐药，这种现象被命名为多药耐受性。各种体内体外实验证实细胞膜上的跨膜蛋白与这种多药耐受性有关。就像哺乳动物细胞一样，面包酵母ABC家族转运蛋白能够泵出细胞内的毒性物质。这个家族的成员包括Pdr5，Snq2等膜蛋白。敲除PDR5和SNQ2基因后，可使更高浓度的有毒化合物在面包酵母细胞内积累，由此可以提高酵母细胞对环境中低浓度有害化合物的灵敏度。
基因敲除是自80年代末发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。由于面包酵母的全基因测序已经完成，所以可以根据目的基因的序列，设计同源基因序列，对目的基因进行敲除。本发明通过分析与酵母细胞壁和细胞膜通透性有关的基因，应用基因敲除技术提高面包酵母的通透性。
发明内容：
本发明的目的是，提供一种超高通透性面包酵母，该酵母可用于检测环境中的遗传毒性致癌物。该超高通透性面包酵母通过基因敲除技术改造现有面包酵母的细胞壁和细胞膜，提高其通透性，从而提高检测灵敏度。本发明的另一目的是，提供上述超高通透性面包酵母的制备方法。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种超高通透性面包酵母，该酵母为缺失CWP1、CWP2、PDR5和SNQ2四基因的面包酵母。
一种超高通透性面包酵母的制备方法为：提取面包酵母基因组DNA，通过特异性引物，以面包酵母基因组DNA为模板，PCR扩增分别得到CWP1、CWP2、PDR5基因；将CWP1基因中的一段替换为选择性标记hisG-URA3-hisG基因(尿嘧啶合成酶基因)，获得cwp1Δ::hisG-URA3-hisG基因敲除组件；将CWP2基因中的一段替换为选择性标记HIS3基因(组氨酸合成酶基因)，获得cwp2Δ::HIS3基因敲除组件；将PDR5基因中的一段替换为选择性标记LEU2基因(亮氨酸合成酶基因)，获得pdr5Δ::LEU2基因敲除组件；将cwp1Δ::hisG-URA3-hisG基因敲除组件、cwp2Δ::HIS3基因敲除组件、pdr5Δ::LEU2转入snq2单基因敲除面包酵母，发生同源重组，通过筛选得到cwp1cwp2pdr5snq2四基因敲除面包酵母。由于hisG序列之间的同源重组，URA3基因可被切除，URA3基因可继续做为选择性标记。再将携带URA3基因(尿嘧啶合成酶基因)作为选择性标记的RNR3-LacZ基因融合质粒转入到cwp1cwp2pdr5snq2四基因敲除面包酵母菌中，得到可用于检测遗传毒性致癌物的高通透性面包酵母。
本发明所使用的环境污染物检测元件为RNR3-lacZ。该检测系统以面包酵母为模式生物，以面包酵母RNR3基因的启动子与lacZ(β-半乳糖苷酶)的融合体作为检测元件，使基因表达水平可以通过测定酶学颜色反应来监控和定量。RNR3是面包酵母核苷酸还原酶的大亚基，而核苷酸还原酶则是催化DNA合成所需的脱氧核苷酸产生的限速酶。RNR3的mRNA转录水平在通常条件下较低，却有较高的诱导表达水平。它的诱导表达只与DNA损伤有关，而与通常的细胞胁迫和生长周期无关。许多环境遗传毒性致癌物是通过致DNA损伤而诱发癌症的，因此该检测系统被发展为一种环境化学致癌物的新型检测系统。本发明通过测定RNR3-lacZ的诱导表达水平来判断酵母细胞通透性的改变和灵敏度的提高。
本发明的优点与效果：
cwp1cwp2pdr5snq2四基因敲除面包酵母菌与野生型酵母菌及cwp1cwp2双基因敲除面包酵母菌相比，对环境遗传毒性致癌物的通透性明显提高。从而扩大了面包酵母RNR3-lacZ系统对环境化学致癌物的检测范围，并提高了面包酵母RNR3-lacZ系统的检测灵敏度，使其更有利于对环境中以低浓度存在的遗传毒性致癌物的监测。
附图说明：
图1cwp1cwp2pdr5snq2四基因敲除面包酵母、cwp1cwp2双基因敲除酵母、snq2pdr5双基因敲除酵母和野生型面包酵母的RNR3-lacZ系统对检测大分子DNA损伤试剂腐草霉素灵敏度的比较。
具体实施方式：
制备一种超高通透性面包酵母的方法包含下列步骤：
1、从野生面包酵母中提取面包酵母基因组DNA；
1a、取少量面包酵母，接种于5毫升的YPD培养液中，30℃，200转/分钟培养16小时，得到面包酵母菌液；
其中：YPD培养液的配方为：酵母膏1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，余者为水；
1b、取面包酵母菌液1.5毫升，用4000转/分钟离心2分钟，沉淀物悬于200微升提取缓冲液中；
其中：提取缓冲液的配方为：曲拉通X-1002％，十二烷基磺酸钠1％，氯化钠0.1摩尔，乙二胺四乙酸1毫摩尔，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10毫摩尔，余者为水，pH 8.0；
1c、加入0.3克酸洗玻璃珠、100微升酚、100微升氯仿，震荡3分钟后，以12000转/分钟离心10分钟，吸取上层液体；
1d、加入所取液体体积2倍的无水乙醇，在-20℃静置30分钟，以12000转/分钟离心15分钟，去上清，取沉淀物；
