CN101646456B - 消耗血液组织内特定细胞群的方法和组合物 - Google Patents

消耗血液组织内特定细胞群的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于细胞分离的组合物和方法。这些试剂和技术通过表面抗原识别特异性凝集细胞并可用于以高产率回收更加罕见的细胞类型。

Description

消耗血液组织内特定细胞群的方法和组合物
技术领域
本发明涉及分离细胞的方法和组合物，更具体涉及分离外周血、骨髓、脐带血以及相关血液组织中的细胞的方法和组合物。
背景
分离供体外研究或细胞疗法所用的细胞通常包括首先分离血细胞组分，主要是大量消耗占血液细胞物质99％以上的红细胞。不能提供长期治疗潜能(例如，粒细胞)、导致发病(例如，与骨髓移植相关的移植物抗宿主病(GVHD)中的T-细胞，或输血相关反应中的红细胞)或者通常会干扰对感兴趣细胞群的监测能力的其他细胞类型也被除去。移植之前耗尽骨髓中的T-淋巴细胞是一项用于降低由T-细胞介导的GVHD发生率或程度的常规技术。用于消耗这些细胞群的技术差异性依赖于要除去的细胞群。可能不需要完全除去T-细胞，因为它们对移植物抗肿瘤效应可能有贡献。可进行调节以除去特定水平的T细胞污染物的可调式细胞分离培养基可能是制备同种异体干细胞移植物的有用工具。
除去红细胞的技术基于红细胞低渗溶胞、密度梯度分离或采用羟乙基淀粉的增强型离心沉降。低渗溶胞对于小体积体外研究有用，但对用于细胞疗法的大体积血液组织处理可能无效。如果用于细胞治疗过程，红细胞低渗溶胞通常是作为最终的清除步骤进行的，以在通过其它方法大量消耗后除去可能污染样品的剩余红细胞。
密度-梯度分离依赖于不同细胞类型的密度差异造成在密度不同的流体介质中不同水平上分离细胞。细胞类型之间的密度差异可以是小的，单个细胞类型在大小和密度上可以是不等同的。因此，特定的细胞类型可分布在整个密度-梯度介质中，而不是在密度介质中的独立区域精确地分离，这导致所需细胞的回收差和/或被不需要的细胞类型污染。在罕见的血细胞类型如造血祖细胞的富集过程中，通常密度-梯度沉降对所需细胞亚群的产量差。例如，据报道用常规密度-梯度方法从脐带血中分离祖细胞(如，CD34+造血干细胞)导致大量损失需要的干细胞。见如，Wagner，J.E.，Am J Ped Hematol Oncol 15：169(1993)。作为另一个例子，据报道用常规密度-梯度方法分离淋巴细胞造成特定淋巴细胞亚群的选择性丢失。见如，Collins，D.P.，J Immunol Methods 243：125(2000)。这些分离方法在用于细胞疗法时有其他禁忌症，因为分离介质中的化学分子如果与细胞一起输入接受者可能是有毒的。因此，必须进行其他步骤以确保它们在输注之前被完全除去。诸如淘洗等仪器方法也依赖于通过密度差异分离血液组分并且在执行时也可能遭遇类似的缺陷。
除去血液中红细胞的其他方法包括与羟乙基淀粉(即，海塔淀粉(heta starch))混合，该物质刺激当在离心机中以50xg沉降时比白细胞组分更快沉降的红细胞聚集体形成。尽管该方法对于接受者通常是无毒且‘安全’的，但其回收包括例如造血干细胞在内的重要细胞类型的性能会根据诸如温度、处理前的样品年龄(收集后)、样品的细胞构成(每单位体积的细胞浓度)、样品体积以及抗凝剂与血液样品的比例等因素而变化。例如，就脐带血而言，这些因素可导致干细胞的回收不理想以及脐带血细胞的移植物移入潜能降低、移植失败风险升高。
提高供体组织中罕见细胞类型的回收率能显著改善移植和免疫疗法(例如，骨髓移植、基于干细胞的基因疗法以及免疫细胞疗法)后果，其成功显然与用于治疗的细胞的实际数量有关。此外，对同种异体骨髓或细胞因子引发的干细胞移植而言，含有干细胞最高可能回收率并除去部分T-细胞的移植物使得移植物成功存活的机会最大。
概述
本发明提供了有效的、不基于密度的、不基于颗粒的用于从外周血、脐带血和骨髓中分离和回收有治疗或诊断价值的细胞的方法和组合物。具体地说，本发明提供了专门去除在体外研究中干扰对感兴趣细胞的监测或当植入时会造成发病的不需要细胞亚类的方法和组合物。所披露的组合物和方法可用于，例如，为组织培养有效准备细胞、免疫表型确定、其他诊断测试、进一步纯化以及治疗性给予。
本发明方法包括使含血细胞样品(例如，外周血样品，脐带血样品，或骨髓样品)接触细胞分离组合物。不局限于特定机制，本发明特征在于一种组合物，该组合物能够通过与细胞表面抗原相互作用和/或通过刺激细胞-细胞粘附(例如，通过增加细胞表面粘附因子的表达)而选择性凝集细胞。凝集的细胞部分与保留在悬浮液中的未凝集的细胞分开。可从聚集体或上清液相中回收细胞。从分级的血液样品上清液相中回收的细胞未通过与该组合物组分相互作用的生物修饰。使用这些组合物能够以相对较高产率回收甚至更加罕见的细胞类型。
本文公开的组合物和方法可用于分离和富集各种细胞类型，包括，例如，T淋巴细胞、T辅助细胞、T抑制细胞、T杀伤细胞、B细胞、NK细胞、造血干细胞、非造血干细胞、母体循环中的循环胎儿细胞、循环的转移肿瘤细胞和循环的癌症干细胞。本文公开的组合物和方法可用于同种异体移植和自体移植范围。在同种异体移植中，可除去细胞移植物中的T淋巴细胞以降低T淋巴细胞-相关的GVHD。在自体移植中，例如本文公开的组合物和方法可用于从患者的血液或骨髓中移除不需要的细胞如转移性癌细胞。需要的细胞(如，造血干细胞)随后可返回给患者，其中没有或基本没有威胁生命的肿瘤细胞。本文公开的方法可应用于任何哺乳动物，包括人类、非人灵长类、啮齿动物、猪、牛和马的血液系统的细胞。
一方面，本发明的特征在于一种组合物，该组合物包含以下物质或基本由以下物质构成：葡聚糖；抗血型糖蛋白A抗体；抗CD9抗体；抗CD15抗体；和串联抗体。所述串联抗体可包含两种不同单克隆抗体。所述串联抗体可包含IgM类抗体或IgG类抗体的任意组合。所述串联抗体可包含两种抗人抗体。所述串联抗体的浓度为约0.001mg/L至约15mg/L。所述串联抗体包含除抗CD9抗体之外的血小板特异性抗体(例如，抗CD41抗体或抗CD61抗体)和定向针对不同细胞类型上细胞表面抗原的抗体。所述细胞表面抗原可选自下组：CD2、CD3、CD4、CD8、CD10、CD13、CD14、CD16、CD19、CD20、CD23、CD31、CD33、CD34、CD38、CD44、CD45、CD56、CD66、CD72、CD83、CD90、CD94、CD161和CD166。例如，所述串联抗体可包含抗CD41抗体和抗CD3抗体；抗CD41抗体和抗CD19抗体；或者抗CD41抗体和抗CD8抗体。
