CN101678063B - 使用ε抑制剂化合物减轻疼痛的方法 - Google Patents

使用ε抑制剂化合物减轻疼痛的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101678063B
CN101678063B CN2008800084226A CN200880008422A CN101678063B CN 101678063 B CN101678063 B CN 101678063B CN 2008800084226 A CN2008800084226 A CN 2008800084226A CN 200880008422 A CN200880008422 A CN 200880008422A CN 101678063 B CN101678063 B CN 101678063B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pkc
peptide
pain
kai
inhibiting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN2008800084226A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101678063A (zh
Inventor
德里克·麦克莱恩
尹凯文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kai Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Kai Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kai Pharmaceuticals Inc filed Critical Kai Pharmaceuticals Inc
Publication of CN101678063A publication Critical patent/CN101678063A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101678063B publication Critical patent/CN101678063B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/45—Transferases (2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本文中的公开内容涉及修饰的εPKC抑制肽，产生所述肽的方法，和使用εPKC抑制肽治疗疼痛的方法。

Description

使用ε抑制剂化合物减轻疼痛的方法
相关申请 
本申请要求美国临时申请号60/881,396，60/903,684，60/917,876，和60/977,332的优先权利益，将其全部内容引入本文作为参考。 
技术领域
本发明涉及调节不同类型疼痛的化合物的开发和使用，且其中将可能具有重叠和/或不重叠的生物化学活性机制的化合物引入到单化合物实体中(所谓的“杂种”化合物或肽)，用于治疗疼痛和相关病症。其中所述化合物包括一种或多种与至少一种载体部分偶联的εPKC(εPKC)抑制肽，且其中抑制肽、载体部分、或二者已从原型序列得到修饰，以增加由此产生的化合物的稳定性、效力、或二者。εPKC抑制肽还可以与一种或多种具有针对一种或多种其他PKC同工酶，包括PKCα，β，δ，γ，θ或η的特异性活性的调节肽偶联。杂种化合物或肽超越同工酶一特异性PKC调节剂的优势应该是提供更广谱的活性，从而调节多种类型的疼痛和/或为疼痛调节化合物提供更大的效力和/或更高的安全性，和/或提供双重治疗活性，以减轻疾病病症的多重方面(例如，组合减轻疼痛活性和消炎活性)。 
背景 
疼痛是由炎症、神经损伤、或对机械、热或化学刺激过度敏感的组织引起的不适感觉。它是严重的健康问题：由于疼痛相关的病症每年损失许多工作日。在广泛多样的疼痛中，神经性疼痛是由神经损伤引起的疾病，并且影响＞1百万美国人。该病症由多种原因包括糖尿病、带状疱疹感染(水痘/带状疱疹)、外伤性神经损伤、癌症、或用化学治疗试剂治疗癌症引起。炎性疼痛是另一种疼痛，其由于其多样的病因学，构成单独的最大类型。关于新型止痛疗法的搜索是医学界的非常感兴趣的领域(Reichling 和Levine，1999)，因为其与其他局部或系统疾病，诸如自体免疫病症如类风湿性关节炎有关，并且因为其是慢性的且因此引起持久的痛苦。 
大部分目前的疼痛治疗使用系统-施用的药物，诸如非-类固醇抗炎药物(NSAIDS)或阿片样物质的治疗法。这些药物中的许多引起系统性副作用，其范围从心脏风险的增高到成瘾。仅存在少量使用局部施药途径，诸如辣椒素霜剂的疼痛治疗法，所述方法不对所有类型的疼痛起作用，且引起局部刺痛(灼烧感、皮肤痛、皮肤炎症，等)。 
蛋白激酶C(“PKC”)是参与多种细胞功能，包括细胞生长、基因表达的调节、和离子通道活性的信号转导中的关键酶。PKC同工酶家族包括至少11种不同的蛋白激酶，基于它们的同源性和对激活剂的敏感性可分为至少三个亚家族。所述家族是经典的、新型的、和非典型的亚家族。每种同工酶包括许多同源(“保守的”或“C”)结构域，其间散布有同工酶-特有的(“可变的”或“V”)结构域。εPKC，连同δ，η和θPKC，都是所述“新型”亚家族的成员。该亚家族的成员典型地缺少C2同源结构域且不需要钙来活化。多种疾病状态的机制中涉及了PKC的各种同工酶。已经生成了源自εPKC的εPKC抑制肽，并显示出影响痛觉。例如，参见专利号6,376,467和6,686,334。 
这种方法的一个问题是切除的片段的“裸露的”末端与它们在蛋白质中的邻近序列不同，在该片段与蛋白质剩余部分附着的位置显示出自由的胺和羧基。这些外来的部分可以致使所述肽对蛋白酶更敏感。作为这些倾向的结果，所述肽的效力可能不太理想，且体内半衰期可能显著缩短。 
现有技术的第二个领域利用类似的策略，其中将“载体”肽设计为HIV-Tat和其他蛋白的片段。这些肽片段模拟亲本蛋白穿过细胞膜的能力。特别感兴趣的是，“货物”肽可以附着于这些载体肽从而将货物和载体肽通过这些载体肽片段运载到细胞中的特性。 
认识到载体肽是片段，类似的缺陷可以如上所注地适用于所述货物肽。即，暴露的末端可以使其具有不理想的特性，包括蛋白酶易感性。 
现有技术货物/载体肽构建体在货物和载体之间使用了Cys-Cys二硫键，其在所述肽进入细胞时，可以被许多试剂，诸如谷胱甘肽还原裂解。该特性已被认为对生物活性很重要，因为货物和载体的物理分离容许这两 个部分在细胞内发挥它们独立的作用。然而，该假说尚未得到有说服力的检验，且不可裂解的类似物事实上可以具有良好的活性。此外，二硫键难以组装，并倾向于化学降解。 
某些现有技术货物/载体肽的设计基于来自该蛋白的连续氨基酸序列。然而，该肽的最佳长度尚未得到充分定义，这基于理想序列的序列比较分析和理论预测，而非基于类似物测试的经验基础。因此，由前述货物肽的类似物可以预测增加的效力，所述类似物包含与其来源的εPKC结构域相对应的另外的残基。 
附图简述 
图1显示修饰的εPKC抑制肽(KP-1634)的图示。 
图2显示抑制性εPKC抑制肽(KP-1586)的化学式。 
图3通过对测试肽相对浓度随时间的变化绘图，显示大鼠或人血清对肽KP-1586，KP-1630，和KP-1631的稳定性的影响。 
图4通过对测试肽相对浓度随时间的变化绘图，显示大鼠或人血清对肽KP-1632，KP-1633，和KP-1634的稳定性的影响。 
图5通过对测试肽相对浓度随时间的变化绘图，显示大鼠或人血清对肽KP-1635，KP-1636，和KP-1637的稳定性的影响。 
图6通过对测试肽相对浓度随时间的变化绘图，显示时间和温度对肽KP-1586，KP-1630，KP-1631，KP-1632，KP-1633，KP-1634，KP-1635，KP-1636，KP-1637，和KP-1638的化学稳定性的影响。 
图7显示福尔马林测试的结果，以在用对照和两种剂量的KP-1586处理的大鼠中的退缩/分钟对比时间的图中显示急性疼痛的减轻。 
图8在描绘角叉藻聚糖模型中针对肽KP-1586和对照肽KP-1587的爪缩回反应时间的柱状图中显示εPKC抑制肽对急性炎性疼痛的影响。 
图9显示描绘爪缩回反应时间的柱状图并在大鼠慢性炎性疼痛模型中比较抑制肽KP-1586或对照肽KP-1587，其中施用角叉藻聚糖，5天后通过PGE2促进慢性痛觉过敏。 
图10示出显示εPKC抑制肽对爪缩回阈值测量的作用的线形图。 
图11显示在L5神经横断后的大鼠(神经性疼痛模型)中皮下输注 εPKC抑制肽对热痛觉过敏的影响的柱状图。 
图12显示线形图，其显示在L5神经横断后的大鼠中皮下推注εPKC抑制肽对热痛觉过敏的影响，这是通过利用爪缩回反应时间测量的。 
图13显示柱状图，其显示在L5神经横断后的大鼠中皮下输注εPKC抑制肽对热痛觉过敏的影响。 
图14局部施用PKC抑制剂对角叉藻聚糖-诱导的应答机械刺激的痛觉过敏的作用。爪缩回阈值(PWT)随着通过皮内(A)和皮下(B)途径注射εV1-2而增加。PWT的增加表示较小的疼痛。PWT的增加回到角叉藻聚糖前的水平称为抗痛觉过敏作用。PWT高于角叉藻聚糖前水平的增加暗示潜在的止痛作用。 
图15.单侧去传入对远离神经交流施用于手术同侧肢的PKC抑制剂的抗-痛觉过敏作用的影响。去传入动物中，对身体同侧的爪上皮内(i.d.)施用该化合物仍能够抑制角叉藻聚糖-诱导的疼痛。 
图16.双侧腰部交感神经切除术加双侧肾上腺神经节截除术对PKC抑制剂的抗-痛觉过敏作用的影响。实验在手术后7天时进行，从而容许SPGN(交感神经节后神经元)末梢的变性。外壳交感神经切除术模仿单侧去传入手术的作用。皮下注射PKC抑制剂(εV1-2-TAT)在施以交感神经切除手术的大鼠中不再诱导抗-痛觉过敏/止痛作用，但是其对假装手术的动物的影响保持不变。痛觉过敏的逆转非常迅速，其发生在施用PKC抑制剂的5分钟内。 
图17.注射酚妥拉明对PKC抑制剂的抗-痛觉过敏作用的影响。注射酚妥拉明，其是非选择性α-肾上腺素受体拮抗剂，消除了注射于先前注射了酚妥拉明的肢远侧的PKC抑制剂(εV1-2-TAT)的疼痛-减轻作用。酚妥拉明后，εV1-2-TAT的抗-痛觉过敏作用消失。 
图18：在大鼠中角叉藻聚糖炎性疼痛模型中，皮内KAI-1678对机械痛觉过敏的影响。在将角叉藻聚糖注射到右后爪足底侧后60分钟时，用皮内推注注射KAI-1678处理大鼠。将KAI-1678以10mcg/kg(三角形)或100mcg/kg(圆形)给药于身体同侧的后肢(即接受角叉藻聚糖的同一肢，实心符号)或对侧后肢(即没有接受角叉藻聚糖的肢，空心符号)。数据表示为关于给定时间点时各组(N＝2-5只动物/组)中动物的(PWT)测量 结果的平均值±SEM(平均值的标准误差)。～90g处的虚线表示角叉藻聚糖前基线PWT测量结果；指示疾病状态的PWT是～60g。在角叉藻聚糖前基线水平处或其上的测量结果表示对角叉藻聚糖-诱导的机械痛觉过敏的完全逆转。 
图19：在大鼠中的角叉藻聚糖炎性疼痛模型中，皮下推注施用KAI-1678对机械痛觉过敏的影响。在将角叉藻聚糖注射到右后爪足底侧后60分钟时，将KAI-1678或KP-1723，即KAI-1678的无活性类似物的皮下推注注射施用于大鼠。将KAI-1678或KP-1723以所示剂量给药于对侧后肢(即没有接受角叉藻聚糖的肢)。数据表示为关于给定时间点时各组(N＝2-5只动物/组)中动物的(PWT)测量结果的平均值±SEM(平均值的标准误差)。～90g处的虚线表示角叉藻聚糖前基线PWT测量结果；指示疾病状态的PWT是～62g。在角叉藻聚糖前基线水平处或其上的测量结果表示对角叉藻聚糖-诱导的机械痛觉过敏的完全逆转。 
图20：在大鼠角叉藻聚糖炎性疼痛模型中，给药位置对皮下推注施用KAI-1678的影响。对用角叉藻聚糖注射到右后爪足底表面的大鼠，从角叉藻聚糖注射后60分钟开始，给药2次10mcg/kg皮下推注注射KAI-1678，相隔4小时。这两次KAI-1678给药在大鼠上的不同位点进行，如所示。数据表示为关于给定时间点时各组(N＝2只动物/组)中动物的(PWT)测量结果的平均值±SEM(平均值的标准误差)。～90g处的虚线表示角叉藻聚糖前基线PWT测量结果；指示疾病状态的PWT是～60g。在角叉藻聚糖前基线水平处或其上的测量结果表示对角叉藻聚糖-诱导的机械痛觉过敏的完全逆转。 
图21：在大鼠中的角叉藻聚糖炎性疼痛模型中，皮下输注KAI-1678对机械痛觉过敏的影响。在将角叉藻聚糖注射到右后爪足底侧后60分钟时，用6-小时皮下输注KAI-1678或KP-1723，即KAI-1678的无活性类似物处理大鼠。将KAI-1678或KP-1723以所示给药速率施用于对侧后肢(即没有接受角叉藻聚糖的肢)。数据表示为关于给定时间点时各组(N＝2-6只动物/组)中动物的(PWT)测量结果的平均值±SEM(平均值的标准误差)。～90g处的虚线表示角叉藻聚糖前基线PWT测量结果；指示疾病状态的PWT是～55g。在角叉藻聚糖前基线水平处或其上的测量结果表示对 角叉藻聚糖-诱导的机械痛觉过敏的完全逆转。 
图22：在大鼠中的角叉藻聚糖炎性疼痛模型中，静脉内输注KAI-1678对机械痛觉过敏的影响。从将角叉藻聚糖注射到右后爪足底侧后60分钟开始，用静脉内输注KAI-1678处理大鼠。KAI-1678通过颈静脉以所示给药速率输注2小时(三角形)或5小时(圆形)。5-小时输注结束后，将10mg/kg吲哚美辛通过口服管饲法施用，从而测试该模型的响应。数据表示为关于给定时间点时各组(N＝3或4只动物/组)中动物的(PWT)测量结果的平均值±SEM(平均值的标准误差)。～90g处的虚线表示角叉藻聚糖前基线PWT测量结果；指示疾病状态的PWT是～55g。在角叉藻聚糖前基线水平处或其上的测量结果表示对角叉藻聚糖-诱导的机械痛觉过敏的完全逆转。 
图23：在大鼠中的角叉藻聚糖炎性疼痛模型中，切断坐骨神经和隐神经对KAI-1678活性的影响。从大鼠左(对侧)后腿中手术摘除1cm坐骨神经和隐神经片段。次日，将角叉藻聚糖注射到手术处理的大鼠右后爪足底侧中。角叉藻聚糖注射后60分钟时，在对侧肢上接近(空心圆)或远离(实心圆)神经横断位点的位点处，以25mcg/kg/hr开始4-小时皮下输注KAI-1678。数据表示为关于给定时间点时各组(N＝4只动物/组)中动物的(PWT)测量结果的平均值±SEM(平均值的标准误差)。～90g处的虚线表示角叉藻聚糖前基线PWT测量结果；指示疾病状态的PWT是～60g。在角叉藻聚糖前基线水平处或其上的测量结果表示对角叉藻聚糖-诱导的机械痛觉过敏的完全逆转。 
