CN101646417B - 将遗传物质引入活细胞的材料和方法 - Google Patents
将遗传物质引入活细胞的材料和方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101646417B CN101646417B CN200780049727.7A CN200780049727A CN101646417B CN 101646417 B CN101646417 B CN 101646417B CN 200780049727 A CN200780049727 A CN 200780049727A CN 101646417 B CN101646417 B CN 101646417B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nanosphere
- pdna
- tyr
- lpei
- transfection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 0 CCC*NC(*C(C)(C)CCOC(C)(C)C(N*(C)(*C)[*+]NC(Cc1ccc(CCC(NC(C(O*)=O)c2ccc(*C(C(C)(C)C)=O)cc2)=O)cc1)=O)=O)=O Chemical compound CCC*NC(*C(C)(C)CCOC(C)(C)C(N*(C)(*C)[*+]NC(Cc1ccc(CCC(NC(C(O*)=O)c2ccc(*C(C(C)(C)C)=O)cc2)=O)cc1)=O)=O)=O 0.000 description 2
- XQOIBQBPAXOVGP-UHFFFAOYSA-N CCNC(C)(C)C Chemical compound CCNC(C)(C)C XQOIBQBPAXOVGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
- A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
- A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
- A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
- A61K47/6935—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
- A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
- A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
- A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
- A61K47/6935—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol
- A61K47/6937—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol the polymer being PLGA, PLA or polyglycolic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
- A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
- A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
- A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
- A61K47/6939—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being a polysaccharide, e.g. starch, chitosan, chitin, cellulose or pectin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0091—Purification or manufacturing processes for gene therapy compositions
