CN101657715B - 检测系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种用于检测分子缔合的系统，所述系统包括：i).第一试剂，其包括与第一报道成分偶联的受体形式的第一相互作用组；ii).第二试剂，其包括与第二报道成分偶联的第二相互作用组；iii).第三试剂，其包括受体形式的第三相互作用组；iv).调控剂，所述调控剂包括调节第三相互作用组的受体的配体；和v).检测器；其中所述第一和第二报道成分的接近产生能够由所述检测器检测的信号；其中所述第三试剂不包括这样的成分，所述成分能够产生显著干扰和/或有助于由第一和第二报道成分的接近所产生的信号的信号；其中所述第一相互作用组与所述第三相互作用组不同；并且其中所述调控剂调控所述第二相互作用组与所述第三相互作用组的缔合；以使由所述检测器监测由所述第一和第二报道成分的接近产生的信号组成对所述第一和第三相互作用组的异源-二聚化和/或寡聚化的监测，其指示所述第一和第三相互作用组的受体的缔合。

Description

检测系统及其应用
发明领域
本发明涉及一种用于检测分子缔合的系统。本发明具有检测不同分子的缔合并且由此检测异源-二聚体和/或异源-寡聚体的形成的具体应用。
背景技术
将在蛋白质缔合的情形中讨论本发明的背景。然而，本发明的范围不应该理解为受限于此。
在细胞中蛋白不以分离形式起作用，而是以稳定的或瞬时的复合物形式起作用，蛋白-蛋白相互作用是蛋白功能的重要决定因素(Auerbach等，(2002)，蛋白质组学(Proteomics)，2，611-623)。此外，蛋白和蛋白复合物与其它细胞成分如DNA、RNA和小分子相互作用。理解参与这些相互作用的个体蛋白以及它们的相互作用二者对于更好地理解生物学过程是重要的。
存在一些工具，用来在体外、在细胞表面通过交联的潜力共免疫沉淀、或在体内证明蛋白-蛋白相互作用，其包括，例如，荧光RET的共振能量转移(RET)技术(FRET)和生物发光RET的共振能量转移(RET)技术(BRET)。
G-蛋白偶联受体(GPCRs)的相互作用代表蛋白缔合的生理学和潜在药学相关性、且特别是异源-二聚体和/或异源-寡聚体的相关性的极佳实例。如Milligan(Milligan，(2006)，今日药物开发(Drug Discovery Today)，11，541-549)所观察的，同源-二聚化和同源-寡聚化对于药物开发工业具有有限的启示，而“GCPR异源-二聚体和异源-寡聚体的差别性药理学、功能和调控提示选择性靶向不同组织中的GPCRs的方式，并且暗示一些药物试剂的功能机制在体内可能不同于由依赖于单一GPCR的异源表达的简单配体筛选程序所预测的功能机制”。
共免疫沉淀已经用来鉴定GPCR异源二聚体(Jordan BA和Devi LA(1999)G-蛋白-偶联受体异源二聚化调控受体功能(G-protein-coupledreceptor heterodimerization modulates receptor function)自然(Nature)399，697700)。然而，共免疫沉淀不能区分组成型和随机型缔合。特别地，存在对在细胞裂解和溶解后发生的假象(artefactual)聚集的关注(KroegerKM等(2003)神经内分泌途径中的G-蛋白偶联受体寡聚化(G-proteincoupled receptor oligomerization in neuroendocrine pathways).神经内分泌学前沿(Front.Neuroendocrinol.)24，254-278)。此外，共免疫沉淀不适用于自动化或高通量筛选。
荧光共振能量转移(FRET)能够检测体内蛋白-蛋白相互作用(Forster，(1948)，物理学年刊(Ann.Phys.)2，57-75)。在克隆了绿色荧光蛋白(GFP)及其具有不同光谱特征的突变变体时，该技术变得特别具有吸引性并且适用于在活细胞中进行的测定法。这允许通过融合编码DNA序列而将GFP及其变体遗传附着到任何靶蛋白上(Heim等，(1994)，PNAS.USA.91，12501-12504)。FRET能够监测在细胞内任何位置发生的相互作用。FRET可以在任何细胞类型(哺乳动物、酵母、细菌等)或无细胞系统中进行确定。其可以通过荧光光谱法、荧光显微镜、和荧光激活的细胞分选法(FACS)进行检测。
生物发光共振能量转移(BRET)是已经开发来研究体内蛋白-蛋白相互作用的另一种技术(Xu等，(1999)，PNAS.USA，96，151-156；Eidne等，(2002)，内分泌学和新陈代谢趋势(Trends Endocrin.Metabol.)13，415-421)。与FRET相同，BRET允许在活细胞或无细胞系统内检测，并且其不局限于特定的细胞区室。
在使用FRET或BRET评估标记的蛋白之间的直接相互作用时，很难区分背景信号与由组成型相互作用导致的信号。此外，由于RET依赖于能量供体和受体之间的相对方向和距离，相互作用亲和性不直接与信号强度相关。
已经提议将‘饱和’BRET[Mercier JF，Salahpour A，Angers S，Breit A和Bouvier M(2002)通过生物发光共振能量转移定量评估β1-和β2-肾上腺素能受体同源-和异源二聚化(Quantitative assessment of beta 1-and beta2-adrenergic receptor homo-and heterodimerization by bioluminescenceresonance energy transfer).生物化学杂志(J Biol Chem)277，44925-44931.]作为区分背景和组成型信号的方法，然而，为了产生饱和曲线，这需要相对于供体-标记的蛋白表达增加浓度的受体-标记的蛋白，并且绝不能是高通量的。
前述讨论仅意欲促使理解本发明。其不应该解释为以任何方式限制本发明下述描述的范围或应用，其也不应该解释为承认所讨论的任何信息属于在优先权日时相关领域技术人员的公知常识。
发明内容
本发明人已经开发了能够克服或至少减少在蛋白质缔合分析中鉴定的一些问题的检测系统。
最重要地，使用依赖于外部调控的信号，本发明的系统能够鉴定在不同分子之间产生的潜在的组成型缔合(即，异源二聚体)以及多个拷贝的相同分子产生的那些(即，寡聚体)，由此赋予区分组成型缔合和随机性缔合的能力。
在本发明的第一方面中，提供一种用于检测分子缔合的系统，所述系统包括：
i).第一试剂，其包括与第一报道成分偶联的受体形式的第一相互作用组；
ii).第二试剂，其包括与第二报道成分偶联的第二相互作用组；
iii).第三试剂，其包括受体形式的第三相互作用组；
iv).调控剂，所述调控剂包括调节第三相互作用组的受体的配体；和
v).检测器；
其中所述第一和第二报道成分的接近产生能够由所述检测器检测的信号；其中所述第三试剂不包括这样的成分，所述成分能够产生显著干扰和/或有助于由第一和第二报道成分的接近所产生的信号的信号；其中所述第一相互作用组与所述第三相互作用组不同并且其中所述调控剂调控所述第二相互作用组与所述第三相互作用组的缔合；以使由所述检测器监测由所述第一和第二报道成分的接近产生的信号组成对所述第一和第三相互作用组的异源-二聚化和/或寡聚化的监测，其指示所述第一和第三相互作用组的受体的缔合。
由于所述第三试剂不包括这样的成分，所述成分能够产生显著干扰和/或有助于由第一和第二报道成分的接近所产生的信号的信号，所以促进了由第一和第二报道成分的接近所产生的信号的检测。在一些系统中，诸如当第一和第三相互作用组以低水平表达时，和/或当所选择的第一和第二报道成分的组合产生弱信号时，根据上述本发明促进对信号的检测可以使得测定可行，或甚至更有利，易于高通量筛选。
所述系统还可以包括报道成分引发物，其中仅在存在所述报道成分引发物的条件下，所述第一和第二报道成分的接近产生能够由所述检测器检测的信号。
在本发明的第二方面中，提供一种检测分子缔合的方法，所述方法包括下列步骤：
i)提供第一试剂，所述第一试剂包括与第一报道成分偶联的受体形式的第一相互作用组；
ii)提供第二试剂，所述第二试剂包括与第二报道成分偶联的第二相互作用组；
iii)提供第三试剂，所述第三试剂包括受体形式的第三相互作用组，其中所述第一相互作用组与所述第三相互作用组不同；
iv).提供调控剂，所述调控剂包括调节第三相互作用组的受体的配体；
其中；所述第一和第二报道成分的接近产生信号；其中所述第三试剂不包括这样的成分，所述成分能够产生显著干扰和/或有助于由第一和第二报道成分的接近所产生的信号的信号；并且其中所述调控剂调控所述第二相互作用组与所述第三相互作用组的缔合；然后
v).检测和/或监测由所述第一和第二报道成分的接近产生的任何信号；
从而通过所述检测器监测由所述第一和第二报道成分的接近产生的信号组成监测对所述第一和第三相互作用组的异源-二聚化和/或寡聚化的监测，其指示所述第一和第三相互作用组的受体的缔合。
在检测和/或监测由所述第一和第二报道成分的接近产生的任何信号的步骤之前，所述方法还可以包括提供报道成分引发物的步骤，其中仅在存在所述报道成分引发物的条件下，所述第一和第二报道成分的接近产生能够由检测器检测的信号。
在本发明的一种形式中，提供报道成分引发物和提供调控剂的步骤，在提供第一、第二和第三试剂的步骤之后发生。
在本发明的特别有利的形式中，所述第一、第二和第三试剂通过在向其中引入调控剂的细胞中共表达的方式提供。
在第三方面中，本发明提供一种用于确定当第二蛋白与第一蛋白缔合时，测试化合物是否与第二蛋白相互作用和/或其程度的方法，所述第一蛋白与所述第二蛋白不同，所述方法包括下列步骤：
a).使所述测试化合物与系统接触，所述系统包括：
i).第一试剂，所述第一试剂包括与第一报道成分偶联的受体形式的第一蛋白；
ii)第二试剂，所述第二试剂包括与第二报道成分偶联的相互作用组；
iii)第三试剂，所述第三试剂包括受体形式的第二蛋白；
其中所述第一和第二报道成分的接近产生信号；其中所述第三试剂不包括这样的成分，所述成分能够产生显著干扰和/或有助于由第一和第二报道成分的接近所产生的信号的信号；并且其中调控剂调控所述相互作用组与所述第二蛋白的缔合；
b).确定信号，作为当所述第二蛋白与所述第一蛋白缔合时，所述测试化合物是否与所述第二蛋白相互作用和/或其程度的确定。
在一个实施方案中，第二蛋白是受体，并且本发明的第三方面包括用于确定当第二蛋白与第一蛋白缔合时，测试化合物是否是第二蛋白的激动剂的方法，并且确定信号作为当所述第二蛋白与不同于所述第二蛋白的第一蛋白缔合时，所述测试化合物是否与第二蛋白相互作用和/或相互作用的程度的确定的步骤更具体地包括这样的步骤，即，检测信号的增加，作为当所述第二蛋白与第一蛋白缔合时，所述测试化合物是否是第二蛋白的激动剂和/或其程度的确定。
所述第一蛋白也可以是不同于所述第二蛋白的受体。
在一个实施方案中，第二蛋白是受体，并且本发明的第三方面包括用于确定当第二蛋白与第一蛋白缔合时，测试化合物是否是第二蛋白的拮抗剂或部分激动剂和/或其程度的方法，所述方法包括下列步骤：
a).使所述测试化合物与系统接触，所述系统包括：
i).第一试剂，所述第一试剂包括与第一报道成分偶联的受体形式的第一蛋白；
ii)第二试剂，所述第二试剂包括与第二报道成分偶联的相互作用组；
iii)第三试剂，所述第三试剂包括受体形式的第二蛋白，其中所述第二蛋白不同于所述第一蛋白；
iv).所述第二蛋白的激动剂；
其中所述第一和第二报道成分的接近产生信号；其中所述第三试剂不包括这样的成分，所述成分能够产生显著干扰和/或有助于由第一和第二报道成分的接近所产生的信号的信号；并且其中调控剂调控所述相互作用组与所述第二蛋白的缔合；
b).检测信号的减少，作为当第二蛋白与第一蛋白缔合时，测试化合物是否是所述第二蛋白的拮抗剂或部分激动剂和/或其程度的确定。
所述第一蛋白也可以是不同于所述第二蛋白的受体。
在一个实施方案中，第二蛋白是组成型活性受体，并且本发明的第三方面包括一种用于确定当所述第二蛋白与不同于所述第二蛋白的第一蛋白缔合时，测试化合物是否是所述第二蛋白的逆激动剂和/或其程度的方法，并且确定信号作为当所述第二蛋白与第一蛋白缔合时所述测试化合物是否与第二蛋白相互作用和/或其程度的确定的步骤更具体地包括这样的步骤，即，检测信号的减少，作为当所述第二蛋白与第一蛋白缔合时，所述测试化合物是否是所述第二蛋白的逆激动剂的确定。
在一个实施方案中，其中所述第一和第二蛋白均为受体，本发明包括用于针对第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体选择性活性筛选测试化合物的方法，所述方法包括下列步骤：
a)确定当第二蛋白与第一蛋白缔合时，测试化合物是否与所述第二蛋白相互作用、和/或其程度，所述第二蛋白不同于所述第一蛋白；和
b)如果在所述第二蛋白与第一蛋白缔合的同时，所述测试化合物与所述第二蛋白相互作用，则确定在不存在所述第一蛋白的条件下，所述测试化合物是否与所述第二蛋白相互作用、或其程度；
从而在所述第二蛋白与所述第一蛋白缔合的同时与所述第二蛋白相互作用时表现出更大亲和性和/或潜力和/或功效的测试化合物针对所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体是选择性的。
在一个实施方案中，其中所述第一和第二蛋白均为受体，本发明包括用于针对第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体选择性拮抗性或部分激动性筛选测试化合物的方法，其中所述第一和第二蛋白都是受体，所述方法包括下列步骤：
a).通过使所述测试化合物与系统接触，而确定所述测试化合物是否是所述第一蛋白/第二蛋白异源二聚体/-寡聚体的拮抗剂或部分激动剂、和/或其程度，所述系统包括：
i).第一试剂，所述第一试剂包括与第一报道成分偶联的第一蛋白；
ii)第二试剂，所述第二试剂包括与第二报道成分偶联的相互作用组；
iii).第三试剂，所述第三试剂包括第二蛋白，其中所述第二蛋白不同于所述第一蛋白；
iv).下列各项的激动剂：所述第一蛋白、所述第二蛋白和/或所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体；
其中所述第一和第二报道成分的接近产生信号；其中所述第三试剂不包括这样的成分，所述成分能够产生显著干扰和/或有助于由第一和第二报道成分的接近所产生的信号的信号；并且其中调控剂调控所述相互作用组与所述第二蛋白的缔合；
b).检测信号的减少，作为所述测试化合物是否是所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体的拮抗剂或部分激动剂和/或其程度的确定；
c).如果所述测试化合物是所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体的拮抗剂或部分激动剂，则确定在不存在第一蛋白条件下所述测试化合物是否与第二蛋白相互作用、或其程度，以及在不存在第二蛋白的条件下所述测试化合物是否与第一蛋白相互作用、或其程度；从而在与所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体相互作用时表现出更大的拮抗性或部分激动性特性的测试化合物针对所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体是选择性的。
在一个实施方案中，其中所述第一和第二蛋白均为受体，提供用于针对第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体的选择性拮抗性或部分激动性筛选测试化合物的方法，所述方法包括下列步骤：
a)通过使所述测试化合物与系统接触，而确定所述测试化合物是否是第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体的拮抗剂或部分激动剂、和/或其程度，所述系统包括：
i).第一试剂，所述第一试剂包括与第一报道成分偶联的第二蛋白；
ii)第二试剂，所述第二试剂包括与第二报道成分偶联的相互作用组；
iii).第三试剂，所述第三试剂包括第一蛋白，其中所述第二蛋白不同于所述第一蛋白；
iv).下列各项的激动剂：第二蛋白，第一蛋白和/或第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体；
其中所述第一和第二报道成分的接近产生信号；其中所述第三试剂不包括这样的成分，所述成分能够产生显著干扰和/或有助于由第一和第二报道成分的接近所产生的信号的信号；并且其中调控剂调控所述相互作用组与所述第一蛋白的缔合；
b)检测信号的减少，作为所述测试化合物是否是第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体的拮抗剂或部分激动剂和/或其程度的确定；
c)如果所述测试化合物是所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体的拮抗剂或部分激动剂，则确定在不存在第二蛋白的条件下所述测试化合物是否是所述第一蛋白的拮抗剂或部分激动剂、或其程度，以及在不存在第一蛋白的条件下所述测试化合物是否是
所述第二蛋白的拮抗剂或部分激动剂、或其程度；从而在与所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体相互作用时表现出更大拮抗性或部分激动性特性的测试化合物针对所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体是选择性的。
在一个实施方案中，其中所述第一蛋白和第二蛋白均为受体，提供用于针对第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体选择性逆激动性筛选测试化合物的方法，其中所述第一和第二蛋白都是受体，所述方法包括下列步骤：
a)通过使所述测试化合物与系统接触，而确定所述测试化合物是否是第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体的逆激动剂、和/或其程度，所述系统包括：
i).第一试剂，所述第一试剂包括与第一报道成分偶联的第一蛋白；
ii).第二试剂，所述第二试剂包括与第二报道成分偶联的相互作用组；
iii).第三试剂，所述第三试剂包括组成型活性的第二蛋白，其中所述第二蛋白不同于所述第一蛋白；
其中所述第一和第二报道成分的接近产生信号；其中所述第三试剂不包括这样的成分，所述成分能够产生显著干扰和/或有助于由第一和第二报道成分的接近所产生的信号的信号；并且其中调控剂调控所述相互作用组与所述第二蛋白的缔合；
b)检测信号的减少，作为所述测试化合物是否是所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体的逆激动剂和/或其程度的确定；
c)如果所述测试化合物是所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体的逆激动剂，则确定在不存在所述第二蛋白的条件下所述测试化合物是否是所述第一蛋白的逆激动剂或其程度，以及在不存在所述第一蛋白的条件下所述测试化合物是否是所述第二蛋白的逆激动剂或其程度；从而在与所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体相互作用时表现出更大逆激动性特性的测试化合物
针对所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体是选择性的。
在一个实施方案中，其中所述第一蛋白和第二蛋白均为受体，提供用于针对第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体选择性逆激动性筛选测试化合物的方法，所述方法包括下列步骤：
a)通过使所述测试化合物与系统接触，而确定所述测试化合物是否是第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体的逆激动剂、和/或其程度，所述系统包括：
i).第一试剂，所述第一试剂包括与第一报道成分偶联的第二蛋白；
ii)第二试剂，所述第二试剂包括与第二报道成分偶联的相互作用组；
iii).第三试剂，所述第三试剂包括组成型活性的第一蛋白，其中所述第一蛋白不同于所述第二蛋白；
其中所述第一和第二报道成分的接近产生信号；其中所述第三试剂不包括这样的成分，所述成分能够产生显著干扰和/或有助于由第一和第二报道成分的接近所产生的信号的信号；并且其中调控剂调控所述相互作用组与所述第一蛋白的缔合；
b)检测信号的减少，作为所述测试化合物是否是第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体的逆激动剂和/或其程度的确定；
c)如果所述测试化合物是所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体的逆激动剂，则确定在不存在第一蛋白的条件下所述测试化合物是否是所述第二蛋白的逆激动剂、或其程度，以及在不存在第二蛋白的条件下所述测试化合物是否是所述第一蛋白的逆激动剂、或其程度；从而在与所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体相互作用时表现出更大逆激动性特性的测试化合物针对所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体是选择性的。
在相关方面，本发明提供用于针对第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体选择性拮抗性或部分激动性来筛选测试化合物的方法，其中，所述第一蛋白和第二蛋白均为受体，所述方法包括下列步骤：
a).通过使所述测试化合物与系统接触，而确定所述测试化合物是否是所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体的拮抗剂或部分激动剂和/或其程度，所述系统包括：
i).第一试剂，其包括与第一报道成分偶联的所述第一蛋白；
ii).第二试剂，其包括与第二报道成分偶联的相互作用组；
iii).第三试剂，其包括所述第二蛋白，其中所述第二蛋白与所述第一蛋白不同；
iv).所述第一蛋白、所述第二蛋白和/或所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体的激动剂；
其中所述第一和第二报道成分的接近产生信号；其中所述第三试剂不包括这样的成分，所述成分能够产生显著干扰和/或有助于由第一和第二报道成分的接近所产生的信号的信号；并且其中调控剂调控所述相互作用组与所述第一蛋白的缔合；
b)检测信号的减少，作为所述测试化合物是否是所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体的拮抗剂或部分激动剂和/或其程度的确定；
c)如果所述测试化合物是所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体的拮抗剂或部分激动剂，则确定在不存在所述第一蛋白的条件下所述测试化合物与所述第二蛋白是否相互作用或其程度，以及在不存在所述第二蛋白的条件下所述测试化合物与所述第一蛋白是否相互作用或其程度；从而在与所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体相互作用时表现出更大拮抗性或部分激动性特性的测试化合物针对所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体是选择性的。
