CN101675932B

CN101675932B - 一种防治肌萎缩侧索硬化的组合物

Info

Publication number: CN101675932B
Application number: CN2008100429473A
Authority: CN
Inventors: 乐卫东; 张晓洁; 陈晟; 李靓; 王倩
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2008-09-16
Filing date: 2008-09-16
Publication date: 2012-02-22
Anticipated expiration: 2028-09-16
Also published as: CN101675932A

Abstract

本发明涉及防治肌萎缩侧索硬化的组合物。本发明公开了一种同型半胱氨酸下调剂的用途，用于制备预防、缓解或治疗哺乳动物肌萎缩侧索硬化的组合物；所述的下调剂是叶酸或叶酸和维生素B12的混合物。所述的下调剂可非常有效地缓解哺乳动物的肌萎缩侧索硬化，降低哺乳动物脊髓内炎症因子的水平，降低脊髓内凋亡蛋白的水平，提高脊髓内抗凋亡蛋白的水平。

Description

一种防治肌萎缩侧索硬化的组合物

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及同型半胱氨酸下调剂在制备预防、缓解或治疗哺乳动物肌萎缩侧索硬化的组合物中的用途。

背景技术

肌萎缩侧索硬化(ALS)是由运动神经元选择性死亡导致的疾病，约20％的家族性肌萎缩性脊髓侧索硬化(FALS)与铜/锌超氧化物歧化酶(SOD1)基因突变有关。过表达突变SOD1基因的模型小鼠表现出与肌萎缩侧索硬化患者相似的临床表现，因此被广泛用于疾病的临床和基础研究。

肌萎缩侧索硬化作为一种致命的神经退行性疾病，其病因和发病机制仍未清楚，目前研究证实，谷氨酸的兴奋性氨基酸毒性作用，氧化应激，线粒体功能异常，蛋白质的错误折叠等与肌萎缩侧索硬化的发病有着密切的关系。肌萎缩侧索硬化与其它神经退行性疾病如帕金森症或阿尔茨海默症相比，发病机制不尽相同，其下运动神经元更易受累，且进展迅速。

因肌萎缩侧索硬化的病因和发病机制仍未清楚，到目前为止，本领域仍然缺乏对肌萎缩侧索硬化的特异有效的治疗方法。因此研发特异性的肌萎缩侧索硬化治疗方法是目前研究中亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供同型半胱氨酸下调剂在制备预防、缓解或治疗哺乳动物肌萎缩侧索硬化的组合物中的用途。

在本发明的第一方面，提供一种同型半胱氨酸下调剂的用途，用于制备预防、缓解或治疗哺乳动物肌萎缩侧索硬化的组合物。

在另一优选例中，所述的肌萎缩侧索硬化是家族性肌萎缩性脊髓侧索硬化。

在另一优选例中，所述的同型半胱氨酸下调剂选自：

(a)叶酸；或

(b)叶酸和维生素B12的混合物。

在另一优选例中，所述的混合物中，叶酸与维生素B12的重量比例是(5-80)：1。较佳的，所述的混合物中，叶酸与维生素B12的重量比例是(10-40):1；更佳地，叶酸与维生素B12的重量比例是(15-25):1。

在另一优选例中，所述的组合物用于抑制炎症反应或抑制细胞凋亡。

在另一优选例中，所述的炎症反应是炎症因子过量引起的炎症反应；或

所述的细胞凋亡是凋亡蛋白水平过高或抗凋亡蛋白水平过低引起的细胞凋亡。

在另一优选例中，所述的组合物用于：

降低脊髓内炎症因子的水平；

降低脊髓内凋亡蛋白的水平；

提高脊髓内抗凋亡蛋白的水平；或

保护脊髓运动神经元。

在另一优选例中，所述的炎症因子包括：诱导型一氧化氮合酶(iNOS)或肿瘤坏死因子α(TNF-α)。

在另一优选例中，所述的凋亡蛋白包括：剪切型胱冬肽酶3(CleavedCaspase-3)，或剪切型聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶(Cleaved PRAP)的水平。