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G18/00—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates
- C08G18/06—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen
- C08G18/08—Processes
- C08G18/10—Prepolymer processes involving reaction of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen in a first reaction step
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G18/00—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates
- C08G18/06—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen
- C08G18/28—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen characterised by the compounds used containing active hydrogen
- C08G18/40—High-molecular-weight compounds
- C08G18/42—Polycondensates having carboxylic or carbonic ester groups in the main chain
- C08G18/4266—Polycondensates having carboxylic or carbonic ester groups in the main chain prepared from hydroxycarboxylic acids and/or lactones
- C08G18/4269—Lactones
- C08G18/4277—Caprolactone and/or substituted caprolactone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G18/00—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates
- C08G18/06—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen
- C08G18/28—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen characterised by the compounds used containing active hydrogen
- C08G18/40—High-molecular-weight compounds
- C08G18/48—Polyethers
- C08G18/4833—Polyethers containing oxyethylene units
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G18/00—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates
- C08G18/06—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen
- C08G18/70—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen characterised by the isocyanates or isothiocyanates used
- C08G18/72—Polyisocyanates or polyisothiocyanates
- C08G18/73—Polyisocyanates or polyisothiocyanates acyclic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G2230/00—Compositions for preparing biodegradable polymers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Polyamides (AREA)