在相关方面，本发明提供用于针对第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体选择性逆激动性来筛选测试化合物的方法，其中所述第一蛋白和所述第二蛋白都是受体，所述方法包括下列步骤：
a)通过使所述测试化合物与系统接触，而确定所述测试化合物是否是所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体的逆激动剂和/或其程度，所述系统包括：
i).第一试剂，所述第一试剂包括与第一报道成分偶联的第一蛋白；
ii).第二试剂，所述第二试剂包括与第二报道成分偶联的相互作用组；
iii).第三试剂，所述第三试剂包括组成型活性的第二蛋白；
其中所述第一和第二报道成分的接近产生信号；其中所述第三试剂不包括这样的成分，所述成分能够产生显著干扰和/或有助于由第一和第二报道成分的接近所产生的信号的信号；并且其中调控剂调控所述相互作用组与所述第二蛋白的缔合；
b)检测信号的减少，作为所述测试化合物是否是所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体的逆激动剂和/或其程度的确定；
c)如果所述测试化合物是所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体的逆激动剂，则确定在不存在所述第二蛋白的条件下所述测试化合物是否是所述第一蛋白的逆激动剂或其程度，以及在不存在所述第一蛋白的条件下所述测试化合物是否是所述第二蛋白的逆激动剂或其程度；从而在与所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体相互作用时表现出更大逆激动性特性的测试化合物针对所述第一蛋白/第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体是选择性的。
在本发明的第四方面，提供用于检测分子缔合的试剂盒，所述试剂盒包括：
i).第一试剂，其包括与第一报道成分偶联的受体形式的第一相互作用组；
ii)第二试剂，其包括与第二报道成分偶联的第二相互作用组；
iii).第三试剂，其包括受体形式的第三相互作用组；
iv).调控剂，所述调控剂包括调节第三试剂的受体的配体；和其中所述第一和第二报道成分的接近产生能够进行检测的信号；其中所述第三试剂不包括这样的成分，所述成分能够产生显著干扰和/或有助于由第一和第二报道成分的接近所产生的信号的信号；其中所述第一相互作用组不同于所述第三相互作用组；并且其中所述调控剂调控所述第二相互作用组与所述第三相互作用组的缔合。
在本发明的一种形式中，所述试剂盒还包括报道成分引发物，并且仅在存在所述报道成分引发物的条件下，所述第一和第二报道成分的接近产生能够进行检测的信号。
在本发明的一种形式中，所述调控剂增加第二相互作用组与第三相互作用组缔合的倾向，从而通过检测器检测由第一和第二报道成分接近产生的信号组成对所述第一试剂与第三试剂的缔合的检测。
应该理解，所述调控剂可以与第一、第二或第三相互作用组的任一种相互作用，或同时与第一和第三相互作用组二者相互作用，或同时与第二和第三相互作用组相互作用，以调控第二相互作用组与第三相互作用组的缔合。
在本发明的一种备选形式中，所述调控剂降低第二相互作用组与第三相互作用组缔合的倾向，从而通过检测器检测由所述第一和第二报道成分的接近产生的信号的减少组成对第一和第三试剂解离的检测。
在本发明的优选形式中，所述第三试剂选自下组：受体、离子通道、酶、载体、转运蛋白、膜内在蛋白质、细胞骨架蛋白、黏附分子、信号传导蛋白、支架蛋白、辅助蛋白、运输蛋白、转录因子、核辅因子和核酸分子，如下文所定义。
在本发明的优选形式中，所述调控剂是配体或酶。
在本发明的优选形式中，所述第三试剂通过在细胞内表达而产生。在第三试剂通过在细胞内表达产生的情形中，本发明的方法可以在全细胞、细胞级分中或在不含细胞的系统中进行。
在本发明的特别有利的实施方案中，第一和第三相互作用组以受体形式提供，并且调控剂以调控所述第三相互作用组的受体的配体的形式提供，从而所述调控剂对由第一和第二报道成分的接近产生的信号的调控是所述第一和第三相互作用组的受体的缔合的指示。
在本发明的第五方面中，提供用于关于针对第一蛋白和第二蛋白的异源二聚体的选择活性筛选测试化合物的方法，所述方法包括下列步骤：
a).使处于增加浓度的所述测试化合物与系统接触，所述系统包括：
i).第一试剂，所述第一试剂包括与第一报道成分偶联的受体形式的第一蛋白；
ii).第二试剂，所述第二试剂包括与第二报道成分偶联的相互作用组；
iii).第三试剂，所述第三试剂包括第二蛋白，其中所述第二蛋白不同于所述第一蛋白；
其中所述第一和第二报道成分的接近产生信号；其中所述第三试剂不包括这样的成分，所述成分能够产生显著干扰和/或有助于由第一和第二报道成分的接近所产生的信号的信号；并且其中调控剂调控所述相互作用组与所述第二蛋白的缔合；
b).确定信号，作为处于每种浓度的所述测试化合物是否调控所述相互作用组与第二蛋白的所述缔合的确定，以产生剂量-响应曲线；
c).确定所述剂量-响应曲线的Hill斜率(Hill slope)，其中超过1的Hill斜率表示所述测试化合物与异源-二聚体相互作用。
在本发明的第六方面中，提供通过本发明的系统、方法或试剂盒中的任一种鉴定的第一蛋白-第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体。
在本发明的第七方面中，提供通过本发明的系统、方法或试剂盒中的任一种鉴定的异源-二聚体或异源-寡聚体受体，其包括与至少一个第二受体亚基缔合的至少一个第一受体亚基。
在本发明的第八方面中，提供通过施用治疗有效量的第二受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂而治疗患有第一受体-相关疾病的患者的方法，其中所述第一和第二受体形成通过本发明的系统、方法或试剂盒中的任一种鉴定的异源-二聚体/-寡聚体。
在一个实施方案中，第二受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂与第一受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂共同施用。
在本发明的第九方面中，提供通过施用治疗有效量的第一受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂而治疗患有第二受体-相关的疾病的患者的方法，其中所述第一和第二受体形成通过本发明的系统、方法或试剂盒中的任一种鉴定的异源-二聚体/-寡聚体。
在一个实施方案中，第一受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂与第二受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂共同施用。
在本发明的第十方面中，提供制备用于治疗患有第一受体相关的疾病的患者的药物的方法，所述方法包括使用治疗有效量的第二受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂，其中第一和第二受体形成通过本发明的系统、方法或试剂盒中的任一种鉴定的异源-二聚体/-寡聚体。
所述药物还可以包含第一受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂。
在本发明的第十一方面中，提供制备用于治疗患有第二受体相关的疾病的患者的药物的方法，所述方法包括使用治疗有效量的第一受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂，其中第一和第二受体形成通过本发明的系统、方法或试剂盒中的任一种鉴定的异源-二聚体/-寡聚体。
所述药物还可以包含第二受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂。
在本发明的第十二方面中，提供通过施用治疗有效量的选择性第二受体激动剂、拮抗剂或逆激动剂结合剂、或其片段而治疗患有第一受体相关疾病的患者的方法，其中第一受体和第二受体形成通过前述权利要求的系统、方法或试剂盒中的任一种鉴定的异源-二聚体/-寡聚体。
所述选择性第二受体激动剂、拮抗剂或逆激动剂结合剂可以是抗体，包括人源化抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR-移植的抗体(CDR-grafted antibody)和/或抗-独特型抗体。
在本发明的第十三方面中，提供通过施用治疗有效量的选择性第一受体激动剂、拮抗剂或逆激动剂结合剂、或其片段而治疗患有第二受体相关疾病的患者的方法，其中第一受体和第二受体形成通过前述权利要求的系统、方法或试剂盒中的任一种鉴定的异源-二聚体/-寡聚体。
所述选择性第一受体激动剂、拮抗剂或逆激动剂结合剂可以是抗体，包括人源化抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR-移植的抗体和/或抗-独特型抗体。
在本发明的第十四方面中，提供通过施用治疗有效量的选择性第一受体激动剂、拮抗剂或逆激动剂结合剂、或其片段而治疗患有第二受体相关疾病的患者的方法，其中第一受体和第二受体形成通过前述权利要求的系统、方法或试剂盒中的任一种鉴定的异源-二聚体/-寡聚体。
所述选择性第一受体激动剂、拮抗剂或逆激动剂结合剂可以是抗体，包括人源化抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR-移植的抗体和/或抗-独特型抗体。
在本发明的第十五方面中，提供在第二蛋白与第一蛋白缔合时，通过本发明的方法鉴定的第二蛋白的激动剂。
在本发明的第十六方面中，提供在第二蛋白与第一蛋白缔合时，通过本发明的方法鉴定的第二蛋白的拮抗剂或部分激动剂。
在本发明的第十七方面中，提供在第二蛋白与第一蛋白缔合时，通过本发明的方法鉴定的第二蛋白的逆激动剂。
在本发明的第十八方面中，提供通过本发明的方法鉴定的第一蛋白-第二蛋白异源-二聚体/-寡聚体的选择性激动剂和/或拮抗剂和/或逆激动剂。
附图简述
图1显示形成用于检测分子缔合的系统的基础的试剂的组成：第一试剂包括与第一报道成分偶联的第一相互作用组；第二试剂包括与第二报道成分偶联的第二相互作用组；并且第三试剂包括第三相互作用组。
图2显示调控剂的施用怎样调控第二相互作用组与第三相互作用组的缔合，优选地通过与所述第三相互作用组相互作用，单独地、或同时与所述第一相互作用组相互作用。
图3显示如果第一和第三相互作用组缔合，对第二和第三相互作用组的缔合的调控因此调控第一和第二报道成分的接近，由此调控能够由检测器检测的信号。因此，通过检测器监测由第一和第二报道成分的接近产生的信号组成对第一和第三试剂的缔合的监测。如果第一和第三相互作用组不缔合，第一和第二报道成分将在空间上保持分离，并且不可能产生可检测的信号。
图4显示促甲状腺素释放激素受体(TRHR)作为IG1，Rluc作为RC1，β-抑制蛋白2(barr2)作为IG2，Venus作为RC2和一系列不同GPCRs作为IG3。
在用它们各自的配体的每一种处理后，在瞬时共表达TRHR/Rluc和barr2/Venus与pcDNA3，食欲肽受体2(OxR2)，CXC趋化因子受体2(CXCR2)，血凝素表位-标记的黑皮质素受体3或4(HA-MC3R或HA-MC4R)，或多巴胺D2受体长形式(D2LR)或短形式(D2SR)的HEK293细胞上，在37C进行eBRET测量。对于每种受体的不同配体处理(10-6M)为：促甲状腺素释放激素(TRH)用于TRHR/Rluc(与pcDNA3)；食欲肽A(OxA)用于OXR2；白介素-8(IL-8)用于CXCR2；α-促黑激素(a-MSH)用于HA-MC3R，HA-MC4R；以及溴麦角环肽(BROM)用于D2LR和D2SR。
图5显示促甲状腺素释放激素受体(TRHR)作为IG1，Rluc作为RC1，β-抑制蛋白1(barr1)或β-抑制蛋白2(barr2)作为IG2，EGFP作为RC2并且OxR2作为IG3。在瞬时共表达TRHR/Rluc和EGFP/barr1或EGFP/barr2与pcDNA3或OXR2的HEK293细胞上在37C进行eBRET测量。配体处理为仅用OxA或TRH或者OxA和TRH二者组合。磷酸缓冲盐溶液(PBS)用作赋形剂对照。
图6显示促甲状腺素释放激素受体(TRHR)作为IG1，Rluc作为RC1，β-抑制蛋白2(barr2)作为IG2，Venus作为RC2并且OxR1或OxR2作为IG3。在HEK293细胞上在37C进行eBRET测量，所述HEK293细胞在用10-6MOxR1-选择性拮抗剂SB-334867-A预处理约40分钟，并且然后加入10-6MOxA(IG3配体；调控剂)或10-6M TRH(IG1配体)，或二者后，瞬时共表达TRHR/Rluc和barr2/Venus与pcDNA3，OxR1或OxR2。在未用拮抗剂预温育的情形中，将细胞用PBS替代处理相同量的时间。
图7显示促甲状腺素释放激素受体(TRHR)作为IG1，Rluc作为RC1，β-抑制蛋白1(barr1)或β-抑制蛋白2(barr2)作为IG2，EGFP作为RC2以及血凝素表位-标记的OxR2(HA-OxR2)作为IG3。在瞬时共表达TRHR/Rluc和EGFP/barr1或EGFP/barr2与pcDNA3或HA-OxR2的HEK293细胞上在37C进行eBRET测量。配体处理为仅为OxA或TRH。磷酸缓冲盐溶液(PBS)用作赋形剂对照。
图8显示促甲状腺素释放激素受体(TRHR)作为IG1，Rluc作为RC1，β-抑制蛋白1(barr1)或β-抑制蛋白1不依赖磷酸化作用的突变体R169E(barr1R169E)作为IG2，EGFP作为RC2且OxR2作为IG3。在瞬时共表达TRHR/Rluc和EGFP/barr1或EGFP/barr1R169E与pcDNA3或OxR2的HEK293细胞上，在37C进行eBRET测量。配体处理为仅用OxA或TRH。磷酸缓冲盐溶液(PBS)用作赋形剂对照。
图9显示在氨基酸335截短的促甲状腺素释放激素受体(TRHR335)作为IG1，Rluc作为RC1，β-抑制蛋白1(barr1)作为IG2，EGFP作为RC2且OxR2或TRHR作为IG3。在瞬时共表达TRHR335/Rluc和EGFP/barr1与OxR2或TRHR的HEK293细胞上，在37C进行eBRET测量。配体处理为仅用OxA或TRH。
图10显示关于促甲状腺素释放激素受体(TRHR)作为IGl，Rluc作为RC1，β-抑制蛋白2(barr2)作为IG2，Venus作为RC2且不存在IG3的剂量-响应曲线。使用增加的TRH剂量，在瞬时共表达TRHR/Rluc，barr2/Venus和pcDNA3的HEK293细胞上，在37C进行BRET测量。使用Prism(GraphPad)绘制S型剂量响应曲线，假定Hill斜率为1或允许可变的斜率。在该图的表格中包括关于可变斜率曲线的EC50和Hill斜率值。
图11显示关于OxR2作为IG1，Rluc作为RC1，barr2作为IG2，Venus作为RC2且不存在IG3的剂量-响应曲线。使用增加的OxA剂量，在瞬时共表达OxR2/Rluc，barr2/Venus和pcDNA3的HEK293细胞上在37C进行BRET测量。使用Prism(GraphPad)绘制S型剂量响应曲线，假定Hill斜率为1或允许可变的斜率。在该图的表格中包括关于可变斜率曲线的EC50和Hill斜率值。
图12显示关于促甲状腺素释放激素受体(TRHR)作为IG1，Rluc作为RC1，β-抑制蛋白2(barr2)作为IG2，Venus作为RC2和OxR2作为IG3的剂量-响应曲线。使用增加的OxA剂量，在瞬时共表达TRHR/Rluc，barr2/Venus和OxR2的HEK293细胞上，在37C进行BRET测量。使用Prism(GraphPad)绘制S型剂量响应曲线，假定Hill斜率为1或允许可变的斜率。在该图的表格中包括关于可变斜率曲线的EC50和Hill斜率值。显示使用腔肠素h(coelenterazine h)和EnduRen作为两种形式的Rluc底物(报道成分引发物)产生的曲线。
图13显示在存在或不存在作为IG3的OxR2的条件下，关于TRHR作为IG1，Rluc作为RC1，barr1作为IG2，EGFP作为RC2的剂量-响应曲线。使用增加的TRH剂量，在不存在OxR2的条件下，在瞬时共表达TRHR/Rluc和EGFP/barr1的HEK293细胞上，以及使用增加的OxA剂量，用或不用10-6M TRH的条件下，在瞬时共表达TRHR/Rluc和EGFP/barr1与OxR2的HEK293细胞上，在37C进行BRET测量。还绘制通过将使用10-6M TRH产生的配体-诱导的信号(来自TRH：TRHR/Rluc+EGFP/barr1曲线)与关于OxA：TRHR/Rluc+EGFP/barr1+OxR2曲线产生的每一个点相加而数学产生的曲线(TRHR/Rluc+EGFP/barr1+OxR2：TRH(10-6M)+OxA：计算的数据)。
图14显示在存在或不存在作为IG3的OxR2的条件下，关于TRHR作为IG1，Rluc作为RC1，barr1作为IG2，EGFP作为RC2的剂量-响应曲线。使用增加的TRH剂量，在不存在OxR2的条件下，在瞬时共表达TRHR/Rluc和EGFP/barr1的HEK293细胞上，以及使用增加的OxA剂量，或增加的TRH剂量加10-6M OxA，在瞬时共表达TRHR/Rluc和EGFP/barr1与OxR2的HEK293细胞上，在37C进行BRET测量。还绘制通过将使用10-6M OxA产生的配体-诱导的信号(来自OxA：TRHR/Rluc+EGFP/barr1+OxR2曲线)与关于TRH：TRHR/Rluc+EGFP/barr1曲线产生的每一点相加而数学产生的曲线(TRHR/Rluc+EGFP/barr1+OxR2：TRH+OxA(10-6M)：计算的数据)。
图15显示关于每种受体组合(IG1和IG3；在83分钟内捕获的数据)随时间的累积eBRET读数。TRHR为IG1，Rluc为RC1，barr1为IG2，EGFP为RC2且OxR2为IG3。对于每次实验，转染相同量的EGFP/barr1(IG2-RC2)。以恒定量(0.1μg DNA/孔)转染TRHR/Rluc(IG1-RC1)，而以变化量的DNA(0，0.01，0.05，0.1，0.5，0.7μg DNA/孔)转染OxR2(IG3)。在向每个孔中加入10-6M OxA(调控剂)后，在HEK293细胞上在37C进行eBRET测量。仅当表达OxR2(IG3)时检测到信号(在0μg OxR2没有记录到任何信号)。
图16显示关于TRHR作为IG1，Rluc作为RC1，barr2作为IG2，Venus作为RC2且OxR2作为IG3的剂量响应曲线。在96-孔或384-孔微量培养板上，使用增加的OxA剂量，在瞬时共表达TRHR/Rluc，barr2/Venus和OxR2的HEK293细胞上在37C进行BRET测量。
图17显示OxR2作为IG1，Rluc8作为RC1，β-抑制蛋白2(barr2)作为IG2，Venus作为RC2和血凝素表位-标记的TRHR(HA-TRHR)作为IG3。在瞬时共表达OxR2/Rluc8和barr2/Venus与pcDNA3或HA-TRHR的HEK293细胞上，在37C进行eBRET测量。配体处理为仅用OxA或TRH。磷酸缓冲盐溶液(PBS)用作赋形剂对照。数据表示为配体-诱导的BRET比率。
图18显示促甲状腺素释放激素受体(TRHR)作为IG1，Rluc8作为RC1，β-抑制蛋白2(barr2)作为IG2，Venus作为RC2和血凝素表位-标记的OxR2(HA-OxR2)作为IG3。在等分在96孔板的所有孔中的瞬时共表达TRHR/Rluc8和barr2/Venus与HA-OxR2的HEK293细胞上，在37C进行eBRET测量。在96孔板的前两行和最后两行(共48个孔)加入磷酸缓冲盐溶液(PBS)作为赋形剂对照。数据表示为荧光/发光。
图19显示促甲状腺素释放激素受体(TRHR)作为IG1，Rluc8作为RC1，β-抑制蛋白2(barr2)作为IG2，Venus作为RC2和血凝素表位-标记的OxR2(HA-OxR2)作为IG3。在等分在96孔平板的所有孔中的瞬时共表达TRHR/Rluc8和barr2/Venus与HA-OxR2的HEK293细胞上，在37C进行eBRET测量。将OxA加入到96孔板的中间4行(共48个孔)中。数据表示为荧光/发光。
图20显示关于促甲状腺素释放激素受体(TRHR)作为IG1，Rluc8作为RC1，β-抑制蛋白2(barr2)作为IG2，Venus作为RC2和血凝素表位-标记的OxR2(HA-OxR2)作为IG3的z-因子数据。如在图19和20中所示，在等分在96孔板的所有孔中的瞬时共表达TRHR/Rluc8和barr2/Venus与HA-OxR2的HEK293细胞上，在37C进行eBRET测量。在96孔板的前两行和最后两行(共48个孔)加入磷酸缓冲盐溶液(PBS)作为赋形剂对照。将OxA加入96孔板的中间四行(共48个孔)中。数据表示为荧光/发光。
图21显示CC趋化因子受体5(CCR5)作为IG1，Topaz(TYFP)作为RC1，β-抑制蛋白2(barr2)作为IG2，Rluc作为RC2和CC趋化因子受体2(CCR2)作为IG3。在瞬时共表达CCR5(5)TYFP(在CCR5和TYFP之间包含5个氨基酸的接头)和barr2/Rluc与CCR2或pcDNA3的HEK293细胞上，在37C进行eBRET测量。配体处理为单核细胞趋化蛋白1(MCP1；CCR2选择性配体)，巨噬细胞炎性蛋白1b(MIP1b；CCR5选择性配体)，或组合的MCP1和MIP1b二者。磷酸缓冲盐溶液(PBS)用作赋形剂对照。
图22显示关于CC趋化因子受体5(CCR5)作为IG1，Topaz(TYFP)作为RC1，β-抑制蛋白2(barr2)作为IG2，Rluc作为RC2和CC趋化因子受体2(CCR2)作为IG3的剂量-响应曲线。在用增加剂量的单核细胞趋化蛋白1(MCP1；CCR2选择性配体)处理的瞬时共表达CCR5(5)TYFP(在CCR5和TYFP之间包含5个氨基酸的接头)，barr2/Rluc和CCR2的HEK293细胞上，在37C进行BRET测量。使用允许可变斜率的Prism(GraphPad)绘制S型剂量响应曲线。
缩略语
ACE            血管紧张素-转化酶.
a-MSH          α-促黑激素.
AngII          血管紧张素II.
AT1R           1型血管紧张素II受体.
barr           β-抑制蛋白.
BRET           生物发光共振能量转移.
BROM           溴麦角环肽.
CB             大麻素受体.
CCR            CC趋化因子受体.
