CN101693892B - 氨转运蛋白基因、其编码蛋白及其应用 - Google Patents

氨转运蛋白基因、其编码蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种氨转运蛋白基因、其编码蛋白及其该基因在农作物氮高效利用方面的应用。本发明的基因来源于盐藻，称为DvAMT1；1，该基因具有高亲和氨转运蛋白的转运功能，能恢复酵母突变体对低浓度的NH4 +的吸收的能力，同时也预示了它在农作物氮高效利用方面的应用价值。

Description

氨转运蛋白基因、其编码蛋白及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域。本发明涉及一种氨转运蛋白基因、其编码蛋白及其该基因在农作物氮高效利用方面的应用。
背景技术
土壤中可利用的氮源比较少，而氮又是植物需求量最大的矿物质元素，自然就会成为农作物产量最主要的限制因素之一。由于外源的氮对农作物产量的提高是非常有效的，因而，在集中型农业系统中，阶段性的施加无机氮肥成为提高农作物产量的重要途径。许多农作物品种之所以被耕种者选择，一部分原因就是它们对施用的氮肥有更高的利用性。然而，无机氮肥的应用会造成一系列环境问题，尤其是淡水，进而江河和海水的富营养。正因为如此，需要降低氮肥的使用量，并寻找氮利用率更高的植物基因型。更高的氮利用率可以保证在产量不下降的前提下，减少氮肥的使用量。当然，值得一提的是，对大多数农作物来讲，随着农产品的收获，土壤中的氮被不可逆转的转移，最终可能会导致土壤中氮源的耗竭。
铵盐(NH4 +)和硝酸盐(NO3 -)是大多数非固氮农作物进行氮吸收和同化的主要形式。在自然界中的土壤中，NH4 +一般在丰度上要比NO3 -少10-1000倍。但是，在许多微生物和植物中，NH4 +是被优先利用的无机氮形式，部分原因可能是NH4 +被细胞代谢所消耗的能量比NO3 -要少。NH4 +是无机氮与有机氮转化过程中的重要中间复合物，在去氨基和转氨基反应生成其它含氮化合物的过程中也是不可或缺的。
在生理水平上，有两个动力学特性不同的转运系统参与了NH4 +的转运：低亲和转运系统(LATS)，与K+被动运输通道相关，介导高浓度下氮的吸收；高亲和转运系统(HATS)，通过将NH4 +内流与H+偶联介导NH4 +的主动运输，介导低浓度下氮的吸收。在分子水平上，植物、酵母、细菌、真菌、动物以及藻类中已发现的编码NH4 +转运蛋白的基因组成了三个家族：AMT/MEP/Rh。
盐藻(Dunaliella viridis)属团藻目、多毛藻科、杜氏藻属，是耐盐性最强的真核单细胞藻类。不仅可在高盐海水和盐湖等生长，也能经受外界环境中盐浓度0.5-5.5mol/L剧烈变化。在外界高盐的环境下，盐藻可利用环境中低浓度的毫摩尔的NO3 --N和NH4 +-N。研究盐藻的NH4 +-N转运，有利于搞清楚高盐环境下植物铵态氮的转运机制及调控机制。因此，盐藻氨转运蛋白基因DvAMT的克隆及功能鉴定对于改善逆境下农作物的性状有重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供了一个具有铵态氮源转运功能的氨转运蛋白基因，该基因是从盐藻中分离的一个DNA分子，称为DvAMT1；1。
本发明的目的之二在于提供该基因的编码蛋白。
本发明的目的之三在于提供该在提高低氮环境下NH4+的利用率中的应用。
本发明的目的之四在于提供了该基因在改良农作物性状中的应用。
为达以上目的，本发明通过下述方案实现：
一种氨转运蛋白基因，其特征在于该基因具有下列核苷酸序列之一：
1)具有SEQ ID NO 1所示的碱基序列；
2)与序列表中序列1所限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且编码相同生物学功能蛋白质的DNA序列。
一种上述的基因的编码蛋白，该蛋白具有下列氨基酸序列之一：
1)具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列；
2)通过将SEQ ID NO 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而产生的衍生蛋白质的氨基酸序列，该衍生蛋白质与SEQ ID NO 2的蛋白具有相同的生物学功能。
一种克隆上述的基因的方法，该方法的具体步骤为：利用SMARTTM cDNA construction kit构建了3个盐藻cDNA文库，通过对该3个文库中cDNA的序列的测序，获得对应的EST文库；再通过序列比对，分离到了一个氨转运蛋白基因，命名为DvAMT1；1；挑选cDNA文库相应克隆进行测序，获得了含有该基因完整ORF的cDNA序列。
一种重组表达载体，该重组载体含有上述的基因。
一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述的重组载体。
