CN101691558A - 一种卡马西平高效降解菌的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种卡马西平高效降解菌的提取方法，包括：(1)取城市污水处理厂二沉池的活性污泥按5wt％的接入量接种于无机盐培养基中，以梯度压力式驯化法驯化2个月；(2)将驯化2个月后的样品静置30min，取上层水样1ml作梯度稀释，然后每种稀释浓度分别取1ml菌液于接种到固体培养基进行富集培养，确保长出纯的单一菌株，再接种到斜面培养基，于4℃下保存，即可。该方法从城市污水处理厂二沉池的活性污泥中提取卡马西平降解菌株，种源易得且分离纯化方法简便快捷，成本低，对环境友好；提取到的菌株对卡马西平的降解率可达75％以上，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属微生物细菌的分离纯化领域，特别是涉及一种卡马西平高效降解菌的提取方法。
背景技术
随着环境分析技术的提高和人们环境意识的增强，药物及个人护理品(Phar maceuticaland Personal Care Products，简称PPCPs)作为一种新兴污染物日益受到人们的关注。药物和个人护理用品即使微量存在仍具有相当程度的生物活性，给环境造成不可预测的影响，并可能通过饮用水和食物等途径对人体健康产生潜在危害。
在常见的PPCPs化合物中，抗生素、消炎药、抗癫痫药物在各类环境介质中的检出频率较高。其中抗癫痫药卡马西平(Carbamazepine，CBZ)(分子结构如图1所示)由于药效显著，常作为治疗癫痫病和神经痛的首选药物被大量使用，然而卡马西平是含氮的芳香杂环化合物，目前传统的污水处理方法(如吸附、活性污泥、生物膜、紫外、光催化降解等方法)不能够有效去除，使其被频繁检出、且检出浓度相对较高，具有一定的生态毒性，是目前最受关注的PPCPs类污染物之一。有研究者将其作为人为影响水环境的一种指示化合物，来评价PPCPs的污染状况。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种卡马西平高效降解菌的提取方法，该方法从城市污水处理厂二沉池的活性污泥中提取卡马西平降解菌株，种源易得且分离纯化方法简便快捷，成本低，对环境友好；提取到的菌株对卡马西平的降解率可达75％以上，具有良好的应用前景。
本发明的一种卡马西平高效降解菌的提取方法，包括：
(1)定向驯化培养
取活性污泥(城市污水处理厂二沉池)按5wt％的接入量接种于无机盐培养基中，以梯度压力式驯化法驯化2个月；
(2)菌株的富集分离和纯化
将驯化2个月后的样品静置30min，取上层水样1mL作梯度稀释，然后每种稀释浓度分别取1mL菌液于接种到固体培养基进行富集培养，确保长出纯的单一菌株，再接种到斜面培养基，于4℃下保存，即可。
所述步骤(1)中的无机盐培养基为K2HPO44.35g/L，KH2PO41.7g/L，NH4Cl 2.1g/L，MgSO4 0.2g/L，MnSO4 0.05g/L，FeSO4·7H200.01g/L，CaCl2·2H200.03g/L，蒸馏水1000mL，pH＝6.8～7.0；
所述步骤(1)中的梯度压力式驯化法为在无机盐培养基中，分别依次加入卡马西平使其浓度为3、5、10、15、20、22mg/L，改变浓度的间隔时间为10d，于30℃，振荡速率160r/min条件下进行驯化培养；
所述步骤(2)中的梯度稀释是指作10-1～10-10的梯度稀释；
所述步骤(2)中的固体培养基为富集培养基中加入17g/L的琼脂粉，加热融化，冷却后而形成的培养基，其中富集培养基为牛肉膏3.0g/L，蛋白陈10.0g/L，NaCl 5.0g/L，蒸馏水1000mL，pH＝7.0～7.2。斜面培养基为将固体培养基加热溶化，取干净的试管，试管中倒入约5mL固体培养基，将试管口端放在玻璃棒上，使管内培养基形成斜面而形成；
所述步骤(2)中的富集培养是指将菌液于接种到富集培养基后于30℃培养箱中培养48h，挑取形态清晰的单一菌落，编号，在固体培养基上划线，将培养皿倒置于30℃培养箱中培养48h，再观察结果，在电子显微镜下观察菌落形态，反复2～4次，确保长出纯的单一菌株；
所述的卡马西平高效降解菌经16S rDNA序列测定，基因全序列如下：
TAAAGGGGGGGCAGGCTACACATGCAAGTCGAGCGGATGACGGGAGCTTGCTCCTT
GATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAA
CGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTT
CGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGC
TCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTG
AGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCG
AAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACT
TTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAG
AATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGT
TAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAA
AGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTACGGTAG
AGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCA
GTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGA
GCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTT
GGAATCCTTGAGATTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTA
CGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGC
ATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAA
CTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGT
CGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTC
CTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGG
AGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGT
GCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCTCACAAA
ACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTA
GTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCC
GTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACG
GTACCACGGTTGATCAAGT；
菌株16S rDNA的基因全序列在NCBI数据库中分析比较，鉴定为恶臭假单胞菌，其系统进化树见图2，同源性达到99％，命名为(Pseudomonas putida.)X-6；
所述的恶臭恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida.)X-6为阴性革兰氏杆菌，好氧，有运动型，菌体长度为0.4～.08um，其电镜扫描图见图3；在固体培养基中是呈乳白色，半透明，有光泽，表面低凸面，圆形，边缘整齐，直径大小为1-4.5mm并产红褐色色素的菌落；在无机盐培养基中的培养特征为乳白色悬浊液；该菌株在紫外线照射2h后，均已失去活性；该恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida.)X-6质粒检测结果表明该菌不携带质粒，因此降解基因编码于染色体上，这一特性使得在利用质粒进行水平基因转移的过程中，避免了质粒的不相容性，是构建具备多种降解能力的基因工程菌的良好材料，且对一般抗生素均无抗性，且易于灭活，保证了使用的生态安全性。
本发明提取的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida.)X-6不仅可以利用卡马西平作为唯一的碳、氮源进行新陈代谢，而且能在相对较高浓度的卡马西平基质条件下(卡马西平浓度约为25mg/L)良好生长；它对卡马西平的去除主要通过生物吸附和生物降解两个阶段，从而对卡马西平达到很高的去除率(75％以上)，同时适量的外加碳源不但不会影响本发明的菌株对卡马西平降解作用，而且对其降解具有促进作用。
在恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida.)X-6对卡马西平的降解代谢中间产物通过气质联机测定，检测结果见图4、图5，结果表明该菌株对卡马西平的降解产物中无CBZ、CBZ-2OH、CBZ-3OH和CBZ-DiOH等，说明该菌株对卡马西平的降解作用较为彻底。
取本发明分离得到的卡马西平高效降解菌的单一菌落于各种含有10mg/L的卡马西平的无机盐培养基中，在30℃、160r/min，250mL锥形瓶中装填量100mL的条件下进行培养，培养时间为48h，培养后通过电子显微镜观察细菌生长情况以及测定溶液中卡马西平的剩余浓度。
有益效果
(1)本发明从城市污水处理厂二沉池的活性污泥中提取卡马西平降解菌株，种源易得且分离纯化方法简便快捷，成本低，对环境友好；
(2)提取的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida.)X-6可以有效地降解卡马西平，对卡马西平的降解率可达75％以上；该菌株是废水处理系统中的优势菌株，因此该菌株能适应复杂的实际条件，这使得该菌的应用前景广阔。
附图说明
图1为卡马西平的分子结构式；
图2为(Pseudomonas putida.)X-6的系统进化树；
图3为(Pseudomonas putida.)X-6的扫描电镜；
图4为卡马西平代谢中间产物CBZ、CBZ-2OH的检测结果；
图5为卡马西平代谢中间产物CBZ-3OH、CBZ-DiOH的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)取自城市污水处理厂二沉池的活性污泥按5％的接入量接种于无机盐培养基中，其中无机盐培养基为K2HPO4 4.35g，KH2PO4 1.7g，NH4Cl 2.1g，MgSO4 0.2g，MnSO4 0.05g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCl2·2H2O 0.03g，蒸馏水1000mL，pH＝6.8-7.0，以梯度压力式驯化法驯化，卡马西平浓度为3、5、10、15、20、22mg/L，在30℃、振荡速率160r/min，250mL锥形瓶中装填量100mL的条件下进行驯化培养，总驯化时间为2个月；