在另一优选例中，所述的抗凋亡蛋白包括：B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)。

在本发明的第二方面，提供一种预防、缓解或治疗哺乳动物肌萎缩侧索硬化的组合物，所述的组合物含有：

有效量的同型半胱氨酸下调剂，以及药学上可接受的载体；

其中，所述的同型半胱氨酸下调剂是叶酸和维生素B12的混合物，含有：

叶酸： 5-80重量份；

维生素B12： 1重量份。

在另一优选例中，所述的混合物中，含有：

叶酸： 10-40重量份；

维生素B12： 1重量份。

更佳的，所述的混合物中，含有：

叶酸： 15-25重量份；

维生素B12：1重量份。

在另一优选例中，叶酸和维生素B12的混合物占组合物总重量的5-100％；较佳的10-60％。

在本发明的第三方面，提供一种预防、缓解或治疗哺乳动物肌萎缩侧索硬化的方法，给予需要的受试者有效量的同型半胱氨酸下调剂。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1.叶酸和维生素B12对SOD1-G93A小鼠发病时间和生存周期的影响。Kaplan-Meier生存分析的曲线表示了四组实验小鼠(SOD1组，B12-SOD1组，FA-SOD1组和FA+B12-SOD1组，每组小鼠数量n＝9)发病时间(A)和生存周期(B)的变化。

图2.实验小鼠120天时经LC--MS/MS检测的Hcy水平。数据显示SOD1组小鼠Hcy的含量明显高于WT组，而FA-SOD1组和FA+B12-SOD1小鼠Hcy水平比SOD1组则显著降低。数据为平均数±SEM，^*P<0.01^**P<0.001(和WT组相比)，^#P<0.01(和SOD1组相比)每组小鼠n＝8。

图3.叶酸及维生素B12对SOD1-G93A小鼠脊髓前角运动神经元的保护作用。

(A)五组实验小鼠脊髓前角运动神经元；其中，(a)WT组，(b)SOD1组，(c)B12-SOD1组，(d)FA-SOD1组，(e)FA+B12-SOD1组。

(B)五组小鼠脊髓L4-5段前角运动神经元数目。数据为平均数±SEM，由ANOVA分析所得。^*P<0.01，^**P<0.001(和WT组相比)，^#P<0.01(和SOD1组相比)每组小鼠n＝3。Bar＝100μm。

图4.叶酸和维生素B12对小鼠脊髓前角胶质细胞激活的影响。CD11b和GFAP作为标记分别观察小鼠脊髓内小胶质细胞(红)和星形胶质细胞(绿)的数目和状态。每组n＝3，Bar＝30μm。

图5.叶酸和维生素B12对小鼠脊髓组织内炎症相关因子和凋亡相关蛋白水平的影响。

(A)五组实验组小鼠脊髓组织内炎症相关因子iNOS和TNF-α水平变化。

(B)五组实验组小鼠脊髓组织凋亡相关蛋白水平的变化。

(C-G)五组实验组小鼠iNOS，TNF-α，Bcl-2，剪切型Caspase-3及剪切型PRAP的定量数值。其中，^*P<0.01，^**P<0.001(和WT组相比)，^#P<0.01，^##P<0.001(和SOD1组相比)每组n＝3，数值为平均值±SEM。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次发现在肌萎缩侧索硬化动物的血浆中同型半胱氨酸(Hcy)的含量显著上升；并且意外地发现采用同型半胱氨酸下调剂，特别是叶酸和维生素B12的混合物，可非常有效地缓解哺乳动物的肌萎缩侧索硬化；并且本发明人出乎意料地发现，叶酸和维生素B12的混合物可非常有效地降低哺乳动物脊髓内炎症因子的水平，降低脊髓内凋亡蛋白的水平，提高脊髓内抗凋亡蛋白的水平，有效地发挥抑制炎症反应以及抗凋亡的作用。

同型半胱氨酸及其下调剂

同型半胱氨酸是一种具有细胞毒性作用的含硫氨基酸，是由甲硫氨酸通过脱甲基作用产生的，其在机体内代谢的平衡是几方面共同作用的结果，而其降解转化主要通过以下两种途径：一是通过再甲基过程转化为甲硫氨酸；二是在胱硫醚-β-合酶的作用下转化为胱硫醚(Cystathionine)。

同型半胱氨酸存在多种下调剂，包括维生素B6等。通过直接或间接途径下调体内同型半胱氨酸的物质(如减少体内同型半胱氨酸产生的物质，促进体内同型半胱氨酸代谢为无毒产物的物质等)均可用于本发明，用于降低体内同型半胱氨酸的水平。作为本发明优选的方式，所述的下调剂是(a)叶酸；或(b)叶酸和维生素B12的混合物。特别优选的，所述的下调剂是叶酸和维生素B12的混合物。