1e、将沉淀物溶解于20微升无菌水，即为面包酵母基因组DNA溶液；
2、构建cwp1Δ::hisG-URA3-hisG基因敲除组件
2a、将含有XhoI内切酶位点的上游引物CWP1-15′-GTACCGAATCGTAGCTCGAGG-3′和含有SphI内切酶位点的下游引物CWP1-25′-GGGAATGTGAGAGCTGCATGC-3′以面包酵母基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到CWP1基因；
其中：PCR的条件为：94℃5分钟；94℃45秒，52℃1分钟，72℃1分钟，30个循环；72℃10分钟；
2b、将CWP1基因克隆到pGEM-T载体(日本Takara公司)上，用XhoI内切酶和StyI内切酶切下一段0.62kb的片断，再加上BamHI接头；
2c、用BamHI内切酶从pNKY51(参考文献：Selectable cassettes for simplified construction of yeast gene disruption vectors.Earley，Marie C.and Crouse，Gray F.Gene.1996，196(1)：111-113.)上切下一段含有hisG-URA3-hisG的3.8-kb片断，接入BamHI接头；
2d、用XhoI-SphI酶切，得到cwp1Δ::hisG-URA3-hisG基因敲除组件；
3、构建cwp2Δ::HIS3基因敲除组件
3a、将含有EcoRI内切酶位点的上游引物CWP2-15′-GTAGAATTCCCGCACCTTATACGCGC-3′和含有BamHI内切酶位点的下游引物CWP2-25′-GCTGGATCCGTGATTTGAGAAATGGCG-3′以面包酵母基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到0.5kb CWP2基因EcoRI-BamHI序列；
其中：PCR的条件为：94℃5分钟；94℃45秒，52℃1分钟，72℃1分钟，30个循环；72℃10分钟；
3b、将含有BamHI内切酶位点的上游引物CWP2-35′-GTAGGATCCATATTATAGATATACCG-3′和含有SphI内切酶位点的下游引物CWP2-45′-CAAGCATGCATGTTTTTTTC-3′以面包酵母基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到0.3kb CWP2基因BamHI-SphI序列；
其中：PCR的条件为：94℃5分钟；94℃45秒，52℃1分钟，72℃1分钟，30个循环；72℃10分钟；
3c、将0.5kb CWP2基因EcoRI-BamHI序列克隆到pGEM-T载体上；
3d、将0.3kb CWP2基因BamHI-SphI序列克隆到步骤3c所得的载体上；
3e、用BamHI内切酶从YDp-H(参考文献：The YDp plasmids：a uniform set of vectors bearing versatile gene disruptioncassettes for Saccharomyces cerevisiae.Berben G，Yeast.1991Jul；7(5)：475-7.)上切下一段含有HIS3基因(组氨酸合成酶基因)的1.16kb片断，将其插入步骤3d所得载体的BamHI多克隆位点处；
3f、用EcoRI-SphI酶切，得到cwp2Δ::HIS3基因敲除组件；
4、构建pdr5Δ::LEU2基因敲除组件
4a、将含BglII内切酶位点的上游引物CWP2-15′-GTCAGATCTGTATTCCTAC-3′和下游引物CWP2-25′-CTGGAGATCTCCAATATTG-3′以面包酵母基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到1.5kb的PDR5基因；
其中：PCR的条件为：94℃5分钟；94℃45秒，52℃1分钟，72℃1分钟，30个循环；72℃10分钟；
4b、将PDR5基因克隆到pGEM-T载体上，用HindIII-BamHI内切酶切下一段1.0kb的片断，再加上BamHI接头；
4c、用BamHI内切酶从YDp-L(参考文献：The YDp plasmids：a uniform set of vectors bearing versatile gene disruptioncassettes for Saccharomyces cerevisiae.Berben G，Yeast.1991Jul；7(5)：475-7.)上切下一段含有LEU2基因(亮氨酸合成酶基因)的1.6kb片断，接入BamHI接头；
4d、用BglII酶切，得到pdr5Δ::LEU2基因敲除组件；
5、将cwp1Δ::hisG-URA3-hisG、cwp2Δ::HIS3、pdr5Δ::LEU2基因敲除组件转入snq2单基因敲除面包酵母(美国Invitrogen公司)，筛选得到cwp1cwp2pdr5snq2四基因敲除面包酵母；