一种上述的基因在提高低氮环境下NH4+的利用率中的应用。
一种上述的基因在在改良农作物性状中的应用。
本发明的基因DvAMT1；1具有高亲和氨转运蛋白的转运功能，能恢复酵母突变体对低浓度的NH4 +的吸收的能力，同时也预示了它在农作物氮高效利用方面的应用价值。
附图说明
图1为本发明的基因DvAMT1；1编码的蛋白的结构图，表明该编码蛋白具有11个跨膜结构域。
图2为本发明的DvAMT1；1基因编码的蛋白的进化分析图，表明该编码蛋白属于高亲和氨转运蛋白家族AMT1家族。
图3为本发明的DvAMT1；1基因在酵母突变体31019b(Δmep1；Δmep2；Δmep3)中的功能互补分析图。
图4为本发明的DvAMT1；1基因在不同氮源处理条件下的表达模式图。
具体实施方式：
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd ed.)或酵母遗传法实验指南(Methods in Yeast Genetics：A Cold Spring Harbor Laboratory CourseManual，Adams A et al编，Cold Spring Harbor Laboratory，1998出版)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例一：DvAMT1；1基因全长编码区的克隆与分析
本实验室利用SMARTTM cDNA construction kit构建了3个盐藻cDNA文库，通过对文库中cDNA的序列进行大规模测序，获得对应的EST文库。通过序列比对，分离到了一个盐藻氨转运蛋白基因，命名为DvAMT1；1。挑选cDNA文库相应克隆进行测序，获得了含有该基因完整ORF的cDNA序列。测序结果表明：DvAMT1；1的cDNA全长2454bp，含有绿藻基因特异的加尾信号TGTAA及poly(A)结构。Vector NTI9.1.0软件的分析结果显示：该基因编码一个含593个氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小约为62.8kDa，等电点为5.76。利用TMHMM Server v.2.0对DvAMT1；1基因编码的蛋白进行跨膜分析表明，该蛋白具有11个跨膜区，参见图1，这是氨转运蛋白均具备的特征，表明该蛋白是膜蛋白。进化分析表明，DvAMT1；1基因编码的蛋白属于高亲和氨转运蛋白家族AMT1家族，参见图2。
实施例二DvAMT1；1在酵母突变体中的功能分析
通过PCR方法，以DvAMT1；1的全长cDNA为模板，扩增获得包含完整ORF的基因片段。所涉及的引物序列如下：
DvAMT1；1
Sense：5’CAGCAGCAGCAAGCATGGCA 3’
Antisence：5’AGCTACAATAATCCCAATCACAG 3’
然后将克隆到的目的片段插入到酵母组成型表达载体pAJ401中，并转化酵母突变体31019b(Δmep1；Δmep2；Δmep3)。该突变体由于缺失高亲和的氨转运蛋白，所以在氮源低于5mM NH4+的酵母培养基中无法正常生长。由图3可以看出，DvAMT1；1的表达，使得酵母突变体在1mM NH4 +培养基条件下生长。该互补实验在酵母中验证了基因DvAMT1；1的高亲和氨转运蛋白的转运功能，证明该基因能够恢复酵母突变体对低浓度的NH4 +的吸收的能力，同时也预示了它在农作物氮高效利用方面的应用价值。
实施例三通过Realtime-PCR方法分析盐藻DvAMT1；1在不同氮源处理条件下的表达模式
为了进一步研究DvAMT1；1在不同外界氮源条件下的表达情况，我们分别对对数期的盐藻进行了如下四种不同氮源的振荡处理：5mM NO3 -→1mM NH4 +，-N→1mM NH4 +，-N→1mM NO3 -，1mMNH4 +→1mM NO3 -。分别在0小时，0.5小时，2小时，24小时取样，并提取盐藻细胞总RNA。上述RNA样品经DNase I消化后，在反转录酶的作用下反转成cDNA，稀释10倍后作为各个实验条件的real-time PCR的模板。
real-time PCR引物设计：
(1)DvAMT1；1R+：5’-CGACTCTTTCGCTCATCACATC-3’
(2)DvAMT1；1R-：5’-AGCGTGAACAACAACGAAAGC-3’
(3)DvACTIN R+：5’-GCCACTGCTTTAGCTGTTTGC-3’
(4)DvACTIN R-：5’-CCTCATGCTCCCAGATGTTCTA-3’
DvAMT1；1和DvACTIN的文库质粒经纯化和定量后，按照10倍梯度稀释作为定量PCR的标准曲线，DvACTIN的转录量作为内参。基因DvAMT1；1的转录变化数据以其在模板中的拷贝数与DvACTIN的拷贝数的比值来作图展示，参见图4，由图4可以看出，基因DvAMT1；1的表达受缺氮诱导，受外界氮源抑制，而且NH4 +的抑制作用比NO3 -还要明显。由此我们可以推测，基因DvAMT1；1具有在缺氮条件下改善生物体氮利用效率的潜能。