所述组合物还可包含磷酸缓冲盐水、肝素、二价阳离子(例如，Ca+2或Mg+2)或血清白蛋白。所述组合物的pH可介于6.8和7.8(例如，介于7.2和7.4)之间。所述血清白蛋白可以是牛血清白蛋白或人血清白蛋白。所述血清白蛋白的浓度可以为约0.5％至约5％。
所述组合物内的抗体可以是单克隆抗体并且可以是任何同种型(例如，IgM抗体或IgG抗体)。所述组合物内的抗体可以是抗人抗体(例如，抗人血型糖蛋白A抗体、抗人CD15抗体或抗人CD9抗体)。所述抗体的浓度可以从约0.001mg/L至约15mg/L。一些实施方式中，所述组合物包含两种抗CD9抗体，其中所述两种抗CD9抗体是不同同种型的(例如，IgG和IgM同种型)。
在另一方面，本发明特征在于一种组合物，其包含以下物质或基本由以下物质构成：葡聚糖；肝素；二价阳离子；抗血型糖蛋白A抗体；抗CD9抗体；抗CD15抗体；和串联抗体。
本发明特征还在于一种试剂盒，其包含采血容器和本文所述的细胞分离组合物。所述采血容器是血袋或真空管。所述细胞分离组合物可以装在无菌袋内。所述无菌袋可操作性连接于无菌处理袋，且无菌处理袋可操作性连接于无菌储存袋。所述无菌储存袋包含冻存剂(cryopreservative)。
本发明特征还在于一种组合物，其包含以下物质或基本由以下物质构成：葡聚糖；抗人血型糖蛋白A抗体；抗人CD15抗体；和两种抗人CD9抗体，其中所述抗CD9抗体是不同同种型的(例如，IgG和IgM同种型)。
再在另一方面，本发明特征在于一种分离细胞的方法。所述方法包括以下步骤或者基本由以下步骤构成：使含血细胞样品接触本文所述的细胞分离组合物；将所述样品分成凝集物和上清液相；和从所述凝集物或所述上清液相中回收细胞。所述样品可以是含有人血细胞样品、外周血样品、脐带样品、或骨髓样品。一些实施方式中，所述细胞是从所述上清液相中回收的。在其他实施方式中，所述细胞是从所述凝集物中回收的。再在其他实施方式中，所述细胞是从凝集物和上清液相中回收的。以1xg将所述样品分配入所述凝集物和所述上清液相。
除非特别说明，本文所用的所有技术和科学术语都与本发明所属领域的技术人员所常理解的意思相同。虽然与本文所描述的那些方法和材料相似或等价的方法和材料也可用于实现本发明，但是下面具体描述合适的方法和材料。本文所提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都已完整纳入本文作为参考。在发生矛盾时以本说明书包括定义为准。另外，材料、方法和实施例只是为了说明，并不意味着限制。
本发明的其他特征和优点通过阅读下面的详细描述和权利要求就会清楚。
发明详述
本发明特征在于分离细胞的组合物和方法。本发明组合物可用于从含有血细胞的样品中选择性凝集细胞。不局限于特定机制，本发明组合物可通过与细胞表面抗原相互作用和/或通过刺激细胞表面粘附因子如LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原-1，CD11a/CD18)和ICAM-1(胞间粘附分子-1，CD54)的表达而凝集细胞。凝集的细胞部分与保留在溶液中的未凝集的细胞分开。可从上清液或凝集物中回收细胞。
细胞分离组合物
本发明所述的细胞分离组合物可含有葡聚糖以及一种或多种抗细胞表面抗原(即，对细胞表面抗原有特异性结合亲和力)的抗体。
葡聚糖是多糖，由葡萄糖单元主要以α(1→6)形式连接组成。葡聚糖可使红细胞堆积(即，形成叠积)并因此有助于从溶液中移去红细胞。通常，在细胞分离组合物中的葡聚糖的浓度是10-20g/L(例如，20g/L)。抗细胞表面抗原的抗体通过同型凝集(即，相同细胞类型的细胞的凝集)和/或异型凝集(即，不同细胞类型的细胞的凝集)帮助从溶液中移去血细胞。
一些实施方案中，细胞分离组合物包括抗血型糖蛋白A的抗体。通常，在细胞分离组合物中的抗血型糖蛋白A抗体的浓度范围从0.1-15mg/L(例如0.1-10mg/L，1-5mg/L或1mg/L)。抗血型糖蛋白A抗体可通过至少两种机制帮助从溶液中移去红细胞。由于血型糖蛋白A是红细胞上的主要表面糖蛋白，抗血型糖蛋白A抗体可导致红细胞的同型凝集。此外，抗血型糖蛋白A抗体可也可稳定葡聚糖介导的叠积形成。示范性单克隆抗血型糖蛋白A抗体包括，但不限于：107FMN(鼠IgG1同种型)、YTH89.1(大鼠IgG2b同种型)、E4(鼠IgM同种型)和2.2.2.E7(鼠IgM抗体，BioE，St.Paul，MN)。参见，例如，M.Vanderlaan等，Molecular Immunology 20：1353(1983)；Telen M.J.和Bolk，T.A.，Transfusion 27：309(1987)；和Outram S.等，Leukocyte Research 12：651(1988)。