Abstract
本发明一般地涉及将遗传物质引入活细胞。在一些实施方式中,本发明涉及用于将核酸靶向输送到细胞的物质组合物。在另外的实施方式中,本发明涉及将核酸靶向输送到细胞的方法。在仍另外的实施方式中,本发明涉及在其主链中包含至少一个氨基酸的聚合物。而在另外的实施方式中,本发明涉及聚合物,所述聚合物在其主链中包含至少一个氨基酸,从而导致生物降解性,并且在一些实施方式中,导致可控的生物降解性。
Description
技术领域
本发明一般地涉及将遗传物质引入活细胞。在一些实施方式中,本发明涉及用于将核酸靶向输送到细胞的物质组合物。在另外的实施方式中,本发明涉及将核酸靶向输送到细胞的方法。在仍另外的实施方式中,本发明涉及在其主链中包含至少一个氨基酸的聚合物。而在另外的实施方式中,本发明涉及聚合物,所述聚合物在其主链中包含至少一个氨基酸,从而导致生物降解性,并且在一些实施方式中,导致可控的生物降解性。
背景技术
以前,非病毒载体不能达到病毒的转染效率。几种非病毒载体已经插入灭活的病毒颗粒或融合病毒肽中,其导致升高的转染效率。遗憾的是,免疫原性仍然是问题。因此也期望具有能够携带有效量的遗传物质并且有效转染细胞同时避免有害副作用如免疫反应的非病毒载体。
美国公布的专利申请第2005/0025820号(下文称为‘820申请)涉及用于系统输送生长停滞、脂质来源的生物活性化合物的方法和系统。更具体地,该‘820申请公开了采用包括微球体和纳米颗粒的各种手段输送“基因治疗剂”。在‘820申请中提出的输送手段包括PEG化的脂质体和无机纳米颗粒壳。此外,‘820申请公开了输送手段可以通过将其与寻靶部分结合而“靶向”特定种类的细胞。相反地,本发明涉及微胶囊和/或纳米胶囊,其包含丙交酯-乙交酯共聚物(poly(lactide-co-glycolide))、L-酪氨酸磷酸酯或其任何组合。
美国公布的专利申请第2002/0131995号(下文称为‘995申请)涉及利用CD44受体配体的靶向药物输送。更具体地,该‘995申请公开了采用各种输送载体——包括脂质体和微球体——来输送药物到靶细胞和/或组织。‘995申请也公开了采用这种载体输送包括DNA的各种药物。此外,‘995申请公开了采用乙酰透明质酸或其它对CD44受体具有亲和性的葡糖胺聚糖作为靶向剂。虽然‘995申请提及输送载体可以是微球体,但是其没有公开如何制备这样的微球体,也没有表明这样的微球体将包含什么材料。而且,‘995申请认为脂质体实施方式是优选的,并且其大量详细地阐述了关于如何制备和使用由脂质体制成的输送载体。
相反地,本发明教导了包含丙交酯-乙交酯共聚物和/或L-酪氨酸磷酸酯的微胶囊和/或纳米胶囊。而且,本发明也包括不同于乙酰透明质酸的靶向剂以及与生物相容性和核酸转运有关的任选的添加剂,其每一种进一步使本发明区别于‘995申请。
美国公布的专利申请第2005/0037075号(下文称为‘075申请)涉及控释聚合物系统的靶向输送。更具体地,该‘075申请公开了由各种聚合物制成的聚合物系统,如微球体和/或纳米球。例如,第【0033】段陈述了:用于控释聚合物系统的合适聚合物的例子包括,但不限于......乳酸-羟基乙酸共聚物、乳酸-羟基乙酸共聚物衍生物、PEG化乳酸-羟基乙酸共聚物.....聚乙烯亚胺、聚乙烯亚胺衍生物、PEG化聚乙烯亚胺......和它们的组合。在优选的实施方式中,控释聚合物系统是微球体或纳米球。
此外,‘075申请讨论了使用核酸配体来靶向特定种类的细胞。而且,‘075申请讨论了使用这样的靶向微球体/纳米球来输送核酸到细胞。本发明包括微胶囊和/或纳米胶囊,其包含丙交酯-乙交酯共聚物和/或L-酪氨酸磷酸酯、至少一种靶向剂,和任选地包括PEG-g-壳聚糖和/或聚氮丙啶。虽然‘075申请公开了使用丙交酯-乙交酯共聚物作为微球体和/或纳米球输送载体,但是其没有公开与PEG-g-壳聚糖和/或聚氮丙啶结合的丙交酯-乙交酯共聚物。而且,‘075申请受限于核酸靶向剂,而本发明包括非核酸靶向剂。而且,本发明包括含有L-酪氨酸磷酸酯的微胶囊和/或纳米胶囊,其没有被‘075申请公开。
因而,本领域需要这样的非病毒载体,其能够靶向输送到生物体中选择的细胞和/或细胞类型,有效转染这类细胞并且避免有害的副作用。有利地,非病毒载体可以模拟病毒进入并转染细胞的能力,并且这样进行不引起免疫反应或导致感受态病毒的复制。同样,有利地,非病毒载体可以是生物可降解的,非毒性的,保护放置在其中的遗传物质免受酶的降解,和/或能够避免内体包囊作用。而且,期望具有不引发免疫、凝固和/或炎症反应的载体。
发明内容