图24：在大鼠中的角叉藻聚糖炎性疼痛模型中，外科交感神经切除术对皮下施用的KAI-1678对机械痛觉过敏的活性的影响。在双侧腰部交感神经切除术和肾上腺神经节截除术后一周，将角叉藻聚糖注射到手术处理的大鼠(施以交感神经切除手术的动物-实心圆)，或其中暴露但不摘除腰部交感神经链和肾上腺神经节的大鼠(假手术的动物-空心圆)的右后爪足底侧。角叉藻聚糖注射后60分钟时，开始以25mcg/kg/hr对每只动物在角叉藻聚糖施用位点的对侧的后肢，进行4-小时皮下输注KAI-1678。数据表示为关于给定时间点时各组(N＝2-4只动物/组)中动物的(PWT)测量结果的平均值±SEM(平均值的标准误差)。～90g处的虚线表示角叉 藻聚糖前基线PWT测量结果；指示疾病状态的PWT是～55g。在角叉藻聚糖前基线水平处或其上的测量结果表示对角叉藻聚糖-诱导的机械痛觉过敏的完全逆转。 
图25：在大鼠L5横断神经性疼痛模型中，皮下推注施用KAI-1678对机械异常性疼痛的影响。横断L5脊神经后7天，以指定的剂量对大鼠皮下推注给药KAI-1678(时间0)。在化合物施用后指定的时刻，用von Frey丝测试动物，以确定(左)30次测试中爪缩回的次数(每种丝5次测试)或(右)如对在5次测试中产生至少3次缩回的最低von Frey丝确定的爪缩回阈值。数据表示为关于给定时间点时各组(N＝6只动物/组)中动物的平均值±SEM(平均值的标准误差)。 
图26：在大鼠L5横断神经性疼痛模型中，皮下输注KAI-1678对异常性疼痛的影响。横断L5脊神经的那天，皮下植入装有KAI-1678的渗透性微泵，以递送指定每日剂量的化合物。在指定的时刻，(左)用von Frey丝测试动物，以确定30次测试中爪缩回的次数(每种丝5次测试)或(右)响应暴露于辐射热源的爪缩回的反应时间。数据表示为关于给定时间点时各组(N＝6只动物/组)中动物的平均值±SEM(平均值的标准误差)。 
图27：IV推注后大鼠中血浆KAI-1678浓度。以300和3,000mcg/kg静脉内推注施用KAI-1678后的血浆浓度。显示了来自三只大鼠(300mcg/kg)和两只大鼠(3,000mcg/kg)的平均数据。来自这些数据的晚期半衰期的初步估计是～38和～66分钟(分别地，300mcg/kg和3,000mcg/kg)。 
图28：通过IV输注给药的大鼠中的KAI-1678血浆浓度。以50mcg/kg/hr静脉内输注施用的KAI-1678的血浆浓度。显示来自三只大鼠的平均数据。 
图29：皮下推注注射后大鼠中KAI-1678血浆浓度。以约80和800mcg/kg皮下推注施用后的KAI-1678血浆浓度。显示来自三只大鼠(80mcg/kg)和四只大鼠(800mcg/kg)的平均数据。来自这些数据的晚期半衰期的初步估计是～35分钟。 
图30：通过皮下输注给药的大鼠中的KAI-1678血浆浓度。通过皮下输注2小时给药的大鼠中的血浆KAI-1678浓度。显示处于各种剂量水平中的两只大鼠的平均数据。 
图31：通过皮下输注给药5天的狗中的KAI-1678血浆浓度。通过以3，8 and 25mg/kg/天皮下输注给药的狗中的血浆KAI-1678浓度。注意，在第1天最初的4小时和在第6天在输注结束(EOI)时回收样品，在这期间不采样。 
发明内容
本文中的内容涉及修饰的εPKC抑制肽，产生所述肽的方法，和利用εPKC抑制肽治疗疼痛的方法。公开的发明还涉及局部-施用的蛋白激酶Cε(εPKC)抑制剂在抑制疼痛感觉中起的作用。使用εPKC抑制剂，特别是通过需要影响交感神经神经系统的初级传入功能和调节的机制系统性抑制疼痛的方法。本发明的范围内还考虑包括εPKC-特异性抑制剂和另一种PKC调节肽的杂种肽。任何PKC调节肽可以用于制备杂种构建体，以使多于一种同工酶-特异性PKC调节剂的活性组合到单杂种化合物/肽中。由以下的详细说明，本领域中的那些技术人员应该清楚其他方面和实施方案。 
发明详述 
本发明涉及修饰的肽，其抑制ε蛋白激酶(εPKC)同工酶并与另一种同工酶-特异性PKC调节剂偶联。典型地，本文中讨论的εPKC抑制肽与载体部分偶联，从而促进该抑制肽向靶细胞的转运。可以相对于原性对照修饰货物抑制肽、载体肽、或二者，以增加由此产生的货物/载体肽构建体的稳定性。本发明的修饰的εPKC肽有效用于预防、逆转和另外治疗多种类型的疼痛，诸如急性疼痛、慢性疼痛、神经性疼痛和炎性疼痛。εPKC抑制蛋白还可以用于构建杂种肽构建体，其包括一种或多种具有针对其他PKC同工酶的活性的同工酶-特异性PKC调节肽。 
定义 
用于本说明书中时，下列词语和短语通常意欲具有如下所示的含义，除非在使用它们的上下文中作出另外的指示。 
“PKC调节化合物”是任何这样的化合物，包括小分子和肽，其能够 调节PKC同工酶的酶活性。术语“调节”指增加和减小PKC同工酶的酶活性和其他功能活性。特异性PKC调节剂(“同工酶-特异性PKC调节剂”)是任何这样的化合物，其以可检测的程度，相对另一种同工酶，阳性地或阴性地调节一种PKC同工酶。 
“PKC激活剂”是任何这样的化合物，包括小分子和肽，其能够激活PKC同工酶的酶活性。特异性PKC激活剂是任何这样的化合物，其以可检测的程度，相对另一种同工酶，激活一种PKC同工酶。 
“PKC抑制剂”是任何这样的化合物，包括小分子和肽，其能够抑制PKC同工酶的酶活性和其他功能性活性。特异性PKC抑制剂是任何这样的化合物，其以可检测的程度，相对另一种同工酶，激活一种PKC同工酶。 
“εPKC激活肽”指能够激活εPKC酶的肽。 
“εPKC抑制肽”指能够抑制或灭活εPKC酶的肽。 
“γPKC激活肽”指能够激活γPKC酶的肽。 
“γPKC抑制肽”指能够抑制或灭活γPKC酶的肽。 
术语“KAI-1586”指源自通过Cys-Cys二硫键与“封端的(capped)”HIV Tat-来源的转运肽缀合的εPKC的第一可变区的肽，并可以表示如下： 
H-Cys-Glu-Ala-Val-Ser-Leu-Lys-Pro-Thr-COOH    (εPKC抑制肽) 
   | 
   S 
   |                                          (二硫键) 
   S 
   | 
Ac-Cys-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-COOH(载体)。 
术语“KAI-1634”指源自εPKC的第一可变区的两个修饰的εPKC肽，其与封端的HIV Tat-来源的转运肽共价连接。该构建体图示在图1中。 
术语“封端的”指化学修饰以改变氨基末端。羧基末端、或二者的肽。与未修饰的货物肽二硫键结合的封端的载体肽显示在图2中。 
术语“载体”指促进细胞吸收的部分，诸如阳离子聚合物、肽和抗体序列，包括聚赖氨酸、聚精氨酸，触角足(Antennapedia)-来源的肽，HIV Tat-来源的肽等，如例如美国专利和公开号4,847,240，5,888,762，5,747,641，6,593,292，US2003/0104622，US2003/0199677和US2003/0206900中所述。载体部分的实例是“载体肽”，其为促进细胞吸收与转运肽化学联合或结合的εPKC抑制肽的肽。 
术语“预防”指作为“治疗”的要素意欲包括如本文中定义的“预防”和“抑制”。本领域中的那些技术人员应该理解，在人类医学中，不总是可能区分“预防”和“抑制”，因为一件或多件根本诱导事件可能是未知的、隐藏的，或患者直到该一件或多件事件彻底发生后才确定。 
术语“稳定性”一般指改善保存期的修饰，例如，延迟基于保存期的cys-cys交换，通过延迟蛋白水解降解，或二者。术语“效力”涉及获得特定结果所需要的特定肽组合物的量。当可以减少一种肽组合物的剂量以获得理想目标时，该肽组合物比另一种更有效力。可以对给定的肽组合物进行某些修饰，以改善该组合物的效力。 
ε蛋白激酶C(εPKC)抑制剂 
存在许多已知的可以在本发明中使用的εPKC抑制剂。PKC的小分子抑制剂记述在美国专利号5,141,957，5,204,370，5,216,014，5,270,310，5,292,737，5,344,841，5,360,818，5,432,198，5,380,746，and 5,489,608，(欧洲专利0,434,057)中，所有这些将其全部内容引入本文作为参考。这些分子属于下列类型：N，N′-二-(亚磺酰氨基)-2-氨基-4-亚氨基萘-1-酮；N，N′-二-(酰胺基)-2-氨基-4-亚氨基萘-1-酮；连位-取代的碳环；1，3-二噁烷衍生物；1，4-二-(氨基-羟烷基氨基)-蒽醌；呋喃香豆素磺酰胺；二-(羟烷基氨基)-蒽醌；和N-氨基烷基酰胺，2-[1-(3-氨基丙基)-1H-吲哚-3-基]-3-(1H-吲哚-3-基)马来酰亚胺，2-[1-[2-(1-甲基吡咯烷)乙基]-1H-吲哚-3-基]-3-(1H-吲哚-3-基)马来酰亚胺， 
Figure G2008800084226D00101
7874。其他已知的小分子PKC抑制剂记述在下述出版物中(Fabre，S.，等1993.Bioorg.Med.Chem.(生物有机和医学化学)1，193，Toullec，D.，等1991.J.Biol.Chem.(生物化学杂志)266，15771，Gschwendt，M.，等1996.FEBS Lett.(FEBS通信)392，77，Merritt，J.E.，等1997.CellSignal(细胞信号)9，53.，Birchall，A.M.，等1994.J.Pharmacol.Exp.Ther.(药理学和实验疗法杂志)268，922.Wilkinson，S.E.，等1993.Biochem.J. (生物化学杂志)294，335.，Davis，P.D.，等1992.J.Med.Chem.(医学化学杂志)35，994)，并属于下述类型：2，3-二(1H-吲哚-3-基)马来酰亚胺(二吲哚基马来酰亚胺IV)；2-[1-(3-二甲基氨基丙基)-5-甲氧基吲哚-3-基]-3-(1H-吲哚-3-基)马来酰亚胺(Go 6983)；2-{8-[(二甲基氨基)甲基]-6，7，8，9-四氢吡啶并[1，2-a]吲哚-3-基}-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)马来酰亚胺(Ro-32-0432)；2-[8-(氨基甲基)-6，7，8，9-四氢吡啶并[1，2-a]吲哚-3-基]-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)马来酰亚胺(Ro-31-8425)；和3-[1-[3-(脒硫代)丙基-1H-吲哚-3-基]-3-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)马来酰亚胺二吲哚基马来酰亚胺IX，甲烷磺酸酯(Ro-31-8220)，将其全部内容引入本文作为参考。 
ε蛋白激酶(εPKC)抑制肽 
多种εPKC抑制剂记述在本文中，并可以通过本公开的方法使用。抑制肽可以源自任何结构域，无论是可变的还是恒定的。因此，抑制肽可以源自V1，V2，V3，V4，或V5。抑制肽还可以源自恒定区C1(C1a，C1b)，C3，C4，或C5。还预期肽与这些区域中的一个或多个重叠。原型肽的另一种来源见美国专利申请号11/011,557，标题为“Isozyme-specific antagonists of protein kinase C(蛋白激酶C的同工酶-特异性拮抗剂)”，将其全部内容引入本文作为参考。 
在一个实施方案中，货物肽是εV1-2的εPKC抑制肽衍生物，其包括氨基酸序列E-A-V-S-L-K-P-T(SEQ ID NO：58)，位于该肽的氨基或羧基末端、或位于中间的半胱氨酸残基，和与所述货物肽连接的载体肽。上述货物肽还可以包括一种或多种另外的货物肽，其彼此附着且最终附着于载体肽。 
对载体肽和货物肽均进行了修饰，其目的在于提高效力，在生物流体/组织中的稳定性。和化学稳定性。这些改变提供具有增强特性的εPKC抑制剂，以用于多种临床适应证。 
已经应用的一些修饰包括： 
1.对货物和/或载体肽进行封端，从而阻碍体内蛋白水解，并由此提高效力和/或功效持续时间； 
2.生成重叠肽，引入亲本蛋白的另外的连续区，从而提高效力； 
3.制备线性肽，其在单一肽链中具有货物和载体，从而提高药物产品的化学稳定性和保存期； 
4.制备多聚体肽，其具有两个或更多个拷贝的活性肽，从而提高蛋白酶抗性和效力； 
5.制备肽的逆反(retro-inverso)类似物，从而阻碍蛋白水解；和 
6.引入二硫化类似物，从而提供提高的化学稳定性。 
本文中所述的修饰改进被修饰的εPKC抑制肽的效力、血浆稳定性、和化学稳定性。对εPKC抑制肽的有效修饰通过选择原型εPKC抑制肽和将这些肽修饰为用于治疗疼痛的货物肽来确定。原型肽可以是目前已知的肽或是如εPKC抑制肽一样尚未确定的肽。尽管任何抑制性εPKC肽可以作为起始货物序列使用，但是优选的原型序列是E-A-V-S-L-K-P-T(SEQ ID NO：58)，其中肽是未修饰的并与载体通过位于货物和载体肽氨基末端的Cys残基缀合。预期了多种修饰的或类似物肽。一些所述类似物包括重叠并超过原型序列延伸的氨基酸序列。其他类似物肽相对于原型是截短的。另外，原型序列的类似物相对于原型序列可以具有一个或多个氨基酸取代，其中被取代的氨基酸是丙氨酸残基或天冬氨酸残基。系统生成所述包含丙氨酸或天冬氨酸的肽称为“扫描”。还预期生成包括所述类似物和修饰的载体肽的线性肽。 
对原型序列的另外的修饰针对修饰一种或多种货物肽、一种或多种载体肽、或二者中的特异性降解位点，并引入氨基酸取代或其他化学修饰，这些修饰阻断这些位点的降解。 
表1列出为了作为原型序列在本发明中使用的许多示范性εPKC抑制肽。 
表1 
源自εPKC的肽 
  肽   SEQ ID NO.   序列   位置
  εV1-1   SEQ ID NO：15   N-G-L-L-K-I-K   εPKC(5-11)
  εV1-2   SEQ ID NO：58   E-A-V-S-L-K-P-T   εPKC(14-21)
  εV1-3   SEQ ID NO：16   L-A-V-F-H-D-A-P-I-G-Y   εPKC(81-91)
