CN101701190A - 对工业废水中复合污染物具有降解能力的微生物菌株的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种对工业废水中复合污染物具有降解能力的微生物菌株的培养方法，属于生物技术领域。它解决了现有的用于降解工业废水的菌株对复合污染物不具降解能力的问题。本发明对工业废水中复合污染物具有降解能力的微生物菌株的培养方法，包括以下步骤：配制含不同浓度梯度的工业废水液体培养基；将工业废水中的活性污泥加入到牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集培养；驯化培养；对菌株进行纯化。本发明的培养方法工艺流程简单，使用原料的成本较低，培养的菌株对复合污染物具有较强的降解能力，对工业废水中的苯胺、苯酚和硝基苯类化合物降解效率较高。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物菌株的培养方法，具体地说涉及一种对工业废水中复合污染物具有降解能力的微生物菌株的培养方法；属于生物技术领域。
背景技术
工业废水污染是治理当前生态保护中一项非常重要和极具挑战性的工作。来自印染、制药、农药、制革、石油化工和食品工业等生产过程中的有机废水成分复杂、可生化性差，严重污染水环境，甚至将削弱水生生物等的长期繁殖能力。现有的工业废水的净化处理技术可归纳为生物法、化学法、物理-化学耦合法和物化-生物耦合法等。其中生物法具有经济性好，无二次污染等优点。
现有的工业废水中对环境污染严重的主要有苯酚、苯胺和硝基苯类化合物等。其中苯酚是造纸、炼焦、炼油、塑料、纺织等工业废水中的主要污染物。硝基苯类化合物广泛应用于农药、染料、炸药、橡胶以及其它化工产品的生产。环境中的硝基苯类污染物主要包括硝基苯、硝基氯苯、硝基甲苯、硝基苯酚、硝基苯胺等化合物。利用微生物降解苯酚、苯胺和硝基苯类化合物是一种既经济且不会产生二次污染的方法，近年来，从工业废水污染的环境中分离到许多可以降解苯酚、苯胺和硝基苯类化合物的微生物菌株。盛连喜等人在应用生态学报，2007年7月，第18卷，第7期中对硝基苯类化合物微生物降解研究进展，并从硝基苯类化合物降解菌的驯化筛选，降解途径、降解激励、共代谢、趋化性和分子遗传学角度，阐述了硝基苯类化合物生物降解的最近研究进展。温洪宇等人在徐州师范大学学报(自然科学版)2003年12月，第21卷，第4期中叙述了降解苯酚细菌的分离及生理学特性研究，虽然它通过菌株培养、驯化与筛选从工业废水中分离出两株可以降解苯酚的细菌，但是该菌株仅仅对苯酚具有降解作用，对工业废水中同时具有苯胺和硝基苯类化合物的复合污染物却不具有降解能力。
发明内容
本发明针对现有技术存在的缺陷，提供一种对工业废水中复合污染物具有降解能力的微生物菌株的培养方法。
本发明的目的是通过下列技术方案来实现的：一种对工业废水中复合污染物具有降解能力的微生物菌株的培养方法，该方法包括以下步骤：
A、针对工业废水中的苯胺、苯酚和硝基苯类复合化合物，分别配制含不同浓度梯度的工业废水液体培养基，所述的液体培养基中还添加微生物菌株生长所需要的其它化学基质成分，将部分液体培养基转化成选择性固体培养基；
B、将工业废水中的活性污泥加入到牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集培养，培养温度为20-40℃，培养时间为2-4天；
C、将假单胞菌株接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集，富集后将其制成感受态细胞，将步骤B中培养的菌株浓缩后与感受态细胞一起重悬于低浓度梯度的工业废水液体培养基，在温度为10-40℃的条件下孵育10-45小时；再采用不同浓度梯度的工业废水液体培养基进行驯化培养，驯化培养温度为15-45℃，驯化培养时间6-25天，反复驯化培养2-12次，驯化培养后涂布于选择性固体培养基，在温度为10-40℃的条件下孵育10-45小时，然后进行鉴定；
D、将步骤C中获得菌株进行纯化后，即获得对工业废水中复合污染物具有降解能力的微生物菌株。