所述的叶酸或维生素B12也可以以被取代的形式存在。例如所述的叶酸可以是四氢叶酸，甲基四氢叶酸。四氢叶酸可在甲基四氢叶酸转移酶的作用下转变为甲基四氢叶酸。甲基四氢叶酸可以提供甲基在甲基转移酶的作用下使同型半胱氨酸转变为甲硫氨酸，完成同型半胱氨酸的甲基化作用。叶酸的含量及甲基四氢叶酸的含量对同型半胱氨酸的水平有着直接的影响。而维生素B12作为甲基转移酶的辅酶，促进同型半胱氨酸向甲硫氨酸的转变过程。

所述的叶酸或维生素B12也可以以“生理学可接受的盐”或“生理学可接受的酸或碱衍生的盐”形式使用。所述的盐包括(但不限于)：与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、以及与有机酸形成的盐，而有机酸则指乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸和马来酸。其他盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式(当以这种形式给药时，在体内可转化成活性部分)。

作为本发明的优选方式，所述的混合物中，叶酸与维生素B12的重量比例是(5-80):1；较佳的，叶酸与维生素B12的重量比例是(10-40):1；更佳的，叶酸与维生素B12的重量比例是(15-25):1。

用途

本发明人首次发现在肌萎缩侧索硬化模型小鼠血浆内同型半胱氨酸水平明显高于正常对照组小鼠，从而提示同型半胱氨酸对于肌萎缩侧索硬化的发生或发展有重要的影响作用。

进一步深入的研究发现，叶酸和维生素B12的混合物可非常有效地缓解哺乳动物的肌萎缩侧索硬化。本发明人将模型小鼠随机分成生理盐水组(SOD1组)，叶酸用药组(FA-SOD1组)，维生素B12用药组(B12-SOD1组)及叶酸和维生素B12联合用药组(FA+B12-SOD1组)，小鼠六周起用药，直至死亡。Rotarod检测和生存时间统计结果表明叶酸用药或叶酸和维生素B12联合用药能够显著延缓疾病的发生，延长模型小鼠的生存时间。免疫组化和蛋白质印迹结果说明，叶酸用药或叶酸和维生素B12联合用药能够明显抑制模型小鼠脊髓中小胶质细胞和星形胶质细胞的激活，降低其脊髓中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的蛋白水平。此外叶酸用药及叶酸和维生素B12联合用药还可明显抑制凋亡相关蛋白剪切型Caspase-3和剪切型PARP的表达，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。

因此，基于本发明人的上述新发现，本发明提供一种同型半胱氨酸下调剂的用途，用于制备预防、缓解或治疗哺乳动物肌萎缩侧索硬化的组合物。所述的肌萎缩侧索硬化是家族性肌萎缩性脊髓侧索硬化。所述的同型半胱氨酸下调剂优选地选自：(a)叶酸；或(b)叶酸和维生素B12的混合物。

所述的同型半胱氨酸下调剂可用于抑制炎症反应或抑制细胞凋亡。所述的炎症反应是体内炎症因子过量引起的炎症反应；所述的细胞凋亡是体内凋亡蛋白水平过高或抗凋亡蛋白水平过低引起的细胞凋亡。

所述的同型半胱氨酸下调剂可用于：降低脊髓内炎症因子的水平。优选地，所述的炎症因子包括：iNOS或TNF-α。

所述的同型半胱氨酸下调剂可用于：降低脊髓内凋亡蛋白的水平。优选地，所述的凋亡蛋白包括：剪切型(Cleaved)Caspase-3，或剪切型(Cleaved)PRAP。

所述的同型半胱氨酸下调剂可用于：提高脊髓内抗凋亡蛋白的水平。优选地，所述的抗凋亡蛋白包括：Bcl-2。

组合物

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。

术语“本发明的组合物”包括但不限于：药物组合物、食物组合物或保健品组合物。

作为本发明的优选方式，用于配制本发明的组合物的各组分的用量如表1所示。

表1

组分	有效量	较佳量	更佳量
				叶酸	5-80重量份	10-40重量份	15-25重量份
维生素B12	1重量份	1重量份	1重量份

较佳地，在组合物中，叶酸和维生素B12的混合物占组合物总重量的5-100％；更佳的10-60％。

对于本发明所述的组合物的剂型没有特别的限制，可以是任何适用于哺乳动物服用的剂型；优选的，所述的剂型可选自：口服液、混悬液、胶囊剂、颗粒剂、片剂、丸剂、或乳剂。

本发明的组合物中可以加入制备不同剂型时所需要的各种常规载体或辅料，如填充剂(如淀粉)、矫味剂(如甜菊素)、抗氧化剂、或包衣材料等。可采用常规的方法制备成任何一种常用的剂型，如片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂。