  εV1-4   SEQ ID NO：17   D-D-F-V-A-N-C-T-I   εPKC(92-100)
  εV1-5   SEQ ID NO：18   W-I-D-L-E-P-E-G-R-V   εPKC(116-125)
  εV1-6   SEQ ID NO：19   H-A-V-G-P-R-P-Q-T-F   εPKC(27-36)
  εV1-7   SEQ ID NO：20   N-G-S-R-H-F-E-D   εPKC(108-115)
  εV1-7.1   SEQ ID NO：21   H-D-A-P-I-G-D-Y    -
  εV1-7.2   SEQ ID NO：22   H-D-A-P-I-G    -
  εV1-7.3   SEQ ID NO：26   H-D-A-A-I-G-Y-D    -
  εV1-7.4   SEQ ID NO：27   H-D-A-P-I-P-Y-D    -
  εV1-7.5   SEQ ID NO：28   H-N-A-P-I-G-Y-D    -
  εV1-7.6   SEQ ID NO：29   H-A-A-P-I-G-Y-D    -
  εV1-7.7   SEQ ID NO：30   A-D-A-P-I-G-Y-D    -
  εV1-7.8   SEQ ID NO：31   H-D-A-P-A-G-Y-D    -
  εV1-7.9   SEQ ID NO：32   H-D-A-P-I-G-A-D    -
  εV1-7.10   SEQ ID NO：33   H-D-A-P-I-A-Y-D    -
  εV1-7.11   SEQ ID NO：34   H-D-A-P-I-G-Y-A    -
  εV3-1   SEQ ID NO：35   S-S-P-S-E-E-D-R-S   εPKC(336-344)
  εV3-2   SEQ ID NO：36   P-C-D-Q-E-I-K-E   εPKC(351-358)
  εV3-3   SEQ ID NO：37   E-N-N-I-R-K-A-L-S   εPKC(360-368)
  εV3-4   SEQ ID NO：38   G-E-V-R-Q-G-Q-A   εPKC(393-400)
  εV5-1   SEQ ID NO：39   E-A-I-V-K-Q   εPKC(714-719)
  εV5-2   SEQ ID NO：40   I-K-T-K-R-D-V   εPKC(689-695)
  εV5-2.1   SEQ ID NO：41   I-K-T-K-R-L-I    -
  εV5-3   SEQ ID NO：42   C-E-A-I-V-K-Q   εPKC(714-719)
  εV5-4   SEQ ID NO：43   T-K-R-D-V-N-N-F-D-Q   εPKC(791-800)
如下文中更完整讨论地，优选地，εPKC抑制肽与载体部分，诸如载体肽化学缔合。在一个实施方案中，抑制肽和载体肽通过二硫键相连接。静电和疏水性相互作用也可以用于化学缔合载体部分和εPKC抑制肽。在形成二硫键的情形中，向PKC抑制肽序列或向载体肽序列添加Cys残基可能是有利的。可以将Cys残基添加到氨基或羧基末端，或二端。Cys残基还可以位于货物或载体肽的氨基酸序列内部。这样的内源Cys已显示出稳定化载体和货物肽之间的二硫键。另一种连接系统涉及利用甘氨酸残基连接体线性化的目的肽。一个优选的实施方案是KP-1678，其具有εV1-2序列和TAT载体肽，其中氨基末端是乙酰化的且羧基末端被氨基基团修饰(Ac-EAVSLKPTGGYGRKKRRQRRR-NH2)。 
杂种肽构建体 
如上讨论地，预期了对PKC调节肽的多种修饰。所述修饰的一个实例包括构建包括例如货物PKC调节肽和载体肽的线性肽。另一个实例的多聚体肽构建体，其包括许多PKC调节肽和载体肽。可以修饰任一种肽设计模型，从而包括多个调节性PKC肽，并且可以对那些调节肽进行选择，从而使不同的PKC同工酶可以被相同的构建体调节。 
杂种肽方法具有多种超越单功能肽构建体的优势。例如，在同一构建体中使用多个PKC调节肽允许一个构建体同时调节两种或更多种不同PKC同工酶，否则使用多个同工酶特异性调节肽进行调节。这种方式的连接修饰，尽管特异性低于单独使用同工酶特异性肽，但其特异性仍高于使用同工酶非特异性肽调节剂和其他小分子型激酶抑制剂。同工酶特异性调节肽的使用仅是示范性的。杂种肽构建体还可以包括特异于或非特异于任何PKC同工酶的调节肽。 
预期认可PCK同工酶的肽调节剂用于构建杂种肽构建体。PKC同工酶家族包括至少11种不同的蛋白激酶，其可以基于它们的同源性和对激活剂的灵敏性分为至少三个亚家族。每种同工酶包括许多同源(“保守”或“C”)结构域，和其间散布的同工酶-特有的(“可变”或“V”)结构域。“经典”或“cPKC”亚家族的成员，即α，βI，βII，和γPKC，含有4个同源结构域(C1，C2，C3和C4)，并需要钙、磷脂酰丝氨酸、和甘油二酯或佛波酯来活化。在“新型”或“nPKC”亚家族的成员，即δ，ε，η和θPKC中，C2-样结构域位于C1结构域之前。然而，该C2结构域不结合钙并因此nPKC亚家族不需要钙来活化。最后，“非典型”或“aPKC”亚家族的成员，即ζ和λPKC，缺少C2和一半的C1同源结构域并对甘油二酯、佛波酯和钙不敏感。具有针对一种或多种PKC同工酶的活性的调节肽可以用于制备杂种肽构建体。 
在优选的实施方案中，肽构建体包括一种或多种杂种εPKC调节肽和一种或多种γPKC调节肽。在一个优选实施方案中，一种或多种εPKC抑制肽与一种或多种γPKC抑制肽一起使用，以构建εPKC-γPKC杂种抑制肽。 
上文中讨论了多种εPKC，且这些肽是可以用于制备杂种肽构建体的一些肽的实例。多种γPKC抑制剂记述在本文中，并可以以本公开的方法使用。抑制肽可以源自任何结构域，无论可变的还是恒定的。因此，抑制 肽可以源自V1，V2，V3，V4，或V5。抑制肽还可以源自恒定区C1(C1a，C1b)，C3，C4，或C5。还预期与这些区域中的一个或多个重叠的肽。货物肽源自多种结构域且长度范围是5-30个氨基酸长。更具体地，源自PKC结构域的肽是5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，或30个残基长。原型肽的另一种来源见美国专利申请号11/011,557，标题为“Isozyme-specific antagonists of protein kinase C(蛋白激酶C的同工酶-特异性拮抗剂)”，其采用激活肽，并将它们转化为抑制肽，并将其全部内容引入本文作为参考。优选的γPKC抑制肽的原型序列是R-L-V-L-A-S(SEQ ID NO：1)。以上所述关于PKC肽的所有修饰都同等地适用于预期在杂种构建体中使用的γPKC抑制肽。 
下述表格列出为了作为原型序列在本发明中使用的许多示范性γPKC抑制肽。 
表2 
Figure G2008800084226D00161
表3 
Figure G2008800084226D00171
表4 
Figure G2008800084226D00181
表5 
Figure G2008800084226D00191
表6 
表7 
Figure G2008800084226D00211
表8 
Figure G2008800084226D00221
表9 
Figure G2008800084226D00231
将于2007年4月6日提交的美国临时号60/910,588中讨论的所有PKC肽引入本文作为参考。 
载体部分 
发现意欲细胞吸收的广泛多样的分子(特别是大分子诸如肽)跨细胞膜转运能力很差。在提议促进细胞吸收的溶液中已经使用了载体部分诸如阳离子(即带正电的)聚合物，肽和抗体序列，包括聚赖氨酸、聚精氨酸、触角足-来源的肽、HIV Tat-来源的肽等。(见，例如，美国专利和公开号 4,847,240，5,888,762，5,747,641，6,593,292，US2003/0104622，US2003/0199677和US2003/0206900) 
货物/载体缀合物的具体实例是KP-1634(SEQ ID NO：49)，其由两种具有氨基末端帽的εPKC-来源的肽和氨基和羧基末端均封端的一种HIV Tat-来源的肽组成。 
其他抑制剂 
εPKC的其他抑制剂可以利用测量活化、细胞内转运、与细胞内受体(例如，RACK)的结合或εPKC的催化活性确定。传统地，PKC家族成员的激酶活性通过在利用放射性ATP作为磷酸酯供体和组蛋白或短肽作为底物的再生磷脂环境中使用至少部分纯化的PKC进行测定。(T.Kitano，M.Go，U.Kikkawa，Y.Nishizuka，Meth.Enzymol.(酶学方法)124，349-352(1986)；R.O.Messing，P.J.Peterson，C.J.Henrich，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)266，23428-23432(1991))。近期的改进包括迅速、高灵敏性化学发光测定，其测量处于生理学浓度的蛋白激酶活性，并可以自动化和/或用在高通量筛选中(C.Lehel，S.Daniel-Issakani，M.Brasseur，B.Strulovici，Anal.Biochem.(分析生物化学)244，340-346(1997))，和使用处于分离的膜中的PKC和源自MARCKS蛋白的选择性肽底物的测定法(B.R.Chakravarthy，A Bussey，J.F.Whitfield，M.Sikorska，R.E.Williams，J.P.Durkin，Anal.Biochem.(分析生物化学)196，144-150(1991))。影响εPKC细胞内迁移的抑制剂可以通过其中通过级分法(R.O.Messing，P.J.Peterson，C.J.Henrich，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)266，23428-23432(1991))或免疫组化(美国专利号5,783,405；美国专利申请系列号08/686,796现美国专利号6,255,057，现美国专利号6,255,057)确定εPKC细胞内定位的测定法来鉴定。为了鉴定εPKC的抑制剂，应该对εPKC进行测定。所述εPKC抑制剂的选择性可以通过比较抑制剂对εPKC的作用和其对其他PKC同工酶的作用来确定。将前述专利和公开物的相关部分引入本文作为参考。 
另外的用于鉴定εPKC抑制剂的测定法可以见美国专利号5,783,405，6,156,977，和6,423,684，将其整体引入本文作为参考。 
机制 
本文报告的实验数据显示(1)在神经性和炎性疼痛模型中，局部递送的εPKC抑制肽对测试动物的后肢产生抗-痛觉过敏/止痛作用；(2)认为εPKC抑制肽的这种作用是由在坐骨和隐神经传入内传送的神经介导的，其投射到后肢并因此可以成为被εPKC抑制肽抑制的神经元反射对象的一部分；(3)εPKC抑制肽的作用似乎是交感肾上腺-依赖性的，其与这样的报告相符，即εPKC不仅在交感神经神经节中存在并对神经递质释放过程起作用(例如，Scholze等：J Neurosci.(神经科学杂志)，22：5823-32，2002)，而且还调节C-纤维(疼痛-敏感神经)的敏化作用(Khasar，等，Neuron(神经元)，24：253-260，1999)；和(4)εPKC抑制肽的抗-痛觉过敏/止痛作用是通过肾上腺素受体介导的。值得注意地，已知肾上腺素(EPI)，即一种由肾上腺髓质和交感神经节后神经元(SPGN)末梢释放的神经递质，敏化C-纤维(Chen和Levine，J.Pain(疼痛杂志)，6：439-446，2005；Khasar，等，Neuron(神经元)，24：253-260，1999)。报告了εPKC通过磷酸化N型钙通道(Zhu和Ikeda，J.Neurophysiol.(神经生理杂志)，74：1546-60，1994)调节Ca++流入(Boehm等，J.Neurosci.(神经科学杂志)，16：4516-603，1996)，并因此调节儿茶酚胺从交感神经神经元中的释放(Scholze等：J.Neurosci.(神经科学杂志)，22：5823-32，2002)。 
确定εPKC抑制肽的抗-痛觉过敏作用不同于Messing和Levine中所讨论的那些(USP 6,686,334 B2，USP 6,376,467 B1和2002/0151465 A1)，其中外源EPI或异普萘洛尔(isopropranolol)(ISO，即一种合成的β-肾上腺素受体激动剂)通过刺激β-肾上腺素受体作用于C-纤维。在该项工作中，外源EPI或ISO的促-痛觉过敏作用是εPKC依赖性的且不作用于SPGN末梢上的自体调节性α2-肾上腺素受体。美国专利号6,686,334和6,376,467和公开号2002/0151465 A1关注εV1-2对下游的抗-痛觉过敏作用，即由外源儿茶酚胺或理论上由外源儿茶酚胺在它们从交感肾上腺系统中释放后引起的作用。本公开的数据不与Messing和Levine相矛盾，而是相反集中和扩展关于εPKC在疼痛神经传递中所起作用的理解。此外，本文中的发现说明εPKC抑制肽的抗-痛觉过敏作用也通过SPGN中的“上游”神经传递介导，并更明确突出εPKC抑制肽对交感肾上腺系统具有的作用。 
本发明显示在远处位点局部施用εPKC抑制剂可以通过由SPGN介导的机制抑制疼痛，且既不受限于也不需要该抑制剂遍及身体的系统分布。抑制疼痛应答所需的εPKC的远程作用、迅速开始和低剂量需要完整的神经，因为横断对侧肢的坐骨和隐神经(去传入)阻断S.C.施用的εPKC抑制来自远处位点的疼痛的能力。此外，双侧腰部交感神经切除术加双侧肾上腺神经节截除术以及单侧注射酚妥拉明(其为非选择性α-肾上腺素受体拮抗剂)消除εPKC抑制剂的减轻疼痛的作用。 
关于εPKC抑制剂观察到的非常低的剂量、迅速开始和远处作用支持这样的结论，即可能甚至更小选择性的εPKC抑制剂(包括如果系统施用可能另外是有毒的抑制剂)可以用于抑制疼痛应答。此外，因为我们显示了局部施用非常低剂量的εPKC可以具有该作用，所以可以想到可以以非常低剂量局部施用类似非常低剂量的另外是非选择性和系统毒性的εPKC抑制剂(即，比该药物的剂量限制系统毒性水平低得多)，从而在不产生任何或仅产生非常有限的系统毒性副作用的条件下，获得疼痛应答的抑制。 