一些实施方案中，细胞分离组合物包括抗CD15的抗体。在细胞分离组合物中的抗CD15抗体的浓度范围为0.1-15mg/L(例如，0.1-10、1-5、或1mg/L)。抗CD15抗体可通过与粒细胞表面上存在的CD15分子交联导致粒细胞的同型凝集。抗CD15抗体还可通过刺激与单核细胞、NK细胞和B细胞上的粘附分子相互作用的粒细胞表面粘附分子(如，L-选择蛋白和β-2整联蛋白)表达来引起粒细胞与单核细胞、NK细胞和B细胞的同型和异型凝集。这些细胞类型的异型凝集有利于这些细胞连同红细胞组分一起从溶液中移去。可通过不与单核细胞反应的性质选择合适的抗CD15抗体。示范性单克隆抗CD15抗体包括，但不限于：AHN1.1(鼠IgM同种型)、FMC-10(鼠IgM同种型)、BU-28(鼠IgM同种型)、MEM-157(鼠IgM同种型)、MEM-158(鼠IgM同种型)、MEM-167(鼠IgM同种型)和324.3.B9(鼠IgM同种型，BioE，St.Paul，MN)。参见，例如，《白细胞分型IV》(Leukocyte typing IV)(1989)；《白细胞分型II》(Leukocyte typing II)(1984)；《白细胞分型IV》(Leukocyte typing IV)(1995)；Solter D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：5565(1978)；Kannagi，R.等，J.Biol.Chem.257：14865(1982)；Magnani，J.L.等，Archives of Biochemistry and Biophysics233：501(1984)；Eggens，I.等，J.Biol Chem.264：9476(1989)。
一些实施方案中，细胞分离组合物包括抗CD9的抗体(例如，浓度范围为0.1-15，0.1-10，1-5，或1mg/L)。抗CD9抗体可引起血小板的同型和异型凝集。抗CD9抗体可通过已经附于粒细胞和单核细胞表面的血小板引起粒细胞和单核细胞的异型凝集。CD9抗体可促进血小板p-选择蛋白(CD62P)、CD41/CD61、CD31和CD36的表达。示范性单克隆抗CD9抗体包括，但不限于：MEM-61(鼠IgG1同种型)、MEM-62(鼠IgG1同种型)、MEM-192(鼠IgM同种型)、FMC-8(鼠IgG2a同种型)、SN4(鼠IgG1同种型)、BU-16(鼠IgG2a同种型)和8.10.E7(鼠IgM同种型，BioE，St.Paul，MN)。参见，例如，《白细胞 分型IV》(Leukocyte typing VI)(1995)；《白细胞分型II》(Leukocyte typing II)(1984)；Von dem Bourne A.E.G.Kr和Moderman P.N.(1989)，载于《白细胞 分型IV》(Leukocyte typing IV)(W.Knapp等编著)，989-92页，牛津大学出版社(Oxford University Press)，牛津；Jennings，L.K.等，载于《白细胞分型V》 (Leukocyte typing V)S.F.Schlossmann等编著，1249-51页，牛津大学出版社，牛津(1995)；Lanza，F.等，J.Biol.Chem.266：10638(1991)；Wright等，Immunology Today 15：588(1994)；Rubinstein，E.等，血栓和止血专题会议(Seminars in Thrombosis and Hemostasis)21：10(1995)。
含有两种不同同种型的抗CD9单克隆抗体的组合物对于分离细胞尤其有用。例如，可使用IgG和IgM同种型的抗CD9抗体。IgG抗体可通过交联CD9和CD36(FCγ1受体)刺激血小板同型聚集和脱粒，而IgM抗体对于将血小板与带有CD9的其他细胞如单核细胞和中性粒细胞交联起来特别有用。因此，使用IgG和IgM抗CD9抗体的组合能够促进多重细胞连接，从而有助于从溶液中聚集和除去血小板和结合于血小板的任何细胞。此外，使用两种抗体的组合使得使用的抗体浓度低于单独使用任一抗体所需的浓度并能够从样品中除去更多血小板。
串联抗体也可包含在本发明组合物中。文中，“串联抗体”是指已经结合在一起形成一个能够结合两种不同抗原的实体的两种不同抗体。本发明组合物可包含任何串联抗体或者串联抗体的组合。串联抗体可采用各种方法制造，其中包括，例如，抗生物素蛋白-生物素桥、使用抗小鼠抗体桥连、以及化学接头。具体地说，可使用水溶性、异双官能交联试剂，如磺基-SMCC(4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸3-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯，密苏里州圣路易斯的西格玛化学品公司(Sigma Chemical，St.Louis，MO)，EMCS(琥珀酰亚胺基6-马来酰亚胺基己酸酯)，或EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，一种可以将不同蛋白质上的胺和羧酸基团直接相连的双官能试剂)。例如，为制造串联抗体，一种抗体可通过加入磺基-SMCC修饰，而另一种抗体可通过加入2-亚氨基硫烷(2-iminothiolane)(一种伯胺的硫醇化试剂)或SPDP/DTT(琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯/二硫苏糖醇)修饰。经修饰的抗体可以等摩尔比例组合并室温孵育。串联抗体可通过大小排阻层析从单个抗体分离。串联抗体的活性可采用流式细胞术验证以证实串联抗体与靶细胞的结合。
串联抗体中的一种抗体可以是血小板特异性抗体(除抗CD9抗体外)(例如，抗CD41抗体或抗CD61抗体)，而另一种抗体可以定向针对不同细胞类型上表达的细胞表面抗原(例如，待除去细胞的特异性细胞表面抗原)。细胞表面抗原的非限制性例子包括任何分化群标记物(CD标记物)，如CD2、CD3、CD4、CD8、CD10、CD13、CD14、CD16、CD19、CD20、CD23、CD31、CD33、CD34、CD38、CD44、CD45、CD56、CD66、CD72、CD83、CD90、CD94、CD161和CD166，或者任何其他细胞表面抗原(例如，肿瘤细胞的细胞表面蛋白)。本领域技术人员可使用常规方法制备抗人和其他哺乳动物的血液细胞和其它细胞的细胞表面抗原的抗体，所述其他哺乳动物包括例如，非人灵长类、啮齿动物(如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠或兔)、猪、牛和马。
