CN101693914A - 一种脂肪酶拆分制备(r)-2-甲基丁酸及(r)-2-甲基丁酸乙酯的方法 - Google Patents
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Abstract
一种脂肪酶拆分制备(R)-2-甲基丁酸及(R)-2-甲基丁酸乙酯的方法，属于生物法拆分外消旋化合物技术领域。本发明工艺分为两步：第一步为脂肪酶催化的选择性水解反应，实现了对(R)-2-甲基丁酸乙酯的拆分；第二步为以第一步获得的剩余底物(R)-2-甲基丁酸乙酯为底物，进行第二次脂肪酶催化的选择性水解反应，实现了(R)-2-甲基丁酸的拆分。最终获得了ee值为95.0％的(R)-2-甲基丁酸乙酯及ee值为92.2％的(R)-2-甲基丁酸。实现了生物法拆分较为困难且研究较少的2-甲基丁酸及其酯的拆分。
Description
技术领域
一种脂肪酶拆分制备(R)-2-甲基丁酸及(R)-2-甲基丁酸乙酯，涉及具有自主知识产权的华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M201021脂肪酶催化(R)-2-甲基丁酸乙酯及(R)-2-甲基丁酸的拆分技术，属于生物法拆分外消旋化合物技术领域。
背景技术
2-甲基丁酸及其短链酯是典型的具有苹果、草莓和菠萝味的重要的手性风味物质，不同的对映体分别对应不同的风味及应用。此外，高光学纯度的2-甲基烷酸还可以作为价值颇高的合成中间体用于生物信息素等许多光学纯化合物的合成。因此它们的拆分引起了人们广泛的兴趣。
脂肪酶催化的动力学拆分相对于其他拆分方法具有规模易放大，环境友好和产品满足“绿色”、安全等食品级要求等优点，因此常被用于许多手性风味物质的拆分。但是，由于2-甲基丁酸及其短链酯中连接于手性中心碳原子上的甲基与乙基的空间差异太小，以至于酶法拆分时脂肪酶不能有效地进行立体化学的识别。因此，2-甲基丁酸及其酯的脂肪酶动力学拆分成为酶法动力学拆分中较为困难的一类反应的代表。另一方面，目前酶法拆分研究报道中多数主要针对的是(S)-型的2-甲基丁酸乙酯及(S)-型2-甲基丁酸的拆分，而关于(R)-2-甲基丁酸乙酯及(R)-2-甲基丁酸则研究得相对较少。
因此，研究针对较难拆分且较少拆分的(R)-2-甲基丁酸乙酯及(R)-2-甲基丁酸，从多种不同来源的脂肪酶中筛选具有拆分(R)-2-甲基丁酸乙酯及(R)-2-甲基丁酸能力的脂肪酶，实现对(R)-2-甲基丁酸乙酯及(R)-2-甲基丁酸的拆分。
发明内容
(1)要解决的技术问题
本发明的目的是实现对较难拆分且极少研究的(R)-2-甲基丁酸乙酯及(R)-2-甲基丁酸的拆分，建立一种脂肪酶动力学拆分较为困难的2-甲基丁酸及其酯的方法。由于几乎所有的脂肪酶都优先选择(S)-型的对映体反应(Kazlauskas-法则)，因此，选择拆分过程中底物ee值较高的脂肪酶作为催化用酶。
(2)本发明的技术方案
一种脂肪酶拆分制备(R)-2-甲基丁酸及(R)-2-甲基丁酸乙酯的方法，分为两步：工艺为：
1)酶法拆分制备(R)-2-甲基丁酸乙酯：
a、选择性水解：取含0.2mol/L(R，S)-2-甲基丁酸乙酯的0.05mol/LKH2PO4/K2HPO4缓冲液于适当的反应容器中，分别加入适量脂肪酶以控制反应速度，由于不同脂肪酶最适反应条件不同，于各自标明的脂肪酶最适反应条件下，200r/min振荡反应；获得ee值为95.0％的剩余底物(R)-2-甲基丁酸乙酯；
b、产物分离：在水解拆分反应体系中，将脂肪酶与反应液离心分离，清液使用正庚烷进行萃取，萃取后的庚烷相用饱和NaHCO3溶液萃取，得到的上层有机相使用硅胶柱分离，使用戊烷将溶剂庚烷洗脱下来，使用乙醚洗脱目的产物(R)-2-甲基丁酸乙酯，乙醚相再经氮吹获得纯的(R)-2-甲基丁酸乙酯；
2)酶法拆分制备(R)-2-甲基丁酸：
c、第二步选择性水解：将第一步水解拆分反应后提取的ee值为95.0％的剩余底物(R)-2-甲基丁酸乙酯作为第二步水解拆分反应的底物，体系中加入10g/L脂肪酶Novozym435，在温度为40℃、转速为200r/min的条件下进行水解反应，反应时间1h，得到第二步水解拆分后的产物ee值为92.2％的(R)-2-甲基丁酸；