使用方法和制剂 
本文中所述的修饰肽有效用于预防和治疗疼痛。为了该讨论的目的，疼痛及其治疗分类为不同的类型：急性、慢性、神经性、和炎性疼痛的治疗。本文中所述的修饰的εPKC抑制肽有效用于治疗急性、慢性、神经性、和炎性疼痛。 
有趣地，本文中公开的化合物还有效用于减轻或预防由许多刺激引起的神经性疼痛的发展。例如，如以下实施例7中所讨论地，慢性炎性疼痛可以通过施用角叉藻聚糖和随后施用前列腺素E2诱导。该现象起多种系统的模型的作用，在所述系统中，接受许多疼痛刺激或疼痛敏化试剂的受试者引起慢性炎性或神经性疼痛。注意到接受TAXOL的化疗患者产生神经性疼痛，其典型地在初始一次或多次药物剂量后减轻。然而，接受完整TAXOL疗程的化疗患者留下持续性神经性疼痛。本发明预期施用本文中所述的εPKC抑制肽，预防性地，与化疗试剂一起，或在化疗后，应该有效减轻或预防慢性炎性或神经性疼痛病症的发展。 
一旦装配了货物/载体肽构建体并测试出其与原型相比增加的稳定性、效力、或二者，将该构建体置于在疼痛诱导事件之前、过程中、或贯穿其间连续施用于受试者的药用制剂中。 
“药用制剂”包括适合于以这样的方式施用修饰的εPKC抑制剂的制剂，所述方式是提供理想结果，且还不产生足以使医师确信其对患者的潜在伤害高于对该患者的潜在益处的不利副作用。适合与修饰的εPKC抑制剂一起使用的药用制剂的成分部分地通过施用途径和方法确定。所述制剂通常包括一种或多种引入到药用载体中的修饰的εPKC抑制肽，所述药用载体典型地包括简单化学剂诸如糖、氨基酸或电解质。示范性溶液典型地用盐水或缓冲液制备。药用载体可以包含本领域中公知的赋形剂，且可以用在多种制剂中。参见，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿制药科学)，第18版，A.R.Gennaro，编辑，Mack Publishing Company(马克出版公司)(1990)；Remington：The Science and Practice of Pharmacy(雷明顿：制药学科学和实践)，第20版，A.R.Gennaro，编辑，LippincottWilliams&Wilkins(2000)；Handbook of Pharmaceutical Excipients(药物赋形剂手册)，第3版，A.H.Kibbe，编辑，American Pharmaceutical Association(美国药物协会)，和Pharmaceutical Press(药物出版社)(2000)；和 Handbook of Pharmaceutical Additives(药物添加剂手册)，由Michael和Irene Ash汇编，Gower(1995)。 
抑制剂在制剂中的剂量应该根据多种参数变化，所述参数受货物/载体构建体的稳定性和效力、施用途径、和理想给药方案的影响。预期日剂量范围为1μg/kg-100mg/kg体重，优选1μg/kg-1mg/kg和最优选10μg/kg-1mg/kg。 
修饰的εPKC抑制剂可以局部或系统施用。局部施用可以通过局部施用、经皮、皮内施用、鞘内施用、腹膜内施用、或皮下注射实现。修饰的εPKC抑制剂的系统施用优选是肠胃外的，尽管也预期了口服、口腔、和鼻内施用。肠胃外施用通常特征在于注射，通过皮下、肌内、腹膜内、和静脉内。修饰的抑制肽的可注射形式可以制备为常规形式，如液体溶液或混悬液，适合于在注射前重构为液体溶液或混悬液的固体(例如，干燥的或冻干的)形式，或如乳剂。通常，合适的赋形剂包括，例如，水、盐水、 葡萄糖、甘油、乙醇等。另外，可以使用小量非毒性辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、增溶剂、补剂(tonicifiers)等，包括，例如，乙酸钠、失水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、环糊精等。 
需要时，可以施用修饰的εPKC抑制肽治疗疼痛。为了预防，修饰的εPKC化合物可以在疼痛-诱导事件之前施用。例如，该肽可以在预期的疼痛-诱发事件前5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55分钟，1小时，数小时，1天，1周，或数周时施用。甚至更长时期的预防施用可以通过使用在体内特别稳定的修饰肽，或通过使用肽的持续不变释放制剂，例如由鞘内泵递送来实现。 
实施例
以下实施例起更完整描述使用上述发明的方式，以及阐明对实施本发明的不同方面所预期的最佳模式的作用。理解这些实例不以任何方式起限制本发明真实范围的作用，而是为了举例说明的目的而存在。本文中引用的所有参考文献作为整体引入包括作为参考。 
实施例1
εPKC抑制剂类似物的最优化
现有技术εPKC抑制序列(KP-1636)作为原型用于研究多种化学修饰对效力和稳定性的影响。原型序列，即KP-1586作为以下所述工作中的模板使用。为了该工作，修饰多种货物和载体肽，并将其提供在表2中。 
表2 
  化合物描述   货物肽序列   载体肽描述
  KP-1586   C-E-A-V-S-L-K-P-T   CapTat
  KP-1630   Ac-C-E-A-V-S-L-K-P-T-NH2   CapTat
  KP-1631   Ac-C-L-K-P-T-A-W-S-L-R-NH2   CapTat
  KP-1632   AC-C-E-A-V-S-L-K-P-T-A-W-S-L-R   CapTat
  KP-1633   E-A-V-S-L-K-P-T-G-G-TaT-NH2   线性
  KP-1634   [Ac-E-A-V-S-L-K-P-T-G-G]-K-C   CapTat
  KP-1635   t-p-k-l-s-v-a-e-c   CapTat
  KP-1636   C-E-A-V-S-L-K-P-T   Tat
  KP-1637   Ac-C-E-A-V-S-L-K-P-T-NH2   Ac-hCys-Tat
  KP-1638   Ac-hC-E-A-V-S-L-K-P-T-NH2   Ac-hCys-Tat
  KP-1678   Ac-E-A-V-S-L-K-P-T-G-G-Tat-NH2   线性
[0139] 表2中的“Tat”指HIV Tat，的片段47-57，且“Cap Tat”指相同肽的N-乙酰基或C-酰胺类似物。术语“hC”或“hCys”指高半胱氨酸氨基酸。 
实施例2
εPKC抑制剂类似物的稳定性
测试了实施例1中所述的多种货物/载体肽构建体的血浆和化学稳定性。该化合物的血浆稳定性利用人和大鼠血清测试，并在30分钟的处理后确定起始物质的量。化学稳定性通过确定9天的处理后剩余的起始物质的量来评估。 
表3 
实施例3
εPKC抑制剂类似物的时间进程血浆稳定性
利用人和大鼠血清测试实施例1中所述的多种货物/载体肽构建体的血浆稳定性，并随着30分钟的处理时间确定起始物质的量。关于货物/载体肽KP-1586，KP-1630，和KP-1631的时间进程数据显示在图3中，关于肽KP-1632，KP-1633，和KP-1634的数据显示在图4中，且关于肽KP-1635， KP-1636，和KP-1637的数据显示在图5中。包含未封端载体肽的二聚体肽和类似物比原型物质更稳定。有趣的是，对货物肽的封端对血浆稳定性几乎无影响，如在比较KP-1586和KP-1630的稳定性时所观察到的。 
实施例4
εPKC抑制剂类似物的时间进程化学稳定性
通过在大于200小时的时期内检查37℃下肽的相对浓度来测试实施例1中所述的多种货物/载体肽构建体的化学稳定性。关于货物/载体肽的时间进程数据显示在图6中。来自该研究的数据显示原型序列与类似物相比仅适度稳定。包含线性和高半胱氨酸的构建体与原型序列相比，均显示提高的稳定性。例如，KP-1637表现出显著的稳定性。 
实施例5
用修饰的εPKC抑制肽减轻急性疼痛
使用福尔马林-诱导的疼痛测试研究修饰的εPKC肽对减轻急性疼痛的能力。福尔马林通过足底内途径施用于本研究中使用的所有大鼠。测试受试者在引起疼痛的试剂前15分钟时，通过鞘内施用接受包含修饰的εPKC肽KP-1586的制剂(预防模式)。在测试受试者中使用两种不同浓度的修饰的肽。来自该实验的数据显示在图7中。该研究的结果说明修饰的εPKC抑制肽的预防性施用在测试动物中有效减少退缩/分钟。因此，施用修饰的εPKC肽有效减轻急性疼痛刺激。 
实施例6
用修饰的εPKC抑制肽减轻慢性疼痛
Chung(L5神经横断)是慢性(神经性)疼痛的公知模型。本发明中提供的代表性的修饰的εPKC肽KP-1586已经在该模型中在系统递送时有效减少疼痛。来自该工作的结果显示在图8中。 
测试肽KP-1586，而非对照肽，在通过皮下渗透泵递送许多天时，在改进的Chung模型中抑制热痛觉过敏。所述抑制作用是剂量依赖性的，其最初剂量是10-50pmol/日。抗-痛觉过敏作用早在植入后第二天就成为可 测量的，且在持续化合物递送的条件下持续至少一周。 
在相同模型中，慢性皮下递送KP-1586而非对照肽KP-1587，抑制机械异常性疼痛。该抑制在一些观察机会中，具体地在建模后第7天的测试中是剂量依赖性的。抗-异常性疼痛作用早在植入后的那天就成为可测量的。 
KP-1586在鞘内施用后，还能够在Chung模型中改善疼痛响应。该药物在这种模型中的功效在单次推注施用后持续至少90分钟。 
实施例7
利用修饰的εPKC抑制肽减轻慢性炎性疼痛
足底内施用角叉藻聚糖后5天对大鼠爪使用前列腺素E2(PGE2)通过炎性机制导致急性和慢性疼痛。如图9中所示，局部递送本文中所述的化合物能够减轻疼痛响应的发展。 
代表性化合物是KP-1586，其在通过皮内施用时，能够逆转角叉藻聚糖的疼痛作用，而对照肽KP-1587不能。 
实施例8
皮下εPKC抑制剂逆转炎性疼痛
在机械疼痛模型中测试足底内施用角叉藻聚糖后1小时皮下推注施用KP-1634，从而证明εPKC对爪缩回的抑制作用。如图10中所示，爪缩回阈值在施用该抑制剂后显著增高，而对照肽KP-1587不诱导该相同的作用。 
实施例9
利用皮下施用εPKC抑制肽预防神经性疼痛
在Chung模型中使用εPKC肽KP-1586测试皮下施用的εPKC抑制肽预防神经性疼痛的能力。测试肽以1，10，50，和100pmol/日施用。来自该工作的结果显示在图11中。 
测试肽KP-1586，而非对照肽1587，在改进的Chung模型中通过皮下渗透泵递送并在手术后1，3和5天测试时，抑制热痛觉过敏。 
实施例10
利用皮下施用εPKC抑制肽逆转神经性疼痛
在Chung模型中使用εPKC肽KP-1586测试皮下施用的εPKC抑制肽逆转神经性疼痛的能力。测试肽以0.1，1，10，50，1000pmol/日施用。来自该工作的结果显示在图12中。图13显示通过利用泵皮下输注以10pmole/日施用的抑制剂的作用，所述泵是在横断事件后7天时植入的。 
实施例11
交感神经末梢在大鼠中由抑制剂PKCε抑制角叉藻聚糖-诱导的机械痛觉过敏中的作用
λ-角叉藻聚糖(Carr)-诱导的炎性疼痛涉及交感神经神经系统的活性。由于交感神经神经元，如感觉神经元，富含蛋白激酶C的ε同工酶(εPKC)，且由于εPKC抑制剂减轻Carr-诱导的机械痛觉过敏，所以假设εPKC抑制剂需要交感神经节后神经(SPGN)末梢的作用机制。 
通过使用Basile Analgesymeter对轻微受限的大鼠量化感受伤害的屈肌反射(Randall-Selitto测试)。炎性痛觉过敏由注射Carr(1％，5 uL，i.d.)诱导，所述Carr是在施用化合物前1小时单侧注射到后爪背中的。εPKC抑制肽(εV1-2)通过系统途径注射。 
皮下注射εV1-2剂量依赖性地抑制Carr-诱导的机械痛觉过敏，其与施药位点无关(身体同侧或对侧后肢或背部躯干)。 
相反，当远离坐骨和隐神经的横断皮下施用εV1-2时，不再存在对Carr-诱导的对侧爪的机械痛觉过敏的抑制。该结果提示这些神经中紧张神经元信号传导可以是εV1-2的作用位点。此外，在实验前7天手术摘除双侧腰部交感神经链(L2-L4)和双侧肾上腺神经节完全消除εV1-2的抗-痛觉过敏作用。手术交感神经切除术的作用通过使用肾上腺素能拮抗剂诸如酚妥拉明(10 ug，s.c.注射于对侧肢，在即将Carr注射前)模拟。 
来自该研究的结果提示εPKC的作用机制，并证明系统递送的εV1-2的抗-痛觉过敏作用。这些结果支持εPKC抑制剂作为炎性疼痛的新型疗法的潜在发展。 
实施例12
利用选择性调节蛋白激酶C的肽调节疼痛响应
已知λ-角叉藻聚糖(Carr)-诱导的炎性疼痛涉及交感神经神经系统的活性。由于交感神经神经元，如感觉神经元，富含蛋白激酶C的ε同工酶(εPKC)，并且由于εPKC抑制剂减轻Carr-诱导的机械痛觉过敏，所以假设εPKC抑制剂作用的机制需要交感神经节后神经(SPGN)末梢。 
通过使用Basile Analgesymeter对轻微受限的大鼠量化感受伤害的屈肌反射(Randall-Selitto测试)。炎性痛觉过敏由注射Carr(1％，5 uL，i.d.)诱导，所述Carr是在施用化合物前1小时单侧注射到后爪背中的。εPKC抑制肽(εV1-2)通过系统途径注射。 
皮下注射εV1-2剂量依赖性地抑制Carr-诱导的机械痛觉过敏，其与施药位点无关(身体同侧或对侧后肢或背部躯干)。 
相反，当远离坐骨和隐神经的横断皮下施用εV1-2时，不再存在对Carr-诱导的对侧爪的机械痛觉过敏的抑制。该结果提示这些神经中紧张神经元信号传导可以是εV1-2的作用位点。此外，在实验前7天手术摘除双侧腰部交感神经链(L2-L4)和双侧肾上腺神经节完全消除εV1-2的抗-痛觉过敏作用。手术交感神经切除术的作用通过使用肾上腺素能拮抗剂诸如酚妥拉明(10 ug，s.c.注射于对侧肢，在即将Carr注射前)模拟。参见图14-17。 
实施例12
KAI-1678的非临床药理学