本发明首先根据工业废水中的复合污染物种类，制成的不同浓度含复合污染物的液体培养基，然后对活性污泥微生物进行富集，再加入感受态的宿主菌重悬于低浓度梯度的工业废水液体培养基进行孵育，采用不同浓度的废水进行反复驯化，并选择优势菌种，纯化后最终得到对复合污染物具有降解能力的微生物菌种。
其中步骤A中配制不同浓度梯度的工业废水液体培养基，主要配制目标化合物的浓度为0，0.5g/L，1.0g/L，1.5g/L，2.0g/L，2.5g/L，3.0g/L，3.5g/L。不同浓度梯度的工业废水液体培养基可以统计出工业废水降解微生物菌株随复合污染物浓度变化的生长变化情况以及对复合污染物的降解率；微生物菌种生长所需要的其它化学基质成分主要有磷、铁、钾、氧、钠、氯、钙、镁等元素。将部分液体培养基添加15-20g琼脂(按1000ml水计算)后就转化成选择性固体培养基。
步骤B中采用的是常规的牛肉膏蛋白胨液体培养基，培养基的配方为牛肉膏3克，蛋白胨10克，氯化钠5克，琼脂15克，水1000ml。
步骤C中的假单胞菌株(Pseudomonas)主要是恶臭假单胞菌株，将它接种到常规的牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集，富集后把细胞悬浮在pH6.0的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，让其转化成感受态细胞。
在上述的对工业废水中复合污染物具有降解能力的微生物菌株的培养方法中，步骤A中所述的液体培养基中其它化学基质组分为：硝酸钾：0.5-1.5g/L；氯化钠：0.1-1g/L；K2HPO4·3H2O：0.2g-0.8g/L；MgSO4·7H2O：0.2g-0.8g/L；FeSO4·7H2O0.005-0.015g/L。
在上述的对工业废水中复合污染物具有降解能力的微生物菌株的培养方法中，步骤C中感受态细胞细菌浓度为1×107-3×109cfu/mL；菌株浓缩后细菌浓度为1×107-3×109cfu/mL。
作为优选，步骤C中在低浓度梯度的工业废水液体培养基中孵育温度为15-35℃，孵育时间为12-36小时。所述的低浓度梯度的工业废水液体培养基主要是指浓度为0、0.5g/L或1.0g/L的工业废水液体培养基。
作为优选，步骤C中驯化培养的培养温度为20-40℃，培养时间7-21天，反复驯化培养3-10次。
综上所述，本发明具有以下优点：
1、本发明的培养方法采用含不同浓度的工业废水液体培养基对活性污泥微生物进行富集培养，加入感受态细胞进行驯化培养，最终纯化后选择出对工业废水中复合污染物具有较强降解能力的优势菌种，应用比较方便且范围较广，便于进行大规模的工业化推广。
2、本发明的培养方法工艺流程简单，使用原料的成本较低，培养的菌株对工业废水中的苯胺、苯酚和硝基苯类化合物降解效率较高。
附图说明
图1是实施例1培养的对工业废水中复合污染物具有降解能力的微生物菌株生长曲线图。
图2是实施例1培养的对工业废水中复合污染物具有降解能力的微生物菌株与pH值对应关系图。
图3是实施例1培养的对工业废水中复合污染物具有降解能力的微生物菌株对有机物的耐受性曲线图。
图4是实施例1培养的对工业废水中复合污染物具有降解能力的微生物菌株对工业废水中有机物的降解的曲线图。
图5是实施例2培养的对工业废水中复合污染物具有降解能力的微生物菌株生长曲线图。
图6是实施例2培养的对工业废水中复合污染物具有降解能力的微生物菌株与pH值对应关系图。
图7是实施例2培养的对工业废水中复合污染物具有降解能力的微生物菌株对有机物的耐受性曲线图。
图8是实施例2培养的对工业废水中复合污染物具有降解能力的微生物菌株对工业废水中有机物的降解的曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明；但是本发明并不限于这些实施例。
实施例1
针对工业废水中的苯胺、苯酚和硝基苯类复合污染物，分别配制含浓度为0g/L，0.5g/L，1.0g/L，1.5g/L，2.0g/L，2.5g/L，3.0g/L，3.5g/L不同浓度梯度的工业废水液体培养基，在工业废水液体培养基中还加入微生物菌株生长所需要的其它化学基质配方硝酸钾：0.5g/L；氯化钠：1g/L；K2HPO4·3H2O：0.8g/L；MgSO4·7H2O：0.2g/L；FeSO4·7H2O 0.010g/L，并将部分液体培养基加入添加15g琼脂(按1000ml水计算)后转化成选择性固体培养基。