d、产物分离：在第二步水解拆分反应体系中，将脂肪酶与反应液离心分离，清液使用正庚烷进行萃取，萃取后的庚烷相用饱和NaHCO3溶液萃取，获得的下层水相使用浓HCl调节pH至1.0，然后使用乙醚萃取，获得的乙醚相使用无水MgSO4干燥过夜，过滤除去无水MgSO4，再经蒸发干燥获得纯的(R)-2-甲基丁酸。
步骤a中所用的脂肪酶选用：华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M201021脂肪酶(RCL)、固定化的米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(Lipozyme IM)、南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶(CAL，即Novozym 435)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)脂肪酶(CRL)、猪胰(porcine pancreas)脂肪酶(PPL)、荧光假单胞菌(Pseuclomones fluorescens)脂肪酶(AK)、青霉(Penicillium camemberti)脂肪酶(G)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)脂肪酶(PS)、固定于硅藻土的洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)脂肪酶(PS-D)以及爪哇曲霉(Aspergillus javanicus)脂肪酶(FAP-15)中的一种。
步骤a中所用的脂肪酶选用：华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M201021脂肪酶(RCL)，加入10g/L华根霉脂肪酶(RCL)在4℃下水解反应84h后获得ee值为95.0％的剩余底物(R)-2-甲基丁酸乙酯。
酶法拆分(R)-2-甲基丁酸乙酯及(R)-2-甲基丁酸，分为两部分：对于(R)-2-甲基丁酸乙酯的拆分，是通过一步选择性水解反应实现的；而(R)-2-甲基丁酸的拆分则是在第一步水解拆分反应的基础上将获得的(R)-2-甲基丁酸乙酯再经第二步脂肪酶催化的选择性水解而实现的。
拆分反应体系pH在5.5～7.5之间，控制温度4～50℃，200r/min振荡反应，定时从反应液中取样，10000r/min离心10min，上清液用等体积乙酸乙酯萃取，萃取液用于手性GC分析。
2-甲基丁酸和2-甲基丁酸乙酯的光学纯度分析采用Varian 3900型气相色谱仪分析。手性毛细色谱柱(SUPELCO-β-DEX-120-Chiral cyclodextrin capillary GCcolumn，30m×0.25mm×0.25μm)，分流比为1∶100；进样口温度250℃；检测器温度300℃；载气H2；载气流量2.0ml/min；柱升温程序为40℃保持22min，再以10℃/min的速率升温至120℃，保持10min。
反应的对映体选择性E值的计算如下式：
E＝ln[1-(c+ees(1-c))]/ln[1-(c-ees(1-c))]＝ln[1-c(1+eep)]/ln[1-c(1-eep)]
其中，产物的对映过量值(eep，％)及底物的对映过量值(ees，％)可由上述方法检测得到，转化率(c，％)＝[ees/(ees+eep)]×100％。
经过对多种不同来源的脂肪酶的选择性水解(R，S)-2-甲基丁酸乙酯能力的筛选，筛选选择性以及水解活性同时较高的脂肪酶做进一步拆分反应过程的考察，发现华根霉脂肪酶在选择性水解(R，S)-2-甲基丁酸乙酯的过程中，具有较高的底物ee值。4℃下水解反应84h后，(R)-2-甲基丁酸乙酯的ee值可达到95.0％。
由于几乎所有脂肪酶都符合Kazlauskas-法则，优先选择(S)-构型的底物进行反应。而目的产物又是(R)-构型的，因此，选择水解活性较强而选择性较弱的脂肪酶作为第二步水解反应用酶，筛选考察后确定了第二步选择性水解用酶为脂肪酶Novozym 435。
将上述单步水解拆分反应的剩余底物(R)-2-甲基丁酸乙酯提取出来，作为第二步水解反应的底物进一步进行水解，以脂肪酶Novozym 435为第二步水解反应用酶，反应1h后获得了ee值为92.2％的(R)-2-甲基丁酸。