已经在大鼠炎性疼痛(角叉藻聚糖-诱导的疼痛)和神经性疼痛(L5脊神经横断)模型中评估了KAI-1678减轻异常性疼痛、对正常无害刺激提高的响应、和痛觉过敏、对疼痛刺激提高的响应的能力。在角叉藻聚糖-诱导的炎性疼痛模型中，局部皮内施用KAI-1678显示出有效减轻机械痛觉过敏。然而，皮内施用KAI-1678到远处位点是同等有效的；这提示局部施用KAI-1678可以提供全系统范围的疼痛减轻。该结论得到这样的观察结果的支持，即KAI-1678在以皮下施用时是有效的，无论是推注还是持久的输注，到动物的任何位点，包括远离角叉藻聚糖注射位点的那些。 尽管KAI-1678似乎具有全系统范围的活性，但是静脉内输注该化合物，即使以足以获得是在获得最大功效的皮下输注结束时测量的血浆稳定水平的5-10倍高的血浆稳定水平的给药速度，也不抑制角叉藻聚糖-诱导的机械痛觉过敏。对KAI-1678的位点作用的说明正在进行中，但是两个观察结果帮助定义该化合物的靶标。手术破坏角叉藻聚糖注射位点对侧后肢上的坐骨和隐神经消除远离而非接近神经破坏位点施用的化合物的活性，这提示需要功能性神经支配化合物的注射位点以获得功效。另外的研究说明KAI-1678在远离创伤位点施用时具有活性需要完整无损的交感神经神经系统和α肾上腺素能受体信号传导。由这些研究产生一种假说，即KAI-1678作用在注射位点处的局部神经上，可能在真皮或表皮中，且通过未确定的机制，引起递减的疼痛-抑制信号，所述信号取决于α肾上腺素能受体信号传导。 
在用于研究KAI-1678在神经性疼痛中的功效的L5脊神经横断单神经性疼痛模型中获得与在角叉藻聚糖-诱导的炎性疼痛模型中获得的那些相类似的结果。在的L5脊神经横断单神经性疼痛模型中，皮下施用KAI-1678导致创伤-诱导的异常性疼痛水平的降低。然而，尽管KAI-1678在这两种神经性疼痛模型中均具有活性，但是最大响应和获得最大响应所需的剂量在这两种模型中充分变化。在这些研究中，由L5神经横断诱导的创伤似乎更易受使用KAI-1678处理的影响，因为创伤-诱导的异常性疼痛的完全逆转利用皮下推注或输注施用低总剂量的化合物实现。 
总之，非临床药理学研究支持KAI-1678在炎性和神经性疼痛中的活性。这些研究还提示最大效应和获得最大效应所需要的剂量可以根据导致疼痛的创伤类型和来源变化。正在努力确定在各种这些模型中的作用位点和作用机制。 
KAI-1678在角叉藻聚糖炎性疼痛模型中的活性
大鼠角叉藻聚糖模型已经广泛用于评估对炎性疼痛调节剂的响应。在用于以下所述研究的模型中，单次5μL注射1％角叉藻聚糖溶液到右后爪的足底表面中用于引起导致局部浮肿和机械痛觉过敏的炎性响应。机械痛觉过敏如前述利用响应角叉藻聚糖注射位点处机械疼痛刺激的感受伤害 的屈肌反射的测量(Randall-Selitto爪缩回测试)来量化。在这些研究中使用的条件下，Randall-Selitto测试中的爪缩回阈值(PWT)典型地由角叉藻聚糖注射前的～90g减至在对未处理动物角注射角叉藻聚糖后1小时测量的～55g。在不存在其他处理的条件下，PWT保持稳定在～55g持续数小时，这使得可能使用该模型在形成疾病状态后至少6小时的期间内评估响应处理的时间进程。 
皮内施用KAI-1678
以前的出版物报告了局部皮内施用KAI-1678类似物在角叉藻聚糖-诱导的炎性疼痛模型中有效。为了确定皮内施用KAI-1678在该模型中是否具有活性，对右后爪中注射角叉藻聚糖后1小时的大鼠使用皮内注射10或100mcg/kg KAI-1678到与角叉藻聚糖注射的同一(身体同侧)后爪或另一只(对侧)后爪中进行处理。如图18中所示，皮内施用10mcg/kgKAI-1678到身体同侧位点能够完全逆转机械痛觉过敏，正如PWT恢复到角叉藻聚糖前的水平的事实所表明的。施用100mcg/kg KAI-1678到身体同侧位点比10mcg/kg剂量更有效，其增高PWT超过角叉藻聚糖前的水平，并维持PWT处于或高于角叉藻聚糖前水平一段较长的时期。引人注目地，KAI-1678的作用证明对机械痛觉过敏作用的迅速开始，在施用10mcg/kg剂量后5分钟时基本上逆转，并在施用100mcg/kg剂量后5分钟时间点时完全逆转。 
皮内施用KAI-1678到对侧后爪也能够完全逆转机械痛觉过敏，其在各剂量的最大逆转程度与对身体同侧后爪施用相同剂量所观察到的类似(图18)。值得注意地，如在接近角叉藻聚糖注射位点施用KAI-1678的情形中，皮内施用KAI-1678到对侧爪分别在关于较低和较高剂量的5分钟时间点时，导致接近的或完全的逆转机械痛觉过敏作用的迅速开始。然而，作用的持续时间上存在差别，与对侧后爪相比，当KAI-1678施用于身体同侧后爪时该作用在这两种剂量水平均更持久。 
虽然局部(身体同侧)施用与KAI-1678在结构相关的选择性肽εPKC抑制剂的功效在以前有所报告，但是没有预期关于皮内施用KAI-1678到对侧后爪同样有效的说明。该结果提示在远处位点局部施用KAI-1678基 于其在炎性疼痛模型中减轻机械痛觉过敏的能力，可以引起全系统范围的疼痛抑制。 
皮下施用KAI-1678
皮下施用KAI-1678，从而测试通过该途径施用该化合物是否可以在角叉藻聚糖炎性疼痛模型中抑制机械痛觉过敏。如图19中所示，在对侧后肢大腿皮下推注施用KAI-1678导致对疼痛响应的剂量依赖性抑制，低至0.1mcg/kg的剂量短期完全逆转机械痛觉过敏。在高至100mcg/kg的剂量下，响应的持续时间增加。然而，在高于100mcg/kg的剂量下，响应的持续时间随剂量增加而减少，这提示关于持续时间的抛物线型剂量-应答。 
还用100mcg/kg KP-1723，即无活性对照肽对动物组给药(见上)。如图19中所示，KP-1723对机械痛觉过敏无作用，这说明对KAI-1678观察到的作用不是载体部分的非特异性作用的结果。 
为了确定以皮下推注施用KAI-1678的位置是否影响其在该模型中的活性，对角叉藻聚糖-注射的大鼠，在角叉藻聚糖注射后1小时的时候，将10mcg/kg皮下推注的KAI-1678给药到接近角叉藻聚糖注射位点的身体同侧后肢、对侧后肢、或对侧后肢以上的中间躯干中。4小时后，对各动物给药第二次10mcg/kg皮下施用的化合物到不同位置，作为关于可能的动物-与-动物之间可变性的对照。图20中所示的结果显示第一剂量化合物的功效类似，与化合物施用的位点无关，且使用第二剂量的响应持续时间相对于第一次施用减小。该后者观察结果提示重复皮下推注施药可以导致快速抗药反应。与该观察结果相一致，重复施用KAI-1678的□PKC抑制剂类似物显示出响应量级和持续时间的减小，其与施用之间的时间长度反相关(数据未显示)。明显快速抗药反应的基础正处于研究中。 
图17(皮内给药)中所示结果与图18(皮下给药)中所示结果的比较显示这两种施药途径均导致迅速的响应，其在早在以较高剂量给药后5分钟时发生完全逆转机械角叉藻聚糖-诱导的痛觉过敏。然而，皮下推注施用后的作用持续时间比邻近角叉藻聚糖注射位点皮内施药观察到的更短。在试图延长抗-痛觉过敏作用持续时间中，从皮内注射角叉藻聚糖后1小时开始，以皮下输注将KAI-1678施用于大鼠。如图21中所示，皮下输注 KAI-1678以剂量依赖性方式延长响应的持续时间。然而，对皮下输注的响应以两个阶段发生。第一阶段，持续约1小时，由在全部测定的剂量迅速和完全逆转机械痛觉过敏组成。第二阶段，典型地在开始输注后2-3小时之间形成，是剂量依赖性的，其仅在较高剂量(≥25mcg/kg/hr)的KAI-1678时完全逆转机械痛觉过敏，如爪缩回阈值恢复到角叉藻聚糖前的基线水平所示。在250mcg/kg/hr下，疼痛的逆转是迅速的，且在无任何痛觉过敏复发的条件下维持；尽管在输注过程中，在开始输注后～60分钟观察到爪缩回阈值的少量下降。值得注意地，KAI-1678的25,000mcg/kg/hr给药速度在随后的皮下输注实验中测试。该给药速度，其是图21中所示的实验中测定的250mcg/kg/hr给药速度的100倍，产生与用该250mcg/kg/hr输注观察到的作用相当的作用(数据未显示)。因此，皮下输注KAI-1678似乎不显示在该模型中以皮下推注施用该化合物时观察到的抛物线剂量-响应(见图19)。 
当皮下输注速度≥25mcg/kg/小时，第二阶段过程中获得的功效在输注期间内维持，但在输注结束后被迅速逆转(图21)。如下所述，血浆KAI-1678水平在皮下输注结束时下降，但具有～30分钟的最终半衰期。因此，在皮下输注结束时功效的下降似乎比血浆浓度的降低更迅速，这暗示血浆浓度不是确定功效的主要因素。 
静脉内施用KAI-1678
上述皮内和皮下研究显示KAI-1678在施用于远离创伤位点的位点处时是有效的，这提示该化合物可以具有全系统范围的效应。我们因此研究通过静脉内(IV)途径系统施用KAI-1678在角叉藻聚糖炎性疼痛模型中是否有效。基于药物动力学实验的结果(见下)，选择在这些研究中使用的IV输注给药速度，以获得匹配或超越与完全有效的皮下输注KAI-1678有关的那些的血浆KAI-1678水平(例如，≥25mcg/kg/hr)。 
如图22中所示，以高达1000mcg/kg/hr的速度IV输注KAI-1678长达5小时对角叉藻聚糖-诱导的机械痛觉过敏无作用。尽管没有采集血浆样品作为这些功效研究的一部分，但是药物动力学研究提示处于100mcg/kg/hr IV给药速度的血浆KAI-1678水平应该近似或高于用25 mcg/kg/hr皮下输注获得的那些(图20)，且处于1,000mcg/kg/hr IV给药速度的血浆KAI-1678水平应该是比用250mcg/kg/hr皮下输注获得的那些高5-10倍。IV KAI-1678不能影响角叉藻聚糖-诱导的痛觉过敏似乎不归因于任何技术问题，因为口服吲哚美辛，即一种显示出减轻角叉藻聚糖-诱导的痛觉过敏的已知止痛剂，在5-hr IV输注KAI-1678结束后施用时完全逆转机械痛觉过敏。而且，IV活性的缺乏似乎不是KAI-1678独有的，因为在该模型中在皮内或皮下施药后有效的结构相关εPKC抑制剂在IV输注施药时无活性(数据未显示)。   
大鼠角叉藻聚糖模型中关于KAI-1678作用位点的研究
KAI-1678似乎引起全系统范围的响应，但仅当皮内或皮下施用时引起的表现提示该化合物的主要作用位点可以在外周。 
该假说，结合关于对KAI-1678的响应非常迅速，甚至在将该化合物施用于对侧肢时的观察结果，提示在化合物施用位点处皮肤中的传入神经可能对作用的迅速开始是必要的。因为通过对侧后肢上皮肤中的外周传入神经传播的信号应该必须通过坐骨和隐神经传输，从而影响身体同侧后爪上的角叉藻聚糖注射位点处的机械痛觉过敏，研究了对化合物施用侧完整无损的坐骨和隐神经的需要。 
在图23中所示的实验中，从大鼠左后腿摘除1-cm的坐骨和隐神经片段。次日，当大鼠从手术中恢复过来后，将角叉藻聚糖注射到大鼠的右后爪的足底表面，从而引起炎性应答。注射角叉藻聚糖到右后爪后60分钟，将KAI-1678以皮下输注施用到左后肢上接近或远离摘除1-cm坐骨和隐神经片段位点的位点。如图23中所示，当化合物施用位点接近而非远离神经横断位点时，25mcg/kg/hr皮下输注KAI-1678有效消除角叉藻聚糖-诱导的机械痛觉过敏。与过去的数据(图21)相比，针对接近坐骨和隐神经横断位点施用的KAI-1678的响应类似于在通过手术首次用于实验的大鼠中观察到的应答(见图21)，尽管第二阶段活性的开始似乎在接近神经横断位点皮下输注施用KAI-1678的大鼠中更迅速。尽管手术过程的其他次生效应可能影响了对远离神经横断位点的皮下输注的响应，但是该实验的结果提示KAI-1678功效需要施药位点处的神经支配。因为坐骨和隐神经 含有运动神经元、初级感觉传入神经元、和交感神经神经元，这些数据不容许我们将作用明确地分配到这些神经元子集之一。 
该发现提示1678可以作用于“正常”神经元，从而传递主要引起全系统范围疼痛抑制的信号。该调节可以发生背角中；然而，当将KAI-1678施用于受到疼痛刺激影响的皮区以外的位点时观察到功效，这提示全系统范围的疼痛抑制发生在脊髓水平以上(见下)。 
早期的研究报告了来自交感肾上腺系统的儿茶酚胺参与角叉藻聚糖-诱导的炎性疼痛，且εPKC表达在交感神经系统中。我们因此研究是否需要完整无损的交感肾上腺系统来维持远处施用的KAI-1678的功效。如图24中所示，双侧腰部交感神经切除术加肾上腺神经节截除术不改变针对角叉藻聚糖的疼痛响应。然而，以25mcg/kg/hr皮下输注施用于对侧后肢的KAI-1678逆转角叉藻聚糖-诱导的机械痛觉过敏的能力在这些动物中消失。如图24中所示，交感神经切除术和肾上腺神经节截除术消除针对皮下KAI-1678输注的双阶段响应的早期和后期阶段。在先前关于包含□V1-2的KAI-1678类似物的实验中，我们还证明了外科交感神经切除术，如上所述，消除以推注注射施用于远处的皮下位点、以及邻近创伤的皮内位点的εPKC抑制剂的作用。 
上述交感神经切除术实验需要进行手术干涉和在用角叉藻聚糖干涉前使动物恢复1周。如图24中所示，无交感神经切除术的假手术，可以部分地减小KAI-1678的功效。因此，我们试图通过研究药理学阻断交感神经神经系统功能的作用来补充该研究，这是通过使用α-肾上腺素能拮抗剂酚妥拉明实现的，由此消除对手术的需要。在角叉藻聚糖注射时施用该试剂不影响疼痛的形成，尽管消除了远处位点皮下推注施用包含□V1-2的KAI-1678类似物的作用，并也消除皮内局部施用到伤害位点的作用(数据未显示)。此外，包含□V1-2的KAI-1678类似物在第二种神经性疼痛模型中在皮下推注施用后的功效也通过预先施用酚妥拉明消除，尽管，同样地，酚妥拉明不妨碍该模型中疼痛的形成(数据未显示)。 
因此手术切除交感神经神经系统和药理学阻断α肾上腺素能受体阻断εPKC抑制剂的抗-痛觉过敏活性。这些作用是否反映在CNS中对交感神经神经系统或对肾上腺素能受体信号传递的依赖性尚不清楚。 
角叉藻聚糖炎性疼痛模型研究的总结
以上数据证明KAI-1678在皮下施用于伤害位点和皮内或皮下施用于远处位点时，可以逆转炎性疼痛。使用静脉内施药没有观察到功效，即使处于与在有效的皮下输注过程中获得的那些相等的KAI-1678血浆水平。我们还证明了远处位点的皮下KAI-1678功效取决于施药位点处的神经支配，这提示KAI-1678的远处位点功效通过对在施药位点处暴露于KAI-1678的皮下神经元的作用而介导。解释这些数据的一种假说是，通过对皮肤痛觉感受器的作用，KAI-1678引起初级传入神经元中升高的信号，其起始脊椎或脊椎上反射，最终导致对角叉藻聚糖-诱导的痛觉过敏递减的疼痛抑制。备选地，KAI-1678可以通过减小注射位点处神经元中的紧张信号传导发挥作用，且该抑制可以导致递减的疼痛抑制。递减的调节可以涉及α肾上腺素能信号传导，其应该与酚妥拉明对KAI-1678功效的作用相一致。因此，在脊髓中，没有从递减的途径中释放的肾上腺素通过对初级传入痛觉感受器中央末梢上的α-2A-肾上腺素受体的抑制作用(突触前抑制)，通过对疼痛中间神经元的直接α-2-肾上腺素能作用(突触后抑制)，和通过α-1-肾上腺素受体-介导的抑制性中间神经元活性而抑制疼痛。该假说与其他εPKC作用模型相反，在所述其他εPKC作用模型中提议了关于εPKC响应炎性刺激，在初级传入神经末梢调节膜通道和膜去极化中的作用。 