例如，串联抗体可包含抗CD41抗体和抗CD3抗体，这有助于除去T淋巴细胞。因此，在含有与葡聚糖、抗血型糖蛋白A抗体、抗CD9抗体和抗CD15抗体组合的串联抗CD3/CD41抗体的组合物中，所述串联抗CD3/CD41抗体可介导血小板与T淋巴细胞结合，CD9可经血小板表面的CD9分子介导T淋巴细胞与单核细胞和粒细胞结合，而CD15可介导单核细胞和粒细胞结合。用这种组合物处理的血液样品以便减少红细胞、粒细胞、单核细胞、血小板和T淋巴细胞，并富集B细胞和NK细胞。用串联抗CD19/CD41抗体代替抗CD3/CD41抗体能制得红细胞、粒细胞、单核细胞、血小板和B细胞减少而T细胞和NK细胞富集的细胞群。
串联抗体的浓度介于0.01-15mg/L(例如，0.1-15、0.1-10、1-5、1、0.8或0.5mg/L)。可对串联抗体的浓度进行调节以使一部分或几乎所有的特定细胞群被除去。参见，例如，表4，该表说明在含有葡聚糖、抗血型糖蛋白A抗体、抗CD9抗体和抗CD15抗体的组合物中加入0.8mg/L抗CD3/抗CD41串联抗体导致CD2群体减少79.9％同时使CD16和CD19群体分别降低12.5％和7.5％。将组合物中相同串联抗体浓度升至2.0mg/L导致CD2群体降低86.7％同时使得CD16和CD19群体分别降低17.5％和17.5％。示范性抗CD41抗体包括，但不限于：PLT-1(鼠IgM同种型)、CN19(鼠IgG1同种型)和8.7.C3(鼠IgG1同种型，BioE，St.Paul，MN)。抗CD3抗体的非限制性例子包括OKT-3(鼠IgG1同种型)、HIT3a(鼠IgG2a同种型)、SK7(鼠IgG1同种型)和BC3(鼠IgG2a同种型)。抗CD19抗体的非限制性例子包括B4(鼠IgG1同种型)、BU-12(鼠IgG1同种型)和HIB19(鼠IgG1)。抗CD8抗体的非限制性例子包括UCHT4(鼠IgG2a同种型)、OKT8(鼠IgG2a同种型)、RPA-T8(鼠IgG1同种型)和HIT8d(鼠IgG1同种型)。
通常，组合物中使用的抗体是单克隆抗体，它们针对抗原内包含的特定抗原表位的均一抗体群体。合适的单克隆抗体可以是商品化产品，或可以使用标准的杂交瘤技术制备。特别是，单克隆抗体可以通过使用培养的连续细胞系来生产抗体分子的技术来获得，包括Kohler，G.等，Nature，1975，256：495中所描述的技术，人B-细胞杂交瘤技术(Kosbor等，Immunology Today 4：72(1983)；Cole等，Proc Natl.Acad.Sci.USA 80：2026(1983))，和EBV-杂交瘤技术(Cole等，《单克隆抗体和癌症治疗》(“Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”)，李斯公司(Alan R.Liss，Inc.)，77-96页(1983))。
抗体可以是任何免疫球蛋白类，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD、IgY和它们的任何亚类。IgG和IgM同种型抗体在本发明的细胞分离组合物中特别有用。五聚IgM抗体比IgG抗体包含更多的抗原结合位点，在一些情况下(如，抗血型糖蛋白A和抗CD15)，它因为刺激聚集和凝集对细胞分离试剂特别有用。在其他情况下(如，抗CD9抗体)，IgG同种型抗体对刺激同型和/或异型的聚集特别有用。这些细胞分离组合物中的抗体作为可溶性抗体以液相提供。
细胞分离组合物也可包含二价阳离子(如，Ca+2和Mg+2)。二价阳离子可以通过，例如，平衡盐溶液(如，汉克斯平衡盐溶液)提供。二价阳离子是选择蛋白-介导的和整联蛋白-介导的细胞-细胞粘附中重要的辅因子。
本发明的细胞分离组合物也可包含抗凝剂如肝素。在高钙环境中肝素可防止凝血和与凝血有关的非特异性细胞损失。肝素也促进血小板结块。结块的血小板可粘附到粒细胞和单核细胞，因此比单独的血小板更能增强异型凝集。肝素可作为一种肝素盐(如，肝素钠、肝素锂，或肝素钾)提供。
细胞分离方法
例如，本文公开的组合物可用于为组织培养有效准备细胞、免疫表型确定、诊断测试、进一步纯化以及治疗性给予。不局限于特定机制，本发明的组合物可以通过与细胞表面抗原相互作用和/或通过刺激细胞-细胞粘附(如，通过增强细胞表面粘附因子的表达)来选择性地凝集细胞。凝集的细胞部分与保留在溶液中的未凝集的细胞分开。
在凝集后，未凝集的细胞可从溶液相(即，上清液)中回收。也可从凝集物中回收细胞。凝集的细胞可以通过，例如，将细胞转移到包含二价阳离子螯合剂如EDTA或EGTA的缓冲液中来解离。从凝集物中回收的细胞可以通过使用抗细胞表面抗原的抗体进一步分离。
本文公开的组合物可用于从各种包含血细胞的样品中分离细胞，这些样品包括外周血(如，通过静脉穿刺获得)、脐带血(如，妊娠后获得)和骨髓(如，抽吸获得)。含血细胞的样品与细胞分离组合物接触至特定类型的细胞凝集。例如，红细胞和分化的骨髓血成分可使用包含针对这些细胞的表面抗原的抗体的细胞分离组合物来选择性地凝集。本文公开的组合物和方法可用来分离和富集各种细胞类型，包括，例如，T淋巴细胞、T辅助细胞、T抑制细胞、B细胞、造血干细胞、母体循环中的循环胎儿细胞和循环的转移性肿瘤细胞。
本文公开的组合物可用来凝集任何哺乳动物，包括人类、非人灵长类、啮齿动物、猪、牛和马的细胞。
本文公开的组合物和方法可用于同种异体移植和自体移植范围。在同种异体移植中，可除去细胞移植物中的T淋巴细胞以降低T淋巴细胞-相关的GVHD。在自体移植中，例如本文公开的组合物和方法可用于从患者的血液或骨髓中移除不需要的细胞如转移性癌细胞。需要的细胞(如，造血干细胞)随后可返回给患者，其中没有或基本没有威胁生命的肿瘤细胞。
包含抗肿瘤细胞表面蛋白的抗体的细胞分离组合物可用来从患者的血液或骨髓中排除肿瘤细胞。例如，这种组合物也可用于诊断程序以获得和检测细胞凝集物中的肿瘤细胞，肿瘤细胞集中在凝集物中，因此比在循环血液或骨髓中更容易检测。在一个实施方式中，包含抗上皮生长因子受体的抗体的细胞分离组合物可用来聚集源自上皮肿瘤的肿瘤细胞。在另一个实施方式中，包含抗雌激素受体的抗体的细胞分离组合物可用来聚集源自乳房和卵巢肿瘤的肿瘤细胞。再在另一个实施方式中，包含抗表面免疫球蛋白的抗体的细胞分离组合物可用来聚集与慢性淋巴细胞白血病、浆细胞瘤和多发性骨髓瘤有关的肿瘤细胞。乳腺癌细胞在细胞表面上表达CD15，并可以使用包含抗CD15抗体的细胞分离组合物从骨髓中排除。其他组合物可基于细胞类型和细胞表面蛋白来制备，以从患者的血液或骨髓中获得或排除源自其他癌(如红白血病、内皮癌或胃肠癌)的转移性肿瘤细胞。