华根霉CCTCC M201021脂肪酶已由中国专利ZL 03113274.X授权。
(3)有益效果
本发明通过脂肪酶的筛选与优化，单步水解拆分实现了(R)-2-甲基丁酸乙酯的拆分，通过两步选择性水解的方法实现了(R)-2-甲基丁酸的拆分。
首次将酶法拆分(R)-2-甲基丁酸乙酯及(R)-2-甲基丁酸的光学纯度提高至95.0％及92.2％。
本发明为2-甲基丁酸及其酯这样的结构特殊、拆分困难的物质的拆分提供了参考，同时也为认识脂肪酶动力学拆分的机理提供了参考。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
取2.0mmol(R，S)-2-甲基丁酸乙酯置于含10mL 0.05mol/L的KH2PO4/K2HPO4缓冲液(pH 7.5)的磨口锥形瓶内，加入10g/L华根霉(Rhizopuschinensis)CCTCC M201021脂肪酶(RCL)，于4℃下200r/min振荡反应。84h后，混合物离心，取上清用乙酸乙酯萃取产物和底物，手性气相色谱分析产物和底物，剩余底物(R)-2-甲基丁酸乙酯光学纯度95.0％，得率24.6％。
产物分离：在水解拆分反应体系中，将脂肪酶与反应液离心分离，清液使用正庚烷进行萃取，萃取后的庚烷相用饱和NaHCO3溶液萃取，得到的上层有机相使用硅胶柱分离，使用戊烷将溶剂庚烷洗脱下来，使用乙醚洗脱目的产物(R)-2-甲基丁酸乙酯，乙醚相再经氮吹获得纯的(R)-2-甲基丁酸乙酯。
提取剩余底物(R)-2-甲基丁酸乙酯，置于含10mL 0.05mol/L的KH2PO4/K2HPO4缓冲液(pH 7.0)的磨口锥形瓶内，加入5g/L的Novozym435，于40℃下200r/min振荡反应。1h后，混合物离心，取上清萃取提取产物。
产物分离：在第二步水解拆分反应体系中，将脂肪酶与反应液离心分离，清液使用正庚烷进行萃取，萃取后的庚烷相用饱和NaHCO3溶液萃取，获得的下层水相使用浓HCl调节pH至1.0，然后使用乙醚萃取，获得的乙醚相使用无水MgSO4干燥过夜，过滤除去无水MgSO4，再经蒸发干燥获得纯的(R)-2-甲基丁酸。
实施例2
取2.0mmol(R，S)-2-甲基丁酸乙酯置于含10mL 0.05mol/L的KH2PO4/K2HPO4缓冲液(pH 7.0)的磨口锥形瓶内，加入20g/L皱褶假丝酵母(Candida rugosa)脂肪酶(CRL)，于45℃下200r/min振荡反应。12h后，混合物离心，取上清用乙酸乙酯萃取产物和底物，手性气相色谱分析产物和底物，剩余底物(R)-2-甲基丁酸乙酯光学纯度85.5％，得率14.5％。
产物分离：在水解拆分反应体系中，将脂肪酶与反应液离心分离，清液使用正庚烷进行萃取，萃取后的庚烷相用饱和NaHCO3溶液萃取，得到的上层有机相使用硅胶柱分离，使用戊烷将溶剂庚烷洗脱下来，使用乙醚洗脱目的产物(R)-2-甲基丁酸乙酯，乙醚相再经氮吹获得纯的(R)-2-甲基丁酸乙酯。
提取剩余底物(R)-2-甲基丁酸乙酯，置于含10mL 0.05mol/L的KH2PO4/K2HPO4缓冲液(pH 7.0)的磨口锥形瓶内，加入5g/L的Novozym435，于40℃下200r/min振荡反应。1h后，混合物离心，取上清萃取提取产物。
产物分离：在第二步水解拆分反应体系中，将脂肪酶与反应液离心分离，清液使用正庚烷进行萃取，萃取后的庚烷相用饱和NaHCO3溶液萃取，获得的下层水相使用浓HCl调节pH至1.0，然后使用乙醚萃取，获得的乙醚相使用无水MgSO4干燥过夜，过滤除去无水MgSO4，再经蒸发干燥获得纯的(R)-2-甲基丁酸。
其余实施例：
以固定化的米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(Lipozyme IM)、南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶(CAL，即Novozym 435)、猪胰(porcine pancreas)脂肪酶(PPL)、荧光假单胞菌(Pseuclomones fluorescens)脂肪酶(AK)、青霉(Penicillium camemberti)脂肪酶(G)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)脂肪酶(PS)、固定于硅藻土的洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)脂肪酶(PS-D)以及爪哇曲霉(Aspergillus