(2)取驯化2个月后的样品，静置30分钟，取上层水样1mL，作10-1～10-10梯度稀释，每种稀释浓度分别取1mL菌液于培养皿内，倒入固体培养基后将培养皿放在桌上，来回转动培养皿后，将培养皿倒置于30℃培养箱中培养48h，挑取形态清晰的单一菌落，编号，在固体培养基上划线，将培养皿倒置于30℃培养箱中培养48h，，并在电子显微镜下观察菌落形态，反复几次，确保是纯的单一菌株后，将分离出的菌种接种到斜面培养基上，4℃下保存于冰箱中待后续进行降解试验，其中固体培养基为富集培养基中加入17g/L的琼脂粉，加热融化，冷却后而形成的培养基，其中富集培养基为牛肉膏3.0g/L，蛋白陈10.0g/L，NaCl 5.0g/L，蒸馏水1000mL，pH＝7.0～7.2。斜面培养基为将固体培养基加热溶化，取干净的试管，试管中倒入约5mL固体培养基，将试管口端放在玻璃棒上，使管内培养基形成斜面而形成；
(3)分别挑取经分离纯化后的单一菌落于各自的无机盐培养基中，各无机盐培养基中均含有10mg/L的卡马西平，在30℃、160r/min，250mL锥形瓶中装填量100mL的条件下进行培养，培养时间为48h，培养后通过电子显微镜观察细菌生长情况以及测定溶液中卡马西平的剩余浓度，从而确定出对卡马西平具有高效降解作用的菌株。
本实施例的一株卡马西平高效降解菌在初始pH值为7.3左右，温度为30℃，振荡速率为160r/min，250mL锥形瓶的装液量为100mL的条件下，菌株接种量为0.6％，卡马西平初始浓度为10mg/L，培养时间36h，然后利用高效液相色谱法进行测定，色谱条件：流动相为甲醇∶0.1％磷酸＝6∶4(V∶V)，测定波长为284nm，流速为1.0ml/min，柱温为25℃，保留时间约为4min；测得卡马西平的降解率高达78.9％。
Claims (7)
1.一种卡马西平高效降解菌的提取方法，包括：
(1)定向驯化培养
取活性污泥按5wt％的接入量接种于无机盐培养基中，以梯度压力式驯化法驯化2个月；
(2)菌株的富集分离和纯化
将驯化2个月后的样品静置30min，取上层水样1mL作梯度稀释，然后每种稀释浓度分别取1mL菌液于接种到固体培养基进行富集培养，确保长出纯的单一菌株，再接种到斜面培养基，于4℃下保存，即可。
2.根据权利要求1所述的一种卡马西平高效降解菌的提取方法，其特征在于：所述步骤(1)中的无机盐培养基为K2HPO44.35g/L，KH2PO41.7g/L，NH4Cl 2.1g/L，MgSO40.2g/L，MnSO40.05g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，CaCl2·2H2O 0.03g/L，蒸馏水1000mL，pH＝6.8～7.0。
3.根据权利要求1所述的一种卡马西平高效降解菌的提取方法，其特征在于：所述步骤(1)中的梯度压力式驯化法为在无机盐培养基中，分别依次加入卡马西平使其浓度为3、5、10、15、20、22mg/L，改变浓度的间隔时间为10d，于30℃，160r/min条件下进行驯化培养。
4.根据权利要求1所述的一种卡马西平高效降解菌的提取方法，其特征在于：所述步骤(2)中的梯度稀释是指作10-1～10-10的梯度稀释。
5.根据权利要求1所述的一种卡马西平高效降解菌的提取方法，其特征在于：所述步骤(2)中的固体培养基为富集培养基中加入17g/L的琼脂粉，加热融化，冷却后而形成的培养基，其中富集培养基为牛肉膏3.0g/L，蛋白陈10.0g/L，NaCl 5.0g/L，蒸馏水1000mL，pH＝7.0～7.2。斜面培养基为将固体培养基加热溶化，取干净的试管，试管中倒入约5mL固体培养基，将试管口端放在玻璃棒上，使管内培养基形成斜面而形成。
6.根据权利要求1所述的一种卡马西平高效降解菌的提取方法，其特征在于：所述步骤(2)中的富集培养是指将菌液于接种到固体培养基后于30℃培养箱中培养48h，挑取形态清晰的单一菌落，编号，在固体培养基上划线，将培养皿倒置于30℃培养箱中培养48h，并在电子显微镜下观察菌落形态，反复2～4次，确保长出纯的单一菌株。
7.根据权利要求1所述的一种卡马西平高效降解菌的提取方法，其特征在于：所述的卡马西平高效降解菌经16S rDNA序列测定和分析比较，鉴定该菌株为恶臭假单胞菌，命名为Pseudomonas putida.X-6，菌体长度为0.4～0.8um，菌落直径大小为1-4.5mm，圆形，边缘整齐，表面低凸面，有光泽，呈乳白色，半透明，革兰氏染色均为阴性。
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| CN102701436A (zh) * | 2012-06-13 | 2012-10-03 | 哈尔滨工业大学宜兴环保研究院 | 一种生物活性炭滤池及用其进行污水深度处理的方法 |
| CN102864097A (zh) * | 2012-04-26 | 2013-01-09 | 哈尔滨工业大学宜兴环保研究院 | 一株耐冷卡马西平降解菌及其筛选方法和在含卡马西平废水处理中的应用 |
| CN109423459A (zh) * | 2017-08-30 | 2019-03-05 | 中国石油化工股份有限公司 | 一种假单胞菌及其鉴定方法和应用 |
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