CCR5(5) TYFP   通过5个氨基酸的接头区域与TYFP连接的CCR5.
CSF            脑脊液.
CXCR           CXC趋化因子受体.
D2LR           多巴胺D2受体(长形式).
D2SR           多巴胺D2受体(短形式).
DOP           δ阿片样物质.
eBRET          延长的BRET：在延长的时间阶段内监测的BRET.
ECFP           增强的蓝绿荧光蛋白(Enhanced Cyan Fluorescent
               Protein)，其是维多利亚水母(Aequorea victoria)绿色
               荧光蛋白基因(GFP)的变体.
EGFP           增强的绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent
               Protein)是野生型GFP的红移变体.
EYFP        增强的黄色荧光蛋白(Enhanced Yellow Fluorescent
            Protein).
FRET        荧光共振能量转移.
GPCRs       G-蛋白偶联的受体.
HA          血凝素表位-标记.
hES细胞     人胚胎干细胞.
His(6)      由6个连续的组氨酸残基组成的组氨酸标记.
IG          相互作用组.
IL-8        白介素-8.
KOP         κ阿片样物质.
MCP1        单核细胞趋化蛋白1(CCR2选择性配体).
MCR         黑皮质素受体.
MIP1b       巨噬细胞炎性蛋白1b(CCR5选择性配体).
mRFP1       单体红色荧光蛋白.
OR          阿片样物质受体.
OxA         食欲肽A.
OxB         食欲肽B.
OxR         食欲肽受体.
PBS         磷酸缓冲盐溶液.
pcDNA3      真核表达载体.
RC          报道成分.
REM         快眼动相.
RET         共振能量转移.
Rluc        海肾(Renilla)萤光素酶.
Rluc8       改良的海肾萤光素酶.
SWS         慢波睡眠.
TRH         促甲状腺素释放激素.
TRHR        促甲状腺素释放激素受体.
TYFP        黄玉色荧光蛋白.(Topaz yellow Fluorescent protein)
Venus       改良的黄色荧光蛋白.
wt           野生型.
实施发明的最佳方式
综述
在详细描述本发明之前，应该理解，本发明不限于具体举例的生物发光或荧光蛋白、分析物、或本发明公开的方法。还应该理解，本文所用的术语仅是为了描述本发明具体实施方案的目的，并不意欲限制。
本文引用的所有的出版物，包括专利和专利申请，不管是在上文还是在下文中引用的，通过引用完全结合于此。然而，引用本文提到的出版物是为了描述和公开在所述出版物中报道的方法、试剂和载体的目的，并且所述方法、试剂和载体可以与本发明联系使用。本文中没有任何内容应该解释为承认本发明没有资格由优先权发明赋予日期在所述公开内容之前。
此外，除非另外指明，本发明的实施利用本领域技术范围之内的常规分子生物学、化学和荧光技术。所述技术是熟练的工人公知的，并且完全在参考文献中解释。关于荧光技术，参见，例如，Coligan，Dunn，Ploegh，Speicher和Wingfield“现代蛋白质科学方法(Current protocols in ProteinScience)”(1999)卷I和II(John Wiley&Sons公司)；和Bailey，J.E.和Ollis，D.F.，生物化学工程基本原理(Biochemical Engineering Fundamentals)，McGraw-Hill Book Company，纽约，1986；Lakowicz，J.R.荧光光谱法原理(Principles of Fluorescence Spectroscopy)，纽约：Plenum Press(1983)。
当用在本文中且用在后附的权利要求中时，单数形式“一个(a)，”“一个(an)，”和“所述(the)”包括复数，除非上下文另外清楚地指明。因此，例如，提及“一种蛋白(a protein)”包括多种这样的蛋白，并且提及“一种分析物(an analyte)”是提及一种或多种分析物，等等。
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域普通技术人员常规理解相同的意思。尽管可以使用与本文所述的那些相似或等价的任何材料和方法来实施或检验本发明，但是现在描述优选的材料和方法。
本文所述的本发明可以包括一个或多个数值(例如，尺寸、浓度等)范围。应该理解数值范围包括在该范围内的所有数值，包括限定该范围的数值，以及接近这样范围的数值，所述数值导致与紧接近限定该范围界限的数值的数值相同或基本相同的结果。
在本说明书中，除非上下文另外需要，措辞“包括(comprise)”或变化，如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”应该理解为暗示包括所陈述的整数，或整数组，但是并不排除任何其它的整数或整数组。
具体描述
正如从本发明的前述概述清楚看到的，本发明涉及检测两种试剂缔合的系统、方法和试剂盒。术语“缔合”，当用于本文时，是指通过任何已知的直接或间接稳定的原子或分子水平相互作用或它们的任意组合而缔合的相互作用组的组合，其中所述相互作用包括，但不限于，键合相互作用，如共价结合、离子键合、氢键合、配位键合、或任何其它分子结合相互作用，静电相互作用，极性或疏水性相互作用，或任何其它经典或量子机械稳定原子或分子相互作用。
术语“缔合”还包括涉及相互作用组的任何相互作用或构象变化，其使得报道成分充分接近足以产生信号。在本发明的优选实施方案中，RCs之间的距离优选在1-10nm范围内。不需要在试剂的IG与RC之间的直接物理接触，并且其可以由一个或多个连接分子介导。
还从本发明的前述概述中清楚的是，主要目的缔合是通过第二和第三试剂缔合的方式所检测的第一和第三试剂的缔合。更具体地，目的缔合是通过第二和第三试剂的相互作用组的缔合的方式所检测的第一和第三试剂的相互作用组的缔合，所述第二和第三试剂的相互作用组的缔合本身通过由第一和第二报道成分的接近产生的信号进行检测。在第二和第三试剂的缔合中重要的是其受调控剂调控的程度，并且由此指示所述第一和第三试剂缔合的潜在的组成性性质。
第一、第二和第三试剂
第一和第二试剂二者均包括相互作用组(IG)，其中所述IG直接或间接地与报道成分(RC)偶联。第三试剂包括IG。
可以有利地加工或修饰试剂，以包含化学基团、肽序列、蛋白或核酸分子，其可以(i)促进它们的纯化和/或(ii)使它们靶向真核宿主细胞的亚细胞区室和/或(iii)当加入到围绕细胞的介质中时，能使它们穿过真核细胞的细胞膜和/或(iv)能使它们的表达水平通过利用抗体或其它方法进行评估。
相互作用组
当用于本文时，术语“相互作用组”或“IG”是指与另一种IG直接或间接相互作用的分子或分子复合物。因此，第一、第二和第三试剂的相互作用组或IG可以是化合物、蛋白、蛋白结构域、蛋白环、蛋白-末端、肽、激素、蛋白-脂质复合物、脂质、碳水化合物、包含碳水化合物的化合物、核酸、寡核苷酸、药剂、药物靶、抗体、抗原性物质、病毒、细菌、和细胞或任何它们的复合物。
此外或备选地，每个相互作用组可以是任何类型的受体、离子通道、酶、载体、转运蛋白、膜内在蛋白质、细胞骨架蛋白、黏附分子、信号传导蛋白、支架蛋白、辅助蛋白、运输蛋白、转录因子、核辅因子或核酸分子，如下文所定义。
当第一、第二和第三相互作用组中的任一个或每一个是核酸分子时，那么可以使用任何形式的核酸分子。例如，所述核酸分子可以包括基因组脱氧核酸(DNA)，重组DNA，互补(complimentary)DNA(cDNA)，肽核酸(PNA)，核糖核酸(RNA)，包含异形核RNA(hnRNA)的RNA，转移RNA(tRNA)，小干扰RNA(siRNA)，信使RNA(mRNA)，或核糖体RNA(rRNA)以及它们的杂交分子。
本质上，所述相互作用组是能够与一个或多个其它实体形成复合物的实体。例如，在本发明的情形中，抗体是第一IG，原因在于它能够与抗原形成复合物，其中所述抗原可以是第二IG(见下文)。本发明的IG的另一个实例是配体，其能够与受体形成复合物。另一个实例是酶与其底物的相互作用。
另外，所述IGs可以是同一分子的部分。因此，例如，G-蛋白偶联受体(GPCR)的第三胞内环可以是第一IG，且同一受体的C-末端可以是第二IG，它们将在受体被激活或灭活时缔合。
调控剂
调控剂直接(诸如配体)或间接地(诸如通过改变pH或温度)调控第二相互作用组与第三相互作用组的缔合。
所述调控剂可以通过与所述第一、第二或第三相互作用组中的一种或多种相互作用而调控第二相互作用组与第三相互作用组的缔合。然而，在本发明的优选形式中，所述调控剂可以通过单独与第三相互作用组相互作用、或同时与第一相互作用组相互作用而调控第二相互作用组与第三相互作用组的缔合。
在本发明的另一个有利形式中，组合加入多于一种调控剂。这可以包括与通过与第一相互作用组相互作用而调控第二相互作用组与第三相互作用组的缔合的调控剂组合，加入通过与第三相互作用组相互作用而调控第二相互作用组与第三相互作用组的缔合的调控剂。
报道成分：与IGs偶联
从本发明的概述中清楚的，第一和第二试剂包括与相互作用组偶联的报道成分。当用于本文时，术语“偶联的”、“直接偶联的”和“间接偶联的”意指所述报道成分与IG附着或缔合，以形成能够进行分析或检测的试剂。优选的偶联方法是由所述IGs和RCs的性质确定的。
第一和第二报道成分可以是能够发射可检测信号的任何已知的化合物、有机的或无机的、蛋白质的或非蛋白质的或它们的复合物。在一些实施方案中，所述报道成分选自由下列各项组成的组：酶、发光分子或它们的部分、荧光分子或它们的部分以及转录因子或其它与所述相互作用组偶联的分子。
第一和第二报道成分与第一和第二相互作用组的直接或间接的偶联分别可以通过任何已知的共价或非共价方式偶联两种分子，包括化学交联、蛋白的化学修饰、氨基酸的化学修饰、核酸的化学修饰、碳水化合物的化学修饰、脂质的化学修饰、任何其它有机或无机分子的化学修饰、生物素-抗生物素蛋白相互作用、抗原-抗体相互作用和核酸杂交。
在本发明的一种形式中，第一和/或第二报道成分分别通过接头与第一和/或第二相互作用组间接偶联。在一些实施方案中，所述接头包括酶裂解位点。
直接偶联蛋白质IG和蛋白质RC的方法的实例是遗传融合，其中融合编码IG和生物发光或荧光蛋白的基因以产生单一多肽链。
直接偶联方法的另一个实例是缀合，其中IG与荧光团的偶联使用酶如连接酶、水解酶、特别是磷酸酶、酯酶和糖苷酶、或氧化还原酶、特别是过氧化物酶实现。
在本发明的特别优选的实施方案中，第一和/或第二相互作用组与第一和/或第二报道成分，分别地，每一个各自形成单一多肽链的一部分。其它官能团可以形成同一多肽链的一部分。例如，第一和/或第二相互作用组与第一和/或第二报道成分分别形成单一多肽链的一部分，其另外包括：
(i)编码用于亲和纯化融合构建体的肽序列的序列；和/或
(ii)编码将融合构建体导向真核细胞的亚细胞区室的肽序列的序列；和/或
(iii)编码促进穿透真核细胞膜的肽序列的序列；和/或
(iv)能够使得通过使用抗体或其它方法评估表达水平的序列；
以产生所述相互作用组、所述报道成分和所述其它肽的融合蛋白。适当的报道成分
第一和第二报道成分的接近产生能够通过检测器检测的信号。第一和第二RCs组成互补对，在这种意义上，在不影响本发明的功能的条件下，第一RC可以与第二RC互换(即，第一RC与第二IG偶联，和第二RC与第一IG偶联)。
因此，报道成分可以包括酶、发光或生物发光分子、荧光分子、和转录因子或通过结合酶裂解位点的接头与所述相互作用组偶联的其它分子。简言之，能够由于它们的空间接近而发射可检测信号的任何已知分子，有机的或无机的，蛋白质的或非蛋白质的或它们的复合物。
优选地，在存在报道成分引发物的条件下，由第一和第二报道成分的接近产生的信号选自由下列各项组成的组：发光、荧光和比色变化。
在一些实施方案中，发光由选自由下列各项组成的组的生物发光蛋白产生：萤光素酶、半乳糖苷酶、内酰胺酶、过氧化物酶、或能够在存在适宜底物的条件下发光的任何蛋白。
第一和第二报道成分的优选组合包括发光报道成分与荧光报道成分，发光报道成分与非荧光猝灭剂，荧光报道成分与非荧光猝灭剂，能够共振能量转移的第一和第二荧光报道成分。
然而，第一和第二报道成分的有用组合决不限于所述这些。
本发明可以使用的第一和第二报道成分的备选组合包括在US6893827(Applera公司)；US6800445(Applera公司)；US7049076(Sentigen生物科学公司，和纽约城哥伦比亚大学的托管人(SentigenBiosciences，Inc.，and The Trustees of Columbia University of the City of NewYork))；US6110693(杜克大学(Duke University))；US5891646(杜克大学(Duke University))；和WO/2005/031309(ODYSSEY THERA公司)中示例的那些。
在本发明的一些方面中，所述检测系统包括RCs对的组合，其能够作为供体和/或受体分子。因此，按照本发明可以使用的RCs可以基于其物理性质选择，如在共振能量转移(RET)领域中已知的，这样选择二者，以使它们一起包括RET对的供体和受体分子。如果在RET对中的RCs之一是生物发光蛋白，则该RET称为生物发光RET(BRET)。如果形成RET对的两个RCs均为荧光团，则所得到的RET称为荧光RET(FRET)。已知的适宜供体和受体对的实例包括：
海肾萤光素酶和黄色荧光蛋白；
海肾萤光素酶和绿色荧光蛋白；
蓝绿荧光蛋白和黄色荧光蛋白；
荧光素和四甲基罗丹明；
5-(2′-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)和荧光素；
通常参见R.Haugland，荧光探针和研究化学品手册(Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals)(第六版1995)。一种或两种荧光团可以是荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白，并且在IG是通过制备IG和荧光蛋白的融合蛋白获得的蛋白或肽时，使用荧光蛋白作为荧光团是特别有利的。
互补的第一和第二报道成分可以以单一蛋白诸如酶、或荧光团的互补部分的形式提供，在使得所述互补部分接近时，恢复其功能。例如，分裂-Rluc互补(Split-Rluc complementation)(Paulmurugan，R.和Gambhir，S.S.使用裂化合成的海肾萤光素酶蛋白-片段-辅助的互补性监测蛋白-蛋白相互作用(Monitoring protein-protein interactions using split synthetic Renillaluciferase protein-fragment-assisted complementation).化学年刊(Anal.Chem.)75，1584-1589(2003))和分裂GFP(split GFP)互补(Hu，C.D.和Kerrpola，T.K.使用多色荧光互补分析同时显现活细胞中的多种蛋白相互作用(Simultaneous visualisation of multiple protein interactions in living cellsusing multicolour fluorescence complementation analysis)自然生物技术(Nat.Biotechnol.)21，539-545(2003))。
在一个实施方案中，第一和/或第二报道成分之一是非荧光猝灭剂。所述非荧光猝灭剂可以是具有吸收光且猝灭荧光和/或发光的能力的任何已知的非荧光发光团。因此，所述非荧光猝灭剂可以是任何已知的分子，不管是蛋白质的或非蛋白质的。优选地，所述非荧光猝灭剂选自由下列各项组成的组：dabcy；非荧光pocilloporins，QSY-7，QSY-9，QSY-21，QSY-35，BHq-1，BHQ-2和BHQ-3。
当用于本文时，术语“发光分子”是指能够产生发光的任何分子。生物发光蛋白包括萤光素酶，其已经在细菌、真菌、昆虫和海洋动物中发现。它们在发光条件下催化特定底物(通常已知为萤光素)的氧化(Hastings(1996)基因(Gene)173，5-11)。最广泛已知的底物是腔肠素(coelenterazine)，其存在于刺胞动物、桡足动物、Chaetgnaths、栉水母动物、十足虾类(decapod shrimps)、糠虾(mysid shrimps)、放射虫和一些鱼类中(Greer和Szalay，(2002)，发光(Luminescence)，17，43-74)。两种最广泛使用的萤光素酶是：
(i)Renilla萤光素酶(来自R.reniformis)，一种35kDa的蛋白质，其利用腔肠素作为底物并且在480nm处发光(Lorenz等，(1991)，PNAS.USA，88，4438-4442)；和
(ii)萤火虫萤光素酶(来自北美萤火虫(Photinus pyralis))，一种61kDa的蛋白质，其利用萤光素作为底物并且在560nm处发光(de Wet等，(1987)，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)，2987，725-737)。
已经开发了Renilla萤光素酶的突变形式，从而提高在涉及生物发光的测定法中的表现。已经利用人源化的密码子应用来使得萤光素酶DNA对于哺乳动物转录机制“较不是外源性的”，并且确保最大的基因表达。点突变的密码子-人源化的Renilla萤光素酶的实例是Rluc2(C124A/M185V)和Rluc8(A55T/C124A/S130A/K136R/A143M/M185V/M253L/S287L)，其与未突变的萤光素酶相比表现出显著改善的性质，包括在与腔肠素类似物一起使用时增加的光输出和在血清中在37℃更好的稳定性(Loening等(2006)蛋白质加工设计选择(Protein Eng Des Sel)19，391-400；Loening等(2007)自然方法学(Nat Methods)4，641-643；De等(2007)癌症研究(Cancer Res)67，7175-7183)。
Gaussia萤光素酶(来自Gaussia princeps)也已经用在生化测定法中(Verhaegen等，(2002)，化学年刊(Anal.Chem.)，74：4378-4385)。Gaussia萤光素酶是一种20kDa的蛋白质，其在快速反应中氧化腔肠素，导致在470nm处的亮光发射。
理想地，只要底物存在，与本发明一起使用的生物发光蛋白就表现出强烈且恒定的光发射。
由于生物发光蛋白与IGs偶联，优选地使用具有小分子量的生物发光蛋白，以减小由于空间位阻抑制IGs之间的相互作用的可能性。
另外，所述生物发光蛋白优选地由单一多肽链组成，以促进第一和第二试剂的便利生产。
另外，所述生物发光蛋白优选地不形成寡聚体或聚集体，所述寡聚体或聚集体另外能够抑制与其偶联的IG的功能。
所述生物发光蛋白Renilla萤光素酶、Gaussia萤光素酶和萤火虫萤光素酶满足所有或大部分这些标准。
荧光RCs
当用于本文时，术语“荧光分子”是指能够发荧光或磷光的任何分子，包括蛋白。存在许多可以用在本发明中的荧光蛋白。例如，分子和细胞生物学中最广泛应用的荧光蛋白是来自水母维多利亚水母的绿色荧光蛋白(GFP)(Tsien，(1998)，生物化学每年综述(Annu.Rev.Biochem.)，67，509-544)以及由其序列衍生的变体。通过点突变开发“增强的”荧光蛋白(例如，EGFP)，其增加溶解性和荧光并且促进蛋白折叠(Zernicka-Goetz等，(1997)，发育(Development)，124，1133-1137)。位置64的Phe点突变为Leu已经增加蛋白在37□C的稳定性，并且位置65的Ser点突变为Thr导致增加的荧光(Okabe等，(1997)，FEBS通讯(FEBS Letters)，407，313-319；Clontech Palo Alto，Calif.)。从Clontech商购的EGFP结合人源化的密码子应用，使其对于哺乳动物转录机制“较不外源性”且确保最大的基因表达。另外，绿色荧光蛋白的光谱特性可以通过特定氨基酸的基因定点诱变而改变，例如，已经生产了EGFP的蓝色(EBFP)、蓝绿(ECFP)和黄色(EYFP)突变体(Zhang等，(2002)，自然分子细胞生物学综述(Nat.Rev.Mol.CellBiol.)，3，906-918)。另一类重要的荧光蛋白是来自珊瑚物种圆盘海葵(Discosoma)(DsRed)(Matz等，(1999)，自然生物技术(Nat.Biotechnol.)17，969-973)和紫点海葵(Heteractis crispa)(HcRed)(Gurskaya等，(2001)，FEBS通讯(FEBS Lett.)507，16-20)的红色荧光蛋白(RFP)。
在一些实施方案中，具有高荧光量子产量的荧光蛋白与本发明一起使用。
在一些实施方案中，与本发明一起使用的荧光蛋白的分子量应该足够小以避免IGs之间的空间位阻。