5a、将snq2单基因敲除面包酵母接种到2毫升YPD培养液，30℃，200转/分钟下振荡培养16小时；
其中：YPD培养液的配方为：酵母膏1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，余者为水；
5b、再加入YPD培养液3毫升，30℃，200转/分钟，培养4小时，得到snq2单基因敲除面包酵母菌液；
5c、取1.5毫升snq2单基因敲除面包酵母菌液，以2500转/分钟离心2分钟，取沉淀物；
5d、将沉淀物悬于100毫摩/升的400微升醋酸锂中，以2500转/分钟离心2分钟，取沉淀物；
5e、将沉淀物悬于100毫摩/升的100微升醋酸锂中；
5f、将2.0毫克/毫升的鲑鱼精单链DNA 2微升煮沸5分钟，冰浴后与cwp1Δ::hisG-URA3-hisG、cwp2Δ::HIS3、pdr5Δ::LEU2基因敲除组件各0.1～1微克一起加入到步骤5e的醋酸锂中，室温放置5分钟；
5g、再加入280微升浓度为50％的聚乙二醇4000；
5h、振荡至混匀，30℃静置30分钟；
5i、加入39微升二甲基亚砜，42℃热激5分钟；
5j、4000转/分钟离心2分钟，取沉淀物，并将沉淀物悬于200微升无菌水中；
5k、4000转/分钟离心2分钟，取沉淀物，悬于100微升无菌水中，涂SD-Leu-His plus 5-FOA选择性平板，30℃培养箱中培养3天，生长出单克隆子，即为cwp1cwp2pdr5snq2四基因敲除面包酵母，也就是本发明的一种超高通透性面包酵母；
其中：SD-Leu-His plus 5-FOA选择性平板的配方为：酵母氮源无氨基酸无硫酸铵0.17％，硫酸铵0.5％，葡萄糖2％，腺嘌呤0.2％，色氨酸1％，尿嘧啶1％，赖氨酸1％，琼脂粉2％，余者为水，121℃高压灭菌20分钟，待温度降到约50℃时，无菌条件下加入5-FOA(5-氟乳清酸)0.1％。
用本发明的一种超高通透性面包酵母构建RNR3-lacZ系统，并检测遗传毒性致癌物的方法按下列步骤进行：
1、由于hisG序列之间的同源重组，cwp1cwp2pdr5snq2四基因敲除面包酵母中作为选择标记的URA3基因(尿嘧啶合成酶基因)会被切除掉，URA3可用于下一步骤的选择性标记，将携带URA3基因(尿嘧啶合成酶基因)作为选择性标记的RNR3-LacZ基因融合质粒pZZ2(参考文献：Isolation of crt mutants constitutive for transcriptionof the DNA damage inducible gene RNR3 in Saccharomycescerevisiae.Zhou Z，Genetics.1992Aug；131(4)：851-66.)，通过醋酸锂转化方法转入到cwp1cwp2pdr5snq2四基因敲除面包酵母菌中，并通过SD-Ura选择性平板筛选阳性菌株，即为可检测环境遗传毒性致癌物的高通透性酵母；
其中：SD-Ura选择性平板的配方为：酵母氮源无氨基酸无硫酸铵0.17％，硫酸铵0.5％，葡萄糖2％，腺嘌呤0.2％，色氨酸1％，组氨酸1％，亮氨酸1％，赖氨酸1％，琼脂粉2％，余者为水；
2、将本发明的一种超高通透性面包酵母接种于SD-Ura选择性培养液中，30℃，200转/分钟下振荡培养16小时，得到一种超高通透性面包酵母液；
3、将酵母菌液0.5毫升接种到2.5毫升SD-Ura选择性培养液中，30℃，200转/分钟下振荡培养至OD600的值在0.15～0.20之间；
其中：SD-Ura选择性培养液的配方为：酵母氮源无氨基酸无硫酸铵0.17％，硫酸铵0.5％，葡萄糖2％，腺嘌呤0.2％，色氨酸1％，组氨酸1％，亮氨酸1％，赖氨酸1％，余者为水；
4、在SD-Ura选择性培养液中加入分子量为1526道尔顿的DNA损伤试剂腐草霉素，培养4小时；
5、用分光光度计测定密度OD600值；
6、取2毫升酵母菌液，2500转/分钟离心2分钟，取沉淀物；
7、将沉淀物悬于1毫升Z缓冲液中，加入0.1％十二烷基磺酸钠50微升，50微升氯仿，高速涡旋10秒，使酵母菌细胞破裂；
其中：Z缓冲液的配方为：Na2HPO460毫摩尔，NaH2PO440毫摩尔，KCl 10毫摩尔，MgSO41毫摩尔，2-巯基乙醇40毫摩尔，余者为水；pH 7.0；
8、加入4毫克/毫升的邻硝基苯-β-D-硫代半乳糖苷200微升，在30℃下保温20分钟；
9、再加入1摩尔Na2CO3500微升终止反应；
10、3500转/分钟离心10分钟，取上清，测定OD420吸收值；
11、根据步骤5测得的OD600值和步骤10测得的OD420吸收值，用下面的公式计算β-半乳糖苷酶活力：SAβ-gal＝(1000×OD420)/(反应时间×菌液体积×OD600)，其中：SAβ-gal表示β-半乳糖苷酶活力；
