CN101676387A

CN101676387A - 一种大量固定家蚕胚胎的方法

Info

Publication number: CN101676387A
Application number: CN 200810141410
Authority: CN
Inventors: 曾晓慧; 刘宗才; 柴换娜; 阚云超; 焦铸锦
Original assignee: Nanyang Normal University
Current assignee: Nanyang Normal University
Priority date: 2008-09-19
Filing date: 2008-09-19
Publication date: 2010-03-24

Abstract

本发明公开了生物技术领域的一种大量固定家蚕胚胎的方法，其特征在于是按照下列步骤制备：(1)KOH溶液对家蚕卵壳的消化；(2)由次氯酸钠溶液对卵壳残余物的处理和卵膜的软化；(3)由甲醛对去壳卵的固定后振荡，获取家蚕胚胎。使用本方法固定胚胎，在甲醛固定前，胚胎一直有卵壳和卵膜保护，并未直接暴露于外部环境。此外该方法可以大量获得各种发育阶段的胚胎，从单细胞层的胚盘到孵化前的蚁蚕都可以大量固定，胚胎形态完好，卵黄等隔离物质已经基本去除，方便进行后续的基因定位实验。

Description

一种大量固定家蚕胚胎的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种新的去除蚕卵壳膜而获得大量形态和mRNA均保护较好的胚胎的方法。更具体地，涉及一套物理和化学处理去除蚕卵壳、膜以及卵黄的方法。

背景技术

家蚕在我国、日本等几个国家都是很重要的经济昆虫，对它的研究已经持续100多年之久，而胚胎发育对于真核生物而言是生命的根本，没有了胚胎发育就没有了生命本身，从而也就没有了来赖以产生经济效益的基础。近些年来，以果蝇为代表的模式昆虫的分子发育研究得到了很大发展。赤拟谷盗、黄斑蟋蟀等昆虫的功能和调控研究也得到了深入的研究，我国科学家对家蚕基因组序列的破译也使得从分子水平上研究基因功能、发育调控以及与经济形状相关的发育基因成为可能。在这些研究中，胚胎的原位杂交和免疫组化技术对研究基因的时空表达和功能调控都是十分重要的技术手段，可是这些技术需要获得大量形态完整、mRNA保护程度较高的胚胎。但是家蚕的卵壳十分厚，而且含有特殊的蛋白骨架结构。在果蝇、赤拟谷盗等昆虫中广泛使用的通过较低浓度次氯酸钠处理去壳而进行大量固定的方法在家蚕研究中效果极差以致无法使用。次氯酸钠处理后卵孔破裂，卵黄溢出，卵壳并未像其它昆虫上一样完全溶解。而传统的用煮沸的高浓度KOH处理蚕卵然后吹出胚胎的方法也并不能有效应用于原位杂交和免疫组化等对胚胎mRNA的保护有较高要求的研究中。

迄今为止所报道的家蚕胚胎原位杂交方法中胚胎样本的获得一为冰冻切片原位杂交，一为取卵纸后用刀片轻轻切去表面一层，然后用吸管吸取缓冲溶液吹出胚胎的方法。

切片方法的缺点：要求有切片机器，细致的操作，只能获得胚胎切面，很难获得整个胚胎，缺乏直观形态。原位杂交时只能在玻片上操作，多次处理后容易损失样本，而且只能通过不同切面结果的拼凑来获得整体的表达图式。切片法获得目标组织的概率比较低，不太适宜在功能研究与调控关系研究中极难获得的突变体中进行深入研究。

而第二种方法费时费力，成功率较低，家蚕产卵为群居产卵，要想在一堆密集的蚕卵中不伤胚胎切去表面难度很大，而且即使切割成功，胚胎也不易被吹出。尤其家蚕初期胚盘很大，几乎包裹了整个卵，基本无法不伤胚盘而进行切割，也很难用吸管吹出胚胎。目前涉及家蚕原位杂交的报道文献中用该方法获得的胚胎均在36小时以后，而此时早期的胚胎分节发育等过程均已完成，也限制了这种方法的使用。