优选地，使用单体蛋白来避免聚集和对偶联的IG功能的干扰。GFP形成弱二聚体，但是其二聚化的倾向可以通过将在二聚化界面的疏水性氨基酸突变而最小化(Zacharias等，(2002)，科学(Science)，296，913-916)。红色荧光蛋白DsRed是一种专性四聚体蛋白。最近，已经描述了DsRed序列的17个点突变，其使得DsRed成为二聚体蛋白(二聚体2)。该二聚体的亚基可以通过肽接头连接以形成物理学以单体作用的束缚的二聚体(tethered dimer)(t-二聚体2(12))。其余16个点突变将该二聚体2转换为单体变体(mRFP1)(Campbell等，(2002)，PNAS.USA，99，7877-7882)。红色荧光蛋白HcRed是一种二聚体蛋白，并且作为单体是不发荧光的。然而，两个亚基可以通过短肽接头连接第一亚基的C端与第二亚基的N端而融合。该融合的蛋白(t-HcRed)有效地以单体单元作用，与t-二聚体2(12)类似(Fradkov等，(2002)，生化杂志(Biochem.J.)，368，17-21)。
优选地，与本发明一起使用的荧光蛋白表现出形成它们的荧光团的短成熟时间。在这些分子中的荧光团通过多肽链的特定重排而形成。该过程可以花费小于1小时到大于24小时(Zhang等，(2002)，自然分子细胞生物学综述(Nat.Rev.Mol.CellBiol.)，3，906-918)。由于慢成熟过程限制功能性RC的可用性和浓度，故优选使用快速成熟的蛋白。快速成熟的荧光蛋白如绿色荧光蛋白EGFP及其颜色变体以及红色荧光蛋白t-二聚体2和mRFP1。慢成熟蛋白例如DsRed和HcRed。
在一些实施方案中，荧光由选自由下列各项组成的组的荧光蛋白产生：绿色荧光蛋白(GFP)或其变体，GFP的蓝色荧光变体(BFP)，GFP的蓝绿荧光变体(CFP)，GFP的黄色荧光变体(YFP)，增强的GFP(EGFP)，增强的CFP (ECFP)，增强的YFP(EYFP)，GFPS65T，深黄绿色(Emerald)，黄玉色(TYFP)，Venus，柠檬色(Citrine)，mCitrine，GFPuv，不稳定的EGFP(dEGFP)，不稳定的ECFP(dECFP)，不稳定的EYFP(dEYFP)，mCFPm，天蓝色(Cerulean)，T-蓝宝石色，CyPet，YPet，mKO，HcRed，t-HcRed，DsRed，DsRed2，DsRed-单体，J-Red，二聚体2，t-二聚体2(12)，mRFP1，pocilloporin，Renilla GFP，Monster GFP，paGFP，Kaede蛋白和激发蛋白(kindling protein)，藻胆蛋白和藻胆蛋白缀合物，包括B-藻红蛋白、R-藻红蛋白和别藻蓝蛋白。荧光蛋白的其它实例包括mHoneydew，mBanana，mOrange，dTomato，tdTomato，mTangerine，mStrawberry，mCherry，mGrape1，mRaspberry，mGrape2，mPlum(Shaner等(2005)自然方法学(Nat.Methods)，2，905-909)和在由Tsien R等产生的成果之后命名的任何其它蛋白，以及在珊瑚中表达的任何荧光分子或其衍生物。
有效用作萤光素酶的互补报道成分的特别有利的荧光蛋白是Venus(Nagai，T等，用于细胞-生物学应用的具有有效成熟的黄色荧光蛋白的变体(A variant of yellow fluorescent protein with efficient maturation forcell-biological applications)，自然生物技术(Nat.Biotechnol.)(2002)20，87-90；和Hamdan，F.等(2005)使用基于生物发光共振能量转移1的β-抑制蛋白2募集测定法高通量筛选G蛋白-偶联的受体拮抗剂(High-ThroughputScreening of G Protein-Coupled Receptor Antagonists Using aBioluminescence Resonance Energy Transfer 1-Based Beta-Arrestin2Recruitment Assay)，生物分子筛选杂志(Journal of BiomolecularScreening)10，463-475)。
当用于本文时，术语“荧光部分(fluorescent moiety)”或“荧光部分”互换使用，并且是指能够产生荧光的非蛋白质分子。非蛋白质荧光分子通常是可以与其它分子连接的小分子。每个非蛋白质荧光分子具有特定的光谱特征。存在可以用在本发明中的许多不同的荧光部分。非限制性实例包括罗丹明、罗丹明衍生物、丹酰、7-羟基香豆素、荧光素、荧光素衍生物、俄勒岗绿、德克萨斯红、Alexa Fluor染料和Cy染料。关于本发明，非常具有吸引性的荧光部分种类是荧光纳米晶体(Bruchez等，(1998)，科学(Science)，281，2013-2016)。荧光纳米晶体表现出强荧光，并且它们的荧光发射可以通过晶体尺寸在超过1000nm的波长范围内调整。所有的纳米晶体的激发在相同波长下发射，不依赖于它们的荧光发射。因此，可以由相同光源或通过来自相同生物发光蛋白或荧光分子的RET激发不同的纳米晶体。
优选地，使用具有高荧光量子产量的荧光部分。
在一些实施方案中，荧光由选自由下列各项组成的组的荧光部分产生：Alexa Fluor染料及衍生物，Bodipy染料及衍生物，Cy染料及衍生物，荧光素及衍生物，丹酰，7-羟基香豆素，荧光和发光微球体，荧光纳米晶体，Marina蓝，Cascade蓝，Cascade黄，Pacific蓝，俄勒岗绿及衍生物，四甲基罗丹明及衍生物，罗丹明及衍生物，德克萨斯红及衍生物，稀土元素螯合剂或它们的任意组合或衍生物或具有荧光性质的任何其它分子。
最近报道了新型荧光部分，并且包括蛋白质和非蛋白质成分二者(Griffin等，(1998)，科学(Science)，281，269-272；Adams等，(2002)，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)，124，6063-6076)。联砷-四半胱氨酸系统(biarsenical-tetracysteine system)融合包含短四半胱氨酸的肽与靶蛋白。该肽与细胞穿透性、非荧光生成联砷染料形成稳定的、荧光复合物。取决于染料的分子结构，获得不同的荧光团。
报道成分引发物
在一些实施方案中，将使用至少一种报道成分引发物来由所述报道成分产生信号。当用于本文时，术语“报道成分引发物”是指能够使得第一和第二报道成分的组合在紧密接近的条件下产生可检测的信号的分子、条件和/或能源。
在一些实施方案中，所述报道成分引发物直接作用，而在其它实施方案中，该作用是间接的。
优选地，所述报道成分引发物是试剂，包括任何已知的化合物，有机的或无机的、蛋白质或非蛋白质的、底物、配体、抗体、酶、核酸、碳水化合物、脂质、药物化合物、激动剂、拮抗剂、逆激动剂或化合物或它们的复合物；或是条件改变，包括温度、离子强度或pH的改变；或是能源，包括光。所述报道成分引发物可以是报道基因。
在一些实施方案中，所述报道成分引发物是可以与酶、转录因子、荧光或生物发光分子联合使用产生信号的任何分子。
报道成分引发物的实例包括用于生物发光反应的底物，用于荧光团的激发光，响应结合转录因子的报道成分的报道基因，缓冲剂，适当的介质，释放束缚(caged)的分子所需要的条件如UV辐射或利用内源酶活性的活细胞，适宜的温度、离子强度和pH以使包括酶和荧光团的蛋白适当行使功能，和保持制备物存活性的适宜条件，包括使用缓冲剂和/或CO2灌注。
在生物发光的情形中，所述报道成分引发物将是底物。关于生物发光，底物的选择可影响由生物发光蛋白产生的光的波长、强度和持续时间。例如，对于Renilla萤光素酶，腔肠素类似物是可用的，其在418-512nm之间引起光发射(Inouye等，(1997)，生化杂志(Biochem.J.)，233，349-353)。已经描述了一种腔肠素类似物(400A，‘DeepBlueC’)与Renilla萤光素酶在400nm处发光(PCT申请WO01/46691)。
理想地，底物的半衰期是这样的，以使光发射持续充足的时间阶段从而在该时间阶段内检测之。特别理想的是提供充足的半衰期以使在加入调控剂之前建立稳定态的底物。已经发现EnduRen(参见Pfleger等，用于监测活细胞中延长的蛋白-蛋白相互作用的延长的生物发光共振能量转移(eBRET)(Extended bioluminescence resonance energy transfer(eBRET)formonitoring prolonged protein-protein interactions in live cells)(2006)细胞信号传导(Cellular Signalling)，18，1664-1670)是高度优选的备选物，特别是从高通量筛选的观点来看。
最近产生的双脱氧腔肠素(bisdeoxycoelenterazine)(DeepBlueC)的保护衍生物可能在下述情形中对DeepBlueC是优选的，所述情形即，该底物的光谱特性是有利的但是衰减动力学限制有效应用(Levi等(2007)美国化学协会杂志(J Am ChemSoc)129，11900-11901)。
与本发明一起使用的底物优选是细胞-透过性的，并且能够通过细胞膜变为细胞内分子可用的。腔肠素及其大部分衍生物是高度细胞透过性的(Shimomura等，(1997)，生化杂志(Biochem.J.)，326：297-298)，而萤光素不有效穿过哺乳动物细胞的膜。然而，已经开发了束缚的萤光素化合物，其通过细胞膜，并且一旦在细胞质内部即可通过细胞酶或UV光释放(Yang等，(1993)，生物技术(Biotechniques)，15，848-850)。
当用于本文时，术语“能源”是指能够激活特定的荧光团的任何能源。在一些实施方案中，所述能源是光。光源的非限制性实例包括激光、汞灯或氙灯。光源还具有将发射的光限制为特定波长或特定波长范围的工具。这可以是，例如，安装在滤波器轮或滤波器载玻片上的适当的滤波器、单色光镜、分色镜或仅产生单波长光的激光。
如上述讨论，在第一和第二试剂中相互作用组可以与报道成分直接或间接偶联。在所述报道成分是生物发光或荧光蛋白的情形中，所述生物发光或荧光蛋白可以直接或间接地(例如，通过接头基团)偶联(例如，共价键合)到适当的IG上。偶联生物发光或荧光蛋白与试剂的方式在本领域内是公知的。偶联蛋白质IG和蛋白质RC的直接方法的实例是遗传融合，其中融合编码IG和生物发光或荧光蛋白的基因，以产生单一多肽链。
直接偶联方法的另一个实例是缀合，其中IG与荧光团的偶联使用酶，如连接酶、水解酶、特别是磷酸酶、酯酶和糖苷酶、或氧化还原酶、特别是过氧化物酶进行。
与可以遗传融合到蛋白质IGs上的蛋白质荧光部分相反，荧光部分和非蛋白质、非荧光猝灭剂具有这样的缺点，即，它们附着到蛋白质IGs上更困难，并且通常不能在活细胞内发生。直接偶联非蛋白质荧光部分和非荧光猝灭剂与IGs的实例包括与反应基共价连接的部分，其能够与IG的特定化学基团形成共价键。实例是与半胱氨酸残基的SH-基团反应的碘乙酰胺和马来酰亚胺，和与赖氨酸残基的NH3+-基团反应的琥珀酰亚胺酯、羧酸和磺酰氯(Ishii等，(1986)，生物物理学杂志(Biophys.J.)50，75-89；Staros等，(1986)，生物化学年刊(Anal.Biochem.)156，220-222；Lefevre等，(1996)，生物缀合物化学(Bioconjug.Chem.)7，482-489)。
将荧光部分附着到IG上的另一种已知的方法典型地包括将荧光部分移接到IG上或通过在其合成过程中将荧光部分结合到IG中。重要的是，所标记的IG保留未标记的IG的重要性质，如与受体或核酸的选择性结合、特定酶的激活或抑制、或结合到生物膜内的能力。存在广泛种类的荧光部分可用，包括，例如，联吡咯亚甲基硼二氟化物染料(dipyrrometheneborondifluoride dyes)、罗丹明、罗丹明衍生物、德克萨斯红、丹酰、7-羟基香豆素、等等。对于可以使用的各种标记或信号产生系统的综述，参见美国专利号4,391,904。
间接偶联荧光部分与IG如蛋白或核酸的方法的一个实例包括荧光部分与蛋白如能够结合生物素的抗生物素蛋白的共价键合，其中生物素共价结合IG，以使所述IG和荧光部分通过生物素和抗生物素蛋白之间的相互作用而间接偶联在一起。
间接偶联IG和生物发光或荧光蛋白的方法的另一个实例是通过接头基团偶联。接头基团可以作为间隔臂起作用以将所述生物发光或荧光蛋白与试剂分隔，从而避免对结合能力的干扰。接头基团还可以作用增加试剂上的取代基的化学反应性，并且因此增加偶联效率。化学反应性的增加还可以促进试剂、或试剂上官能团的应用，否则所述应用将是不可能的。
对于本领域技术人员是明显的，各种双官能或多官能试剂，同-和异-官能(诸如在Pierce化学品公司(Pierce Chemical Co.)罗克福德，III的目录中记述的那些)二者，可以用作接头基团。偶联可以，例如，通过氨基基团、羧基基团、巯基基团或氧化的碳水化合物残基实施。存在大量描述所述方法的参考文献，例如，美国专利号4,671,958。
在一些实施方案中，蛋白质RC或蛋白质IG通过利用本领域技术人员公知的标准分子生物学技术将编码RC或IG的DNA序列插入到表达载体中而重组产生。将DNA序列可操作性地连接到适宜的转录或翻译调控元件上。负责DNA表达的调控元件仅位于编码第一多肽的DNA序列的5′。类似地，终止翻译和转录终止信号所需要的终止密码子仅存在于编码第二多肽的DNA序列的3′。融合的RC和IG多肽在适当的宿主中表达。
本领域普通技术人员已知的多种表达载体中的任一种可以用来表达本发明的重组多肽。表达可以在任何适当的宿主细胞中实现，所述宿主细胞已经转化或转染了包含编码重组多肽的DNA分子的表达载体。适当的宿主细胞包括原核细胞、酵母和高级真核细胞。优选地，所用的宿主细胞是大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞系，诸如CHO，HEK293或COS-7细胞。
在另一个实施方案中，蛋白质IG-RC试剂作为融合构建体重组产生。使用已知的重组DNA技术来将编码蛋白质RC多肽和IG多肽的分离的DNA序列组装到适宜的表达载体中，而构建编码本发明的融合蛋白的DNA序列。用或不用肽接头，将第一DNA序列的3’端连接到第二DNA序列的5’端，以使两个序列的阅读框符合读框，从而允许所述两个DNA序列的mRNA翻译成保留RC和IG二者生物学活性的单一融合蛋白。RC和IG在融合构建体内的方向可以交换，以增加其功能性或表达。
肽接头序列可以用来将生物发光蛋白和IG多肽分隔充分的距离，以足以确保每种多肽折叠成其二级和三级结构。使用本领域公知的标准技术将这样的肽接头序列结合到融合蛋白中。适当的肽接头序列可以基于下述因素进行选择：(1)它们采用灵活延伸的构象的能力；(2)它们不能采用可以与生物发光蛋白或IG上的功能性表位相互作用的二级结构；和(3)缺少可能与多肽功能性表位相互作用或减小融合多肽的溶解性的疏水性或带电荷残基。优选的肽接头序列包含Gly，Asn和Ser残基。其它接近中性的氨基酸，诸如Thr和Ala也可以用在接头序列中。可以有效用作接头的氨基酸序列包括在下列各项中公开的那些：Maratea等，(1985)，基因(Gene)，40，39-46；Murphy等，(1986)，PNAS.USA，83，8258-8262；美国专利号4,935,233和4,75l,180。接头序列长度可以为1-约50个氨基酸。当所述生物发光蛋白或IG具有可以用来分隔功能性结构域和防止空间干扰的非必需N端氨基酸区域时，不需要肽序列。
连接的DNA序列可操作性地连接到适宜的转录或翻译调控元件上。负责DNA表达的调控元件仅位于编码第一多肽的DNA序列的5′。类似地，终止翻译和转录终止信号所需要的终止密码子仅存在于编码第二多肽的DNA序列的3′。
在一些实施方案中，编码重组多肽的序列进一步遗传融合到编码促进通过亲和层析纯化融合构建体的肽的序列上。实例包括组氨酸标记、麦芽糖-结合蛋白标记、纤维素-结合蛋白标记、内含肽标记、S-标记和GST标记。
在另一个实施方案中，编码重组多肽的序列遗传融合到编码促进融合构建体靶向真核宿主细胞的特定亚细胞区室或分泌到周围介质中的肽的序列上。实例包括核定位信号、线粒体输入序列、靶向内质网和输出信号的KDEL序列。
在另一个实施方案中，编码重组多肽的序列遗传融合到编码促进穿过真核细胞膜且因此将融合构建体摄入到细胞内的肽的序列上(Schwartz等，(2000)，现代分子治疗学观点(Curr.Opin.Mol.Ther.)，2，162-167)。实例包括来源于HIV Tat蛋白、单纯疱疹病毒VP22和卡波西FGF-4的肽序列。
作为重组方法的备选方案，多肽和寡肽可以化学合成。所述方法典型地包括固态方法，但是还可以利用基于溶液的化学和固态和溶液方法的一一种或多种组合。Merrifield，(1964)，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)，85，2149；和Houghton，(1985)，PNAS.USA.，82，5132记述了合成蛋白的固态方法的实例。
一旦按上述已经形成相互作用组和报道成分，它们就可以用在本发明的方法中。
在一些实施方案中，第一、第二和第三试剂中的每一个均是蛋白质的，其中第一和第二试剂通过遗传融合偶联以在适当的宿主细胞中与IG第三试剂一起表达IG-RC融合构建体。RCs的激活和检测以及IGs的缔合发生在活宿主细胞内、细胞器内、其细胞膜内或其表面上。
在另一个实施方案中，IG-RC试剂亚组是蛋白质的并且通过遗传融合偶联以在适当的宿主细胞中表达IG-RC融合构建体。将另一IG-RC试剂亚组，蛋白质样、非蛋白质的或其组合，加入到宿主细胞中，其任选地具有穿透宿主细胞膜的能力。RCs的激活和检测以及IGs的缔合发生在活宿主细胞内、细胞器内、其细胞膜内或其表面上。
在另一个实施方案中，所述IG-RC试剂，不管它们的性质和制备方法，在还可以包含适当缓冲物质的溶液中提供。IG-RC试剂可以是下列各项的一部分：细胞提取物、细胞级分或合成混合物，或可以是至少约90％纯度，更优选至少约95％纯度，且最优选至少约99％纯度。纯化按照本领域的标准方法发生，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、离子交换和/或尺寸排阻和/或疏水相互作用层析、HPLC、FPLC、凝胶电泳、毛细管电泳等(一般参见，Scopes，(1982)，蛋白质纯化(Protein Purification)，Springer-Overflag，纽约，Deutsche，酶学方法(Methods in Enzymology)卷182：蛋白纯化指南(Guide to Protein Purification).，学院出版公司(Academic Press，Inc.)纽约(1990))。
信号
当用于本文时，术语“信号”包括发光、荧光和检测为吸光度改变的比色改变。这可以由报道成分的酶活性和/或通过作用为报道成分的转录因子调控的报道基因的上调或下调而导致。信号也可以取决于报道成分之间的能量转移。
在一些实施方案中，信号应该是“发射的光”，其中检测信号的步骤是通过光检测器检测特定波长的光的光子。光检测器的实例包括光电倍增管或CCD照相机。检测器还包括将所检测的光限制为特定波长或特定波长范围内的工具。这可以是例如，固定在滤波器轮或滤波器载玻片上的适当的滤光器或单色光镜或分色镜。
在一些实施方案中，第一RC由对该RC特异性的激发光激活，并且由该RC发射的光被第二RC吸收。然后，检测由第二RC产生的荧光，或者如果第二RC是猝灭剂，那么则检测由第一RC产生的荧光的减少。
在一些实施方案中，第一RC通过加入对该RC特异性的底物而激活，并且由该RC发射的光被第二RC吸收。然后检测由所述第二RC产生的荧光，或者如果第二RC是猝灭剂，那么则检测由第一RC产生的发光的减少。
应该清楚，本发明的应用不限于由配体调控的受体的相互作用。在本发明的一个实施方案中，第二相互作用组通过酶裂解位点偶联到第三相互作用组上，并且调控剂是适合作用在所述酶裂解位点上的酶，以使通过检测器检测由第一和第二报道成分接近产生的信号的减少组成对第二和第三试剂的解离的检测，并且因此组成对第一和第三试剂的缔合的监测。
易于通过本发明分析的系统的实例
本发明的应用的实例是分析细胞因子受体信号传导。在通过结合它们的配体而激活时，细胞因子受体形成膜-结合的亚基的异源-二聚体。一个亚基通常对所述配体是特异性的，而另一个亚基负责信号转导并且由其它配体-特异性亚基共享。激活的受体与细胞内蛋白如信号转导子和转录(STAT)蛋白的激活剂相互作用(Ishihara等(2002)，生物化学和生物物理学学报(Biochim.Biophys.Acta)，1592，281-296)。因此，细胞因子受体信号传导包括具有许多重叠和多余功能的信号转导分子和受体分子网络。通常很难将特定的作用归因于特定分子或受体的作用。第一试剂可以来源于信号转导受体亚基(RC1-IG1)，第二试剂来源于形成适当的RET对(RC1-IG1:IG2-RC2)的信号转导蛋白(RC2-IG2)，且第三试剂来源于配体-特异性受体亚基。
当配体与采用配体-特异性受体亚基形式的第三试剂相互作用时，以信号转导蛋白形式的第二相互作用组与第三试剂缔合。如果信号转导受体亚基与配体-特异性受体亚基缔合，则第一和第二报道成分将接近并产生可检测的信号。