细胞分离试剂盒
细胞分离组合物可结合包装材料并作为一种试剂盒销售。例如，试剂盒中可装有含有葡聚糖、抗血型糖蛋白A抗体、抗CD15抗体、抗CD9抗体和串联抗体的细胞分离组合物。这种细胞分离组合物还可包含二价阳离子和肝素。在其他实施方式中，试剂盒中可装有含有葡聚糖、抗血型糖蛋白A抗体、抗CD15抗体以及两种不同同种型的抗CD9抗体的细胞分离组合物。这种细胞分离组合物还可包含二价阳离子和肝素。
细胞分离组合物的组分可以单独包装或与其他成分联合包装。一些实施方案中，包装材料包括血液收集容器(如，血袋或真空管)。在其他实施方式中，所述细胞分离组合物可装在无菌袋内。此外，无菌袋可操作性连接于(例如，通过无菌管连接于)处理袋，而处理袋可操作性连接于(例如，通过无菌管连接于)储存袋或储存容器以便于处理和无菌转移分离的细胞。储存袋或容器可包含冻存剂，如二甲亚砜(DMSO，通常为1-10％)或与DMSO、海藻糖和葡聚糖中的一种或多种组合的胎牛血清、人血清或人血清白蛋白。深低温保藏能够长期保存这些细胞供治疗或研究使用。试剂盒中包含的包装材料通常包括描述如何使用细胞分离组合物来凝集特定类型细胞的说明书或标签。生产这种试剂盒的成分和方法是熟知的。
本发明以下列实施例进一步描述，这些实施例并不限制权利要求中所描述的本发明的范围。
实施例
实施例1：分离血细胞。
本实施例描述使用以下描述的细胞分离试剂分离细胞的一般方法。将等体积细胞分离试剂与柠檬酸盐、肝素或乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的血液样品(例如，外周血、脐带血或骨髓)在无菌密封容器(例如，锥形管、离心管或采血袋)内混合。在锥形管内将白细胞计数大于20×106细胞/毫升的样品以一份血与两份细胞分离试剂的比例混合。室温下将管在震荡台上轻轻混合或温和颠倒30到45分钟。在该混合阶段中特定细胞类型受到刺激表达介导同型-和异型结合成较大聚集体的细胞表面分子。混合阶段完成后将管在支架上竖直静置30到50分钟使得凝集细胞与保留在上清液相悬浮液中的未凝集的细胞分离。不扰动凝集物，使用移液管从上清液中回收未凝集细胞。回收的细胞用PBS+1％BSA(牛血清白蛋白)或HSA(人血清白蛋白)或组织培养基洗涤供进一步使用。将细胞团重悬于PBS+2％HAS供计数和流式细胞术分析。
也可以使用包含EDTA和乙二醇-二(2-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)的低渗裂解液从凝集物中回收细胞。凝集的细胞相用20∶1体积的VitaLyseTM(明尼苏达州圣保罗BE公司(BioErgonomics，St.Paul，MN))处理并涡漩混合。红细胞完全裂解后(通常为10分钟)，通过500xg离心7分钟并移去上清液来回收白细胞和其他细胞。将细胞重悬于PBS。
红细胞、白细胞、血小板和白细胞亚类的回收率通过血液学分析和流式细胞分析对细胞及其亚类进行计数来确定。在流式细胞分析之前，使用CoulterOnyx血液学分析仪(Coulter Onyx Hematology Analyzer)确定白细胞、红细胞和血小板的回收。用荧光标记的抗体标记，并采用Coulter ELITE流式细胞仪通过流式细胞术分析来进行细胞亚类分析。简言之，将105个分离的细胞或100μL未分离的血液样品用饱和剂量的CD2PE、CD3FITC、CD3Cy5PE、CD4PE、CD8PE、CD14PE、CD16PE、CD19Cy5PE、CD34PE、CD45FITC或CD45Cy5PE或者这些抗体的组合室温染色20分钟。用PBS(pH 7.4)洗涤细胞以除去未结合的抗体。对细胞进行分析以了解表达特定抗原或抗原组合的细胞的百分比。将流式细胞术得到的表达百分数数据与通过血液学分析确定的细胞计数结合可得到细胞亚类的浓度。将分离过程回收的细胞与原始样品中的细胞进行比较可确定细胞回收率。
实施例2：消耗血液组织中的红细胞、单核细胞、粒细胞和血小板
按照实施例1中描述的方法用表1中描述的试剂来分离细胞。
表1
  葡聚糖(平均分子量413,000道尔顿)   20g/L
  汉克斯缓冲盐溶液(10X)   100mL/L
  肝素钠(10,000单位/毫升)   1mL/L
  抗人血型糖蛋白A(鼠IgM单克隆抗体克隆2.2.2.E7)   1mg/L
  抗人CD15(鼠IgM单克隆抗体克隆324.3.B9)   2mg/L
  抗人CD9(鼠IgM单克隆抗体克隆8.10.E7)   1mg/L
  抗人CD9(鼠IgG单克隆抗体克隆MEM-61)   1mg/L
从健康成年人收集的外周血的分离结果示于表2。这种分离的意图是除去红细胞、单核细胞、粒细胞和血小板。此外，在之前的实验中进一步消耗了对人IgG的CD11b和Fcγ受体呈阳性的CD16+NK细胞、CD19+B-细胞和CD3+T-细胞亚群，其构成淋巴细胞群内被消耗的大部分细胞。从上清液中回收的细胞中红细胞约100％消耗(低于标准血液学分析仪器的检出限)。相对于单核细胞和粒细胞，淋巴细胞在上清液中富集，导致出现T-淋巴细胞浓缩的群体。
表2
  分离前   分离后   ％消耗
  红细胞/毫升   3.8x109细胞/毫升   0   100
  白细胞/毫升   3.7x106细胞/毫升   1.054x106/mL   71.5
  血小板/毫升   166x106细胞/毫升   1.09x106/mL   99.3
  淋巴细胞(％)(绝对数)   39.5％(1.46x106/mL)   98.1％(1.033x106/mL)   29.2
  单核细胞(％)(绝对数)   10.1％(0.37x106/mL)   0.9％(.0091x106/mL)   97.7