此外以上两种方法均为固定前个体解剖处理，此时mRNA易于降解，处理时间过长，后期杂交结果受到很大影响。如果要求大量胚胎，费时、费力，而且效率低下，效果差。

发明内容

本发明涉及一套新的通过物理和化学处理去除家蚕卵壳膜大量获得固定胚胎的方法，从而获得大量形态完整、mRNA保护程度较高的家蚕胚胎。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：该大量固定家蚕胚胎的方法是按照下列步骤制备：1、KOH溶液对家蚕卵壳的消化；2、由次氯酸钠溶液对卵壳残余物的处理和卵膜的软化；3、由甲醛对去壳卵的固定后振荡，获取家蚕胚胎。

所述的家蚕卵壳的消化：将干燥蚕卵置于20-30％的KOH溶液处理，解剖镜下观察卵壳的消化程度，在卵壳变为一层脱离卵膜的薄膜时，终止反应；所述蚕卵处理后卵壳残余物的处理和膜的软化：将处理蚕卵浸入2-4％的次氯酸钠水溶液，卵壳残余物薄膜消失后，用PBS中洗涤数次；所述蚕卵去壳后的固定：加入等体积PBS和庚烷，然后加入4-8％的甲醛，摇床上室温水平震荡2小时左右，转速100-200rpm，吸干净庚烷和PBS，加入适量甲醇，立即震荡数分钟，胚胎将破膜而出，重复几次震荡步骤后用甲醇洗涤数次，最后置于-20℃保存。

本发明所使用的方法则可以克服现有技术存在的缺点，具有明显的优势。使用本方法固定胚胎，在甲醛固定前，胚胎一直有卵壳和卵膜保护，并未直接暴露于外部环境。此外该方法可以大量获得各种发育阶段的胚胎，从单细胞层的胚盘到孵化前的蚁蚕都可以大量固定，胚胎形态完好，卵黄等隔离物质已经基本去除，方便进行后续的基因定位实验。固定好的胚胎可以冷冻保存一年以上，杂交效果保持不变。这样可以在蚕虫源充足时，大量固定胚胎。而避免了对虫源的即时要求。胚胎形态完好，组织mRNA保存较好，可以通过原位杂交或者免疫组化分析相同基因在家蚕胚胎上的表达或者多基因原位杂交来分析不同基因的同时表达图谱。本方法的建立对于运用分子技术研究家蚕胚胎的早期发育机制提供了基础性的技术平台，对很多与经济性状有关的家蚕基因的早期表达和功能研究提供了方便。

下面通过家蚕基因的原位杂交方法和制作玻片照相来进一步说明通过上述固定胚胎的方法获得大量形态完整、mRNA保护程度较高的家蚕胚胎。

家蚕基因的原位杂交方法

原位杂交方法参照赤拟谷盗(Gregor and Klingler Lab)，有细微修改。

原位杂交第一天：

(1)甲醇/PBT 1∶1混匀，PBT漂洗数次，吸去上清液。

(2)加入1ml PBT和140μl 37％的甲醛，旋转固定15分钟，PBT漂洗4-5次。

(3)1ml PBT中加入0.5μl20mg/ml的蛋白酶K，，旋转5分钟培养后PBT漂洗两次。

(4)加入1ml PBT和140μl 37％的多聚甲醛，再旋转固定15分钟，PBT漂洗4-5次。

(5)加入250μl PBT和250μl杂交缓冲液B沉淀一次，再用杂交缓冲液B沉淀一次，然后加入250μl杂交缓冲液A，在65℃的水浴中预杂交1～2小时。

(6)探针准备：取1～5μl的探针加入30μl杂交缓冲液A于65℃水浴中放置15分钟左右。

(7)尽量将管子里的杂交缓冲液A吸净，然后加入含有探针的杂交缓冲液A溶液，在65℃的水浴中杂交过夜。

原位杂交第二天：

(8)加入500μl预热的杂交缓冲液B，于65℃水浴中孵育20分钟后，加入500μl PBT，

沉淀后再用PBT漂洗一两次后旋转漂洗15分钟。

(9)用含有0.5％Blocking Reagent的PBT漂洗20分钟，用PBT漂洗一两次。

(10)加入1ml PBT，再加入0.5μl anti-FL-AP后室温旋转1-2小时，PBT漂洗3-4次，每次30分钟左右。

(11)用AP-染色buffer漂洗2次，然后在1ml染色buffer中加入4.5μlNBT和3.5μl BCIP进行避光染色，染到适当时候，用PBT漂洗终止染色。