本发明的混合物或组合物的用量可随给予的模式、剂型和受试者的患病严重程度而变化。然而，通常当本发明的组合物每天以约0.0001～1g/kg动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以1～4次分开的剂量给予，或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每天的总剂量约为0.005～50g，较佳地约为0.02～20g。可调节此剂量方案以提供最佳治疗效果。例如，由治疗状况的需要，可每天分开给予若干次的单一剂量，或将剂量按比例地减少。当然，具体剂量还应考虑施用方式、施用对象的身体状况等因素，这些都是本领域技能范围之内的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

I.材料和方法

实验动物

携带人源突变的铜/锌超氧化物歧化酶(SOD1)(G93A突变体)的转基因小鼠(B6SJL-TgN[SOD1-G93A]1Gur，编号002726)购自美国JacksonLaboratory(Barharbor，ME，U.S.A)。根据文献报道，小鼠的保种和繁殖方法为：一个野生型母鼠和一个转基因公鼠交配，其子代用幼鼠的鼠尾抽提获得的DNA通过聚合酶链反应(PCR)鉴定。

动物分组和给药

48只SOD1-G93A转基因小鼠随机分为四组：

(1)0.9％生理盐水灌胃组(SOD1组，n＝12)；

(2)4mg叶酸/kg体重/天灌胃用药组(FA-SOD1组，n＝12)；

(3)0.2mg维生素B12/kg体重/天灌胃用药组(B12-SOD1组，n＝12)；

(4)4mg叶酸和0.2mg维生素B12/kg体重/天联合用药组(FA+B12-SOD1组，n＝12)。

所有小鼠自出生42天(6周)开始每天给药，直至死亡。其中36只转基因小鼠(SOD1组，n＝9；FA-SOD1组，n＝9；B12-SOD1组，n＝9；FA+B12-SOD1组，n＝9)用于小鼠发病时间的判定及小鼠生存周期的观测。其余的转基因小鼠用于免疫组化和蛋白质印迹样本的制作。同时，10只与SOD1-G93A转基因小鼠同窝的野生型小鼠用于制作免疫组化和蛋白质印迹时的对照样本(即正常对照组，WT)。

运动能力的评测和生存周期的观测

小鼠运动能力的评测从70天开始。在Rotarod仪器上(4cm直径，20rpm转速)，小鼠先练习5天使之习惯次运动并同时得到一个基础运动值。记录小鼠在仪器上停留的时间(5分钟为上限)。每隔一天测定一次，每次实验重复3次并取其最好成绩记录。疾病发生定义为：如小鼠在Rotarod仪器上停留的时间小于5分钟，则该天记录为小鼠疾病发生的时间。

SOD1-G93A转基因小鼠疾病发生后逐渐表现出静止性震颤，发展性步态不稳，随之双下肢出现偏侧或双侧的肢体瘫痪，疾病最后阶段则完全瘫痪，不能自主进食。从伦理学讲应在其不能自主进食前将其处死，而转基因小鼠的死亡判定标准为：将小鼠侧卧放置，如其不能在30秒内翻身为正常姿态者，判断其死亡，该天记录为小鼠的死亡时间。

血浆同型半胱氨酸的测定

A.样本的制备

1.样品制备：准确吸取50μl血浆样品于1.5ml离心管中，分别加入50μl内标液(DL-高胱胺酸-D8)和50μl还原剂(1，4-二硫苏糖醇)，混匀。室温放置30分钟，加入50μl蛋白沉淀剂(三氯醋酸)，窝旋混合30秒，高速离心15,000rpm×3分钟，吸取上清液供色谱进行分析。

2.标准品制备：准确吸取5μl对照液(DL-同型半胱氨酸)，加入45μl稀释液(小牛血清水溶液)稀释后，与血浆样品同样的处理方法处理，得到的上清供色谱分析所用。

B.液相色谱-串联质谱分析(LC-MS/MS分析)

1.色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶填充；流动相为0.02％甲酸的甲醇溶液-0.02％甲酸的水溶液(10:90)，流速0.20ml/min；柱温为25℃；进样量为5μl。

2.质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描；MRM扫描分析，Q1/Q3离子通道分别选择为m/z：136→90amu(Hcy)和140→94amu(内标)。离子源参数包括雾化气流速：0.48MPa，气帘气流速：0.52MPa，碰撞气流速：0.40MPa；离子源电压：2500V，离子源温度：450℃。