另一个实例是分析形成同源或异源-二聚体的G-蛋白偶联的受体(GPCRs)。最近的研究已经表明，GPCRs不但可以以单体作用，还可以以引起改变的配体结合、信号传导和胞吞作用的同源-和异源-二聚体作用(Rios等(2000)药物治疗(Pharmacol.Ther.)92，71-87)。因此，作用为特定受体的激动剂或拮抗剂的药物的作用可取决于该受体的结合配偶体。将药物的作用限制在由特定受体二聚体介导的细胞反应可能是理想的。本发明提供的系统能够监测特定GPCR异源-二聚体的活性。
GPCRs本身作用为IGs。一个GPCR附着在RC上(IG1-RC1，IG3)。第二个IG(IG2-RC2)来源于在配体结合时与GPCRs相互作用的分子(例如，β-抑制蛋白，或其突变体)。所述检测系统不但检测受体异源二聚体的形成，而且可以区分配体或药物是否作用为所述受体异源-二聚体的激动剂、部分激动剂、拮抗剂、逆激动剂或部分逆激动剂。
另一个实例是基因表达的转录调控。转录因子以多蛋白-DNA复合物形式作用，并且这些复合物的组成决定它们的特异性和活性(Wolberger等(1999)生物物理学和生物分子结构综述年刊(Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.)28，29-56)。例如，转录因子Fos仅作为与JUN转录因子家族成员的异源-二聚体才有活性(Chinenov等(2001)癌基因(Oncogene)20，2438-2452)。Fos/Jun二聚体可以激活或抑制多种基因的转录。该复合物的特异性和活性通过与该二聚体相互作用的其它蛋白调控，如ETS转录因子，NF-AT或Smad蛋白(Wang等(1994)分析细胞生物学(Mol.CellBiol.)14，1153-1159；Stranick等(1994)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)272，16453-16465；Zhang等(1998)自然(Nature)394，909-913)。IGs可以来源于Fos和Jun蛋白，其中一个附着在报道成分上。另一个IG来源于与Fos/Jun复合物相互作用的转录调控剂。该IG附着在第二RC上，其发射或猝灭由附着在Fos或Jun蛋白上的RC转移的光。该信号对于包括Fos/Jun蛋白特定组合的三聚体复合物的活性是特异性的。通过与其它调控剂相互作用激活Fos/Jun或使用相同调控剂激活不同的Fos/Jun复合物将导致不同的信号，这取决于它们是否是由于第一和第二IG缔合而发生，或是否是由于由第二和第三IG缔合引起的第一和第二RC接近而发生，或是否是由于二者的组合而发生。
另一个实例是开发新型抗病毒药物。HIV和其它病毒治疗的主要问题是病毒通过病毒蛋白的点突变而逐渐变得耐受目前开发的所有药物的适应性。因此，靶向病毒生命周期中的多个事件的治疗是更成功的，并且不同药物的混合物，即所谓的组合治疗，已经发现了宽泛的临床应用。有希望的、新型抗-反转录病毒药物是病毒进入抑制剂(Starr-Spires等(2002)，临床实验室医学(Clin.Lab.Med.)22，681-701)。HIV病毒体的进入通过两种细胞受体介导：CD4和CXCR4或CCR5，这取决于病毒株。当病毒表面改变时，仅阻断病毒-CD4相互作用的抗体或药物迅速放松它们的功效。本发明所提供的系统允许同时检测病毒与两种受体的结合。所述两种受体之一可以用RC标记，所述RC如是病毒表面蛋白，在形成三聚体复合物时产生特异性信号。因此，可以鉴定有效阻断两种相互作用或抑制病毒蛋白结合两种受体所需要的构象改变的化合物。由于同时靶向两种病毒相互作用，故较不可能出现抗性病毒。
在另一个实例中，本发明用来分析大的、稳定的分子复合物的组成、构象、组装或解离。RET信号的存在或不存在指示所述复合物的组装和功能性或在所述复合物、或复合物成分内的构象改变/运动。复合物的实例包括转录因子复合物、核糖体、蛋白质组、蛋白伴侣、寡聚体受体、离子通道等。
可能地是，在不同组织中的异源-二聚体的全体成员是独特的，且它们代表“新”的药物靶标。例如，6’guanidinoaltrindole，公知的KOP受体配体的类似物，已经鉴定为DOP-KOP异源-二聚体选择性激动剂，具有作为脊柱选择性止痛剂的功效，导致这样的结论，即DOP-KOP异源二聚体在脊髓中表达而不在脑内表达(Waldhoer，M.等(2005)异源-二聚体选择性激动剂在体内表现出与G-蛋白偶联的受体二聚体的相关性(Ahetero-dimer selective agnosit shows in vivo relevance of G-protein coupledreceptor dimers).美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)102，9050-9055)。因此，本发明能够鉴定新的药物靶标。
在许多情形中，在参考文献中未解释的观察资料可以由本发明所示的异源-二聚体对来揭示。例如，下述阿片样物质受体的变体是已知的：2muOR，2δOR和3κOR。然而，对于每种仅存在一种基因。已经表明在该家族内和之外的异源-二聚体形成可以解释这些结果。
其中药理学提示除基因外的更多靶点的其它实例包括β-AR4受体、降钙素-基因相关肽1和2、C5A受体亚型、ETB受体亚型、甘丙肽受体亚型、神经肽Y3亚型和血小板激活因子受体亚型。在许多情形中，其余一种或多种受体可以通过异源-二聚体对的存在进行解释，本发明能够进行其鉴定。
特别转向GPCRs，销售最好的GPCR-靶向药物包括克敏能(Claritin)(组胺受体/变态反应适应症)；Cozarr，依普罗沙坦(Teveten)(血管紧张素受体/高血压适应症)和氯氮平(Clozapine)(多巴胺/精神分裂症)-以及在下表中突出表示的其它药物(GPCR药物)。
Figure GSB00000507581200441
这些药物中的许多与多种GPCRs相互作用，其中一些作用可能包括异源-二聚体靶标。本发明允许证实由异源-二聚体引发的作用的系统途径和允许推论关于作用、和/或副作用的解释，其又允许开发最优化药物化合物的治疗益处的策略。
如使用6’guanidinoaltrindole的情形，已知的配体可以表现出不同的引发异源-二聚体受体的能力，其可以揭示现有分子的新应用：
-Hilairet等2003(生物化学杂志(J.Biol.Chem.)278，23731-23737)最近已经表明CB1拮抗剂通过经由CB1/OxR1异源-二聚体对抑制食欲。
-已经表明促生长素抑制素SSTR5受体将与多巴胺D2受体异源-二聚化(Rocheville等(2000)科学(Science)288，154-157)。
阿片样物质系统的一个特性在于受体不能再循环，并且这导致阿片样物质作用的脱敏。这是由于在配体刺激时受体不能内在化。本发明可以使得能够鉴定与阿片样受体异源-二聚化的受体，在所述情形中，关于这一配偶体受体的配体的共同施用可以引发所述受体异源-二聚体的内在化，并且由此避免阿片样物质受体脱敏成为可能。
孤独受体具有未知的功能，并且关于它们各自的配体没有可用的信息。许多GPCRs是孤独受体。本发明可以用来检测任何孤独受体能否与一组潜在的求偶受体(suitor receptor)、包括GPCRs形成异源-二聚体对。然后使用已知的激动剂和拮抗剂引发孤独受体的能力可以通过共表达研究检测。其最近的实例是使用MrgE孤独受体，发现其与MrgD受体异源-二聚化，并且提高MrgD激动剂B-丙氨酸的功效。这些受体有效地参与疼痛控制。
通常，对于高通量筛选和药物发现，这种类型的测定法可以用来在特定的多成分分子缔合物内在其环境中发现抑制或激活分子功能的化合物。同一分子在另一种缔合物内的功能可以不受影响。
本领域技术人员应该清楚，上述分子相互作用的方面在许多细胞功能中起重要作用，并且不限于在所述实例中描述的那些。
促甲状腺素释放激素受体/食欲肽受体异源-二聚体/-寡聚体
正如从下述实施例中清楚的，本发明人在本文中已经使用本发明的系统来鉴定和表征促甲状腺素释放激素受体与食欲肽受体的分子缔合。
短语“促甲状腺素释放激素受体”或“TRHR”应该理解成至少包括G蛋白偶联的受体，其与在前垂体腺的促甲状腺素细胞中、以及中枢神经系统中的多种结构由促甲状腺素释放激素(TRH)激活的相似(Riehl等(2000)神经精神病理学(Neuropsychopharmacology)23，34-45)，除了其它作用，其具有刺激促甲状腺素(甲状腺刺激激素；TSH)合成和分泌的主要调控作用，并且与促甲状腺素释放激素受体1(TRHR1)同义(Gershengom(2003)促甲状腺素释放激素受体信号传导(Thyrotropin-releasing hormone receptorsignaling)，在激素百科全书(Encyclopedia of hormones)中.Eds Henry HL和Norman AW.学院出版社.卷3；502-510)。短语“促甲状腺素释放激素受体”或“TRHR”也应该理解为意指促甲状腺素释放激素受体2或TRHR2，已知至少在大鼠和小鼠中表达的促甲状腺素释放激素受体的第二亚型，并且其功能尚未被清楚阐明(Gershengorn(2003)促甲状腺素释放激素受体信号传导(Thyrotropin-releasing hormone receptor signaling)，在激素百科全书(Encyclopedia of hormones)中.Eds Henry HL和Norman AW.学院出版社.卷3；502-510)。短语“促甲状腺素释放激素受体”或“TRHR”还应该理解为包括最新发现的TRHR家族成员。在实例中，促甲状腺素释放激素受体和缩写词TRHR是指TRHR1。
短语“食欲肽受体”或“OxR”应该理解为意指食欲肽受体1(OxR1；OXR1；OX1R；下丘泌素-1-受体；hcrtr 1)或食欲肽受体2(OxR2；OXR2；OX2R；下丘泌素-2-受体；hctr 2)，作为与Sakurai等描述的要被食欲肽A(OxA；下丘泌素-1；Hcrt-1)和食欲肽B(OxB；下丘泌素-2；Hcrt-2)(Sakurai等(1998)细胞(Cell)92，573-585)激活的那些相似的G蛋白-偶联受体。“食欲肽受体”或“OxR”还应该理解为包括最新发现的食欲肽受体家族成员。
本领域技术人员应该清楚，促甲状腺素释放激素受体与食欲肽受体的缔合使得能够使用一种受体的配体(它们应该是激动剂、逆激动剂或拮抗剂)治疗与另一种受体相关的疾病。
因此，本发明包括通过施用治疗有效量的促甲状腺素释放激素受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂来治疗患有食欲肽-相关疾病的患者的方法。
所述促甲状腺素释放激素受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂可以与食欲肽受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂共同施用。
本发明还包括通过施用治疗有效量的食欲肽受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂来治疗患有促甲状腺素释放激素-相关疾病的患者的方法。
本发明还包括制备用于通过施用治疗有效量的促甲状腺素释放激素受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂来治疗患有食欲肽-相关疾病的患者的药物的方法。
所述药物还可以包含食欲肽受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂。
本发明还包括制备用于通过施用治疗有效量的食欲肽受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂来治疗患有促甲状腺素释放激素-相关疾病的患者的药物的方法。
所述药物还可以包含促甲状腺素释放激素受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂。
因此，本发明包括通过施用治疗有效量的促甲状腺素-选择性结合剂、或其片段来治疗患有食欲肽-相关的疾病的患者的方法。
所述促甲状腺素-选择性结合剂可以是抗体，包括人源化的抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR-移植抗体和/或抗-独特型抗体。
本发明还包括通过施用治疗有效量的食欲肽-选择性结合剂、或其片段来治疗患有促甲状腺素释放激素-相关的疾病的患者的方法。
所述食欲肽-选择性结合剂可以是抗体，包括人源化的抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR-移植抗体和/或抗-独特型抗体。
Gary报道了促甲状腺素释放激素(TRH)在中枢神经系统(CNS)中的功能(Gary，Keith A.，等，体内稳态调控的促甲状腺素释放激素(TRH)假说：对于基于TRH的治疗的暗示(The Thyrotropin-Releasing Hormone(TRH)Hypothesis of Homeostatic Regulation：Implications for TRH-BasedTherapeutics)，JPET 305：410-416，2003)作为4种解剖学上不同的成分，它们一起包括通用的TRH体内稳态系统，它们为：1)下丘脑-促垂体神经内分泌系统(hypothalamic-hypophysiotropic neuroendocrine system)，2)脑干/中脑/脊髓系统，3)边缘/皮质系统，和4)生物钟学系统。
Gary还记录“对TRH调控和标准化CNS活性的整体功能的了解，以及对TRH本身作为治疗剂的固有限制性的了解，导致对在显著宽泛的临床情形中来自代谢稳定性TRH-模拟药物，作为单一治疗和作为其它治疗剂的佐剂二者的治疗益处的理性的预测”。
促甲状腺素释放激素-相关的疾病包括这样的疾病，即，其与增加的或减少的促甲状腺素释放激素生产、和/或增加的或减少的细胞针对促甲状腺素释放激素的响应性相关。下述列表(Gary，KeithA.，等，体内稳态调控的促甲状腺素释放激素(TRH)假说：对于基于TRH的治疗的暗示(TheThyrotropin-Releasing Hormone(TRH)Hypothesis of Homeostatic Regulation：Implications for TRH-Based Therapeutics)，JPET 305：410-416，2003)提供了一些TRH-相关的疾病的实例：
抑郁症，特别伴随嗜睡；
慢性疲劳综合征；
日间过度嗜睡(excessive daytime sleepiness)(包括嗜眠症)，神经衰弱，和昏睡；
对药物、化疗、或放射治疗继发的镇静；
镇静剂中毒/呼吸窘迫(ER设定(setting))；
全身麻醉恢复；
注意力缺陷/多动症(hyperactive disorder)；
生理节律紊乱(例如，时差综合征(jet lag))；
由情绪稳定剂*导致的两极情感疾病(bipolar affective discorder)；焦虑症*；
阿尔茨海默病和其它具有认知缺陷的痴呆症*；
癫痫病(Seizure disorders)*；和
运动神经元疾病*。
*可能作为辅佐治疗是特别有效的
然而，应该理解，短语促甲状腺素释放激素-相关疾病不限于此。
食欲肽-相关疾病包括这样的疾病，即，其与增加或减少的食欲肽生产、和/或增加或减少的细胞针对食欲肽的响应性相关。食欲肽-相关疾病的主要实例是伴有猝倒症的嗜眠症。在约90％的患者中，这与低的或不可检测的脑脊液(CSF)食欲肽A水平相关(Baumarm和Bassetti(2005)睡眠药物综述(Sleep Medicine Reviews)9，253-268)。食欲肽受体2基因突变导致家族性犬科动物嗜眠症，并且在偶发性犬科动物嗜眠症中观察到食欲肽神经元的丢失和低CSF食欲肽A。在一些情形中，由急性外伤性脑损伤引起的神经病症，急性感染性多神经炎和晚期帕金森综合征还可能与低的或不可检测的CSF食欲肽A水平相联系。Sakurai已经假设了食欲肽系统在饮食和能量体内稳态中的作用，原因在于食欲肽神经元的活性受葡萄糖和瘦蛋白抑制，并且受生长素释放肽刺激，所述生长素释放肽是一种促进饮食的胃源性肽。这可能具有关于肥胖症的治疗的暗示(Sakurai(2005)睡眠药物综述(Sleep Medicine Reviews)9，231-241)。
然而，应该理解，短语食欲肽-相关的疾病不限于此。
已知的食欲肽受体调控剂包括食欲肽A(OxA；下丘泌素-1；Hcrt-1)，食欲肽B(OxB；下丘泌素-2；Hcrt-2)以及它们的片段(Lang等(2004)药物化学杂志(JMed Chem)47，1153-1160)。
已知的的关于OxR1和OxR2的拮抗剂包括6，7-二甲氧基-1，2，3，4-四氢异喹啉类似物(Hirose M等(2003)生物有机药物化学通讯(Bioorg.Med.Chem.Lett.)13，4497-4499)，Almorexant((2R)-2-{(1S)-6，7-二甲氧基-1-[2-(4-三氟甲基苯基)-乙基]-3，4-二氢-1H-异喹啉-2-基}-N-甲基-2-苯基-乙酰胺；ACT-078573；Actelion药物有限公司(Actelion Pharmaceuticals Ltd.)，Allschwil，瑞士；Brisbare-Roch等(2007)自然医学(Nature Medicine)13，150-155)。
已知的OxR1拮抗剂包括SB-334867-A(1-(2-甲基苯并噁唑-6-基)-3-[1，5]二氮杂萘-4-基盐酸脲)，SB-674042(1-(5-(2-氟-苯基)-2-甲基-噻唑基-4-基)-1-((S)-2-(5-苯基-(1，3，4)噁二唑-2基甲基)-吡咯烷-1-基)-甲烷酮(methanone))，SB-408124(1-(6，8-二氟-2-甲基-喹啉-4-基)-3-(4-二甲基氨基-苯基)-脲)和SB-410220(1-(5，8-二氟-喹啉-4-基)-3-(4-二甲基氨基-苯基)-脲)(Haynes等(2000)调控肽(Regulatory Peptides)96，45-51；Langmead等(2004)英国药理学杂志(British Journal of Pharmacolog)141，340-346)。
已知的OxR2拮抗剂包括N-芳基甲基叔-亮氨酰6，7-二甲氧基-1，2，3，4-t四氢异-喹啉类似物和N-酰基6，7-二甲氧基-1，2，3，4-四氢异喹啉类似物(Hirose M等(2003)生物有机医学化学通讯(Bioorg.Med.Chem.Lett.)13，4497-4499)，和取代的4-苯基-[1，3]二噁烷，特别是1-(2，4-二溴-苯基)-3-((4S，5S)-2，2-二甲基-4-苯基-[1，3]二噁烷-5-基)-脲(McAtee LC等(2004)生物有机医学化学通讯(Bioorg.Med.Chem.Lett.)14，4225-4229)。
已知的促甲状腺素释放激素受体的调控剂包括促甲状腺素释放激素(TRH；促甲状腺素释放素；TRF；pGlu-His-Pro-NH2)，[Glu2]TRH，氨基端焦谷氨酰残基被吡啶鎓部分替代的[Glu2]TRH(Prokai-Tatrai等(2005)医学化学(Med.Chem.)1，141-152)，甲基-TRH，(3-甲基-His2)TRH，孟替瑞林((3R，6R)-6-甲基-5-氧代-3-硫代吗啉基羰基-L-组氨酰-L-脯氨酰胺四水合物；CG-3703；Grunenthal GmbH，Aachen，德国)，CNK-602A(N-[(6-甲基-5-氧代-3-硫代吗啉基)羰基]-L-组氨酰-L-脯氨酰胺；Renming等(1992)欧洲药理学杂志(Eur.J.Pharmacol.)223，185-192)，他替瑞林((-)-N-[(S)-六氢-1-甲基-2，6-二氧代-4-嘧啶基羰基]-L-组氨酰-L-脯氨酰胺四水合物；Ceredist；TA-0910；Tanabe Seiyaku有限公司，大阪，日本)，JTP-2942(Nα-[(1S，2R)-2-甲基-4-氧代环戊基羰基]-L-组氨酰-L-脯氨酰胺一水合物；日本烟草公司(Japan Tobacco，Inc.)，东京，日本)，氮替瑞林(YM-14673；Yamanouchi制药有限公司(Yamanouchi Pharmaceutical Co.，Ltd)，东京，日本)，DN-1417(γ-丁内酯-γ-羰基-组氨酰-脯氨酰胺柠檬酸盐；Miyamoto M等(1981)生命科学(LifeSci.)28，861-869)，RX-77368(pGlu-His-(3，3’-二甲基)-Pro-NH2；Ferring制药，Feltham，Middlesex，UK)，CG-3509(Grunenthal GmBH，Stolberg，德国)，MK-771(1-焦-2-氨基已二酰基-L-组氨酰-L-噻唑烷-4-羧酰胺(carboxamide)；默克(Merck)，Rahway，新泽西)，泊替瑞林(RGH 2202；L-6-酮哌啶-2-羰基-L-亮氨酰-L-脯氨酸酰胺；Gedeon RichterPharmaceuticals，布达佩斯，匈牙利)，Ro 24-9975(1S，3R，5(2S)，5S)-5-[(5-氧代-1-苯基甲基)-2-吡咯烷基]-甲基]-5-[(1H-咪唑-5-基)甲基]-环己烷乙酰胺；霍夫曼拉维奇罗氏(Hoffman-La Roche)，巴塞尔，瑞士)，普罗瑞林(5-氧代-L-脯氨酰-L-组氨酰-L-脯氨酸酰胺；
Figure GSB00000507581200501
TRH；Ferring制药，Tarrytown，纽约)，咪达唑仑，地西泮和氯氮
Figure GSB00000507581200502
(逆激动剂；Jinsi-Parimoo A和Gershengorn MC(1997)内分泌学(Endocrinology)138，1471-1475)。