将工业废水中的活性污泥加入到常规的牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集培养，培养温度为20℃，培养时间4天。
将恶臭假单胞菌株接种到常规的牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集，富集后把细胞悬浮在pH6.0的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，让其转化成感受态细胞。将步骤B中培养的菌株浓缩后(细菌浓度为1×107-3×109cfu/mL)与感受态细胞(细菌浓度为1×107-3×109cfu/mL)一起重悬于低浓度梯度(浓度分别为0g/L，0.5g/L，1.0g/L)的工业废水液体培养基，在温度为35℃的条件下孵育12小时；再采用其它不同浓度梯度(浓度分别为1.5g/L，2.0g/L，2.5g/L，3.0g/L，3.5g/L)的工业废水液体培养基进行驯化培养，驯化培养温度为20℃，驯化培养时间21天，反复驯化培养3次，驯化培养后涂布于选择性固体培养基，在温度为15℃的条件下孵育36小时，挑选单菌落采用常规的方法进行鉴定，并对其随苯胺浓度的生长变化情况，随废水浓度的生长变化情况，降解能力鉴定；分别对其生长性能，对pH值的适应性能，对废水中的有机物耐受性能和对废水中有机物的降解性能进行鉴定，鉴定结果如图1、图2、图3和图4所示。
将上述经过鉴定后符合标准的菌株采用划线平板分离法进行纯化后，即获得对工业废水中复合污染物具有降解能力的微生物菌株。
实施例2
针对工业废水中的苯胺、苯酚和硝基苯类复合污染物，分别配制含浓度为0g/L，0.5g/L，1.0g/L，1.5g/L，2.0g/L，2.5g/L，3.0g/L，3.5g/L不同浓度梯度的工业废水液体培养基，在工业废水液体培养基中还加入微生物菌株生长所需要的其它化学基质配方硝酸钾：1.0g/L；氯化钠：0.5g/L；K2HPO4·3H2O：0.5g/L；MgSO4·7H2O：0.5g/L；FeSO4·7H2O 0.005g/L，并将部分液体培养基加入添加20g琼脂(按1000ml水计算)后转化成选择性固体培养基。
将工业废水中的活性污泥加入到常规的牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集培养，培养温度为30℃，培养时间3天。
将恶臭假单胞菌株接种到常规的牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集，富集后把细胞悬浮在pH6.0的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，让其转化成感受态细胞。将步骤B中培养的菌株浓缩后(细菌浓度为1×107-3×109cfu/mL)与感受态细胞(细菌浓度为1×107-3×109cfu/mL)一起重悬于低浓度梯度(浓度分别为0g/L，0.5g/L，1.0g/L)的工业废水液体培养基，在温度为25℃的条件下孵育24小时；再采用其它不同浓度梯度(浓度分别为1.5g/L，2.0g/L，2.5g/L，3.0g/L，3.5g/L)的工业废水液体培养基进行驯化培养，驯化培养温度为30℃，培养时间14天，反复驯化培养6次，驯化培养后涂布于选择性固体培养基，在温度为25℃的条件下孵育24小时，挑选单菌落采用常规的方法进行鉴定，分别对其生长性能，对pH值的适应性能，对废水中的有机物耐受性能和对废水中有机物的降解性能进行鉴定，鉴定结果如图5、图6、图7和图8所示。
将上述经过鉴定后符合标准的菌株采用划线平板分离法进行纯化后，即获得对工业废水中复合污染物具有降解能力的微生物菌株。
实施例3
针对工业废水中的苯胺、苯酚和硝基苯类复合污染物，分别配制含浓度为0g/L，0.5g/L，1.0g/L，1.5g/L，2.0g/L，2.5g/L，3.0g/L，3.5g/L不同浓度梯度的工业废水液体培养基，在工业废水液体培养基中还加入微生物菌株生长所需要的其它化学基质配方硝酸钾：1.5g/L；氯化钠：0.1g/L；K2HPO4·3H2O：0.2g/L；MgSO4·7H2O：0.8g/L；FeSO4·7H2O 0.015g/L，并将部分液体培养基加入添加20g琼脂(按1000ml水计算)后转化成选择性固体培养基。