12、按照以上方法平行测定未经DNA损伤试剂处理的面包酵母菌液β-半乳糖苷酶活力，当经DNA损伤试剂处理的面包酵母菌液β-半乳糖苷酶活力值与未经DNA损伤试剂处理的面包酵母菌液β-半乳糖苷酶活力值之比大于2时为阳性，表明检测物中含有遗传毒性致癌物，在检测物中含有遗传毒性致癌物比例相同的情况下，比值越大，表明面包酵母RNR3-lacZ系统的检测灵敏度越高。

Claims (2)

1.一种超高通透性面包酵母，其特征在于，该超高通透性面包酵母为缺失CWP1、CWP2、SNQ2和PDR5四个基因的面包酵母。
2.实现权利要求1所述的一种超高通透性面包酵母的制备方法，其特征在于，该方法包含下列步骤：
制备超高通透性面包酵母的方法包含下列步骤：
(1)、从野生面包酵母中提取面包酵母基因组DNA；
1a、取少量面包酵母，接种于5毫升的YPD培养液中，30℃，200转/分钟培养16小时，得到面包酵母菌液；
其中：YPD培养液的配方为：酵母膏1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，余者为水；
1b、取面包酵母菌液1.5毫升，用4000转/分钟离心2分钟，沉淀物悬于200微升提取缓冲液中；
其中：提取缓冲液的配方为：曲拉通X-1002％，十二烷基磺酸钠1％，氯化钠0.1摩尔，乙二胺四乙酸1毫摩尔，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10毫摩尔，余者为水，pH 8.0；
1c、加入0.3克酸洗玻璃珠、100微升酚、100微升氯仿，震荡3分钟后，以12000转/分钟离心10分钟，吸取上层液体；
1d、加入所取液体体积2倍的无水乙醇，在-20℃静置30分钟，以12000转/分钟离心15分钟，去上清，取沉淀物；
1e、将沉淀物溶解于20微升无菌水，即为面包酵母基因组DNA溶液；
(2)、构建cwp1Δ::hisG-URA3-hisG基因敲除组件
2a、将含有XhoI内切酶位点的上游引物CWP1-15′-GTACCGAATCGTAGCTCGAGG-3′和含有SphI内切酶位点的下游引物CWP1-25′-GGGAATGTGAGAGCTGCATGC-3′以面包酵母基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到CWP1基因；
其中：PCR的条件为：94℃5分钟；94℃45秒，52℃1分钟，72℃1分钟，30个循环；72℃10分钟；
2b、将CWP1基因克隆到pGEM-T载体上，用XhoI内切酶和StyI内切酶切下一段0.62kb的片断，再加上BamHI接头；
2c、用BamHI内切酶从pNKY51上切下一段含有hisG-URA3-hisG的3.8-kb片断，接入BamHI接头；
2d、用XhoI-SphI酶切，得到cwp1Δ::hisG-URA3-hisG基因敲除组件；
(3)、构建cwp2Δ::HIS3基因敲除组件
3a、将含有EcoRI内切酶位点的上游引物CWP2-1 5′-GTAGAATTCCCGCACCTTATACGCGC-3′和含有BamHI内切酶位点的下游引物CWP2-2 5′-GCTGGATCCGTGATTTGAGAAATGGCG-3′以面包酵母基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到0.5kb CWP2基因EcoRI-BamHI序列；
其中：PCR的条件为：94℃5分钟；94℃45秒，52℃1分钟，72℃1分钟，30个循环；72℃10分钟；
3b、将含有BamHI内切酶位点的上游引物CWP2-3 5′-GTAGGATCCATATTATAGATATACCG-3′和含有SphI内切酶位点的下游引物CWP2-4 5′-CAAGCATGCATGTTTTTTTC-3′以面包酵母基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到0.3kb CWP2基因BamHI-SphI序列；
其中：PCR的条件为：94℃5分钟；94℃45秒，52℃1分钟，72℃1分钟，30个循环；72℃10分钟；
3c、将0.5kb CWP2基因EcoRI-BamHI序列克隆到pGEM-T载体上；
3d、将0.3kb CWP2基因BamHI-SphI序列克隆到步骤3c所得的载体上；
3e、用BamHI内切酶从YDp-H上切下一段含有HIS3基因的1.16kb片断，将其插入步骤3d所得载体的BamHI多克隆位点处；
3f、用EcoRI-SphI酶切，得到cwp2Δ::HIS3基因敲除组件；
(4)、构建pdr5Δ::LEU2基因敲除组件
4a、将含BglII内切酶位点的上游引物CWP2-1 5′-GTCAGATCTGTATTCCTAC-3′和下游引物CWP2-2 5′-CTGGAGATCTCCAATATTG-3′以面包酵母基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到1.5kb的PDR5基因；
其中：PCR的条件为：94℃5分钟；94℃45秒，52℃1分钟，72℃1分钟，30个循环；72℃10分钟；
4b、将PDR5基因克隆到pGEM-T载体上，用HindIII-BamHI内切酶切下一段1.0kb的片断，再加上BamHI接头；