已经建立了食欲肽系统和伴有猝倒症的嗜眠症之间的强相关性(Sakurai (2005)睡眠医学综述(Sleep Medicine Reviews)9，231-241)。此外，Nishino等提议TRH类似物可以有效用于治疗嗜眠症中的日间过度嗜睡(Nishino等(1997)神经科学杂志(The Journal of Neuroscience)17，6401-6408)。TRH类似物CG-3703和TA-0910以剂量-和时间-依赖性方式显著减少慢波睡眠(SWS)和快速眼动(REM)睡眠。此外，在研究的大部分动物中，TRH类似物完全抑制猝倒症。血清T3和T4没有显著变化，“表明TRH以及TRH类似物的抗猝倒和警示作用受神经调控性CNS特性介导而不受对甲状颈干(thyroid axis)间接作用的介导。”(Nishino等(1997)神经科学杂志(Thejournal of neuroscience)17，6401-6408)。在2000年，这些观察受到进一步研究的支持(Riehl等(2000)神经精神病药理学(Neuropsychopharmacology)23，34-45)。TRH和食欲肽(及其类似物)在嗜眠症病理生理学中的作用模式尚未阐明，然而，在本发明中鉴定的异源-二聚体/-寡聚体相互作用有助于这些受体系统的综合。Riehl等评论，“解释下丘泌素系统参与嗜眠症病理生理学中的机制尚不清楚。然而，有趣的是，注意到包含下丘泌素[食欲肽]-的神经元专一地位于外侧下丘脑处(Sakurai等1998[细胞(Cell)，92，573-585]；Peyron等1998[神经科学杂志(J.Neurosc.)18，9996-10015])，其为富含TRH神经元的区域(Kreider等1985[肽(Peptides)6，997-1000])。另外，下丘泌素[食欲肽]和TRH受体二者均为针对神经肽的G-蛋白偶联的受体，并且TRH受体表现出与下丘泌素[食欲肽]受体的第二高(25％)的同源性(与Y2神经肽Y受体具有最高同源性)(Sakurai等1998[细胞(Cell)，92，573-585])，表明TRH可能通过与下丘泌素[食欲肽]系统的未知的特异性相互作用而在嗜眠症的病理生理学中起重要作用。”(Riehl等(2000)神经精神病药理学(Neuropsychopharmacology)23，34-45)。作者已经鉴定TRH和食欲肽系统整合的可能性，而没有鉴定所述整合可作为在本发明中鉴定的受体异源-二聚化/-寡聚化的结果而发生。
除了嗜眠症之外，TRH和食欲肽受体系统可能关于饮食和代谢体内稳态的控制而整合。在饥饿过程中，甲状腺激素分泌被抑制，而在外侧下丘脑中，前下丘泌素原(食欲肽的前体)mRNA被上调。这样的观察导致Kok等研究TRH和食欲肽系统的整合，因为“尽管”，“下丘泌素-[食欲肽-]和促甲状腺素细胞神经回路的局部解剖图(topography)表明TRH神经活动受到下丘泌素[食欲肽]输入的控制，但是信号的本质(即，兴奋或抑制)保持为未知”(Kok等(2005)AJP-内分泌学和代谢学(AJP-Endocrinologyand Metabolism)288，892-899)。该研究证明与对照相比较，在食欲肽-缺陷型患发作性睡眠症的人中显著更低的平均血浆TSH浓度。重要的是注意到，在所述系统中，与前馈信号传导一样，包括通过在激素-神经递质-分泌神经元上或在其位置处表达的受体的自分泌和旁分泌反馈的复杂反馈途径可能是普遍的，并且可能在其中这些受体形成异源-二聚体/-寡聚体的系统整合中起生理学或病理生理学作用。
本发明包括针对促甲状腺素释放激素受体/食欲肽受体异源-二聚体/-寡聚体选择性活性筛选测试化合物的方法，所述方法包括下述步骤：
a)确定在食欲肽受体与促甲状腺素释放激素受体缔合时，所述测试化合物是否与所述食欲肽受体相互作用、和/或其程度；和
b)如果在食欲肽受体与促甲状腺素释放激素受体缔合时所述测试化合物与所述食欲肽受体相互作用，则在不存在促甲状腺素释放激素受体的条件下，确定所述测试化合物是否与所述食欲肽受体相互作用、或其程度；
以使在所述食欲肽受体与促甲状腺素释放激素受体缔合时与所述食欲肽受体相互作用时表现出更大亲和性和/或潜力和/或功效的测试化合物是针对促甲状腺素释放激素受体/食欲肽受体异源-二聚体/-寡聚体选择性的。
本发明包括针对促甲状腺素释放激素受体/食欲肽受体异源-二聚体/-寡聚体选择性活性筛选测试化合物的方法，所述方法包括下列步骤：
a)确定在促甲状腺素释放激素受体与食欲肽受体缔合时，所述测试化合物是否与所述促甲状腺素释放激素受体相互作用、和/或其程度；和
b)如果在促甲状腺素释放激素受体与食欲肽受体缔合时所述测试化合物与所述促甲状腺素释放激素受体相互作用，则在不存在食欲肽受体的条件下，确定所述测试化合物是否与所述促甲状腺素释放激素受体相互作用、或其程度；
以使在所述促甲状腺素释放激素受体与食欲肽受体缔合时与所述促甲状腺素释放激素受体相互作用时表现出更大亲和性和/或潜力和/或功效的测试化合物是针对促甲状腺素释放激素受体/食欲肽受体异源-二聚体/-寡聚体选择性的。
在本发明的优选实施方案中，通过本发明的方法进行下述步骤：确定在促甲状腺素释放激素受体与食欲肽受体缔合时测试化合物是否与所述促甲状腺素释放激素受体相互作用、和/或其程度的步骤；和/或确定在食欲肽受体与促甲状腺素释放激素受体缔合时测试化合物是否与所述食欲肽受体相互作用、和/或其程度的步骤。
本发明还包括通过施用治疗有效量的促甲状腺素释放激素受体/食欲肽受体异源-二聚体/-寡聚体选择性激动剂、逆激动剂或拮抗剂而治疗患有促甲状腺素释放激素-相关疾病或食欲肽-相关疾病的患者的方法。
本发明还包括治疗有效量的促甲状腺素释放激素受体/食欲肽受体异源-二聚体/-寡聚体选择性激动剂、逆激动剂或拮抗剂用于制备治疗患有促甲状腺素释放激素-相关疾病或食欲肽-相关疾病的患者的药物的应用。
本发明包括促甲状腺素释放激素受体/食欲肽受体异源-二聚体/-寡聚体的选择性激动剂和/或拮抗剂和/或逆激动剂。
当用于本文时，术语“患者”是指可能患有食欲肽-或促甲状腺素释放激素-相关疾病中的一种或多种的任何动物。最优选地，所述动物为哺乳动物。该术语应该理解为包括例如人、畜牧动物(即，牛、马、山羊、绵羊和猪)、家养宠物(即，猫和狗)等。
当用于本文时，短语“治疗有效量”是指足以调控与食欲肽受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂与食欲肽受体相互作用，或促甲状腺素释放激素受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂与促甲状腺素释放激素受体相互作用，或食欲肽受体/促甲状腺素释放激素受体异源-二聚体/寡聚体-特异性激动剂、逆激动剂或拮抗剂与食欲肽受体/促甲状腺素释放激素受体异源-二聚体/寡聚体的相互作用相关的生物学活性的量。在本发明该方面的情形中，其中促甲状腺素释放激素受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂与食欲肽受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂组合施用，组合中的促甲状腺素释放激素受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂的治疗有效量或食欲肽受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂的治疗有效量可以低于单独施用时促甲状腺素释放激素受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂或食欲肽受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂的治疗有效量。即，促甲状腺素释放激素受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂和食欲肽受体激动剂、逆激动剂或拮抗剂的组合施用可能以另外可能是其任一的亚治疗剂量产生治疗效果。
本发明的药物可以通过注射施用，或制备用于口服、肺部、鼻或用于任何其它施用形式。优选地，例如，药物通过例如静脉内、皮下、肌内、眼框内、眼部、心室内、颅内、囊内、脊柱内、池内、腹膜内、颊含、直肠、阴道、鼻内或通过气雾剂施用而施用。
然而，施用方式必须至少适合所述药物已经制备成的形式。对于最有效响应的施用方式可能需要凭经验确定，并且提供下述施用方式作为实例，并且不限制以任何方式递送本发明的组合物的方法。所有上述制剂通常在制药工业中使用并且对于适当有资格的从业者通常是已知的。
除了激动剂和/或逆激动剂和/或拮抗剂之外，本发明的药物可以包括药用无毒赋形剂和载体，并且通过任何肠胃外技术如皮下、静脉内和腹膜内注射进行施用。另外，制剂可以任选地包含一种或多种佐剂。
适合注射应用的药物形式包括无菌水溶液(在水溶性情形中)或分散体，和用于即时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉剂。备选地，本发明的化合物可以包封在脂质体中，并且在可注射溶液中递送，以辅助它们穿过细胞膜的转运。备选地，或另外地，所述制剂可以包含自我-组装的孔结构的成分，以促进穿过细胞膜的转运。所述载体可以是溶剂或分散介质，例如，其包含水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇，等)、它们的适当的混合物、和植物油。例如，通过利用涂层如磷脂酰胆碱，在分散体的情形中通过保持需要的粒度，和利用表面活性剂，可以保持适当的流动性。可注射组合物的延长的吸收可以通过在该组合物中使用延迟吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶而导致。
无菌注射溶液可以通过将需要量的活性化合物，当需要时，与各种上述列举的各种其它成分，结合在适当的溶剂中，然后过滤灭菌而制备。通常，分散体通过将各种无菌活性成分和来自上述列举的那些的需要的其它成分结合在包含基本分散介质的无菌赋形剂(vehicle)中而制备。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂的情形中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻-干燥技术，其产生活性成分加来自其预先无菌过滤的溶液的任何其它需要的成分的粉末。
在本文中考虑使用的是口服固体剂型，其一般在Martin，雷明顿药物科学(Remington′s PharmaceuticalSciences)，第18版.(1990Mack出版公司，Easton PA 18042)在第89章中描述，其通过引用结合在本文中。固体剂型包括片剂、胶囊、丸剂、药片或锭剂、扁囊剂或小丸剂。此外，可以使用脂质体或类蛋白包封来配制该组合物(如，例如，在美国专利号4,925,673中报道的类蛋白微球体)。可以使用脂质体包封，并且脂质体可以用各种聚合物衍生(例如，美国专利号5,013,556)。Marshall在现代制药学(ModernPharmaceutics)，第10章，Banker和Rhodes编，(1979)中提供了用于治疗的可能的固体剂型的描述，其通过引用结合在本文中。一般地，所述制剂包括作为本发明的部分描述的化合物(或其化学修饰的形式)、和允许针对胃环境提供保护、并且在肠中释放生物学活性物质的惰性成分。
对于本发明的激动剂、拮抗剂和逆激动剂，释放位置可以是胃、小肠(十二指肠、空肠(jejunem)、或回肠)、或大肠。本领域技术人员可获得在胃中不溶解而将在十二指肠或在肠内其它地方释放物质的制剂。优选地，释放将通过对所述组合物进行保护或通过在胃环境之外如在肠内释放该化合物而避免胃环境的有害作用。
为了确保完全的胃抗性，对至少pH 5.0是不能渗透的涂层是必需的。用作肠衣的较常见的惰性成分的实例是乙酸-1，2，4-苯甲酸纤维素(CAT)，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)，HPMCP 50，HPMCP 55，聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯(PVAP)，丙烯酸树脂L30D，Aquateric，醋酞纤维素(CAP)，丙烯酸树脂L，丙烯酸树脂S，和虫胶。这些涂层可以作为混合的薄膜使用。
涂层或涂层混合物还可以用在片剂上，其不是意欲针对胃进行保护。这可以包括糖涂层、或使得所述片剂更容易吞咽的涂层。胶囊可以由用于递送干治疗剂即粉剂的硬壳(诸如明胶)组成；对于液体形式，可以使用软明胶壳。扁囊剂的壳物质可以是稠淀粉或其它可食用的纸。对于丸剂、锭剂、模制的片剂或片剂研碎物，可以使用湿聚(moist massing)技术。
治疗剂可以以约1mm粒度的粒剂或小丸剂的形式作为细碎的微粒包含在制剂中。用于胶囊施用的物质的制剂还可以是作为粉剂，稍微压缩的填料(plugs)或者甚至作为片剂形式。所述治疗剂可以通过压缩制备。
着色剂和调味剂均可以包括在其中。例如，可以配制化合物(诸如通过脂质体或微球体包封)，然后进一步包含在可食用的产品中，诸如包含着色剂和调味剂的冷冻饮料中。
可以使用惰性物质稀释或增加治疗剂的体积。这些稀释剂可以包括碳水化合物、特别是甘露醇、α-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、改性葡聚糖和淀粉。某些无机盐也可以用作填充剂，包括三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。一些商购的稀释剂为Fast-Flo，Emdex，STA-Rx 1500，Emcompress和Avicell。
在治疗剂的配制过程中可以将崩解剂包含在固体剂型中。用作崩解剂的物质包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的商购崩解剂淀粉乙醇酸钠(Explotab)。淀粉羟乙酸钠、离子交换树脂(Amberlite)、羧甲基纤维素钠、ultramylopectin、藻酸钠、明胶、橙皮、酸性羧甲基纤维素、天然海绵和膨润土均可以使用。另一种形式的崩解剂是不溶的阳离子交换树脂。粉末状胶可以用作崩解剂和粘合剂，并且这些可以包括粉末胶诸如琼脂、刺梧桐或黄蓍胶。藻酸及其钠盐也可以有效用作崩解剂。
粘合剂可以用来保持治疗化合物在一起以形成硬片剂，并且包括来自天然产物的物质，如阿拉伯树胶、黄蓍胶、淀粉和明胶。其它包括甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)和羧甲基纤维素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)均可以用在醇溶液中来粒化治疗剂。
在治疗剂的配制过程中可以包括润滑剂(artifrictional agent)，以防止在配置过程中的黏附。润滑剂可以用作在治疗剂和模壁之间的层，并且这些可以包括但不限于：硬脂酸包括其镁盐和钙盐、聚四氟乙烯(PTFE)、液体石蜡、植物油和蜡。还可以使用可溶的润滑剂，诸如十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁、各种分子量的聚乙二醇、和聚乙二醇(Carbowax)4000和6000。
可以加入助流剂，所述助流剂可以在配制过程中提高化合物的流动性并且在压缩过程中辅助重排。所述助流剂可以包括淀粉、滑石、热解硅胶和水合硅铝酸盐。
为了辅助治疗剂溶解到水性环境中，可以加入表面活性剂作为湿润剂。表面活性剂可以包括阴离子去污剂如十二烷基硫酸钠、多库酯钠和二辛基磺酸钠。可以使用阳离子去污剂，并且其可以包括苯扎氯铵或苯索氯铵。可以作为表面活性剂包含在制剂中的潜在的非离子去污剂的列表为聚桂醇400、聚乙二醇酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯、聚山梨酯40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂可以单独或作为不同比例的混合物存在于化合物的制剂中。
有力提高化合物摄取的佐剂例如为脂肪酸油酸、亚油酸和亚麻酸。
控释制剂可以是理想的。可以将化合物结合在允许通过扩散或沥滤机制释放的惰性基质如树胶中。也可以将缓慢崩解基质结合在制剂中。该治疗剂的另一种控释形式是通过基于Oros治疗系统(Alza公司)的方法，即，将药物包封在半渗透性膜中，其允许水进入并且推动药物通过由于渗透作用形成的单个小开孔流出。一些肠衣还具有延迟释放的作用。
可以使用物质的混合物来提供最佳的薄膜涂层。薄膜涂敷可以在盘状涂布机或在流化床中或通过压缩涂敷进行。
本发明还考虑化合物的肺递送。在吸入时化合物可以被递送至哺乳动物的肺部，并且穿过肺上皮内层进入血流中。
在本发明的实践中考虑的应用是设计用于肺递送治疗产品的宽范围的机械装置，包括但不限于，喷雾器、定量吸入器、和粉末吸入器，所有这些都是本领域技术人员所熟悉的。
适用于实施本发明的商购装置一些具体实例为由Mallinckrodt，公司，圣路易斯，密苏里州制造的Ultravent喷雾器；由Marquest医学产品(MarquestMedical Products)，Englewood，科罗拉多制造的Acorn II喷雾器；由Glaxo公司，Research Triangle Park，北卡罗莱纳州制造的Ventolin定量吸入器；和由Fisons公司，Bedford，马萨诸塞州制造的Spinhaler粉末吸入器。
所有这样的装置需要使用适用于分散所述化合物的制剂。典型地，每种制剂对所用的装置类型是特异的，并且除了有效用于治疗的常用的稀释剂、佐剂和/或载体之外，可以包括使用适当的推进剂物质。此外，还考虑使用脂质体、微胶囊或微球体、内含物复合物、或其它类型的载体。
适用于喷气式或超声式的喷雾器的制剂典型地包括悬浮在水中的化合物。所述制剂还可以包括缓冲剂和简单的糖(例如，用于蛋白稳定和渗透压调节)。喷雾器制剂还可以包含表面活性剂，以减少或防止在形成气雾剂过程中由于溶液的雾化引起的表面诱导的化合物聚集。
用于定量吸入器装置的制剂通常包括细分的粉末，所述粉末包含在表面活性剂的辅助下悬浮在推动剂中的化合物。所述推动剂可以是任何常规用于该目的的物质，诸如含氯氟烃、氢氯氟烃、或氢氟烃、或烃，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇、和1，1，1，2-四氟乙烷或它们的组合。适当的表面活性剂包括三油酸山梨坦和大豆卵磷脂。油酸也可以有效用作表面活性剂。
用于从粉末吸入装置分散的制剂包括包含所述化合物的细分的干粉，并且还可以包括以促进粉末从所述装置分散的量如占所述制剂的重量的50-90％的填充剂，诸如乳糖、山梨醇、蔗糖、或甘露醇。所述化合物(或衍生物)应该最有利地配制在具有小于10微米平均粒度、最优选0.5-5微米平均粒度的微粒形式中，以用于最有效的递送至肺部末梢。
还考虑化合物的鼻递送。鼻递送允许蛋白在将治疗产品施用到鼻后直接通过血流，不需要该产品在肺部沉积。用于鼻递送的制剂包括具有葡聚糖或环糊精的那些。
应该理解，本发明的药物可以以单剂量时间表给药，或优选地，以多剂量时间表给药。多剂量时间表是其中递送的主要过程可以是使用1-10份单独的剂量，然后以保持或加强治疗所需要的随后的时间间隔给药其它剂量的一种时间表。该剂量方案还应该至少部分由个体的需要和从业者的判断所确定。
现在将通过仅参考下述非限制性实施例的方式进一步描述本发明。然而，应该理解，下述实施例仅是举例说明性的，并且不应该以任何方式视为是对上述本发明的一般性的限制。特别地，尽管关于特异性相互作用组的使用详细描述了本发明，但是应该清楚地明白本发明的发现不限于这些相互作用组。
实施例
一般方法
将细胞以约630,000个细胞/孔(HEK293FT)或约150,000个细胞/孔(COS-7)的密度接种在6-孔板中，并且在37℃，5％CO2保持在补充了10％胎牛血清(FCS；Gibco)的完全培养基(包含0.3mg/ml谷氨酰胺，100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Gibco)的DMEM)中。在接种后24小时，使用GeneJuice(Novagen)或Metafectene(Biontex)按照供应商的用法说明进行瞬时转染。转染后24小时，用PBS洗涤细胞，使用0.05％胰蛋白酶/0.53mMEDTA脱附，重悬在HEPES-缓冲的不含酚红的含5％FCS的完全培养基中，并且加入到聚-L-赖氨酸-包被的白色微量培养板(Nunc)中。转染后48小时，在用EnduRenTM普洛麦格((Promega))以30-40μM的终浓度在37℃，5％CO2预温育细胞2小时后，进行eBRET测定法2小时。对于原始的BRET研究，所述HEPES-缓冲的不含酚红的完全培养基用PBS替代，并且在开始该测定法之前立即加入腔肠素h(分子探针(MolecularProbes))至终浓度5μM。BRET测量在37℃使用Victor光平板读数仪利用Wallac 1420软件(Perkin-Elmer)进行。在每个‘供体波长范围’(400-475nm)和‘受体波长范围’(对于EGFP＞500nm或对于EYFP、Topaz(TYFP)或Venus 520-540nm)连续测量过滤的光发射3-5秒。通过减去背景BRET比例而标准化在相互作用的蛋白之间观察到的BRET信号。这可以以下列两种方式中的一种进行(参见Pfleger等(2006)细胞信号(Cell Signal)18，1664-1670；Pfleger等(2006)自然方法(Nat Protoc)1，336-344)：1)从关于包含相互作用的受体和供体融合蛋白的样品的同一比例减去关于仅包含供体构建体的细胞样品通过在400-475nm发射的‘受体波长范围’的光发射比例；2)从关于用配体处理的同一细胞样品的第二等分试样的同一比例减去关于用赋形剂处理的细胞样品通过在400-475nm发射的‘受体波长范围’的光发射比例。在下述实施例中，将使用第一种计算法，除非将信号描述为‘配体诱导的BRET比例’。备选地，并且特别地，当举例说明z-因子数据时(Zhang等(1999)生物分子筛选杂志(J Biomol Screen)4，67-73)，在相互作用的蛋白之间观察的BRET信号可以与背景BRET比例结合(与减去之相反)显示，以独立地评估与在相互作用的蛋白之间观察到的BRET信号相关的误差和与背景BERT比例相关的误差。在该情形中，数据显示为“荧光/发光”，作为关于特定细胞样品的通过在400-475nm发射的‘受体波长范围’的光发射比例。除非另外阐述，在96孔微量培养板中测量BRET信号。