本发明一般地涉及将遗传物质引入活细胞。在一些实施方式中,本发明涉及用于将核酸靶向输送到细胞的物质组合物。在另外的实施方式中,本发明涉及将核酸靶向输送到细胞的方法。在仍另外的实施方式中,本发明涉及在其主链中包含至少一个氨基酸的聚合物。而在另外的实施方式中,本发明涉及聚合物,所述聚合物在其主链中包含至少一个氨基酸,从而导致生物降解性,并且在一些实施方式中,导致可控的生物降解性。
在一种实施方式中,本发明涉及将核酸靶向输送到细胞的组合物,其包括:至少一种合成聚合物微胶囊或纳米胶囊,其中所述胶囊包括一种或多种材料,所述材料选自丙交酯-乙交酯共聚物、L-酪氨酸聚磷酸酯、L-酪氨酸聚氨酯或它们的任何组合;至少一个寻靶部分,所述寻靶部分布置在所述胶囊的表面上并且可用于结合到靶分子,其中所述寻靶部分包括能够与靶分子如抗体、抗体片段、抗原、跨膜蛋白、糖蛋白以及它们的任何组合特异性结合的任何部分;用于增强生物相容性的添加剂,其选自PEG-g-壳聚糖和两性PEG种类的一种或多种;以及用于帮助DNA转运穿过细胞膜的添加剂,所述添加剂选自线性聚氮丙啶、PEG-g-壳聚糖和其任何组合的一种或多种。
在另一实施方式中,本发明涉及含L-酪氨酸基的聚合物化合物(L-tyrosine-basedcontainingpolymercompound),其选自L-酪氨酸基聚磷酸酯聚合物、L-酪氨酸基聚氨酯聚合物或其两种或更多种的掺合物,其中至少一种L-酪氨酸基氨基酸部分或其衍生物存在于聚合物成分的主链中。
在仍另一实施方式中,本发明涉及L-酪氨酸基聚磷酸酯聚合物化合物,其包括至少一种具有下面所示式子的聚合物成分:其中重复单元数x被选择以使上述L-酪氨酸聚磷酸酯的分子量在降解之前近似在大约5,000Da至大约40,000Da的范围内。
而仍在另一实施方式中,本发明涉及L-酪氨酸基聚氨酯聚合物化合物,其包括至少一种具有下面所示式子的聚合物成分:其中重复单元数m、n和p被选择以使上述聚氨酯化合物的分子量在大约4,000Da至大约1,000,000Da的范围内。
而仍在另一实施方式中,本发明涉及产生至少一种聚氨酯聚合物化合物的方法,其包括下列步骤:(i)提供至少一种大二醇(macrodiol)、至少一种二异氰酸酯和至少一种增链剂;(ii)使所述至少一种大二醇(macrodiol)、至少一种二异氰酸酯和至少一种增链剂反应形成至少一种聚氨酯聚合物化合物;和(iii)收集所述至少一种聚氨酯化合物,其中所述至少一种增链剂包含L-酪氨酸,或者其官能衍生物或官能部分。
而仍在另一实施方式中,本发明涉及L-酪氨酸基聚磷酸酯聚合物化合物,其包括至少一种具有下面所示式子的聚合物成分:其中X是范围在大约10至大约80内的整数。
而仍在另一实施方式中,本发明涉及L-酪氨酸基聚氨酯聚合物化合物,其包括至少一种具有下面所示式子的聚合物成分:
其中n是大约5至大约25的范围内的整数,m是1至大约4的范围内的整数,而p是大约20至大约200范围内的整数。
附图说明
图1是由超声处理乳液形成的纳米球和假设的纳米球组合物的图解;
图2是假设的pDNA-LPEI从内体逃逸的图解;
图3是凝胶电泳:(A)1kbDNA梯;(B)贮存pDNA;(C)1分钟超声处理的pDNA-LPEI;和(F至H)贮存pDNAZ-LPEI;
图4是在24孔培养板中以各种pDNA-LPEI、BPEI和PEG-g-CHN复合质量比转染的细胞3天后的平均数图;
图5是用与各种质量比的聚合物复合的pDNA转染的人成纤维细胞的转染百分数图;
图6是人成纤维细胞的转染照片:(A)空白细胞;(B)1分钟超声处理的pDNA;(C)与FuGENE6一起的pDNA;(D)PDNA-LPEI;(E)30秒钟超声处理的pDNA-LPEI;(E)1分钟超声处理的pDNA-LPEI;
图7是1%复合pDNA纳米球的扫描电子显微术(SEM)(5000×放大倍数);
图8是1%复合pDNA纳米球的扫描电子显微术(SEM)(30000×放大倍数);
图9是空白纳米球的扫描电子显微术(SEM)(30000×放大倍数);
图10是叶轮复合的pDNA纳米球的扫描电子显微术(SEM)(30000×放大倍数);
图11是10%的复合pDNA纳米球的扫描电子显微术(SEM)(30000×放大倍数);
图12是说明采用正则化非负约束最小二乘法确定的空白pDNA纳米球的代表性大小分布图;
图13是说明采用正则化非负约束最小二乘法确定的1%复合pDNA纳米球的代表性大小分布图;
图14是说明采用正则化非负约束最小二乘法确定的叶轮形成的1%复合pDNA纳米球的代表性大小分布图;
图15是说明采用正则化非负约束最小二乘法确定的10%复合pDNA纳米球的代表性大小分布图;
图16是采用正则化非负约束最小二乘法的空白纳米球平均直径的下降;