3.样品测定：取处理好的对照品、质控品和测定样品溶液各5μl注入液质联用仪，记录色谱图。

4.结果计算：以3个对照品的标示浓度(5、15、45μmol/L)为横坐标(x)，以3个对照品的实际测定峰面积与各自内标峰面积的比值为纵坐标(y)，绘制标准曲线。将测定样本同型半胱氨酸峰面积和内标峰面积的比值代入标准曲线方程，计算测定样本同型半胱氨酸浓度。

脊髓切片和尼氏染色分析

转基因小鼠(SOD1组，n＝3；FA-SOD1组，n＝3；B12-SOD1组，n＝3；FA+B12-SOD1组，n＝3)和野生型小鼠(n＝3)在120天时被随机挑选出来做脊髓样本的采集。小鼠用10％水合氯醛深度麻醉后，用pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)心脏灌流10分钟。一部分小鼠的脊髓(L4-L5段)用于组织病理学分析和免疫组织化学分析。脊髓取出后，浸泡于4％的多聚甲醛中4℃过夜，随后用15％，30％的蔗糖溶液4℃分别处理24小时。另一部分脊髓(C1-L3段)用于蛋白质印迹(Western blot)，其取出后迅速置于液氮中。脊髓L4-L5段经上述处理后，用OCT包被，冰冻于-80℃冰箱。脊髓连续切片的厚度为10μm，切片被贴到明胶(1％)包被过的载玻片上。为了计数运动神经元，脊髓L4-L5段连续切片200张，每3张切片取1张做尼氏染色处理(1％甲苯胺蓝染色，梯度乙醇脱水，中性树胶封片)。处理好的切片用显微镜明视野拍照后，计数。

计数的标准为：(1)计数的目的神经元所在的区域为脊髓前角部分，中央管(central canal)以上的部分。(2)运动神经元的直径在20μm以上。(3)运动神经元有明显的细胞核。

脊髓切片的免疫组化分析

脊髓切片(L4-L5段)分别用一抗CD11b(1:100，Serotec，Oxford，UK)，GFAP(1:2000，Sigma，St.Louis，MO，USA)来检测小胶质细胞(Microglia)和星形胶质细胞(Astrocyte)的状态。同时为排除假阳性，部分切片用单一的二抗处理，观察。免疫组化的具体步骤如下：

1.0.01M PBS洗2×5min后，继以1％H₂O₂室温处理10min。

2.封闭4℃1小时(PBS含4％血清，0.3％Triton-X-100，0.05％叠氮钠)

3.一抗CD11b或GFAP4℃孵育过夜(CD11b：1:100；GFAP：1:2000)。

4.0.01M PBS洗3×5min后，二抗(荧光素标记，分别为cy3：1:1000；FITC：1:200)室温孵育2h。

5.0.01M PBS洗3×5min后，终止反应，显微镜下观察，拍照。

蛋白免疫印迹分析(Western blot)

蛋白样本从液氮中取出，置于RIPA裂解液中(50Mm Tris-CL Ph7.4，1％NP-40，0.25％Na-脱氧胆酸盐(deoxycholate)，150mM Nacl，1mM EDTA，1mMPMSF，1μg/ml抑肽酶(Aprotinin)，1μg/ml亮肽素(Leupeptin)，1μg/ml抑肽素(Pepstatin))。超声破碎1分钟。12,000rpm，4℃离心，15分钟，取上清。SDS-PAGE电泳，转膜，封闭液(TBST+5％脱脂奶粉)，PVDF膜室温封闭1小时。PVDF膜覆于一抗(iNOS，1:5000，chemicon，CA，USA；TNF-α，1:1000，cell signaling，MA，USA；Bcl-2，1:1000，Santa Cruz Biotechnology，INC，Santa Cruz；cleavedCaspase3，1:1000，Santa Cruz Biotechnology，INC，Santa Cruz；PARP andcleavage，1:1000，Cell signaling，MA；USA，β-actin，1:4000，Cell signaling，MA，USA)4℃孵育过夜。二抗(抗兔HRP相连的IgG，1:2000；抗鼠HRP相连的IgG，1:2000，Pierce)，室温孵育2小时。采用化学发光法(Super Signal WestDura Extended Duration Substrate，Pierce；IL U.S.A)。显影于X胶片，显影，定影后使用Bio-Rad，Quantity One-4.2.0图象分析系统对Western blot结果进行灰度分析，从而对蛋白条带的密度进行定量；每个样品的免疫印迹蛋白条带与同一样品的β-actin相比较后得出一个密度比，再进行统计学分析。