实施例1 指示促甲状腺素释放激素受体与食欲肽受体的分子缔合的可检 测信号的测量
现在参考图4，在用它们各自的配体处理后，从瞬时共表达TRHR/Rluc和barr2/Venus与pcDNA3，OxR2，CXCR2，HA-MC3R，HA-MC4R，D2LR或D2SR的细胞测量eBRET信号。
在配体(在0分钟处加入)处理之前，对于每种受体组合记录基线eBRET信号。在第一分钟内，对共表达TRHR/Rluc和barr2/Venus与pcDNA3的细胞的TRH处理导致eBRET信号快速达到大于0.17的峰值，并且该信号在整个记录时间期间内(接近2小时)保持较高。在用OxA处理共表达TRHR/Rluc、barr2/Venus和OxR2的细胞后也观察到信号。然而，该信号持续30分钟达到约0.07-0.08。对于其余受体组合中的任一种没有观察到配体-诱导的eBRET信号。
本实施例表明，对于其中促甲状腺素释放激素受体(TRHR)是IG1，Rluc是RC1，β-抑制蛋白2(barr2)是IG2，Venus是RC2和OxR2是IG3的组合，并且当在该情形中调控剂OxA作为与IG3特异性相互作用的结果调控IG2和IG3的缔合时，特异性检测到由RC1和RC2的接近导致的信号。当IG3为CXCR2，HA-MC3R，HA-MC4R，D2LR或D2SR并且对这些IG3s特异性的激动剂调控IG2和IG3的缔合时，没有检测到信号，这表明该信号是针对OxR2作为IG3的组合特异性的。
更一般地，本实施例表明本发明的方法鉴定和/或监测特异性相互作用组之间的特异性分子缔合的能力，并且本发明人使用在本发明中所述的方法已经鉴定了促甲状腺素释放激素受体与食欲肽受体的分子缔合。
本实施例还表明，关于由于IG2和IG3缔合调控导致的由RC1和RC2接近产生的信号所观察到的动力学模式不同于在该IG1-IG2缔合由配体，在该情形中是TRH，与IG1的特异性相互作用调控时关于由IG1和IG2缔合导致的由RC1和RC2接近产生的eBRET信号所观察到的动力学模式。与后种模式相比，前种模式基本上是延迟的。
实施例2 指示促甲状腺素释放激素受体与食欲肽受体的分子缔合的加性 (additive)可检测信号的测量
现在参考图5，从瞬时共表达TRHR/Rluc和EGFP/barr1或EGFP/barr2与pcDNA3或OXR2的细胞测量eBRET信号。配体处理是仅用OxA或TRH或组合的OxA和TRH二者。
在配体(在0分钟处加入)处理之前，对于每种受体组合记录基线eBRET信号。在整个记录时间时期(70分钟)，用PBS处理的表达每种组合的细胞仅表现出基线eBRET信号。在用OxA处理之后，表达OxR2和EGFP/barr1(十字形)或EGFP/barr2(灰色倒三角形)的细胞表现出在超过10分钟后达到平台的eBRET信号。在仅表达TRHR/Rluc(无OxR2)与任一种barr的细胞中，TRH处理导致对eBRET信号的快速刺激。具有barr2的信号(黑色圆)比关于barr1(灰色三角形)的信号大，然而，如果存在OxA，则关于任一种抑制蛋白不存在差异(barr2，黑色三角形；barr1，灰色圆)。在表达TRHR/Rluc和OxR2(barr1，灰色正方形；barr2，黑色正方形)二者的细胞中，加入两种配体表现出增加的eBRET信号，其高于在单独加入OxA或TRH之后观察到的信号。
本实施例表明，对于其中促甲状腺素释放激素受体(TRHR)是IG1，Rluc是RC1，β-抑制蛋白1(barr1)或β-抑制蛋白2(barr2)是IG2，EGFP是RC2和OxR2是IG3的组合，在调控剂OxA作为与IG3特异性相互作用的结果调控IG2和IG3的缔合时，检测到由RC1和RC2的接近导致的信号。
因此，本实施例表明使用与实施例1所示的备选组合，包括使用不同的IG2和RC2的信号检测。
如在实施例1中，本实施例表明关于在该情形中由于通过OxA调控IG2和IG3的缔合导致的由RC1和RC2接近产生的信号所观察到的延迟的动力学模式不同于在该IG1-IG2缔合由配体，在该情形中是TRH，与IG1的特异性相互作用调控时关于由IG1和IG2缔合导致的由RC1和RC2接近产生的eBRET信号所观察到的更快速的动力学模式。然而，除了在实施例中所表明的之外，本实施例表明使用IG1配体(TRH)和IG3配体(OxA；调控剂)组合治疗的加性效应。
因此，本实施例提供本发明所述的方法鉴定和/或监测特异性相互作用组之间的特异性分子缔合的能力的深入且清楚的证明，以及使用本发明所述的方法关于促甲状腺素释放激素受体与食欲肽受体的分子缔合的深入且清楚的证据，原因在于该附加作用是除了IG2-IG3-IG1缔合之外由于IG1-IG2缔合的结果产生的RC1和RC2接近的指示。这提供针对在不存在IG1-特异性配体的条件下由非特异性IG1-IG2缔合产生的信号的证据。不希望受到理论限制，这种附加作用也可能部分是由于IG1配体作用为调控剂通过对IG3的变构作用而调控IG2和IG3的缔合所导致。此外，这种附加作用也可能部分是由于活性IG构象(与激动剂结合的一种构象)导致，所述构象更有利于信号产生，可能能够增加RC1和RC2的接近，或更有利于RC1和RC2的相对取向。
实施例3 竞争调控剂结合的拮抗剂对信号产生的作用的测量
现在参考图6，在加入10-6M OxA(IG3配体；调控剂)或10-6M TRH(IG1配体)、或二者之前用10-6M OxR1-选择性拮抗剂SB-334867-A预处理约40分钟后，从瞬时共表达TRHR/Rluc和barr2/Venus与pcDNA3、OxR1或OxR2的细胞测量eBRET信号。将未用拮抗剂预处理的细胞用PBS代替进行预处理相同量的时间。
在激动剂(在0分钟处加入)处理之前，对于每种受体组合记录基线eBRET信号。对于OxA-处理的TRHR/Rluc和barr2/Venus与OxR1观察到小eBRET信号(灰色菱形)。在存在拮抗剂的条件下，该信号减小(开放的正方形)。向表达OxR1的细胞中加入TRH和OxA二者导致高得多的信号(白色三角形)，并且在存在拮抗剂的条件下，该信号的大小减小(灰色圆形)。在用OxA处理共表达TRHR/Rluc、barr2/Venus与OxR2的细胞后观察到eBRET信号(黑色菱形)。该信号不受拮抗剂预处理的影响(白色正方形)。向表达OxR2的细胞中加入TRH和OxA二者产生这样的信号，其在存在(黑色圆形)或不存在(灰色三角形)拮抗剂的条件下没有不同。
本实施例显示，对于其中促甲状腺素释放激素受体(TRHR)是IG1，Rluc是RC1，β-抑制蛋白2(barr2)是IG2，Venus是RC2和OxR1或OxR2是IG3的组合，在调控剂OxA作为与IG3特异性相互作用的结果调控IG2和IG3的缔合时，检测到的由RC1和RC接近产生的信号。
本实施例表明，调控剂结合的特异性拮抗性，在该情形中，OxA通过OxR1-选择性拮抗剂SB-334867-A作用在OxR1上的特异性拮抗性，可以作为其对由于受到调控剂调控的RC1和RC2接近产生的信号的结果而检测，在该情形中所述调控剂是OxA。
实施例4 存IG3上应用不组成报道成分的标记
现在参考图7，从瞬时共表达TRHR/Rluc和EGFP/barr1或EGFP/barr2与pcDNA3或HA-OxR2的细胞测量eBRET信号。配体处理是仅用OxA或TRH。
在配体(在0分钟处加入)处理之前，对于每种受体组合记录基线eBRET信号。在整个记录时间时期(80分钟)，用PBS处理的表达每种组合的细胞仅表现出基线eBRET信号(数据未显示)。在用OxA处理之后，表达HA-OxR2和任一种EGFP/barrs的细胞表现出在超过10分钟后达到平台的eBRET信号(EGFP/barr1，黑色菱形，和EGFP/barr2，黑色圆形)。在仅表达TRHR/Rluc的细胞(无HA-OxR2)中，TRH刺激eBRET信号的快速增加，在最初的几分钟内达到峰值，然后在剩余的记录时间期间内信号略微下移(灰色正方形)。在向缺乏HA-OxR2的细胞中加入OxA后没有观察到eBRET信号高于基线的增加(灰色三角形)。
本实施例显示，对于其中促甲状腺素释放激素受体(TRHR)是IG1，Rluc是RC1，β-抑制蛋白1(barr1)或β-抑制蛋白2(barr2)是IG2，EGFP是RC2和血凝素(HA)表位-标记的OxR2(HA-OxR2)是IG3的组合，在调控剂OxA作为与IG3特异性相互作用的结果调控IG2和IG3的缔合时，检测到的由RC1和RC2的接近产生的信号。
本实施例表明，IG3可以被标记，诸如通过加入血凝素(HA)表位-标记，然而，该标记不组成报道成分并且不干扰和/或有助于由RC1和RC2的接近产生的信号。这样的标记能够确定附加信息，诸如IG3的相对表达水平。
实施例5 突变体β-抑制蛋白作为相互作用组的应用
现在参考图8，从瞬时共表达TRHR/Rluc和EGFP/barr1或EGFP/barr1不依赖磷酸化作用的突变体R169E(EGFP/barr1R169E)与pcDNA3或OxR2的细胞测量eBRET信号。配体处理为仅用OxA或TRH。
在配体(在0分钟处加入)处理之前，对于每种受体组合记录基线eBRET信号。在整个记录时间时期(100分钟)，用PBS处理的表达每种组合的细胞仅表现出基线eBRET信号(白色正方形，白色菱形和黑色菱形)。在用OxA处理之后，表达OxR2和EGFP/barr1(黑色圆形)或EGFP/barr1R169E(黑色三角形)的细胞表现出eBRET信号，其中EGFP/barr1在超过10分钟后达到平台，而EGFP/barr1R169E显示较低的信号，其直到20分钟才达到平台。在仅表达TRHR/Rluc(无OxR2)与任一种barrs的细胞中，TRH刺激eBRET信号的快速增加，在最初的几分钟内达到峰值，然后在剩余记录时间期间内该信号略微下移。关于EGFP/barr1R169E的信号(白色三角形)低于关于EGFP/barr1的信号(白色圆形)，其可能反映该蛋白的较低的表达水平。
本实施例显示，对于其中促甲状腺素释放激素受体(TRHR)是IG1，Rluc是RC1，barr1或barr1R169E是IG2，EGFP是RC2和OxR2是IG3的组合检测到的由RC1和RC2的接近产生的信号。
本实施例表明，在使用突变体β-抑制蛋白，如β-抑制蛋白1不依赖磷酸化作用的突变体R169E，作为相互作用组之一时，可以产生可检测的信号。
实施例6 测量指示C-端截短的促甲状腺素释放激素受体与食欲肽受体 的分子缔合的可检测的信号
现在参考图9，从瞬时共表达TRHR335/Rluc和EGFP/barr1与OxR2或TRHR的细胞测量eBRET信号。配体处理是仅用OxA或TRH。
在配体(在0分钟处加入)处理之前，对于每种受体组合记录基线eBRET信号。在用OxA处理之后，表达OxR2的细胞(黑色圆形)表现出在约20分钟之后达到平台的eBRET信号。相反，在用OxA处理时从表达TRHR的细胞(白色三角形)，或在用TRH处理时从表达OxR2的细胞(黑色正方形)，没有观察到高于基线的eBRET信号。
本实施例显示，对于其中在氨基酸335处截短的促甲状腺素释放激素受体(TRHR335)是IG1，Rluc是RC1，β-抑制蛋白1(barr1)是IG2，EGFP是RC2和OxR2或TRHR是IG3的组合，检测到由RC1和RC2的接近产生的信号。
本实施例表明，在IG1不与IG2相互作用时，在该情形中，截短的TRHR不与barr1相互作用，可以产生可检测的信号(Heding等(2000)内分泌学(Endocrinology)141，299-306)。当用TRH处理TRHR335/Rluc+EGFP/barr1+OxR2时在图9中观察到的信号缺乏证实当用OxA处理该试剂组合时观察到的信号不是由于IG1-IG2缔合产生。
因此，本实施例提供促甲状腺素释放激素受体与食欲肽受体分子缔合的深入且清楚的证据，原因在于IG1不与IG2相互作用是作为IG2-IG3-IG1缔合而不是IG1-IG2缔合的结果的RC1和RC2接近的指示。这进一步提供针对在不存在IG1-特异性配体的条件下由非特异性IG1-IG2缔合产生的信号的证据。
此外，本实施例表明，该信号由IG2-IG3-IG1缔合导致，而与引起IG1反式激活的IG3激活相反，其然后与IG2缔合，由此在IG2和IG3不缔合的条件下引起RC1和RC2紧密接近。
实施例7 测量以特征性剂量-依赖性方式指示TRHR与OXR2分子缔合的 可检测的信号
现在参考图10、11和12，从瞬时共表达下列各项的细胞测量BRET信号：TRHR/Rluc和barr2/Venus与pcDNA3(用增加的TRH剂量处理；图10)；OxR2/Rluc和barr2/Venus与pcDNA3(用增加的OxA剂量处理；图11)；以及TRHR/Rluc和barr2/Venus与OxR2(用增加的OxA剂量处理；图12)。
本实施例显示：关于TRHR作为IG1，Rluc作为RC1，barr2作为IG2，Venus作为RC2且在不存在IG3的条件下的TRH剂量-响应曲线(图10)；关于OxR2作为IG1，Rluc作为RC1，barr2作为IG2，Venus作为RC2且在不存在IG3的条件下的OxA剂量-响应曲线(图11)；以及关于TRHR作为IG1，Rluc作为RC1，barr2作为IG2，Venus作为RC2和OxR2作为IG3的OxA剂量-响应曲线(图12)。
本实施例表明，信号可以以剂量-依赖性方式检测。此外，关于由作用在IG3(OxR2)上的调控剂(OxA)以及因此由IG1-RC1(TRHR/Rluc)和IG2-RC2(barr2/Venus；图12)接近产生的信号的EC50值与来自导致IG 1-RC1(OxR2/Rluc)和IG2-RC2(barr2/Venus；图11)接近的OxA对IG1(OxR2)的激活的那些相当，并且不同于来自导致IG1-RC1(TRHR/Rluc)和IG2-RC2(barr2/Venus；图10)接近的TRH对IG1(TRHR)的激活的那些。
因此，本实施例进一步表明，信号由IG2-IG3-IG1缔合产生而不是由IG1-IG2缔合产生。
关于导致IG 1-RC1(OxR2/Rluc)和IG2-RC2(barr2/Venus；图11)接近的OxA对IG1(OxR2)的激活；和导致IG1-RC1(TRHR/Rluc)和IG2-RC2(barr2/Venus；图10)接近的TRH对IG1(TRHR)的激活的剂量-响应Hill斜率均约为1。相反，关于导致IG1-RC1(TRHR/Rluc)和IG2-RC2(barr2/Venus；图12)接近的作用在IG3(OxR2)上的调控剂(OxA)的剂量-响应Hill斜率显著大于1。
因此，本实施例表明使用Hill斜率作为指征鉴定和监测特异性分子缔合的潜力。
本实施例进一步表明，不同形式的Rluc底物(报道成分引发物)，在该情形中为腔肠素h和EnduRen，可以用来产生具有相似EC50值的数据(图12)。
实施例8 测量以剂量-依赖性方式指示TRHR与OXR2的分子缔合的加 性可检测信号
现在参考图13和14，在不存在OxR2的条件下，使用增加剂量的TRH，从瞬时共表达TRHR/Rluc和EGFP/barr1的细胞，以及使用增加的OxA剂量有和无10-6M TRH、或增加的TRH剂量与10-6M OxA，从瞬时共表达TRHR/Rluc和EGFP/barr1与OxR2的细胞，测量BRET信号。
本实施例显示通过将使用10-6M TRH产生的配体诱导的信号(来自TRH：TRHR/Rluc+EGFP/barr 1曲线)与关于OxA：TRHR/Rluc+EGFP/barr1+OxR2曲线所产生的每个点相加而数学产生的曲线(TRHR/Rluc+EGFP/barr1+OxR2：TRH(10-6M)+OxA：计算的数据)，其在由关于TRHR/Rluc+EGFP/barr1+OxR2：TRH(10-6M)+OxA组合观察到的数据产生的曲线之上(图13)。
此外，本实施例显示通过将使用10-6M OxA产生的配体-诱导的信号(来自OxA：TRHR/Rluc+EGFP/barr1+OxR2曲线)与关于TRH：TRHR/Rluc+EGFP/barr1曲线产生的每个点相加而数学产生的曲线(TRHR/Rluc+EGFP/barr1+OxR2：TRH+OxA(10-6M)：计算的数据)，其在关于TRHR/Rluc+EGFP/barr1+OxR2：TRH+OxA(10-6M)组合观察到的数据产生的曲线之上(图14)。
因此，本实施例清楚地表明了使用IG1配体(TRH)和IG3配体(OxA；调控剂)组合处理的剂量依赖性方式的加性效应。
因此，本实施例进一步提供关于促甲状腺素释放激素受体与食欲肽受体的分子缔合的证据，原因在于该加性效应指示作为除了IG2-IG3-IG1缔合之外的IG1-IG2缔合结果的RC1和RC2接近。这进一步提供针对在不存在IG1-特异性配体条件下来源于非特异性IG1-IG2缔合的信号的证据。不希望受到理论限制，该加性效应还可能部分是由于IG1配体作用为调控剂通过对IG3的变构作用而调控IG2和IG3的缔合而产生。此外，该加性效应还可能部分是由于活性IG构象(与激动剂结合的构象)，其更有利于信号产生，可能能够增加RC1和RC2的接近，或RC1和RC2的更有利的相对取向。
实施例9 测量指示TRHR与不同表达水平的OXR2的分子缔合的可检测 的信号
现在参考图15，在加入10-6MOxA后，从瞬时共表达TRHR/Rluc、EGFP/barr1和OxR2的细胞测量eBRET信号。
本实施例显示关于每种受体组合随时间的累积eBRET读数(IG1和IG3；在83分钟内捕获的数据)。对于每次实验，转染相同量的EGFP/barr1(IG2-RC2)。以恒定量(0.1μg DNA/孔)转染TRHR/Rluc(IG1-RC1)，而以变化量的DNA(0，0.01，0.05，0.1，0.5，0.7μg DNA/孔)转染OxR2(IG3)。仅当OxR2(IG3)表达时，检测到信号(在0μg OxR2没有记录到信号)。
本实施例表明当OxR2的DNA浓度信号低至0.01μg DNA/孔时，可以检测到信号。
此外，本实施例表明，在每次转染中增加的OxR2DNA的量导致可检测信号的增加。在1∶1比例的DNA浓度(0.1∶0.1μgDNA/孔)观察到最大可检测信号。以高于TRHR/Rluc DNA的量的水平进一步增加OxR2DNA浓度(0.5或0.7μgDNA/孔)导致检测到较低的信号。
本实施例暗示增加IG3分子(OxR2)数目导致到达这样的点，所述点超过IG1分子(TRHR)数目成为形成异源-二聚体/-寡聚体的限制的点。因此，当与不产生信号的调控剂(OxA)相互作用时，对于不与IG1分子(TRHR)缔合的IG3分子(OxR2)存在与IG2-RC2(EGFP/barr1)缔合的增加的倾向。因此，由于关于IG2-RC2(EGFP/barr1)缔合的竞争作用，信号产生将受到抑制。
因此，本实施例使用本发明所述的方法提供关于促甲状腺素释放激素受体与食欲肽受体的分子缔合的深入且清楚的证据，原因在于，如果信号不是依赖于IG1和IG3的特异性分子缔合，则预计使用超过IG1浓度增加的增加的IG3浓度不会发生这样的信号减少。
实施例10 在384-孔板中测量指示TRHR与OXR2的分子缔合的可检测 信号
现在参考图16，在96-孔和384-孔微量培养板中使用增加的OxA剂量，从瞬时共表达TRHR/Rluc、barr2/Venus和OxR2的细胞测量BRET信号。
使用相同浓度的表达相同浓度的试剂的细胞，相同浓度的Rluc底物(报道成分引发物)和相同浓度的配体(调控剂)，进行BRET测量。加入到384-孔板的每个孔的总体积约为加入到96-孔板的每个孔的体积的一半。
本实施例表明除了96-孔板之外，在384-孔板中，以剂量-依赖性方式指示TRHR与OxR2的分子缔合的可检测信号的测量。
因此，本实施例证明本发明所述的方法能够按比例缩小，由此使其易于进行高通量筛选应用。
实施例11 测量指示作为IG3的促甲状腺素释放激素受体与作为IG1的食 欲肽受体的分子缔合的可检测信号
现在参考图17，从瞬时共表达OxR2/Rluc8和barr2/Venus与HA-TRHR或pcDNA3的细胞，测量eBRET信号。配体处理为用OxA或TRH。
在配体或赋形剂(在0分钟处加入)处理之前，对于每种受体组合记录基线eBRET信号。在最初5分钟内，用OxA处理共表达OxR2/Rluc8和barr2/Venus与HA-TRHR的细胞，导致eBRET信号快速达到0.1的峰值，并且在整个记录时间期间(经过1小时)内该信号保持为较高。在用TRH处理共表达OxR2/Rluc8、barr2/Venus和HA-TRHR的细胞后，也观察到信号。然而，该信号随时间逐渐增加至达到0.05。在用TRH处理共表达OxR2/Rluc8和barr2/Venus与pcDNA3的细胞之后没有观察到配体-诱导的eBRET信号。