KAI-1678在神经性疼痛模型中的活性
在L5横断模型或改善的Chung模型评估了KAI-1678的活性，所述改善的Chung模型是一种单神经性疼痛模型，其中手术横断L5脊神经，其导致迅速形成持续的疼痛。KAI-1678在该模型中的活性记述在下文中。 
KAI-1678在大鼠L5脊神经横断单神经性疼痛模型中的活性
大鼠L5脊神经横断模型已用于评估对神经性疼痛的调节剂的响应。在以下所述的研究中，手术横断L5脊神经用于引起特征为神经性疼痛的机械异常性疼痛、机械痛觉过敏和热痛觉过敏。在该模型中，神经性作用 在一天内形成，并被报告持续1-2个月。 
机械异常性疼痛和机械痛觉过敏利用校准的von Frey丝引起屈肌缩回应答(爪缩回应答)测量，这是通过将它们压在神经横断同侧后爪的足底表面上实现的。使用2g，6g和10g von Frey丝评估异常性疼痛，因为这些刺激对通常对首次用于实验的动物无害。使用15g，26g and 60g的丝评估痛觉(对有害刺激的应答)，因为这些刺激在首次用于实验的动物中引起爪缩回，并被认为代表疼痛刺激。 
神经横断后疾病状态的存在基于用2g和10g的丝进行的测试验证。当用总共3组，每组10次测试(总共30次测试)进行测试时，响应2g vonFrey丝的爪缩回典型地由神经损伤前的1-2次增加到手术后的12-15次爪缩回。类似地，响应10g丝的爪缩回次数典型地由神经损伤前的2-3次增加到手术后的20-23次爪缩回。在不存在其他处理的条件下，机械异常性疼痛保持稳定至少3周，这使得使用该模型评估响应推注施用或长期输注的处理的时间进程成为可能，其连续的测量典型在形成疾病状态后1-2周的期间内进行。 
一旦证实了疾病状态，机械异常性疼痛或痛觉过敏程度的评估通过观察针对5次利用各种von Frey丝的测试应答的爪缩回次数确定。结果典型地表示为关于异常性疼痛丝(2g，6g和10g，总共15次测试)或痛觉丝(15g，26g和60g，总共15次测试)的爪缩回总数，或表示为组中的动物在5次使用特定丝的测试中具有定义为≥3次缩回的平均阳性应答的最低的丝。 
连同测量化合物处理对机械异常性疼痛和痛觉过敏的作用，利用Hargreaves测试，在该模型中确定了热痛觉水平响应L5脊神经横断的变化。在这些研究中，将大鼠置于放射热源上的玻璃表面上，所述放射热源集中在受影响的后爪的横向足底表面。当打开热源时，玻璃表面随着时间升温。直到动物抬起其后爪的时间(爪缩回反应时间，以秒测量)是热痛觉的指示。在本研究使用的条件下，爪缩回反应时间由神经损伤前的10-12秒缩短到L5神经横断后的6-8秒，这指示热痛觉过敏的形成。在不存在其他处理的条件下，热痛觉过敏保持稳定至少3周。 
皮下施用KAI-1678
在横断后第7天，用推注皮下给药0.00025-0.25mcg/大鼠(～0.001-1mcg/kg)范围内的KAI-1678处理L5脊神经横断的大鼠。在施用该化合物之前和之后至多3小时，基于针对6种不同von Frey丝的爪缩回次数，评估机械异常性疼痛和痛觉过敏的程度。为了比较，一些大鼠用0.250mcg/大鼠(～1mcg/kg)KP-1723，即KAI-1678的无活性类似物给药。 
如图25中所示，KAI-1678处理在剂量≥0.01mcg/kg时，导致机械异常性疼痛和机械痛觉过敏的剂量依赖性减小。基于用15g，26g和60g vonFrey丝的综合测量(图25，左)，KAI-1678在0.1和1mcg/kg完全逆转机械痛觉过敏，如回到手术前的应答所表示的。在这两种剂量下痛觉过敏的完全逆转在化合物施用后30-60分钟之间观察到，且观察到抗-痛觉过敏作用持续至少2小时。与使用KAI-1678获得的结果相反，KP-1723处理在1mcg/kg下对机械痛觉过敏无作用。在使用2g，6g和10g von Frey丝测量KAI-1678对L5-横断-诱导的机械异常性疼痛的作用时，获得与上述类似的结果(数据未显示)。 
当通过确定在5次刺激中引起3次爪缩回的最小von Frey丝测量爪缩回阈值时，KAI-1678在该模型中的功效也很明显(图25，右)。 
为了确定KAI-1678在该模型中的功效是否随着持续递送、皮下暴露而延长，将递送0.00025-0.25mcg/日(～0.001-1mcg/kg/日)KAI-1678或0.25mcg/日(～1mcg/kg/日)KAI-1723的渗透小泵，在横断后第2天皮下植入肩胛骨之间。机械异常性疼痛在横断后第3，5，7，9，11天(泵植入后第1，3，5，7，9天)利用2g和10g的丝测量。如图26(左)中所示，来自使用10g丝的测试结果显示KAI-1678给药速度≥0.0025mcg/日(～0.01mcg/kg/日)能够充分减小机械异常性疼痛水平，其中0.025和0.25mcg/day(～0.1和1mcg/kg/hr)给药速度产生接近完全的机械异常性疼痛逆转，该逆转持续直到泵植入后的第7天。以最高给药速度时，在迟至横断后第11天观察到减小机械异常性疼痛的证据。利用2g丝获得类似的结果，从而评估机械异常性疼痛(数据未显示)，并利用Hargreaves测试评估热痛觉过敏(图26，右)。在含有KAI-1678的泵的存在下，痛觉过敏完全逆转约5天后，我们注意到功效的消失。这不归因于对药物的耐受，因为在这时皮下推注施用药物引起疼痛的完全逆转(数据未显示)，且其可能是这样的，即作 用的消失归因于泵未能保持递送。 
神经性疼痛模型研究的总结
以上数据证明KAI-1678在L5脊神经横断单神经性疼痛模型中非常有效。皮下推注施用的KAI-1678在逆转L5脊横断模型中的机械和热异常性疼痛的效力相当。当通过皮下输注施用时，KAI-1678比在角叉藻聚糖-诱导的炎性疼痛模型中更有效约1000倍。关于L5-横断模型对KAI-1678处理的高灵敏性的原因尚未知，但是其可能反映该模型对选择性εPKC抑制剂的响应性，因为该模型对KAI-1678的结构相关类似物表现出类似的高灵敏性。KAI-1678在两种神经性疼痛模型中具有活性的证明提示该化合物可能具有管理人中神经性疼痛的临床效用。 
来自大鼠药理学研究的结论
在大鼠炎性和神经性疼痛模型中评估了KAI-1678的活性。皮下施用该化合物在所示模型中是有效的。通过皮下推注施用的KAI-1678的效力在模型之间是相似的，如测试的作用的迅速开始和持续时间，尽管在模型之间的总作用大小确实有变化。模型之间对不同输注给药速度的应答也不同。具体地，L5横断单神经性疼痛模型似乎对KAI-1678特别灵敏，其在该模型中具有活性的剂量比在角叉藻聚糖模型中低大约1000倍。 
在继续使用这些模型的实验的同时，在其他疼痛模型中进行另外的工作。具体地，Brennan切口模型和单省(single spared)神经模型中的初步结果提示KAI-1678在这些模型中，在处于与在角叉藻聚糖模型中具有活性的那些相类似的剂量时也具有活性。 
总之，可获得的动物功效数据提示KAI-1678在多种疼痛模型中可以是有效的，且支持化合物的继续开发。 
动物中的药物动力学
KAI-1678的药物动力学在以静脉内推注和输注或以皮下推注和输注施用该化合物的大鼠中研究。KAI-1678的毒性动力学在以皮下输注施用该化合物的狗中研究，作为毒性研究的一部分。在这些研究中，利用凯制 药(KAI Pharmaceuticals)开发的基于夹心式的ELISA测定确定了血浆KAI-1678水平。该测定量化的下限是约0.3ng/mL。开发了类似的测定法以测量组织KAI-1678水平。 
在大鼠中，KAI-1678在静脉内推注施用后，迅速从系统循环中清除。当以50mcg/kg/hr进行2-小时静脉内输注施用时，似乎在60分钟时获得约10-20ng/mL的稳态血浆浓度，并在输注结束时迅速下降。通过就那么途径推注和输注施用KAI-1678的最终半衰期分别是约50和25分钟。 
以推注(约80或800mcg/kg)或输注(19和190mcg/kg/hr)对大鼠皮下施用KAI-1678导致对测试的剂量的暴露与剂量成比例的增加。血浆KAI-1678浓度在分别对于皮下推注和输注约10分钟和1小时达到最大，且然后一旦不再施用该肽，分别以约35和45分钟的半衰期减小。通过皮下途径施用的KAI-1678生物适用性在大鼠中约是10％。尽管最终半衰期不确定，但是KAI-1678在持续皮下输注5天后施用KAI-1678的狗中也迅速从系统循环中清除。在该研究中，在来自在输注结束时摘除的各种器官的(最著名地，肾、肝和肺)不同组织样品中检测KAI-1678，而脑和脊髓中的KAI-1678水平一贯很低。 
大鼠的药物动力学
静脉内施用
为了最初表征KAI-1678在大鼠中的药物动力学，通过尾静脉以IV推注注射对雄性大鼠施用剂量为100和1,000mcg/大鼠(～300和～3,000mcg/kg)的KAI-1678。注射后至多2小时内周期性采取血液样品，以进行KAI-1678水平的血浆分析。100和1,000mcg剂量组中分别有3和2只动物，且各剂量组中动物之间存在KAI-1678血浆浓度的一致性。如图27中所示，KAI-1678的Cmax血浆水平针对测试的剂量以与剂量成比例的方式增加。这些数据的初步分析显示关于～300mcg/kg和～3,000mcg/kg剂量水平的最终半衰期分别是约38和66分钟。 
皮下施用
通过将KAI-1678皮下推注或输注施用于大鼠进行了大部分动物功效 研究。因此，基于血浆KAI-1678浓度的测量评估了通过皮下途径施用的KAI-1678的药物动力学。 
在图29中所示的实验中，以皮下推注注射(将200μL注射到左后腿中)对雄性大鼠施用剂量25或250mcg/动物(分别地，约80和800mcg/kg)的KAI-1678。在施用该化合物后2小时内在不同时间点获取血液样品，从而确定血浆KAI-1678浓度。25和250mcg/动物的剂量组中分别有3和4只动物，且各剂量组中动物之间KAI-1678血浆浓度测量值是一致的。Cmax发生在注射后10分钟内，且针对两种测试的剂量以与剂量成比例的方式增加。来自这些数据的初步最终半衰期评估对于两种剂量水平均是35分钟。关于以静脉内推注和以皮下推注施用的KAI-1678的血浆浓度对比时间曲线下面积的比较显示通过皮下途径施用的KAI-1678的生物适用性在大鼠中，在该施用位点处是约10％。 
在图30中所示的实验中，以持续皮下输注2小时对雄性大鼠施用剂量为19和190mcg/kg/hr的KAI-1678。在贯穿输注始终和输注结束后1小时内的不同时间点获取血液样品，从而确定血浆KAI-1678浓度。存在2只动物/剂量组，且各剂量组中动物之间的血浆KAI-1678浓度测量值相一致。以较低的给药速度(19mcg/kg/hr)时，血浆浓度在60分钟时达到稳态(～3ng/mL)，且在剩余输注过程中保持相对恒定。以较高给药速度(190mcg/kg/hr)时，血浆KAI-1678浓度在整个输注过程中上升，且似乎在2小时输注过程中不达到稳定水平或稳态(Cmax～60ng/mL)。以这两种给药速度，血浆KAI-1678浓度在输注结束后迅速下降，尽管在输注结束后1小时，在这两种剂量水平仍能检测到化合物。 
图28和图30中的数据的比较显示50mcg/kg/hr静脉内输注KAI-1678会产生高于以19mcg/kg/hr皮下输注获得浓度(～3ng/mL)和接近以190mcg/kg/hr皮下输注所获得的水平(～60ng/mL)的化合物血浆浓度(10-20ng/mL)。有趣的是，这些剂量似乎与血浆浓度和功效无关，因为利用iv施用KAI-1678，即使以高于通过皮下输注该化合物获得最大功效所需剂量的剂量，没有观察到功效。 
狗的药物动力学
作为范围-发现毒理学研究的一部分，以3，8 and 25mg/kg/日的剂量水平对6只毕尔格猎犬(1只/组)连续皮下输注施用KAI-1678 5天。在第1天(输注开始)和第6天(输注结束后)的不同时间收集血液样品。血浆KAI-1678浓度在输注最初的4小时期间内增加，且在大多数情形中，在第5天输注结束时再增高2-3倍，这提示以测试的剂量水平皮下输注4小时内未达到稳态(图31)。然而，以所有剂量水平，血浆水平在停止输注时迅速下降，尽管由于可获得少量数据点，计算不出最终半衰期。 
作为该研究的一部分，在给药结束时，从动物子集中收获组织。制备和分析组织提取物，以确定KAI-1678的存在，其在来自两个最高剂量组的组织子集中检测：肝、肺、肾、脑(大脑)、脊髓、注射位点(由皮肤及其下面的骨骼肌组成)、左前肢中的外周神经、和腿中的肌肉(不接近输注位点)。通常，主要器官(肾、肝和肺)中的组织KAI-1678水平随着剂量增加而增加，且反映出在血浆水平中观察到的差异。如预料到地，KAI-1678浓度在输注位点皮肤中最高(即对于25,000 mcg/kg/日的动物)，尽管其下面的肌肉具有相对低的水平。神经系统(脊髓和尺骨神经)和外周组织(肌肉和皮肤)中的KAI-1678水平在动物和剂量组之间不太一致。在脑和脊髓中的水平，在许多刚刚高于量化界限的情形中，在极大程度上，一贯很低，这表明这些组织相对低地暴露于皮下输注的KAI-1678。 
表4：在KAI-1678以25mg/kg/日皮下输注施用5天的狗中的组织KAI-1678水平 
Figure G2008800084226D00461
*包括至少一个低于量化特定界限的数据点。 
Figure IYZ000006049376700011
Figure IYZ000006049376700021
Figure IYZ000006049376700041
Figure IYZ000006049376700051
Figure IYZ000006049376700061
Figure IYZ000006049376700091
Figure IYZ000006049376700101
Figure IYZ000006049376700111
Figure IYZ000006049376700121
Figure IYZ000006049376700131
Figure IYZ000006049376700141
Figure IYZ000006049376700161
Figure IYZ000006049376700181
Figure IYZ000006049376700191
Figure IYZ000006049376700211