统计学分析

小鼠发病时间和生存周期数据使用Kaplan-Meier生存分析(SPSS13.0)，通过log-rank试验可得到一个x²值用于确定数据的差异性。其余数据使用ANOVA进行检测，若得到的P值小于0.05则认为数值之间差异明显。所有的数据以平均数±SEM的形式表示。

II.实施例

实施例1.叶酸或叶酸和维生素B12联合用药延缓SOD1-G93A模型小鼠的发病时间，延长小鼠寿命

SOD1-G93A转基因小鼠的发病症状与ALS患者的临床表现十分相似，表现为渐进性的肌无力，肌萎缩，直至瘫痪和死亡，病理标志为运动神经元选择性退行性病变。

在实施例中，本发明人采用了Rotarod仪器检测小鼠的运动能力，以此作为评价疾病发生发展的指标。通过观测发现，叶酸灌胃的FA-SOD1组小鼠比生理盐水灌胃的SOD1组小鼠其平均发病时间延缓了7天(114.4±1.7天(FA-SOD1)vs107.9±1.8天(SOD1)，x²＝6.33，P<0.05)，FA+B12-SOD1组比SOD1组小鼠发病时间延缓了9天(116.3±2.0天(FA+B12-SOD1)vs107.9±1.8天(SOD1)，x²＝8.989，P<0.05)，而维生素B12单独使用对小鼠的发病则无明显延缓(109.4±1.7天(B12-SOD1)vs107.9±1.8天(SOD1)，x²＝0.015，P>0.05)，见图1A。

本发明人通过检测发病晚期小鼠的翻身情况确定小鼠的生存周期，经统计分析发现，叶酸灌胃的FA-SOD1组小鼠比生理盐水灌胃的SOD1组小鼠其平均生存周期延长了9天(137.7±1.9天(FA-SOD1)vs128.8±3.4天(SOD1)，x²＝3.95，P<0.05)，FA+B12-SOD1组比SOD1组小鼠平均生存周期延长了13天(141.4±2.9天(FA+B12-SOD1)vs128.8±3.4天(SOD1)，x²＝5.0，P<0.05)，而维生素B12单独给药仍无明显作用(132.3±1.9天(B12-SOD1)vs128.8±3.4(SOD1)，x²＝0.015，P>0.05)，见图1B。

实施例2.叶酸或叶酸和维生素B12联合用药降低小鼠血浆同型半胱氨酸水平

鉴于同型半胱氨酸对神经细胞的损伤作用，且可能在SOD1-G93A小鼠体内造成神经退行性病变，测定各组模型小鼠和野生型小鼠血浆内的Hcy水平以定量其变化显的尤为重要。

根据LC-MS/MS的结果，本发明人看到120天的SOD1组小鼠和野生型小鼠(WT)之间血浆Hcy水平存在显著的差别(6.84±0.4μmol/L(SOD1)vs3.8±0.26μmol/L(WT)，P<0.001)，SOD1组小鼠Hcy含量几乎是野生型小鼠的两倍。而叶酸用药或叶酸和维生素B12联合用药组小鼠血浆Hcy则分别下降了61％或69％(4.98±0.38μmol/L(FA-SOD1)，4.75±0.67μmol/L(FA+B12-SOD1)Vs6.84±0.4μmol/L(SOD1)，P<0.01)。维生素B12单独使用组Hcy水平则只有微弱的，无显著差异的下降(6.56±0.8μmol/L(B12-SOD1)vs6.84±0.4μmol/L(SOD1)在SOD1组，P>0.05)，见图2。

结果说明，SOD1-G93A模型小鼠血浆内Hcy水平明显高于野生型小鼠，而叶酸或叶酸和维生素B12联合用药则可以显著降低模型小鼠血浆Hcy水平。

实施例3.叶酸或叶酸和维生素B12联合用药减少脊髓运动神经元退行性病变

导致SOD1-G93A转基因小鼠发生疾病的直接因素为脊髓前角运动神经元退行性变。本实施例中，本发明人通过对各组转基因小鼠脊髓(L4-5)前角组织切片，尼氏染色，显微镜观察和计数。