图17是采用正则化非负约束最小二乘法的1%复合pDNA纳米球平均直径的下降;
图18是采用正则化非负约束最小二乘法的叶轮形成的1%复合pDNA纳米球平均直径的下降;
图19是采用正则化非负约束最小二乘法的10%复合pDNA纳米球平均直径的下降;
图20是暴露于200μL缓冲液的人皮肤成纤维细胞的一组图像:(A)显示死细胞;(B)显示活的并且新陈代谢活跃的细胞;和(C)组合荧光通道;
图21是暴露于4μgpDNA的人皮肤成纤维细胞的一组图像:(A)显示死细胞;(B)显示活的并且新陈代谢活跃的细胞;和(C)组合荧光通道,其中死细胞被圈出;
图22是暴露于2mMH2O2的人皮肤成纤维细胞的一组图像:(A)显示死细胞;(B)显示活的并且新陈代谢活跃的细胞;和(C)组合荧光通道;
图23是暴露于4μgpDNA和12μLFuGENE6的人皮肤成纤维细胞的一组图像:(A)显示死细胞;(B)显示活的并且新陈代谢活跃的细胞;和(C)组合荧光通道,其中死细胞被圈出;
图24是暴露于与4μgLPEI复合的4μgpDNA的人皮肤成纤维细胞的一组图像:(A)显示死细胞;(B)显示活的并且新陈代谢活跃的细胞;和(C)组合荧光通道,其中死细胞被圈出;
图25是暴露于400μg的1%复合pDNA纳米球的人皮肤成纤维细胞的一组图像:(A)显示死细胞;(B)显示活的并且新陈代谢活跃的细胞;和(C)组合荧光通道,其中死细胞被圈出;
图26是暴露于400μgPLGA纳米球的人皮肤成纤维细胞的一组图像:(A)显示死细胞;(B)显示活的并且新陈代谢活跃的细胞;和(C)组合荧光通道,其中死细胞被圈出;
图27是暴露于400μg叶轮形成的1%复合pDNA纳米球的人皮肤成纤维细胞的一组图像:(A)显示死细胞;(B)显示活的并且新陈代谢活跃的细胞;和(C)组合荧光通道,其中死细胞被圈出;
图28是暴露于100μg的10%复合pDNA纳米球的人皮肤成纤维细胞的一组图像:(A)显示死细胞;(B)显示活的并且新陈代谢活跃的细胞;和(C)组合荧光通道;
图29是说明通过LIVE/DEAD(活/死)细胞分析确定的各种绿色载体(greenvector)的细胞生存力的图;
图30是说明各种纳米球制剂的负载效率的图;
图31是凝胶电泳照片:(A)1kbDNA梯;(B)1天后的空白纳米球释放;(C)2天后的空白纳米球释放;(D)3天后的空白纳米球释放;(E)4天后的空白纳米球释放;(F)5天后的空白纳米球释放;(G)6天后的空白纳米球释放;(H)7天后的空白纳米球释放;
图32是凝胶电泳照片:(A)1kbDNA梯;(B)贮存pDNA;(C)贮存pDNA-LPEI,(D)0.5小时后的1%复合pDNA纳米球释放;(E)1.5小时后的1%复合pDNA纳米球释放;(F)3.0小时后的1%复合pDNA纳米球释放;(G)6.0小时后的1%复合pDNA纳米球释放;(H)12.0小时后的1%复合pDNA纳米球释放;(I)24小时后的1%复合pDNA纳米球释放;(J)2天后的1%复合pDNA纳米球释放;(K)3天后的1%复合pDNA纳米球释放;(L)4天后的1%复合pDNA纳米球释放;(M)5天后的1%复合pDNA纳米球释放;(N)6天后的1%复合pDNA纳米球释放;和(O)7天后的1%复合pDNA纳米球释放;
图33是凝胶电泳照片:(A)1kbDNA梯;(B)贮存pDNA;(C)贮存pDNA-LPEI,(D)0.5小时后的10%复合pDNA纳米球释放;(E)1.5小时后的10%复合pDNA纳米球释放;(F)6.0小时后的10%复合pDNA纳米球释放;(G)12.0小时后的10%复合pDNA纳米球释放;(H)24.0小时后的10%复合pDNA纳米球释放;(I)2天后的10%复合pDNA纳米球释放;(J)3天后的10%复合pDNA纳米球释放;(K)4天后的10%复合pDNA纳米球释放;(L)6天后的10%复合pDNA纳米球释放;(M)7天后的10%复合pDNA纳米球释放;
图34是凝胶电泳照片:(A)1kbDNA梯;(B)贮存pDNA;(C)贮存pDNA-LPEI,(D)0.5小时后的叶轮形成的1%复合pDNA纳米球释放;(E)1.5小时后的叶轮形成的1%复合pDNA纳米球释放;(F)3.0小时后的叶轮形成的1%复合pDNA纳米球释放;(G)6.0小时后的叶轮形成的1%复合pDNA纳米球释放;(H)12.0小时后的叶轮形成的1%复合pDNA纳米球释放;(I)24小时后的叶轮形成的1%复合pDNA纳米球释放;(J)2天后的叶轮形成的1%复合pDNA纳米球释放;(K)3天后的叶轮形成的1%复合pDNA纳米球释放;(L)4天后的叶轮形成的1%复合pDNA纳米球释放;(M)5天后的叶轮形成的1%复合pDNA纳米球释放;(N)6天后的叶轮形成的1%复合pDNA纳米球释放;(O)7天后的叶轮形成的1%复合pDNA纳米球释放;