Claims (9)

1.修饰的ε蛋白激酶C(εPKC)抑制性构建体用于制备治疗受试者的药物中的用途，其中所述构建体与原型序列相比更稳定，更有效力，或二者，其中所述构建体包括具有下式或序列之一的与细胞内载体肽共价连接的抑制肽：
2.修饰的ε蛋白激酶C(εPKC)抑制性构建体用于制备在遭受疼痛的受试者中减少疼痛的药物中的用途，其中所述构建体包括具有下式或序列之一的与细胞内载体肽共价连接的抑制肽：
Figure FSB00000772415100012
Figure FSB00000772415100021
3.修饰的ε蛋白激酶C(εPKC)抑制性构建体用于制备在需要其的受试者中实现系统抗-痛觉过敏的药物中的用途，其包括：
通过皮下途径将有效量的修饰的ε蛋白激酶C(εPKC)抑制性构建体施用于受试者，其中所述修饰的εPKC肽与原型序列相比更稳定，更有效力，或二者，由此实现系统性抗-痛觉过敏，其中所述构建体包括具有下式或序列之一的与细胞内载体肽共价连接的抑制肽：
Figure FSB00000772415100022
4.权利要求2或3的用途，其中所述受试者患有选自由急性疼痛、慢性疼痛、神经性疼痛、和炎性疼痛组成的组的疼痛。
5.权利要求1、2或3的用途，其中增加的效力是由比所述原型序列更快开始作用或更长的活性持续时间引起的。
6.权利要求1、2或3的用途，其中所述修饰的εPKC抑制肽在受试者接受疼痛刺激之前、过程中、或之后施用于所述受试者。
7.权利要求1、2或3的用途，其中将所述修饰的εPKC抑制肽施用于所述受试者，其中所述受试者患有慢性疼痛。
8.权利要求7的用途，其中所述抑制肽在疼痛刺激前5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，一小时，数小时，一天，数天，一周，或数周施用。
9.ε蛋白激酶C(εPKC)抑制肽组合物，其包括：
具有下式或序列之一的与细胞内载体肽共价连接的抑制肽：
Figure FSB00000772415100031
CN2008800084226A 2007-01-19 2008-01-22 使用ε抑制剂化合物减轻疼痛的方法 Expired - Fee Related CN101678063B (zh)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US88139607P 2007-01-19 2007-01-19
US60/881,396 2007-01-19
US90368407P 2007-02-26 2007-02-26
US60/903,684 2007-02-26
US91787607P 2007-05-14 2007-05-14
US60/917,876 2007-05-14
US97733207P 2007-10-03 2007-10-03
US60/977,332 2007-10-03
PCT/US2008/051736 WO2008089494A2 (en) 2007-01-19 2008-01-22 Methods of use of epsilon inhibitor compounds for the attenuation of pain