结果发现，与正常对照组小鼠相比，120天SOD1转基因小鼠脊髓运动神经元数目明显下降(219.67±21.32个(SOD1)vs792±40.07个(WT)；n＝3；P<0.001)，见图3A中a和b。而叶酸或叶酸和维生素B12联合用药可以有效保护脊髓前角运动神经元，使疾病晚期(120天)小鼠脊髓前角运动神经元存活的数目明显增多，运动神经元的胞体也较生理盐水组明显增大(383.5±24.43个(FA-SOD1)，413.67±32.48个(FA+B12-SOD1)vs219.67±21.32个(SOD1)；n＝3；P<0.01)，见图3A中d和e。而维生素B12单独用药对脊髓前角运动神经元的存活则无明显的保护作用(248±24.49个(B12-SOD1)vs219.67±21.32个(SOD1)；n＝3；P>0.05)，见图3A中c)。

同时，对各组运动神经元的存活数目进行统计也得出了相应的结果，见图3B。

实施例4.叶酸或叶酸和维生素B12联合用药抑制转基因小鼠脊髓胶质细胞的激活，减少了炎症因子的分泌

据文献报道，炎症反应在ALS病情的发生发展中扮演着重要的角色，胶质细胞的激活是SOD1-G93A转基因小鼠体内炎症反应的检测标准之一。在本实施例中，本发明人使用CD11b和GFAP作为标记分别观测转基因小鼠脊髓前角小胶质细胞和星形胶质细胞的形态。

本发明人发现，120天时SOD1-G93A转基因小鼠脊髓前角胶质细胞包括小胶质细胞和星形胶质细胞被广泛激活，而叶酸尤其是叶酸和维生素B12联合用药组小鼠脊髓胶质细胞的激活得到了显著的抑制，表现为胶质细胞数目减少，尤其是激活态的胶质细胞减少显著。维生素B12单独用药组胶质细胞数目和形态的改变则不明显。结果见图4。

在本发明人的实验中还使用Western blot的方法检测五组实验小鼠脊髓组织中iNOS和TNF-α的水平。结果发现，转基因小鼠与野生型小鼠相比iNOS和TNF-α的水平明显升高，而叶酸或叶酸和维生素B12联合用药可显著降低SOD1-G93A小鼠脊髓内两种炎症因子的水平，见图5A。同时，本发明人也注意到，叶酸和维生素B12联合用药组转基因小鼠脊髓组织内iNOS和TNF-α的水平与叶酸单用组相比更低，说明联合用药对小鼠体内炎症反应的抑制效果更好，见图5C和图5D。维生素B12单独用药对小鼠脊髓两种炎症因子的释放并没有明显作用，见图5A。

实施例5.叶酸或叶酸和维生素B12联合用药影响脊髓凋亡相关蛋白的水平，减少了凋亡的发生

已有报道说明高水平的Hcy可以通过激活神经元凋亡途径导致神经元细胞的死亡。叶酸或叶酸和维生素B12联合用药均可降低转基因小鼠血浆Hcy水平，为进一步探讨其对小鼠体内凋亡水平的影响，本发明人用Western blot的方法检测了各组实验小鼠脊髓组织内凋亡相关蛋白如Bcl-2，剪切型(Cleaved)Caspase-3(即Caspase-3蛋白的活性形式)和剪切型(Cleaved)PRAP(即PRAP蛋白的活性形式)的水平。

实验结果显示，叶酸或叶酸和维生素B12联合用药与灌胃生理盐水相比，可明显降低凋亡蛋白cleaved Caspase-3和cleaved PRAP的水平，同时可显著增加抗凋亡蛋白Bcl-2的水平，见图5B。尤其是发现叶酸和维生素B12联合用药可使抗凋亡蛋白Bcl-2的水平升高，接近正常野生型小鼠的水平，而且更显著抑制了cleaved Caspase-3和cleaved PRAP的水平，这也说明了叶酸和维生素B12联合用药在SOD1-G93A转基因小鼠脊髓内有非常显著的抗凋亡作用。维生素B12单独使用则作用不明显。

统计数据也说明，叶酸或叶酸和维生素B12联合用药在模型小鼠体内可通过影响凋亡相关蛋白的表达起到显著的抗凋亡作用，且叶酸和维生素B12联合用药的效果更佳，见图5E-G。

实施例6组合物的制备和用药

本发明人配制了组合物，精密称量如下重量的各组分：

	组合物1	组合物2	组合物3
				叶酸(g)	40	60	50
维生素B12(g)	2	1	3

将按照上表组合物的配方称取组分，充分混合，与1000ml蒸馏水混合，制成液态组合物。按照实施例1的方法将各组合物给药模型小鼠，发现各组合物均可有效延长小鼠的存活时间，其中组合物1的效果最为优异。