  粒细胞(％)(绝对数)   49.8％(0.69x106/mL)   0.6％(.0063x106/mL)   99.4
  CD3+淋巴细胞(％)(绝对数)   27.5％(1.02x106/mL)   72.9％(0.765x106/mL)   24.9
实施例3：消耗血液组织中的红细胞、单核细胞、粒细胞、血小板和T-淋巴细胞
按照实施例1中描述的方法用表3中描述的细胞分离试剂来分离细胞。串联抗体由抗体克隆8.7.C3(抗CD41)和克隆OKT-3(抗CD3)构成。简言之，以10x摩尔比例的PBS(pH 7.3)溶液加入磺基-SMCC(密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma，St.Louis，MO))来修饰CD3(或者在一些实施方式中是CD8)抗体。以100x摩尔比例的PBS(pH 7.3)溶液加入2-亚氨基硫烷来修饰CD41抗体。用sephadex G-25柱脱盐除去过量的未结合的磺基-SMCC和2-亚氨基硫烷。然后以1∶1的摩尔比混合修饰的抗体并室温混合过夜。通过Sepharose S-300HR凝胶排阻层析分离串联抗体和单一抗体。通过A280测定抗体浓度并通过流式细胞术证实活性，该实验证明血小板与CD3+和CD8+细胞结合。
表3
  葡聚糖(平均分子量413,000道尔顿)   20g/L
  汉克斯缓冲盐溶液(10X)   100mL/L
  肝素钠(10,000单位/mL)   1mL/L
  抗人血型糖蛋白A(鼠IgM单克隆抗体克隆2.2.2.E7)   1mg/L
  抗人CD15(鼠IgM单克隆抗体克隆324.3.B9)   2mg/L
  抗人CD9(鼠IgM单克隆抗体克隆8.10.E7)   1mg/L
  抗人CD9(鼠IgG单克隆抗体克隆MEM-61)   1mg/L
  抗人CD41/抗人CD3(串联鼠IgG单克隆)   2mg/L
表4包含用表1和3的配方对成人外周血样品进行分离的结果。从上清液中回收的细胞中红细胞约100％消耗。此外，从上清液中回收的细胞中单核细胞、粒细胞、血小板和T-淋巴细胞被明显除去。
表4
  表1配方   CD3/CD41分离表3配方   ％消耗
  红细胞/mL   0.0308x109细胞/毫升   0a   100a
  白细胞/mL   1.9x106细胞/毫升   0.476x106/mLa   74.9a
  血小板/mL   1.4x106细胞/毫升   1.54x106/mLa   -10a
  红细胞/mL   0.0308x109细胞/毫升   0.013x109/mLb   57.8b
  白细胞/mL   1.9x106细胞/毫升   0.406x106/mLb   78.6b
  血小板/mL   1.4x106细胞/毫升   6.72x106/mLb   -243b
  淋巴细胞(％)(绝对数)   98.3％(1.87x106/mL)   ND
  单核细胞(％)(绝对数)   1.1％(0.02x106/mL)   ND
  粒细胞(％)(绝对数)   0.6％(0.01x106/mL)   ND
  CD2+(％)(绝对数)   83.9％(1.59x106/mL)   68％(0.32x106/mL)a   79.9a
  CD2+/CD3+(％)(绝对数)   72.2％(1.37x106/mL)   ND
  CD16+(％)(绝对数)   6.4％(0.12x106/mL)   22％(0.105x106/mL)a   12.5a
  CD19+(％)(绝对数)   4.4％(0.08x106/mL)   15.6％(.074x106/mL)a   7.5a
  CD2+(％)(绝对数)   83.9％(1.59x106/mL)   52％(0.211x106/mL)6   86.7b
  CD2+/CD3+(％)(绝对数)   72.2％(1.37x106/mL)   ND
  CD16+(％)(绝对数)   6.4％(0.12x106/mL)   24.5％(0.099x106/mL)b   17.5b
  CD19+(％)(绝对数)   4.4％(0.08x106/mL)   16.3％(.066x106/mL)b   17.5b
a表3所述CD3/CD41串联抗体浓度的40％。
b表3所述CD3/CD41串联抗体浓度的100％。
用表1所述细胞分离试剂处理的外周血上清液中发现的CD2群由86％的CD3+细胞和14％的CD3-细胞构成。上文中表3所述的细胞分离试剂与表1配方的不同之处在于表3所述配方中加入了由抗CD3抗体和抗CD41抗体结合在一起构成的串联抗体。加入0.8μg/mL串联抗体导致CD2群体降低79.9％同时使CD16和CD19群体分别降低12.5％和7.5％。加入2.0μg/mL串联抗体导致CD2群体降低86.7％同时使得CD16和CD19群体分别降低17.5％和17.5％。由于串联抗体的CD3部分有效阻断荧光报道物抗体的结合，这阻碍了对CD3表达的直接分析；作为替代可用CD2进行T-细胞计数。
实施例4：消耗血液组织中的红细胞、单核细胞、粒细胞、血小板和CD8+T-淋巴细胞
按照实施例1中描述的方法用表5中描述的试剂来分离细胞。串联抗体由抗体克隆8.7.C3(抗CD41)和克隆UCHT4(抗CD8)构成并按照实施例3的描述产生。细胞分离结果示于表6。
表5
  葡聚糖(平均分子量413,000道尔顿)   20g/L
  汉克斯缓冲盐溶液(10X)   100mL/L
  肝素钠(10,000单位/mL)   1mL/L
  抗人血型糖蛋白A(鼠IgM单克隆抗体克隆2.2.2.E7)   1mg/L
  抗人CD15(鼠IgM单克隆抗体克隆324.3.B9)   2mg/L
  抗人CD9(鼠IgM单克隆抗体克隆8.10.E7)   1mg/L
  抗人CD9(鼠IgG单克隆抗体克隆MEM-61)   1mg/L
  抗人CD41/抗人CD8(串联鼠IgG单克隆)   2mg/L