序列表
<110>上海大学
<120>氨转运蛋白基因、其编码蛋白及其应用
<160>2
<210>1
<211>2454
<212>DNA
<213>盐藻(Dunaliella viridis)
<400>1
ACGCGGGGAC ACACATTTTA AAAGGCCTCA GGCACCGCGC CCCTGACTGT GGTGGGAGCT  60
ACCCTCTCGC CAGCAGCAGC AGCAAGCATG GCAGCGGCTC TCAGCCCAGA GCTGCTGGAG  120
GCCATCCGCG GTGCGGTGAA GGCCGAGATT CAGCATGAGG ACCCACTGTT CGCGCACGGA  180
GGCGCGCGCC ACAGCCGAGG CCTGCTGTCC AACCACTACT CGGGCGTGGA CTCCAGCTCC  240
CTGTCGGGCA CAGCAGCGCA AGTTGACGCC AGCGGCAACG TCGTGTCCGT GCCCATCTAT  300
GACAACGGCT TCGCCTCCGC GGACAGTGTC AACGTCTTCT GGCTGCTCAT CTGCGGCTAC  360
CTGGTGTTCC TGATGCAGCT GGGCTTCGCT ATGCTTTGCG CCGGACTGGT CCGCTACAAG  420
AACGCCAACA ACATCATGCT CAAGAACATC TTGGATGCAT CTGTTGGTAG CATTTGCTGG  480
TATGTCCTTG GCTACGGATT CGCATACGGA ATTAGCAACC ACCGATCCAA CGCCTTCATT  540
GGTAACCATG ACTTCGGCCT GACCTACACA ACCAAAGCCA ACTGGTTCAT GGCATGGCCG  600
CAAGATACCC ACGACTATGT GACTGCTGGA AACTACGCAG GCTACTTCTT CCAGTGGGCC  660
TTCGCTGCCA CCGCAGCCAC CATTGTGTCC GGAGCTGTGG CTGAGCGCTG CACTTTCATT  720
GCTTACCTGA GCTACTCTAT CTACATGGCC TCCTTCGTGT ACCCCGTGGT CGTCCATGCA  780
TGCTGGTCTG GCATCGGCTG GCTGTCCCCA TGGGTGGGCA ACGGCACTGC TGTGGAGACC  840
AACGGTGGCC GTGAGAATGG TGACAGCGGT GACTTCACTT TTGCTGGCCA CTGGAACGGT  900
GGTGCTGCCA TCCTGAACAC TGGTGCCTAC GACTTTGCCG GCTCCGGTGT TGTCCACATG  960
ACGGGTGGTG TTGCTGCACT GGTTGGCGCT ACCATGCTGG GCCCCCGTCT GGGTCGCTTC  1020
AGGGATGGCA AGGTCAATGA TGAGATGTCC GGCTCCTCCA CTGTCCTGGT CGTGCTGGGT  1080
ACCCTCATCC TGTGGTTCGG CTGGTACGGC TTCAACCCTG GCTCCCAGCT GGCCATCGCC  1140
GGAGTTGTGG ATGGTGCCGT TGCCGGCCGC TGCGCTGTGT GCACCACTCT GTCCGCGGGT  1200
GCTGGTGGTG TGACTGCCCT GCTGTTCCGC TTCTGGCGCA GCGGCGCCTT TGAGGTTGTG  1260
TACACCTGCA ACGGCGTGCT GGCGGGCCTG GTCGGCGTGA CTGCCAGCTG CTCCCTGATT  1320
GAGCCTTGGG CTGCCATCAT CTGCGGTGTC TTCGCTGCCC TCACTATGTA CGGCGCTGAA  1380
TGCGCCCTGC ATGCCCTCCA GATCGATGAC CCCGTGAGTG CCTTCCCCGT CCACGGTGCT  1440
GCTGGAATGT ACGCCCTCAT CTTCACCGGC TTCTTCACAA AGCATGATTA CGCCAAGGAG  1500
GTGTACGGCT ACCCCGTGTC TAGCCGCCGA TACGGCTGGT TCTACGGTGG CCACGGCCAG  1560
GTGATGCTAT CTGAGATTGT CGAGCTTTTC TTCATCCTCT GCTGGGTGGG CATCAACTTC  1620