本实施例表明，对于其中OxR2是IG1，Rluc8是RC1，β-抑制蛋白2(barr2)是IG2，Venus是RC2和HA-TRHR是IG3的组合，并且当调控剂，在该情形中为TRH，作为与IG3特异性相互作用的结果调控IG2和IG3的缔合时，特异性检测到由RC1和RC2接近产生的信号。
本实施例表明使用作为IG3的促甲状腺素释放激素受体和作为IG1的食欲肽受体检测到促甲状腺素释放激素受体与食欲肽受体的分子缔合。这表明与前述实施例比较使用备选的IG’s排列这些受体的分子缔合的检测。
本实施例还表明第二类型的萤光素酶，Rluc8的应用，在该情形中其用作RC1，Venus作为RC2。
本实施例进一步表明记述在Pfleger等，2006(细胞信号(Cell Signal)18，1664-1670)和Pfleger等，2006(自然方法(Nat Protoc)1，336-344)中的计算eBRET信号的备选方法可以用来测量指示促甲状腺素释放激素受体和食欲肽受体的分子缔合的可检测信号。
如在实施例4中，本实施例表明可以标记IG3，诸如通过加入血凝素(HA)表位-标记，然而，该标记不组成报道成分并且不干扰和/或有助于由RC1和RC2的接近产生的信号。这样的标记能够使用本发明所述的方法确定额外的信息，诸如IG3的相对表达水平。
实施例12 测量指示促甲状腺素释放激素受体与具有超过0.6的Z-因子的 食欲肽受体的分子缔合的可检测信号
现在参考图18、19和20，从等分在96-孔板的所有孔中的瞬时共表达TRHR/Rluc8和barr2/Venus与HA-OxR2的细胞测量eBRET信号。在96孔板的前两行和最后两行(共48个孔)加入磷酸缓冲盐溶液(PBS)作为赋形剂对照。将OxA加入到96孔板的中间4行(共48个孔)中。数据表示为荧光/发光。
在配体或赋形剂(在0分钟处加入)处理之前，记录基线读数。用OxA处理共表达TRHR/Rluc8和barr2/Venus与HA-OxR2的细胞导致荧光/发光比例的增加(图19)，在用磷酸缓冲盐溶液(PBS)赋形剂对照处理后没有观察到该增加(图18)。使用Zhang等，1999(生物分子筛选杂志(JBiomol Screen)4，67-73)所述的计算法，比较用OxA处理的48-孔(定义为关于z-因子计算的‘信号’)和用PBS处理的48-孔(定义为关于z-因子计算的‘背景’)的荧光/发光比例的分析导致0.67的z-因子。平均值显示为实线和来自显示为虚线的平均值的3个标准偏差。
本实施例表明，对于其中TRHR是IG1，Rluc8是RC1，β-抑制蛋白2(barr2)是IG2，Venus是RC2和HA-OxR2是IG3的组合，并且在调控剂，在该情形中为OxA，作为与IG3特异性相互作用的结果调控IG2和IG3的缔合时，特异性检测到由于RC1和RC2的接近产生的信号。
本实施例表明，以导致超过0.6的z-因子的方式检测促甲状腺素释放激素受体和食欲肽受体的分子缔合，并且因此易于进行高通量筛选。
本实施例进一步证明表示BRET数据的第三种方法，其可以用来表示指示促甲状腺素释放激素受体和食欲肽受体的分子缔合的可检测信号。
如在实施例4和12中，本实施例表明可以标记IG3，诸如通过添加血凝素(HA)表位-标记，然而，该标记不组成报道成分并且不干扰和/或有助于由RC1和RC2的接近产生的信号。这样的标记能够使用本发明所述的方法确定额外的信息，诸如IG3的相对表达水平。
实施例13 测量指示已知的CCR2和CCR5的分子缔合的可检测信号
现在参考图21和22：从瞬时共表达CCR5(5)TYFP和barr2/Rluc与CCR2或pcDNA3的细胞测量eBRET信号(配体处理为用MCP1，MIP1b，或组合的MCP1和MIP1b二者；图21)；从用增加剂量的单核细胞趋化蛋白1(MCP1；CCR2选择性配体)处理的瞬时共表达CCR5(5)TYFP、barr2/Rluc和CCR2的细胞测量配体-诱导的BRET信号，并且表示为BRET比例(％最大值；图22)。
在配体(在0分钟处加入)处理之前，对于每种受体组合记录基线eBRET信号(图21)。在表达CCR5(5)TYFP与barr2/Rluc和pcDNA3的细胞中，CCR2选择性配体MCP1没有引发eBRET信号(开放圆形)，而CCR5选择性配体MIP1b产生强信号(黑色正方形)。加入MCP1对该信号没有产生差别(开放的正方形)。在存在CCR2的条件下，MCP1能够产生barr2/Rluc和CCR5(5)TYFP之间的信号(黑色圆形)。用MIP1b处理这些细胞也产生信号(灰色圆形)。这低于在不存在CCR2条件下产生的信号，其可能是由于当共表达3种蛋白时更低的受体表达水平和/或可能是在异源二聚化时受体构象改变的结果。在表达两种受体的细胞中用两种配体处理产生最高的eBRET信号(黑色倒三角形)。用PBS处理的表达所述组合的每一种的细胞(开放的三角形和灰色正方形)在整个记录时间期间内(95分钟)仅表现出基线eBRET信号。
本实施例进一步显示关于CC趋化因子受体5(CCR5)作为IG1，Topaz(TYFP)作为RC1，barr2作为IG2，Rluc作为RC2和CC趋化因子受体2(CCR2)作为IG3的MCP1剂量-响应曲线(图22)。
本实施例表明，对于其中CCR5是IG1，Topaz(TYFP)是RC1，β-抑制蛋白2(barr2)是IG2，Rluc是RC2和CCR2是IG3的组合，在调控剂MCP1(CCR2选择配体)作为与IG3特异性相互作用的结果调控IG2和IG3的缔合时，检测到由RC1和RC2的接近产生的信号。
因此，本实施例证明了在参考文献中公布的使用IG1和IG3作为GPCRs作为形成功能性异源-二聚体/-寡聚体的信号检测(Mellado等(2001)胚胎学杂志(EMBO Journal)20，2497-2507)，其与实施例1中证明的新型异源-二聚体/-寡聚体截然不同，由此提供对本发明的方法的独立确认。
对于barr2/Rluc+CCR(5)TYFP+CCR2组合，使用MCP1和MIP1b共同处理导致高于单独使用MCP1和MIP1b产生的信号的相加的信号(图21)。
因此，本实施例表明，使用关于IG1和IG3二者的配体共同处理的增强的信号不可能完全通过IG1-IG2缔合和IG2-IG3-IG1缔合的加性效应解释。因此，不希望受到理论限制，本实施例表明，IG1配体还可以作用为调控剂通过对IG3的变构作用来调控IG2和IG3的缔合。此外，活性IG构象(与激动剂结合的构象)可更有利于信号产生，可能能够增加RC1和RC2的接近，或RC1和RC2的更有利的相对取向。
因此，本实施例表明，与单独的IG3处理相比，IG1和IG3的共同处理可以导致额外的信号产生和/或信息，并且本发明包括所述共同处理。
本实施例还证明第三种类型的荧光团Topaz(TYFP)的应用，在该情形中其用作RC1，Rluc作为RC2。

Claims (26)

1.一种用于检测分子缔合的系统，所述系统包括：
i).第一试剂，其包括与第一报道成分偶联的受体形式的第一相互作用组；
ii).第二试剂，其包括与第二报道成分偶联的第二相互作用组；
iii).第三试剂，其包括受体形式的第三相互作用组；
iv).调控剂，所述调控剂包括调节第三相互作用组的受体的配体；和
v).检测器；
其中所述第一和第二报道成分的接近产生能够由所述检测器检测的信号；其中所述第三试剂不包括这样的成分，所述成分能够产生显著干扰和/或有助于由第一和第二报道成分的接近所产生的信号的信号；其中所述第一相互作用组与所述第三相互作用组不同；并且其中所述调控剂调控所述第二相互作用组与所述第三相互作用组的缔合；以使由所述检测器监测由所述第一和第二报道成分的接近产生的信号组成对所述第一和第三相互作用组的异源-二聚化和/或寡聚化的监测，其指示所述第一和第三相互作用组的受体的缔合。
2.按照权利要求1所述的系统，其特征在于所述系统还包括报道成分引发物，其中仅在存在所述报道成分引发物的条件下，所述第一和第二报道成分的接近产生能够由所述检测器检测的信号。
3.一种检测分子缔合的方法，所述方法包括下列步骤：
i).提供第一试剂，所述第一试剂包括与第一报道成分偶联的受体形式的第一相互作用组；
ii).提供第二试剂，所述第二试剂包括与第二报道成分偶联的第二相互作用组；
iii).提供第三试剂，所述第三试剂包括受体形式的第三相互作用组，其中所述第一相互作用组与所述第三相互作用组不同；
iv).提供调控剂，所述调控剂包括调节第三相互作用组的受体的配体；
其中；所述第一和第二报道成分的接近产生信号；其中所述第三试剂不包括这样的成分，所述成分能够产生显著干扰和/或有助于由第一和第二报道成分的接近所产生的信号的信号；并且其中所述调控剂调控所述第二相互作用组与所述第三相互作用组的缔合；然后
v).检测和/或监测由所述第一和第二报道成分的接近产生的任何信号；
从而通过所述检测器监测由所述第一和第二报道成分的接近产生的信号组成监测对所述第一和第三相互作用组的异源-二聚化和/或寡聚化的监测，其指示所述第一和第三相互作用组的受体的缔合。
4.按照权利要求3的方法，其特征在于，在检测和/或监测由所述第一和第二报道成分的接近产生的任何信号的步骤之前，所述方法还包括提供报道成分引发物的步骤，其中仅在存在所述报道成分引发物的条件下，所述第一和第二报道成分的接近产生能够由所述检测器检测的信号。
5.按照权利要求4的方法，其特征在于，提供报道成分引发物和提供调控剂的步骤发生于提供所述第一、第二和第三试剂的步骤之后。
6.一种用于确定当第二蛋白与第一蛋白缔合时，测试化合物是否与第二蛋白相互作用和/或其程度的方法，所述第一蛋白与所述第二蛋白不同，所述方法包括下列步骤：
a).使所述测试化合物与系统接触，所述系统包括：
i).第一试剂，所述第一试剂包括与第一报道成分偶联的受体形式的第一蛋白；
ii).第二试剂，所述第二试剂包括与第二报道成分偶联的相互作用组；
iii).第三试剂，所述第三试剂包括受体形式的所述第二蛋白；
iv).调控剂，所述调控剂包括调节第二蛋白的受体的配体；
其中所述第一和第二报道成分的接近产生信号；并且其中调控剂调控所述相互作用组与所述第二蛋白的缔合；其中所述第三试剂不包括这样的成分，所述成分能够产生显著干扰和/或有助于由第一和第二报道成分的接近所产生的信号的信号；
b).确定信号，作为当所述第二蛋白与所述第一蛋白缔合时，所述测试化合物是否与所述第二蛋白相互作用和/或其程度的确定。
7.按照权利要求6的方法，其特征在于，所述第二蛋白是受体，从而确定在所述第二蛋白与第一蛋白缔合时测试化合物是否与第二蛋白相互作用和/或其程度的方法包括用于确定当所述第二蛋白与第一蛋白缔合时，测试化合物是否是第二蛋白的激动剂和/或其程度的方法，并且更具体地，确定信号作为当所述第二蛋白与第一蛋白缔合时，所述测试化合物是否与第二蛋白相互作用和/或其程度的确定的步骤包括这样的步骤，即，检测信号的增加，作为当所述第二蛋白与第一蛋白缔合时，所述测试化合物是所述第二蛋白的激动剂的程度的确定。
8.按照权利要求6的方法，其特征在于所述第二蛋白是受体，从而用于确定在所述第二蛋白与第一蛋白缔合时，测试化合物是否与第二蛋白相互作用和/或其程度的方法包括用于确定在所述第二蛋白与第一蛋白缔合时，测试化合物是否是所述第二蛋白的拮抗剂或部分激动剂和/或其程度的方法，所述方法包括下列步骤：
a).使所述测试化合物与系统接触，所述系统包括：
i).第一试剂，所述第一试剂包括与第一报道成分偶联的受体形式的所述第一蛋白；
ii).第二试剂，所述第二试剂包括与第二报道成分偶联的相互作用组；
iii).第三试剂，所述第三试剂包括受体形式的所述第二蛋白；
iv).所述第二蛋白的激动剂；
其中所述第一和第二报道成分的接近产生信号；其中所述第三试剂不包括这样的成分，所述成分能够产生显著干扰和/或有助于由第一和第二报道成分的接近所产生的信号的信号；并且其中激动剂调控所述相互作用组与所述第二蛋白的缔合；
b).检测信号的减少，作为当所述第二蛋白与第一蛋白缔合时，所述测试化合物是所述第二蛋白的拮抗剂或部分激动剂的程度的确定。
9.按照权利要求6的方法，其特征在于，所述第二蛋白是组成型活性受体，从而用于确定当所述第二蛋白与第一蛋白缔合时，测试化合物是否与第二蛋白相互作用和/或其程度的方法包括用于确定当所述第二蛋白与第一蛋白缔合时，测试化合物是否是所述第二蛋白的逆激动剂和/或其程度的方法，并且更具体地，确定信号作为当所述第二蛋白与第一蛋白缔合时所述测试化合物是否与第二蛋白相互作用和/或其程度的确定的步骤包括这样的步骤，即，检测信号的减少，作为当所述第二蛋白与第一蛋白缔合时，所述测试化合物是所述第二蛋白的逆激动剂的程度的确定。
10.按照权利要求6的方法，其特征在于，所述第一和第二蛋白均为受体，从而用于确定当所述第二蛋白与第一蛋白缔合时，测试化合物是否与第二蛋白相互作用和/或其程度的方法包括用于针对第一蛋白或第二蛋白形成的异源-二聚体或异源-寡聚体的选择性活性筛选测试化合物的方法，所述方法包括下列步骤：
a)确定当所述第二蛋白与第一蛋白缔合时，所述测试化合物是否与所述第二蛋白相互作用和/或其程度；和
b)如果在所述第二蛋白与第一蛋白缔合的同时，所述测试化合物与所述第二蛋白相互作用，则确定在不存在所述第一蛋白的条件下，所述测试化合物是否与所述第二蛋白相互作用或其程度；
从而在所述第二蛋白与所述第一蛋白缔合的同时与所述第二蛋白相互作用时表现出更大亲和性和/或潜力和/或功效的测试化合物针对所述第一蛋白或第二蛋白形成的异源-二聚体或异源-寡聚体是选择性的。
11.用于针对第一蛋白或第二蛋白形成的异源-二聚体或异源-寡聚体的选择性拮抗性或部分激动性来筛选测试化合物的方法，
其中，所述第一蛋白和第二蛋白均为受体，
所述方法包括下列步骤：
a).通过使所述测试化合物与系统接触，而确定所述测试化合物是否是所述第一蛋白或第二蛋白形成的异源-二聚体或异源-寡聚体的拮抗剂或部分激动剂和/或其程度，所述系统包括：
i).第一试剂，所述第一试剂包括与第一报道成分偶联的第一蛋白；
ii).第二试剂，所述第二试剂包括与第二报道成分偶联的相互作用组；
iii).第三试剂，所述第三试剂包括所述第二蛋白，其中所述第二蛋白与所述第一蛋白不同；
iv).所述第二蛋白和/或异源-二聚体或异源-寡聚体的调控剂，所述异源-二聚体或异源-寡聚体由所述第一蛋白或第二蛋白形成，其中所述调控剂为激动剂；
其中所述第一和第二报道成分的接近产生信号；其中所述第三试剂不包括这样的成分，所述成分能够产生显著干扰和/或有助于由第一和第二报道成分的接近所产生的信号的信号；并且其中所述调控剂调控所述相互作用组与所述第二蛋白的缔合；
b)检测信号的减少，作为所述测试化合物是所述第一蛋白或第二蛋白形成的异源-二聚体或异源-寡聚体的拮抗剂或部分激动剂的程度的确定；
c)如果所述测试化合物是所述第一蛋白或第二蛋白形成的异源-二聚体或异源-寡聚体的拮抗剂或部分激动剂，则确定在不存在所述第一蛋白的条件下所述测试化合物与所述第二蛋白是否相互作用或其程度，以及在不存在所述第二蛋白的条件下所述测试化合物与所述第一蛋白是否相互作用或其程度；从而在与所述第一蛋白或第二蛋白形成的异源-二聚体或异源-寡聚体相互作用时表现出更大拮抗性或部分激动性特性的测试化合物针对所述第一蛋白或第二蛋白形成的异源-二聚体或异源-寡聚体是选择性的。
12.用于针对第一蛋白或第二蛋白形成的异源-二聚体或异源-寡聚体的选择性逆激动性来筛选测试化合物的方法，其中所述第一蛋白和所述第二蛋白都是受体，所述方法包括下列步骤：
a)通过使所述测试化合物与系统接触，而确定所述测试化合物是否是所述第一蛋白或第二蛋白形成的异源-二聚体或异源-寡聚体的逆激动剂和/或其程度，所述系统包括：
i).第一试剂，所述第一试剂包括与第一报道成分偶联的第一蛋白；
ii).第二试剂，所述第二试剂包括与第二报道成分偶联的相互作用组；
iii).第三试剂，所述第三试剂包括组成型活性的第二蛋白，其中所述第二蛋白不同于所述第一蛋白；
其中所述第一和第二报道成分的接近产生信号；其中所述第三试剂不包括这样的成分，所述成分能够产生显著干扰和/或有助于由第一和第二报道成分的接近所产生的信号的信号；
b)检测信号的减少，作为所述测试化合物是所述第一蛋白或第二蛋白形成的异源-二聚体或异源-寡聚体的逆激动剂的程度的确定；
c)如果所述测试化合物是所述第一蛋白或第二蛋白形成的异源-二聚体或异源-寡聚体的逆激动剂，则确定在不存在所述第二蛋白的条件下所述测试化合物是否是所述第一蛋白的逆激动剂或其程度，以及在不存在所述第一蛋白的条件下所述测试化合物是否是所述第二蛋白的逆激动剂或其程度；从而在与所述第一蛋白或第二蛋白形成的异源-二聚体或异源-寡聚体相互作用时表现出更大逆激动性特性的测试化合物针对所述第一蛋白或第二蛋白形成的异源-二聚体或异源-寡聚体是选择性的。
13.用于检测分子缔合的试剂盒，所述试剂盒包括：
i).第一试剂，其包括与第一报道成分偶联的受体形式的第一相互作用组；
ii).第二试剂，其包括与第二报道成分偶联的第二相互作用组；
iii).第三试剂，其包括受体形式的第三相互作用组；
iv).调控剂，所述调控剂包括调节第三试剂的受体的配体；和其中所述第一和第二报道成分的接近产生能够进行检测的信号；其中所述第三试剂不包括这样的成分，所述成分能够产生显著干扰和/或有助于由第一和第二报道成分的接近所产生的信号的信号；其中所述第一相互作用组不同于所述第三相互作用组；并且其中所述调控剂调控所述第二相互作用组与所述第三相互作用组的缔合。
14.按照权利要求13的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括报道成分引发物，并且仅在存在所述报道成分引发物的条件下，所述第一和第二报道成分的接近产生能够进行检测的信号。
15.用于筛选对第一蛋白和第二蛋白的异源-二聚体具有选择活性的测试化合物的方法，所述方法包括下列步骤：
a).使处于增加浓度的所述测试化合物与系统接触，所述系统包括：
i).第一试剂，所述第一试剂包括与第一报道成分偶联的受体形式的第一蛋白；
ii).第二试剂，所述第二试剂包括与第二报道成分偶联的相互作用组；
iii).第三试剂，所述第三试剂包括所述第二蛋白，其中所述第二蛋白不同于所述第一蛋白；
其中所述第一和第二报道成分的接近产生信号；其中所述第三试剂不包括这样的成分，所述成分能够产生显著干扰和/或有助于由第一和第二报道成分的接近所产生的信号的信号；
b).确定信号，作为处于每种浓度的所述测试化合物调控所述相互作用组与第二蛋白的所述缔合的程度的确定，以产生剂量-响应曲线；
c).确定所述剂量-响应曲线的Hill斜率，其中超过1的Hill斜率表示所述测试化合物与异源-二聚体相互作用。
16.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述调控剂增加所述第二相互作用组与第三相互作用组缔合的倾向，从而通过检测器检测由所述第一和第二报道成分的接近产生的信号组成对所述第一试剂和第三试剂的缔合的检测。
17.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述调控剂减少所述第二相互作用组与第三相互作用组缔合的倾向，从而通过检测器检测由所述第一和第二报道成分的接近产生的信号的减少组成对所述第一和第三试剂的解离的检测。
18.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述第三试剂通过在细胞内，包括全细胞、细胞级分或不含细胞的系统中表达而产生。
19.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述调控剂增加所述第二相互作用组与第三相互作用组缔合的倾向，从而通过检测器检测由所述第一和第二报道成分的接近产生的信号组成对所述第一试剂和第三试剂的缔合的检测。
20.根据权利要求6或11中任一项所述的方法，其特征在于，所述调控剂增加所述与第二报道成分偶联的相互作用组与第二蛋白缔合的倾向，从而通过检测器检测由所述第一和第二报道成分的接近产生的信号组成对所述第一试剂和第三试剂的缔合的检测。
21.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述调控剂减少所述第二相互作用组与第三相互作用组缔合的倾向，从而通过检测器检测由所述第一和第二报道成分的接近产生的信号的减少组成对所述第一和第三试剂的解离的检测。
22.根据权利要求6或11中任一项所述的方法，其特征在于，所述调控剂减少所述与第二报道成分偶联的相互作用组与第二蛋白缔合的倾向，从而通过检测器检测由所述第一和第二报道成分的接近产生的信号的减少组成对所述第一和第三试剂的解离的检测。
23.根据权利要求3、6、11或12中任一项所述的方法，其特征在于，其特征在于，所述第三试剂通过在细胞内，包括全细胞、细胞级分或不含细胞的系统中表达而产生。
24.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述调控剂增加所述第二相互作用组与第三相互作用组缔合的倾向，从而通过检测器检测由所述第一和第二报道成分的接近产生的信号组成对所述第一试剂和第三试剂的缔合的检测。
25.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述调控剂减少所述第二相互作用组与第三相互作用组缔合的倾向，从而通过检测器检测由所述第一和第二报道成分的接近产生的信号的减少组成对所述第一和第三试剂的解离的检测。
26.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，其特征在于，所述第三试剂通过在细胞内，包括全细胞、细胞级分或不含细胞的系统中表达而产生。
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