4c、用BamHI内切酶从YDp-L上切下一段含有LEU2基因的1.6kb片断，接入BamHI接头；
4d、用BglII酶切，得到pdr5Δ::LEU2基因敲除组件；
(5)、将cwp1Δ::hisG-URA3-hisG、cwp2Δ::HIS3、pdr5Δ::LEU2基因敲除组件转入snq2单基因敲除面包酵母，筛选得到cwp1cwp2pdr5snq2四基因敲除面包酵母；
5a、将snq2单基因敲除面包酵母接种到2毫升YPD培养液，30℃，200转/分钟下振荡培养16小时；
其中：YPD培养液的配方为：酵母膏1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，余者为水；
5b、再加入YPD培养液3毫升，30℃，200转/分钟，培养4小时，得到snq2单基因敲除面包酵母菌液；
5c、取1.5毫升snq2单基因敲除面包酵母菌液，以2500转/分钟离心2分钟，取沉淀物；
5d、将沉淀物悬于100毫摩/升的400微升醋酸锂中，以2500转/分钟离心2分钟，取沉淀物；
5e、将沉淀物悬于100毫摩/升的100微升醋酸锂中；
5f、将2.0毫克/毫升的鲑鱼精单链DNA 2微升煮沸5分钟，冰浴后与cwp1Δ::hisG-URA3-hisG、cwp2Δ::HIS3、pdr5Δ::LEU2基因敲除组件各0.1～1微克一起加入到步骤5e的醋酸锂中，室温放置5分钟；
5g、再加入280微升浓度为50％的聚乙二醇4000；
5h、振荡至混匀，30℃静置30分钟；
5i、加入39微升二甲基亚砜，42℃热激5分钟；
5j、4000转/分钟离心2分钟，取沉淀物，并将沉淀物悬于200微升无菌水中；
5k、4000转/分钟离心2分钟，取沉淀物，悬于100微升无菌水中，涂SD-Leu-His plus 5-FOA选择性平板，30℃培养箱中培养3天，生长出单克隆子，即为cwplcwp2pdr5snq2四基因敲除面包酵母，也就是本发明的一种超高通透性面包酵母；
其中：SD-Leu-His plus 5-FOA选择性平板的配方为：酵母氮源无氨基酸无硫酸铵0.17％，硫酸铵0.5％，葡萄糖2％，腺嘌呤0.2％，色氨酸1％，尿嘧啶1％，赖氨酸1％，琼脂粉2％，余者为水；将配方中的物质121℃高压灭菌20分钟，待温度降到约50℃时，无菌条件下加入5-FOA 0.1％，即得SD-Leu-His plus 5-FOA选择性平板。
CN 200910272505 2009-10-23 2009-10-23 一种超高通透性面包酵母及其制备方法 Expired - Fee Related CN101717736B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 200910272505 CN101717736B (zh) 2009-10-23 2009-10-23 一种超高通透性面包酵母及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 200910272505 CN101717736B (zh) 2009-10-23 2009-10-23 一种超高通透性面包酵母及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101717736A true CN101717736A (zh) 2010-06-02
CN101717736B CN101717736B (zh) 2013-06-19

Family

ID=42432375

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 200910272505 Expired - Fee Related CN101717736B (zh) 2009-10-23 2009-10-23 一种超高通透性面包酵母及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101717736B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102120968A (zh) * 2010-12-18 2011-07-13 中国科学院水生生物研究所 一种对氧化损伤高敏感性的面包酵母及其制备方法
CN102796735A (zh) * 2012-07-27 2012-11-28 中国科学院水生生物研究所 基于酵母dna损伤响应的生物传感器元件盒及其应用
CN103509876A (zh) * 2013-10-24 2014-01-15 上海辰山植物园 一种利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法
CN104099397A (zh) * 2014-07-23 2014-10-15 中国科学院水生生物研究所 一种利用酵母突变株检测纳米材料细胞毒性的方法