TTCCTGCTGT TCGGCCTGCT CAAGATCACC GGCAGGCTGA GGGTGCCCCC TGAGGTTGAG  1680
CACGCTGGGC ACGAGGCTTC AGTGCACGGC TCCAAGAAGG GCACCAGTGG CAACATCTTC  1740
GGTGGCGGCA TGGAGTCCAA CGGCATGGAC CTGACAGTGG ACACCGTGAA GCCCTCCAAC  1800
AACACTGCCA GCCCCAAGGG TGAGGGTGTG GAGGAGACAC CTGTGCAGCC GGGCACGAGC  1860
GCTGTGTAAA ATTCTTGACG AACCTTATTG TCCTGTGGCC TTGGCTGTTA GGGCGCAAGT  1920
CCACAGGAGC GGTGCTGAGA GGGCACTGCT GTGATTGGGA TTATTGTAGC TATCTATGGT  1980
GACCACTGTT GTGTGCTTCT GACAGTGGGG TGTTCAGGGA GTTTGTTTTG TGCACTAGAA  2040
CACAACTCAA GCATAAGCTT GCGGGTGTAT CCCTTGACAA CCCCGGAGGA GTAGCTTGCC  2100
TCCGGTGTCC GAGCTCTTGC TCTCGACTCT TTCGCTCATC ACATCACTCA TTTAGTACGC  2160
ACTGTTTTGT CATCTTCCTT ACATACCTCT GTAGCTTGGT TGGAAGATTG CTCATTTCAT  2220
GTTATAGCGA ACGTGCAGTA TGTATGTGTT CGCTTTTTTT CATTGTCTCC ATGTATGCCG  2280
GAATACCGGA TCTGAGAGTT GGCTGCCAAG TCTGTAGCTT ATATATTTGG TTCATGGAGA  2340
TGTGATCCAT GCATGTATGC GATTGCTTTC GTTGTTGTTC ACGCTGGATC TCGCTGGATT  2400
TTGTATCCTG AAGAATAACA TGTAACTTAA CTCAATGCTT AAAAAAAAAA AAAA        2454
<210>2
<211>593
<212>PRT
<213>盐藻(Dunaliella viridis)
<400>2
MAAALSPELL EAIRGAVKAE IQHEDPLFAH GGARHSRGLL SNHYSGVDSS SLSGTAAQVD   60
ASGNVVSVPI YDNGFASADS VNVFWLLICG YLVFLMQLGF AMLCAGLVRY KNANNIMLKN    120
ILDASVGSIC WYVLGYGFAY GISNHRSNAF IGNHDFGLTY TTKANWFMAW PQDTHDYVTA    180
GNYAGYFFQW AFAATAATIV SGAVAERCTF IAYLSYSIYM ASFVYPVVVH ACWSGIGWLS    240
PWVGNGTAVE TNGGRENGDS GDFTFAGHWN GGAAILNTGA YDFAGSGVVH MTGGVAALVG    300
ATMLGPRLGR FRDGKVNDEM SGSSTVLVVL GTLILWFGWY GFNPGSQLAI AGVVDGAVAG    360
RCAVCTTLSA GAGGVTALLF RFWRSGAFEV VYTCNGVLAG LVGVTASCSL IEPWAAIICG    420
VFAALTMYGA ECALHALQID DPVSAFPVHG AAGMYALIFT GFFTKHDYAK EVYGYPVSSR    480
RYGWFYGGHG QVMLSEIVEL FFILCWVGIN FFLLFGLLKI TGRLRVPPEV EHAGHEASVH    540
GSKKGTSGNI FGGGMESNGM DLTVDTVKPS NNTASPKGEG VEETPVQPGT SAV           593

Claims (6)

1.一种氨转运蛋白基因，其特征在于该基因是SEQ ID NO 1所示的碱基序列。
2.一种根据权利要求1所述的基因的编码蛋白，该蛋白是SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列；
3.一种重组表达载体，该重组载体含有根据权利要求1所述的基因。
4.一种宿主细胞，该宿主细胞含有根据权利要求3所述的重组表达载体。
5.一种根据权利要求1所述的基因在提高低氮环境下NH4 +的利用率中的应用。
6.一种根据权利要求1所述的基因在改良农作物性状中的应用。
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