将工业废水中的活性污泥加入到常规的牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集培养，培养温度为40℃，培养时间2天。
将恶臭假单胞菌株接种到常规的牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集，富集后把细胞悬浮在pH6.0的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，让其转化成感受态细胞。将步骤B中培养的菌株浓缩后(细菌浓度为1×107-3×109cfu/mL)与感受态细胞(细菌浓度为1×107-3×109cfu/mL)一起重悬于低浓度梯度(浓度分别为0g/L，0.5g/L，1.0g/L)的工业废水液体培养基，在温度为15℃的条件下孵育36小时；再采用其它不同浓度梯度(浓度分别为1.5g/L，2.0g/L，2.5g/L，3.0g/L，3.5g/L)的工业废水液体培养基进行驯化培养，驯化培养温度为40℃，驯化培养时间7天，反复驯化培养8次，驯化培养后涂布于选择性固体培养基，在温度为35℃的条件下孵育12小时，挑选单菌落采用常规的方法进行鉴定，分别对其生长性能，对pH值的适应性能，对废水中的有机物耐受性能和对废水中有机物的降解性能进行鉴定。
将上述经过鉴定后符合标准的菌株采用划线平板分离法进行纯化后，即获得对工业废水中复合污染物具有降解能力的微生物菌株。
本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
Claims (5)
1.一种对工业废水中复合污染物具有降解能力的微生物菌株的培养方法，该方法包括以下步骤：
A、针对工业废水中的苯胺、苯酚和硝基苯类复合化合物，分别配制含不同浓度梯度的工业废水液体培养基，所述的液体培养基中还添加微生物菌株生长所需要的其它化学基质成分，将部分液体培养基转化成选择性固体培养基；
B、将工业废水中的活性污泥加入到牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集培养，培养温度为20-40℃，培养时间为2-4天；
C、将假单胞菌株接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集，富集后将其制成感受态细胞，将步骤B中培养的菌株浓缩后与感受态细胞一起重悬于低浓度梯度的工业废水液体培养基，在温度为10-40℃的条件下孵育10-45小时；再采用不同浓度梯度的工业废水液体培养基进行驯化培养，驯化培养温度为15-45℃，驯化培养时间6-25天，反复驯化培养2-12次，驯化培养后涂布于选择性固体培养基，在温度为10-40℃的条件下孵育10-45小时，然后进行鉴定；
D、将步骤C中获得菌株进行纯化后，即获得对工业废水中复合污染物具有降解能力的微生物菌株。
2.根据权利要求1所述的对工业废水中复合污染物具有降解能力的微生物菌株的培养方法，其特征在于：步骤A中所述的液体培养基中其它化学基质组分为：硝酸钾：0.5-1.5g/L；氯化钠：0.1-1g/L；K2HPO4·3H2O：0.2g-0.8g/L；MgSO4·7H2O：0.2g-0.8g/L；FeSO4·7H2O 0.005-0.015g/L。
3.根据权利要求1所述的对工业废水中复合污染物具有降解能力的微生物菌株的培养方法，其特征在于：步骤C中感受态细胞细菌浓度为1×107-3×109cfu/mL；菌株浓缩后细菌浓度为1×107-3×109cfu/mL。
4.根据权利要求1或3所述的对工业废水中复合污染物具有降解能力的微生物菌株的培养方法，其特征在于：步骤C中在低浓度梯度的工业废水液体培养基中孵育温度为15-35℃，孵育时间为12-36小时。
5.根据权利要求1或3所述的对工业废水中复合污染物具有降解能力的微生物菌株的培养方法，其特征在于：步骤C中驯化培养的培养温度为20-40℃，培养时间7-21天，反复驯化培养3-10次。
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