CN108676811A (zh) * 2018-05-28 2018-10-19 郝志敏 一种基因无痕编辑载体及其在生物体基因编辑中的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10085481T1 (de) * 2000-07-26 2003-07-31 Korea Res Inst Of Bioscience Neue Zellwand-Anker-Proteine, die aus Hefe stammen, ihre Gene und Zelloberflächen-Expressionssysteme, in denen sie verwendet werden
CN101240251A (zh) * 2008-02-20 2008-08-13 中国科学院水生生物研究所 可用于检测环境致癌物的高通透性面包酵母及其制备方法

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102120968A (zh) * 2010-12-18 2011-07-13 中国科学院水生生物研究所 一种对氧化损伤高敏感性的面包酵母及其制备方法
CN102796735A (zh) * 2012-07-27 2012-11-28 中国科学院水生生物研究所 基于酵母dna损伤响应的生物传感器元件盒及其应用
CN103509876A (zh) * 2013-10-24 2014-01-15 上海辰山植物园 一种利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法
CN103509876B (zh) * 2013-10-24 2019-09-03 上海辰山植物园 一种利用酵母快速筛选植物多重逆境抗性基因的方法
CN104099397A (zh) * 2014-07-23 2014-10-15 中国科学院水生生物研究所 一种利用酵母突变株检测纳米材料细胞毒性的方法
CN108676811A (zh) * 2018-05-28 2018-10-19 郝志敏 一种基因无痕编辑载体及其在生物体基因编辑中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN101717736B (zh) 2013-06-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Porter et al. A subset of polysaccharide capsules in the human symbiont Bacteroides thetaiotaomicron promote increased competitive fitness in the mouse gut
Jørgensen et al. Transcriptomic insights into the physiology of Aspergillus niger approaching a specific growth rate of zero
Bulik et al. Chitin synthesis in Saccharomyces cerevisiae in response to supplementation of growth medium with glucosamine and cell wall stress
Vediyappan et al. Interaction of Candida albicans biofilms with antifungals: transcriptional response and binding of antifungals to beta-glucans
Nett et al. Interface of Candida albicans biofilm matrix-associated drug resistance and cell wall integrity regulation
Teixeira et al. Genome-wide identification of S accharomyces cerevisiae genes required for maximal tolerance to ethanol
Tanghe et al. Aquaporin expression correlates with freeze tolerance in baker's yeast, and overexpression improves freeze tolerance in industrial strains
Ram et al. The cell wall stress response in Aspergillus niger involves increased expression of the glutamine: fructose-6-phosphate amidotransferase-encoding gene (gfaA) and increased deposition of chitin in the cell wall