javanicus)脂肪酶(FAP-15)中的一种代替实施例1中的华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M201021脂肪酶(RCL)或实施例2中的皱褶假丝酵母(Candida rugosa)脂肪酶(CRL)，于各自标明的脂肪酶最适反应条件下，200r/min振荡反应；其余操作条件同实施例1，制得(R)-2-甲基丁酸乙酯及(R)-2-甲基丁酸。
Claims (3)
1.一种脂肪酶拆分制备(R)-2-甲基丁酸及(R)-2-甲基丁酸乙酯的方法，其特征是分为两步：工艺为：
1)酶法拆分制备(R)-2-甲基丁酸乙酯：
a、选择性水解：取含0.2mol/L(R，S)-2-甲基丁酸乙酯的0.05mol/LKH2PO4/K2HPO4缓冲液于适当的反应容器中，分别加入适量脂肪酶以控制反应速度，由于不同脂肪酶最适反应条件不同，于各自标明的脂肪酶最适反应条件下，200r/min振荡反应；获得ee值为95.0％的剩余底物(R)-2-甲基丁酸乙酯；
b、产物分离：在水解拆分反应体系中，将脂肪酶与反应液离心分离，清液使用正庚烷进行萃取，萃取后的庚烷相用饱和NaHCO3溶液萃取，得到的上层有机相使用硅胶柱分离，使用戊烷将溶剂庚烷洗脱下来，使用乙醚洗脱目的产物(R)-2-甲基丁酸乙酯，乙醚相再经氮吹获得纯的(R)-2-甲基丁酸乙酯；
2)酶法拆分制备(R)-2-甲基丁酸：
c、第二步选择性水解：将第一步水解拆分反应后提取的ee值为95.0％的剩余底物(R)-2-甲基丁酸乙酯作为第二步水解拆分反应的底物，体系中加入10g/L脂肪酶Novozym435，在温度为40℃、转速为200r/min的条件下进行水解反应，反应时间1h，得到第二步水解拆分后的产物ee值为92.2％的(R)-2-甲基丁酸；
d、产物分离：在第二步水解拆分反应体系中，将脂肪酶与反应液离心分离，清液使用正庚烷进行萃取，萃取后的庚烷相用饱和NaHCO3溶液萃取，获得的下层水相使用浓HCl调节pH至1.0，然后使用乙醚萃取，获得的乙醚相使用无水MgSO4干燥过夜，过滤除去无水MgSO4，再经蒸发干燥获得纯的(R)-2-甲基丁酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤a中所用的脂肪酶选用：华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M201021脂肪酶(RCL)、固定化的米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(Lipozyme IM)、南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶(CAL，即Novozym 435)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)脂肪酶(CRL)、猪胰(porcine pancreas)脂肪酶(PPL)、荧光假单胞菌(Pseuclomones fluorescens)脂肪酶(AK)、青霉(Penicillium camemberti)脂肪酶(G)、洋葱假单胞菌(Pseudomonascepacia)脂肪酶(PS)、固定于硅藻土的洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)脂肪酶(PS-D)以及爪哇曲霉(Aspergillus javanicus)脂肪酶(FAP-15)中的一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤a中所用的脂肪酶选用：华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M201021脂肪酶(RCL)，加入10g/L华根霉脂肪酶(RCL)在4℃下水解反应84h后获得ee值为95.0％的剩余底物(R)-2-甲基丁酸乙酯。
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