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101678063A CN101678063A (zh) 2010-03-24
CN101678063B true CN101678063B (zh) 2012-12-19

Family

ID=39636773

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2008800084226A Expired - Fee Related CN101678063B (zh) 2007-01-19 2008-01-22 使用ε抑制剂化合物减轻疼痛的方法

Country Status (8)

Country Link
US (3) US8017583B2 (zh)
EP (1) EP2124987A4 (zh)
JP (1) JP2010516709A (zh)
KR (1) KR20090117878A (zh)
CN (1) CN101678063B (zh)
AU (1) AU2008206028A1 (zh)
CA (1) CA2676340A1 (zh)
WO (1) WO2008089494A2 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010516707A (ja) * 2007-01-19 2010-05-20 カイ ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド ペプチド組成物の安定性および送達効率を上昇させるための修飾方法
WO2008124698A2 (en) * 2007-04-06 2008-10-16 Kai Pharmaceuticals, Inc. Methods of use of gamma inhibitor compounds for the attenuation of pain
CN102120755B (zh) * 2010-04-23 2013-04-03 江苏省人民医院 一种棕色脂肪组织靶向性多肽及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6376467B1 (en) * 1998-10-09 2002-04-23 The Regents Of The University Of California Use of inhibitors of protein kinase C epsilon to treat pain

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4847240A (en) * 1978-01-16 1989-07-11 The Trustees Of Boston University Method of effecting cellular uptake of molecules
US5380746A (en) 1989-05-05 1995-01-10 Goedecke Aktiengesellschaft Bis-(1H-indol-3-YL)-maleinimide derivatives, processes for the preparation thereof and pharmaceutical compositions containing them
DE3942296A1 (de) 1989-12-21 1991-06-27 Goedecke Ag Indolocarbazol-derivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung
US5747641A (en) * 1989-12-21 1998-05-05 Biogen Inc Tat-derived transport polypeptide conjugates
US5489608A (en) * 1989-12-21 1996-02-06 Goedecke Aktiengesellschaft Indolocarbazole derivatives and the use thereof
US5888762A (en) * 1990-06-05 1999-03-30 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Neurotropic growth factors comprising a homeobox peptide
US5141957A (en) * 1990-11-02 1992-08-25 Sphinx Pharmaceuticals Corporation 1,4-bis-(amino-hydroxyalkylamino)-anthraquinones for inhibiting protein kinase c
HUT64295A (en) * 1990-11-02 1993-12-28 Sphinx Pharma Corp Method for producing bis-(hydroxy-alkyl-amino)-anthraquinone derivatives as well as pharmaceutical preparatives containing them
US5204370A (en) * 1990-11-05 1993-04-20 Sphinx Pharmaceuticals Corporation Bis-(hydroxyalkylamino)-anthraquinone inhibitors of protein kinase C
AU650106B2 (en) * 1991-03-07 1994-06-09 Zeria Pharmaceutical Co., Ltd. Trialkylamine derivative and ameliorant for digestive tract movement containing the same
US5216014A (en) * 1991-09-10 1993-06-01 Sphinx Pharmaceuticals Corporation Furo-coumarinsulfonamides as protein kinase C inhibitors
US5360818A (en) * 1991-09-23 1994-11-01 Sphinx Pharmaceuticals Corporation 1,3-dioxane derivatives having protein kinase C inhibitory activity
US5270310A (en) * 1991-12-13 1993-12-14 Sphinx Pharmaceuticals Corporation N-aminoalkyl amide inhibitors of protein kinase C
US5292737A (en) * 1992-10-23 1994-03-08 Sphinx Pharmaceuticals Corporation N,N'-bis(sulfonamido)-2-amino-4-iminonaphthalen-1-ones and N,N'-bis(amido)-2-amino-4-iminonaphthalen-1-ones
US5783405A (en) * 1994-02-01 1998-07-21 Terrapin Technologies, Inc. Rapid screening method for effectors of signal transduction
US6423684B1 (en) * 1994-02-01 2002-07-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University WD-40 derived peptides and uses thereof
US5432198A (en) * 1994-08-18 1995-07-11 Sphinx Pharmaceuticals Corporation Vicinal-substituted carbocyclic compounds as therapeutic agents
US6255057B1 (en) * 1996-07-26 2001-07-03 Ernest Gallo Clinic And Research Center Detection of cellular exposure to ethanol
FR2766826B1 (fr) * 1997-08-04 2001-05-18 Pasteur Institut Vecteurs derives d'anticorps pour le transfert de substances dans les cellules
ES2147115B1 (es) * 1998-02-03 2001-03-16 Aparellaje Electrico Sl Dispositivo para la conexion de dos tramos de canal para conducciones electricas.
JP3822384B2 (ja) * 1999-06-04 2006-09-20 株式会社共立 携帯型動力作業機
EP1210121A2 (en) * 1999-08-24 2002-06-05 Cellgate Inc. Enhancing drug delivery across and into epithelial tissues using oligo arginine moieties
US20030104622A1 (en) * 1999-09-01 2003-06-05 Robbins Paul D. Identification of peptides that facilitate uptake and cytoplasmic and/or nuclear transport of proteins, DNA and viruses
US8003595B2 (en) * 2000-03-01 2011-08-23 Cellectis Amino acid sequences facilitating penetration of a substance of interest into cells and/or cell nuclei
EP1319184B1 (en) * 2000-08-14 2007-07-25 N.V. Organon Use of antibodies against specific mhc-peptide complexes
US20030175745A1 (en) * 2001-11-28 2003-09-18 Dean Cheryl H. Peptides with growth inhibitory action
CA2482598C (en) * 2002-04-22 2012-09-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Peptide inhibitors of protein kinase c
US6933275B2 (en) * 2002-05-01 2005-08-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Protein kinase C peptides for use in withdrawal
US20050074865A1 (en) * 2002-08-27 2005-04-07 Compound Therapeutics, Inc. Adzymes and uses thereof
AU2003264918A1 (en) * 2003-10-02 2005-04-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Protein kinase c peptides for use in withdrawal
JP2007513974A (ja) * 2003-12-11 2007-05-31 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー プロテインキナーゼｃのアイソザイム特異的アンタゴニスト
FR2868318B1 (fr) * 2004-04-01 2012-11-16 Commissariat Energie Atomique Antigene tat stabilise et ses applications pour la vaccination anti-vih
WO2008124698A2 (en) * 2007-04-06 2008-10-16 Kai Pharmaceuticals, Inc. Methods of use of gamma inhibitor compounds for the attenuation of pain

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6376467B1 (en) * 1998-10-09 2002-04-23 The Regents Of The University Of California Use of inhibitors of protein kinase C epsilon to treat pain

Also Published As

Publication number Publication date
EP2124987A2 (en) 2009-12-02
CN101678063A (zh) 2010-03-24
US20130281380A1 (en) 2013-10-24
JP2010516709A (ja) 2010-05-20
EP2124987A4 (en) 2012-05-02
WO2008089494A3 (en) 2008-11-20
CA2676340A1 (en) 2008-07-24
KR20090117878A (ko) 2009-11-13
US20120129790A1 (en) 2012-05-24
WO2008089494A2 (en) 2008-07-24
US20090062209A1 (en) 2009-03-05
US8492346B2 (en) 2013-07-23
AU2008206028A1 (en) 2008-07-24
US8017583B2 (en) 2011-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6686334B2 (en) Use of inhibitors of protein kinase C epsilon to treat pain
Honore et al. A-425619 [1-isoquinolin-5-yl-3-(4-trifluoromethyl-benzyl)-urea], a novel transient receptor potential type V1 receptor antagonist, relieves pathophysiological pain associated with inflammation and tissue injury in rats
US9365837B2 (en) Peptide inhibitors of protein kinase C
Chacon‐Cabrera et al. Pharmacological strategies in lung cancer‐induced cachexia: effects on muscle proteolysis, autophagy, structure, and weakness
Andrews et al. The role of tachykinins and the tachykinin NK 1 receptor in nausea and emesis
Su et al. Role of the central renin‑angiotensin system in hypertension
US20040138204A1 (en) Compositions and methods for pain reduction
EP1093379B1 (en) Use of inhibitors of protein kinase c epsilon to treat pain
CN101678063B (zh) 使用ε抑制剂化合物减轻疼痛的方法
Li et al. Chronic arthritis down‐regulates peripheral μ‐opioid receptor expression with concomitant loss of endomorphin 1 antinociception
Gasparini et al. Adrenergic mechanisms of the Kölliker-Fuse/A7 area on the control of water and sodium intake
BR112013007557A2 (pt) peptídeos nd2 e seu uso no tratamento de doenças neurológicas
Khapchaev et al. Design of peptidase‐resistant peptide inhibitors of myosin light chain kinase
Mizumura Natural history of nociceptor sensitization: the search for a peripheral mechanism of hyperalgesia
Liu et al. Enhanced release of adenosine in rat hind paw following spinal nerve ligation: involvement of capsaicin-sensitive sensory afferents
Honore et al. A-425619, a novel TRPV1 receptor antagonist, relieves pathophysiological pain associated with inflammation and tissue injury in rats
Gaginella et al. Serotonin and gastrointestinal function
Dirksen The clinical relevance of endorphin receptors: the antinociceptive effectiveness of epidurally or intrathecally injected endorphinomimetics
Yao et al. Hydroxychloroquine and a low activity bisphosphonate conjugate prevent and reverse ovariectomy-induced bone loss in mice through dual antiresorptive and anabolic effects
EP3265118B1 (en) Use of creatine kinase and derived peptides thereof to relief pain
Altier The role of midbrain substance P in stress-induced analgesia using the formalin test for tonic pain
Ballough Alterations in supraoptic and paraventricular magnocellular metabolism following acute T-2 toxin mycotoxicosis
AU2011202912A1 (en) Peptide inhibitors of protein kinase C
AU2012216402A1 (en) Peptide inhibitors of protein kinase Cy for pain management

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20121219

Termination date: 20140122