Marks et al. Dynamics of the yeast transcriptome during wine fermentation reveals a novel fermentation stress response
Graca da Silveira et al. Flow cytometric assessment of membrane integrity of ethanol-stressed Oenococcus oeni cells
Zhou et al. O-Mannosyltransferase 1 in Aspergillus fumigatus (AfPmt1p) is crucial for cell wall integrity and conidium morphology, especially at an elevated temperature
Gehrke et al. Heptahelical receptors GprC and GprD of Aspergillus fumigatus are essential regulators of colony growth, hyphal morphogenesis, and virulence
CN101717736B (zh) 一种超高通透性面包酵母及其制备方法
Nicolás et al. The RNAi machinery controls distinct responses to environmental signals in the basal fungus Mucor circinelloides
Carvalho et al. Genome-wide expression analysis upon constitutive activation of the HacA bZIP transcription factor in Aspergillus niger reveals a coordinated cellular response to counteract ER stress
CN101240251A (zh) 可用于检测环境致癌物的高通透性面包酵母及其制备方法
CN103597084A (zh) 增强的纤维糊精代谢
Tekarslan-Sahin et al. Physiological and transcriptomic analysis of a salt-resistant Saccharomyces cerevisiae mutant obtained by evolutionary engineering
Zhang et al. Disruption of the cell wall integrity gene ECM33 results in improved fermentation by wine yeast
Somers Isolation of suppressive sensitive mutants from killer and neutral strains of Saccharomyces cerevisiae
Valle‐Maldonado et al. The heterotrimeric G‐protein beta subunit Gpb1 controls hyphal growth under low oxygen conditions through the protein kinase A pathway and is essential for virulence in the fungus Mucor circinelloides
CN102120968A (zh) 一种对氧化损伤高敏感性的面包酵母及其制备方法
Schachtschabel et al. The transcriptional repressor TupA in Aspergillus niger is involved in controlling gene expression related to cell wall biosynthesis, development, and nitrogen source availability
CN1726290A (zh) 产生用于筛选活性物质的经遗传修饰生物的方法
Górka-Nieć et al. Influence of sorbitol on protein production and glycosylation and cell wall formation in Trichoderma reesei

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20130619

Termination date: 20161023