讨论

在本发明人的实验中首次发现ALS转基因小鼠SOD1-G93A血浆中同型半胱氨酸(Hcy)的水平远远高于正常的野生型小鼠，这提示本发明人考虑使用针对性的降低Hcy的治疗方法是否能够降低SOD1-G93A小鼠体内的Hcy的水平，以及考虑这种针对性的治疗方式对SOD1-G93A转基因小鼠的病情的发生发展是否有一定的保护作用。

进而，本发明人试验了多种药物，发现叶酸或叶酸和维生素B12联合用药可以明显延缓SOD1-G93A小鼠的发病时间，同时也显著延长了转基因小鼠的生存周期。本发明人进一步研究了叶酸或叶酸和维生素B12对SOD1-G93A小鼠保护作用的机制，研究发现叶酸或叶酸和维生素B12联合用药可以保护脊髓运动神经元，明显增加120天的转基因小鼠脊髓前角运动神经元的存活数目。同时叶酸或叶酸和维生素B12联合用药可抑制小鼠脊髓内胶质细胞的激活，减少胶质细胞尤其是激活态胶质细胞的数目，显著降低炎症相关因子iNOS和TNF-α的水平。此外，叶酸或叶酸和维生素B12联合用药还可增加抗凋亡蛋白Bcl-2的水平，降低凋亡蛋白cleaved Caspase-3及cleaved PRAP的水平。本发明人的研究结果表明，叶酸或叶酸和维生素B12联合用药对ALS转基因小鼠SOD1-G93A有着非常明显的保护作用。

已报道Hcy作为一种毒性的含硫氨基酸，与帕金森病，阿尔茨海默病等神经退行性疾病的发生有着密切的关系。但是，肌萎缩侧索硬化与帕金森症或阿尔茨海默症相比，发病机制不尽相同；且确切的Hcy在ALS患者或转基因小鼠体内的水平变化或明确的Hcy与ALS发生发展的证据一直没有报道。

在小鼠的炎症反应方面，通过本发明人的实验结果观察到叶酸或叶酸和维生素B12联合用药可以明显抑制转基因小鼠脊髓前角胶质细胞的激活同时降低炎症相关蛋白iNOS和TNF-α的水平。

在本发明人的实验中还发现，叶酸或叶酸和维生素B12联合用药可以明显增加转基因小鼠脊髓组织内Bcl-2的水平，这为叶酸或叶酸和维生素B12联合用药的抗凋亡作用提供了有力的证据。cleaved Caspase-3及cleaved PRAP位于凋亡通路的下游，在SOD1-G93A小鼠脊髓运动神经元的凋亡中发挥重要作用。这些结果证实了叶酸或叶酸和维生素B12联合用药可以通过抑制SOD1-G93A小鼠体内的凋亡水平达到其对脊髓运动神经元的保护作用。

通过本发明人的实验和分析，可以确定叶酸或叶酸和维生素B12联合用药对ALS模型小鼠的发病和生存都有着显著的延长作用，且叶酸和维生素B12联合用药是非常有效的预防和治疗ALS的手段，在临床上有着良好的应用前景。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种同型半胱氨酸下调剂的用途，用于制备预防、缓解或治疗哺乳动物肌萎缩侧索硬化的组合物；

所述的同型半胱氨酸下调剂是叶酸和维生素B12的混合物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的混合物中，叶酸与维生素B12的重量比例是(5-80)∶1。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的混合物中，叶酸与维生素B12的重量比例是(10-40)∶1。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的混合物中，叶酸与维生素B12的重量比例是(15-25)∶1。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物用于抑制炎症反应或抑制细胞凋亡。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的炎症反应是炎症因子过量引起的炎症反应；或

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的炎症因子包括：诱导型一氧化氮合酶或肿瘤坏死因子-α。

8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的凋亡蛋白包括：剪切型胱冬肽酶3，或剪切型聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶。

9.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的抗凋亡蛋白是Bcl-2。

10.一种预防、缓解或治疗哺乳动物肌萎缩侧索硬化的组合物，所述的组合物含有：

有效量的同型半胱氨酸下调剂，所述的同型半胱氨酸下调剂是叶酸和维生素B12的混合物，含有：

叶酸： 5-80重量份；

维生素B12：1重量份；

以及药学上可接受的载体。