(12)用PBT多漂洗几次后，加PBT于4℃条件下短期保存或梯度乙醇处理后于室温下长期保存。

制作玻片照相

(1)从离心管中小心挑取已染好色的不同时期的胚胎，置于载玻片上。

(2)滴一滴50％的甘油于载玻片上，在解剖镜下小心地将胚胎上沾着的卵黄等杂物都去掉，将解剖干净的胚胎小心地平置于载玻片上。

(3)吸去50％的甘油，再在胚胎四角放置一些橡皮泥。

(4)取一个盖玻片小心地盖在胚胎上，解剖镜下观察并用一定的力度向下轻轻压，直至将胚胎展平。

(5)用滴管吸取一滴100％的甘油使其沿着盖玻片边缘渗入到胚胎四周，尽量避免产生气泡，调好焦距，用相机拍照并保存照片，以待进一步分析。

试剂配制

(1)PBT：1×PBS，0.02％Tween20，0.5ml DEPC/L在磁力搅拌器上搅拌30分钟，高压灭菌。

(2)染色buffer：0.1M Tris PH9.5，1ml 1M MgCl2混匀，加入400μl 5MNaCl混匀，最后加入100μl 20％Tween20混匀备用(现配现用)。

(3)杂交缓冲液A：加入20ml去离子甲酰胺和12.5ml 20×SSC，用HCl调节至PH5.5，再加入1ml 10mg/mlssDNA，250μl 20mg/mltRNA，25μl 100mg/ml肝素钠后加超纯水至50ml。

(4)杂交缓冲液B：50％的去离子甲酰胺，5×SSC，加超纯水至50ml。

其它试剂PBS，SSC等配制方法参见分子克隆实验指南。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施例作进一步详细的说明。

图1为家蚕蚕卵去壳处理卵壳厚度增加的示意图。

图2为家蚕卵壳外围出现一层薄膜样包裹的示意图。

图3为家蚕卵壳只剩一层膨胀脱离卵薄膜的示意图。

图4为经次氯酸钠处理后的蚕卵的示意图。

图5为家蚕蚕卵固定后胚盘期的胚胎示意图。

图6为家蚕蚕卵固定后头叶初期的胚胎示意图。

图7为家蚕蚕卵固定后头叶中、后期和胚带初期的胚胎示意图。

图8为家蚕蚕卵固定后胚带期的胚胎示意图。

图9为家蚕蚕卵固定后器官形成初期的胚胎示意图。

图10为家蚕蚕卵固定后收缩期的胚胎示意图。

图11为kruppel基因在胚盘中央区域表达一条宽带的表达图式。

图12为evenskipped基因在胚盘末期表达有8个条带的表达图式。

图13为wingless基因在胚带伸展期表达有16个条带的表达图式。

图14为engrailed基因在胚带期表达有14个条带的表达图式。

图15为engrailed基因在器官分化初期在16个体节表达条带在头部也有特异表达的表达图式。

具体实施方式

本发明该大量固定家蚕胚胎的方法按下述步骤操作：其中：虫源、家蚕中、日杂交品系(由河南省蚕业研究院提供蚕种)，本室25℃恒温饲养，家蚕非滞育品系Nistari(由中国农业科学院蚕业研究所提供蚕种)。

1、将收集的蚕卵放入筛子晾干后置于浓度为25-30％的KOH水溶液去壳处理，蚕卵必须晾干，以免浸入KOH后卵壳破裂，卵黄溢出，用吸管不时吹、吸，使得蚕卵全部浸入，每隔2-3分钟，在卵壳从松散状态变为一层脱离卵膜的薄膜时，终止反应。一般情况5分钟处理后，卵壳就会变得较为松散，厚度增加，见图1。随后卵壳继续消化，外围逐渐出现一层薄膜样包裹见图2，处理到10-15分钟时，卵壳由一层较厚的包裹层逐渐消化，最后只剩一层膨胀脱离卵的薄膜，见图3。此时如继续用KOH处理，就会对蚕卵有所损伤，卵黄有外溢现象，迅即变为红色胶状物质，严重影响实验结果。因此当镜检发现大部分卵壳呈现薄膜样并膨胀脱离卵黄时，应该迅速停止强碱处理。