淋巴细胞的T-细胞组分(CD3+)由CD4+细胞(占CD3+群体的74.4％)和CD8+细胞(占CD3+群体的24.7％)构成。细胞消耗步骤之后，CD4细胞占该细胞群的89.2％。假设剩余的CD3+群体主要包含CD8+细胞(消耗前CD4+和CD8+细胞总共占CD3+细胞的99.3％)，那么仍有0.078x106CD8细胞未消耗。这会导致加入CD8/CD41偶联物介导的CD8+ T-细胞总体消耗为68.9％。无法通过流式细胞术对CD8+ T-细胞直接计数，这是由于用于消耗细胞群的导向CD8的串联抗体阻断了荧光标记抗体的结合。故而用CD3+数-CD4+数代替直接CD8+计数。
表6
  分离前   分离后   ％消耗
  红细胞/毫升   3.8x109细胞/毫升   0   100
  白细胞/毫升   3.7x106细胞/毫升   1.05x106/mL   71.6
  血小板/毫升   166x106细胞/毫升   20.4x106/mL   87.7
  淋巴细胞(％)(绝对数)   39.5％(1.46x106/mL)   97.6％(1.025x106/mL)   29.8
  单核细胞(％)(绝对数)   10.1％(0.37x106/mL)   0.9％(.0095x106/mL)   97.7
  粒细胞(％)(绝对数)   49.8％(0.69x106/mL)   1.1％(0.0115x106/mL)   99.4
  CD3+淋巴细胞(％)(绝对数)   27.5％(1.02x106/mL)   71.0％(0.745x106/mL)   24.9
  CD4+淋巴细胞(％)(绝对数)   20.5％(0.759x106/mL)   63.4％(0.666x106/mL)   12.2
  CD8+淋巴细胞(％)(绝对数)   6.8％(0.252x106/mL)   ND
实施例5：消耗人脐带血中的CD3+T-淋巴细胞但不减少CD34+造血干细胞
就T-淋巴细胞(CD3+)的减少和CD34+造血干细胞的回收比较表1和表3所述的细胞分离组合物。使用人脐带血的典型实验结果示于表7。
表7
  表1配方   表3配方   ％消耗
  红细胞/毫升   0x109细胞/毫升   0x109细胞/毫升   0
  白细胞/毫升   1.26x106细胞/毫升   0.72x106/mL   42.9
  血小板/毫升   3.3x106细胞/毫升   1.8x106/mL   45.55
  淋巴细胞(％)(绝对数)   98.1％(1.24x106/mL)   97.8％(0.704x106/mL)   43.3
  单核细胞(％)(绝对数)   0.06％(0.0008x106/mL)   0.38％(0.003x106/mL)   -275
  粒细胞(％)(绝对数)   1.46％(0.018x106/mL)   1.6％(0.012x106/mL)   -33.3
  CD3+淋巴细胞(％)(绝对数)   69.1％(0.871x106/mL)   36.9％(0.266x106/mL)   69.5
  CD34+淋巴细胞(％)(绝对数)   1.02％(0.013x106/mL)   1.77％(0.013x106/mL)   0
表7所示结果证实，加入CD3/CD41串联抗体导致CD3+ T-淋巴细胞减少69.5％但CD34+造血细胞没有任何减少。该试剂在处理脐带血或类似造血干细胞来源中的作用能帮助减轻造血细胞移植和重建中发生的T-细胞介导的GVHD。
表8
  分离前   表3配方   ％消耗
  总红细胞   14.5x109   0.044x109   99.7
  总白细胞   57.12x106   7.19x106   87.4
  总血小板   1752x106   46.25x106   97.4
  总淋巴细胞   31.78x106   6.99x106   78
  总单核细胞   4.6x106   0.165x106   96.4
  总粒细胞   20.74x106   0.036x106   99.8
  CD3+淋巴细胞   23.52x106   ND   ND
  CD2+淋巴细胞   25.3x106   1.57x106   93.8
表8所示结果是采用表3列出的利用了CD3/CD41串联抗体的细胞分离介质对人脐带血进行细胞分离的结果。分离前，CD2+在93％的时间上与CD3共同表达。处理后，93.8％的CD2+细胞被消耗。
其他实施方式
尽管结合前文的详细描述和实施例对本发明作了描述，但以上的描述和实施例是用来阐明而并非限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求的范围限定。本发明的其他方面、优点和改进是在权利要求的范围内。

Claims (39)

1.一种组合物，其包含：
a)葡聚糖；
b)抗血型糖蛋白A抗体；
c)两种抗CD9抗体，所述两种抗CD9抗体是IgG和IgM同种型；
d)抗CD15抗体；和
e)串联抗体，所述串联抗体是已经结合在一起形成一个能够结合两种不同抗原的实体的两种不同抗体；
所述串联抗体包含除抗CD9抗体之外的血小板特异性抗体和针对不同细胞类型上细胞表面抗原的抗体。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述串联抗体包含两种不同单克隆抗体。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述串联抗体包含IgM类抗体或IgG类抗体的任意组合。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述串联抗体包含两种抗人抗体。
5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述串联抗体的浓度为0.001mg/L至15mg/L。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述血小板特异性抗体是抗CD41抗体。
7.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述细胞表面抗原选自下组：CD2、CD3、CD4、CD8、CD10、CD13、CD14、CD16、CD19、CD20、CD23、CD31、CD33、CD34、CD38、CD44、CD45、CD56、CD66、CD72、CD83、CD90、CD94、CD161和CD166。
8.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述串联抗体包含抗CD41抗体和抗CD3抗体。
9.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述串联抗体包含抗CD41抗体和抗CD19抗体。
10.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述串联抗体包含抗CD41抗体和抗CD8抗体。
11.如权利要求1所述的组合物，还包含磷酸缓冲盐水和/或肝素。
12.如权利要求1所述的组合物，还包含二价阳离子。
13.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述二价阳离子是Ca+2或Mg+2。
14.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物的pH介于6.8和7.8之间。
15.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述抗血型糖蛋白A抗体是单克隆抗体。
16.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述抗血型糖蛋白A抗体是IgM抗体或IgG抗体。
17.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述抗血型糖蛋白A抗体是抗人血型糖蛋白A抗体。
18.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述抗CD9抗体是单克隆抗体。
19.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述抗CD9抗体是抗人CD9抗体。
20.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述抗CD15抗体是单克隆抗体。
21.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述抗CD15抗体是IgM抗体或IgG抗体。
22.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述抗CD15抗体是抗人CD15抗体。
23.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述抗血型糖蛋白A抗体、所述抗CD9抗体或所述抗CD15抗体的浓度为0.001mg/L至15mg/L。
24.如权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含血清白蛋白。
25.如权利要求24所述的组合物，其特征在于，所述血清白蛋白是牛血清白蛋白或人血清白蛋白。
26.如权利要求24所述的组合物，其特征在于，所述血清白蛋白的浓度为0.5%至5%。
27.一种组合物，其包含：
a)葡聚糖；
b)肝素；
c)二价阳离子；
d)抗血型糖蛋白A抗体；
e)两种抗CD9抗体，所述两种抗CD9抗体是IgG和IgM同种型；
f)抗CD15抗体；和
g)串联抗体，所述串联抗体是已经结合在一起形成一个能够结合两种不同抗原的实体的两种不同抗体；
所述串联抗体包含除抗CD9抗体之外的血小板特异性抗体和针对不同细胞类型上细胞表面抗原的抗体。
28.一种试剂盒，其包含采血容器和权利要求1所述的组合物。
29.如权利要求28所述的试剂盒，其特征在于，所述采血容器是血袋或真空管。
30.如权利要求28所述的试剂盒，其特征在于，权利要求1所述的组合物装在无菌袋内。
31.如权利要求30所述的试剂盒，其特征在于，所述无菌袋操作性连接于无菌处理袋，所述无菌处理袋操作性连接于无菌储存袋。
32.如权利要求31所述的试剂盒，其特征在于，所述无菌储存袋包含冻存剂。
33.一种分离细胞的方法，所述方法包括：
a)使含血细胞的样品接触一种组合物，所述组合物包含：
i.葡聚糖；
ii.抗血型糖蛋白A抗体；
iii.两种抗CD9抗体，所述两种抗CD9抗体是IgG和IgM同种型的
iv.抗CD15抗体；和
v.串联抗体，所述串联抗体是已经结合在一起形成一个能够结合两种不同抗原的实体的两种不同抗体；
所述串联抗体包含除抗CD9抗体之外的血小板特异性抗体和针对不同细胞类型上细胞表面抗原的抗体；
b)将所述样品分成凝集物和上清液相；和
c)从所述凝集物或所述上清液相中回收细胞。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述样品是含有人血细胞的样品。
35.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述样品是外周血样品、脐带样品或骨髓样品。
36.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述细胞是从所述上清液相中回收的。
37.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述细胞是从所述凝集物中回收的。
38.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述细胞是从凝集物和上清液相中回收的。
39.如权利要求33所述的方法，其特征在于，以1x g将所述样品分成所述凝集物和所述上清液相。
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