2、将筛子取出后迅速浸入终浓度为2-4％的次氯酸钠水溶液中2-5分钟，在解剖镜下观察会发现卵壳残余物的薄膜会消失。然后在PBS水溶液中洗涤2-3次。2％左右次氯酸钠处理既消化了卵壳的残余物质，也对卵膜起到了软化作用，又并不使卵膜破裂，胚胎的完整性和分子生化等物质也得到了很好的保护，图4显示了次氯酸钠处理后的蚕卵，可以看出蚕卵卵壳消失，而卵膜完整。

3、用PBS洗涤蚕卵数次，加入10ml冰上放置的PBS，再加入10ml庚烷，然后加入在PBS中终浓度为4-8％的甲醛，然后水平放置到摇床上震荡2小时左右，温度25℃，转速200rpm左右。将管中的庚烷和PBS吸净，立即加入15ml冰上放置的甲醇，并剧烈震荡2分钟以上，胚胎就会破膜而出，表面的卵黄也基本去除干净。加入甲醇过晚或者加入后停滞时间过长，均会导致去膜困难。

第一次振荡时间对固定效果最为重要，振荡时间过短，胚胎收率就会降低，而且获得的胚胎上会包被一层卵黄，使得后续的杂交实验中探针与mRNA的接触受阻，从而影响效果。轻轻晃动管子，脱膜后的胚胎下沉速度较慢，尽快将上面的胚胎倒入另一管子，剩余的还未脱膜的卵沉入底部，再加入甲醇，继续上述步骤，经过3-4次，能够获得大部分胚胎，最后置于-20℃保存。

用该方法固定可以获得从胚盘初期的单细胞层阶段到胚胎已经成型的任何阶段的胚胎，见图5、6、7、8、9、10，而且mRNA保护性好，固定好的胚胎可以用于形态学研究，分子生物学研究中的原位杂交和免疫组化等研究。粗略估计，有70-90％的胚胎可以破膜而出，而且虽经剧烈振荡，胚胎除了有极少量破碎外均保持了很好的形态，而且附在胚胎上的卵黄也基本去除干净，形态展示十分清楚。卵黄的去除除了从形态观察方面的作用外，同时使得用分子手段研究家蚕发育基因的时空表达，功能调控等也提供了方便，在原位杂交实验中使得探针更易接触杂交目标。为了验证该固定方法对胚胎mRNA的损伤程度，选择了参与家蚕胚胎早期分节发育的4个基因kruppel、evenskipped、wingless和engrailed，通过原位杂交方法研究了这些基因在本方法固定的不同发育阶段胚胎上的时空表达，结果发现本方法固定获得的胚胎能够很好地进行原位杂交实验，杂交效果良好，实验获得了这4个基因的特异表达图式，见图11、12、13、14、15。

Claims

1、一种大量固定家蚕胚胎的方法，其特征在于是按照下列步骤制备：(1)、KOH溶液对家蚕卵壳的消化；(2)、由次氯酸钠溶液对卵壳残余物的处理和卵膜的软化；(3)、由甲醛对去壳卵的固定后振荡，获取家蚕胚胎。

2、根据权利要求1所述的大量固定家蚕胚胎的方法，其特征在于：所述的家蚕卵壳的消化：将干燥蚕卵置于20-30％的KOH溶液处理，解剖镜下观察卵壳的消化程度，在卵壳变为一层脱离卵膜的薄膜时，终止反应；所述蚕卵处理后卵壳残余物的处理和膜的软化：将处理蚕卵浸入2-4％的次氯酸钠水溶液，卵壳残余物薄膜消失后，用PBS中洗涤数次；所述蚕卵去壳后的固定：加入等体积PBS和庚烷，然后加入4-8％的甲醛，摇床上室温水平震荡2小时左右，转速100-200rpm，吸干净庚烷和PBS，加入适量甲醇，立即震荡数分钟，胚胎将破膜而出，重复几次震荡步骤后用甲醇洗涤数次，最后置于-20℃保存。