图35凝胶电泳照片:(A)1kbDNA梯;(B)贮存pDNA;(C)第1天后的非复合pDNA纳米球释放;(D)第2天后的非复合pDNA纳米球释放;(E)第3天后的非复合pDNA纳米球释放;
图36是原代人皮肤成纤维细胞的的代表性转染的照片,所述转染通过第2天从(A)空白纳米球;(B)1%pDNA纳米球;(C)10%pDNA纳米球;(D)叶轮形成的1%pDNA纳米球释放而获得;
图37是说明基于原代人皮肤成纤维细胞的转染百分数的pDNA-LPEI的累积释放图。
图38是一组照片:(A)FITC标记的纳米球;(B)DAPI染色的核;(C)罗丹明鬼笔环肽(rhodaminephalloidin)染色的细胞骨架;和(D)示出的FITC标记纳米球之人成纤维细胞细胞摄取;
图39是一组照片:(A)对人成纤维细胞的FITC荧光过滤;(B)DAPI染色的核;(C)罗丹明鬼笔环肽染色的细胞骨架;(D)没有添加FITC标记纳米球情况下的人成纤维细胞;
图40是一组来自成纤维细胞摄取FITC标记纳米球的共聚焦显微术的照片:
图41是用下列转染的人皮肤成纤维细胞在第3天的一组照片:(A)4μgpDNA;(B)4μgpDNA与12μLFuGENE6转染试剂;(C)与4μgLPEI复合的4μgpDNA;(D)400μg的1%复合pDNA纳米球;
图42是用下列转染的人皮肤成纤维细胞在第5天的一组照片:(A)4μgpDNA;(B)4μgpDNA与12μLFuGENE6转染试剂;(C)与4μgLPEI复合的4μgpDNA;(D)400μg的1%复合pDNA纳米球;
图43是是用下列转染的人皮肤成纤维细胞在第7天的一组照片:(A)4μgpDNA;(B)4μgpDNA与12μLFuGENE6转染试剂;(C)与4μgLPEI复合的4μgpDNA;(D)400μg的1%复合pDNA纳米球;
图44是是用下列转染的人皮肤成纤维细胞在第9天的一组照片:(A)4μgpDNA;(B)4μgpDNA与12μLFuGENE6转染试剂;(C)与4μgLPEI复合的4μgpDNA;(D)400μg的1%复合pDNA纳米球;
图45是是用下列转染的人皮肤成纤维细胞在第11天的一组照片:(A)4μgpDNA;(B)4μgpDNA与12μLFuGENE6转染试剂;(C)与4μgLPEI复合的4μgpDNA;(D)400μg的1%复合pDNA纳米球;
图46是说明在11天的期间pDNA-LPEI对1%pDNA-LPEI纳米球的比较转染效率图;
图47是说明在11天的期间FuGENE6对1%pDNA-LPEI纳米球的比较转染效率图;
图48是说明在11天的期间1%pDNA-LPEI纳米球对pDNA-LPEI和pDNA-FuGENE6的转染效率曲线图;
图49是说明在11天的期间1%pDNA-LPEI纳米球对pDNA-LPEI和pDNA-FuGENE6的累积转染效率曲线图;
图50是表达lacZ基因的人皮肤成纤维细胞的亮视野图像;
图51是PEG-HDI-DTH的1HNMR图;
图52是PCL-HDI-DTH的1HNMR图;
图53是PEG-HDI-DTH的13CNMR图;
图54是PCL-HDI-DTH的13CNMR图;
图55是按照本发明形成的L-酪氨酸基聚氨酯的一组FT-IR描记线;
图56是按照本发明的成分、预聚物和聚氨酯的一组FT-IR描记线;
图57是按照本发明形成的L-酪氨酸基聚氨酯的一组DSC加热曲线;
图58是按照本发明形成的L-酪氨酸基聚氨酯的TGA分析;和
图59是按照本发明形成的L-酪氨酸基聚氨酯的应力应变曲线。
具体实施方式
本发明一般地涉及将遗传物质引入活细胞。在一些实施方式中,本发明涉及用于将核酸靶向输送到细胞的物质组合物。在另外的实施方式中,本发明涉及将核酸靶向输送到细胞的方法。在仍另外的实施方式中,本发明涉及在其主链中包含至少一个氨基酸的聚合物。而在另外的实施方式中,本发明涉及聚合物,所述聚合物在其主链中包含至少一个氨基酸,从而导致生物降解性,并且在一些实施方式中,导致可控的生物降解性。
本发明一般地涉及靶向输送遗传物质到真核细胞的方法和材料。本发明的一些实施方式包括纳米球,所述纳米球由L-酪氨酸聚磷酸酯(LTP)的共混聚合物、接枝到壳聚糖的聚乙二醇(PEG-g-CHN)、以及作为非病毒基因输送载体的与线性2聚氮丙啶(LPEI)复合的质粒DNA(pDNA)配制。因而,一些实施方式能够通过被例如哺乳动物细胞吸收来模拟病毒、逃避内体截留、保护布置在其中的遗传物质免于酶降解和/或体外有效转染细胞。从非病毒载体持续释放:
为了减少给药次数并维持最佳剂量水平,非病毒载体需要显示出持续并可控的释放。载体降解的速率决定了所述释放的释放动力学和持续时间。持续DNA释放可以延长外源基因表达,因而减少了对于重复给药的需要,这对于长期基因治疗是一种显著的优势。以前的研究使用水凝胶、聚合物基质和微球体以获得持续控制释放。由乙酰透明质酸配制的微球体在几个月内显示出持续的pDNA释放,这对于长期治疗是期望的。然而,侵入性短期基因输送对于与癌症治疗有关的“自杀”基因治疗可能是必需的。因此,更多侵入性治疗将受益于在几天内降解并产生持续释放的聚合物载体。L-酪氨酸聚磷酸酯降解:
具有L-酪氨酸聚磷酸酯(LTP)的非病毒载体的配制产生在7天内展示出持续释放的载体。LTP将是短期治疗的理想基因载体。LTP是由天然氨基酸L-酪氨酸合成的生物可降解肽聚磷酸酯。LTP在磷酯键处水解生物降解并且在聚合物主链中的肽键处酶促降解为L-酪氨酸基衍生物,从而适合用于生物材料应用。降解产物是无毒的磷酸盐和L-酪氨酸。而且,LTP的降解产物对于局部pH的影响微不足道,这不象其它的生物材料如DL-丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)。L-酪氨酸聚磷酸酯在各种常见有机溶剂中可溶并且因而能够被加工为微球体或纳米球制剂。其中上式表示L-酪氨酸聚磷酸酯的化学结构,并且其中(1)至(4)表示其降解位点,其中(1)是主链磷酸酯键——水解;(2)是侧链磷酸酯键——水解;(3)是侧链烷基(己基)酯键——水解;和(4)是主链酰胺(肽)键——酶解作用,并且其中x是范围在大约10至大约80内的整数,或从大约15至大约75的整数,或从大约20至大约70的整数,或从大约25至大约60的整数,或从大约30至大约50的整数,或甚至从大约35至大约45的整数。这里以及说明书和权利要求中的其它地方,各个范围界限可以被组合以形成额外的未公开的范围。
在另一实施方式中,上式中重复单元数x被选择,使得上述L-酪氨酸聚磷酸酯的分子量在降解之前近似地在大约5,000道尔顿(Da)至大约40,000Da、或大约7,500Da至大约30,000Da、或大约10,000Da至大约25,000Da、或甚至从大约15,000Da至大约20,000Da的范围内。在这里以及说明书和权利要求中的其它地方,各个范围界限可以被组合以形成额外的未公开的范围。在另一实施方式中,重复单元数x被选择以使上述L-酪氨酸聚磷酸酯的分子量为大约11,000Da。作为非病毒载体的纳米球:
生物可降解纳米球相对于其它非病毒载体具有独特的优势,因为它们在大小上与病毒相当。病毒的大小范围为几十到几百个纳米。以前的研究表明,与大于50nm的颗粒相比,具有小于50nm的半径的颗粒显示出明显较大的内吞或胞饮摄取,其中最适大小为大约25nm。一些细胞受体能够促进载体摄取,直接穿过质膜进入到细胞质中,但是大分子部分的受体介导的摄取的大多数常见途径是通过内吞作用。因而,内吞作用是靶向基因输送的有吸引力的机制,其可以通过纳米球完成。同样,类似于病毒,一旦纳米球被内吞,它们可以提供细胞内pDNA输送,其将避免循环中的酶降解。纳米球包囊pDNA:
在纳米球中包囊蛋白质或质粒的最常见的方法是通过超声处理产生乳液(图1)。在乳化过程中,热力学利于亲水性pDNA被包载在油相内的内部水相中。得到的纳米球在通过蒸发而提取溶剂之后形成。在配制用于pDNA输送的纳米球时出现几个问题,如不良负载、爆发释放、乳液不稳定性以及生物活性丧失。不良的包载效率可能由于不稳定的乳液而出现,或可能在大量的pDNA聚集在乳液的外部水相中时出现。同样地,当外部水相中的pDNA在溶剂蒸发期间粘附到纳米球的表面时,爆发释放可以发生。超声处理可以剪切大多数的pDNA,使得其不再是生物活性的。这些问题可以通过将复合到pDNA的阳离子聚合物与防止剪切并稳定乳液的两性聚合物掺合而减轻。聚乙二醇接枝的壳聚糖在纳米球中的作用:
将聚乙二醇接枝的壳聚糖(PEG-g-CHN)掺合入纳米球中不仅稳定了乳液以便增加纳米球产量,而且也增强了生物相容性。几个研究显示,PEG-g-CHN与DNA形成复合物并且能够被用作基因载体。显示壳聚糖本身与pDNA形成复合物并改善转染效率。而且,壳聚糖被FDA批准为食品添加剂并且被认为是无毒的。然而,壳聚糖作为基因载体受到限制,因为具有分子内和分子间氢键的壳聚糖的晶体结构在生理pH下抑制其在有机溶剂或水溶液中的溶解性。通过将聚乙二醇(PEG)经由氢键接枝到壳聚糖,形成两性聚合物,其在二甲基亚砜(DMSO)和酸性水溶液中都可溶。当通过乳液法配制具有PEG-g-CHN的纳米球(图1)时,热力学有利于亲水性PEG在油相和外部水相之间的富集。因而,在溶剂蒸发过程中,PEG被假定为在纳米球表面变得富集。在纳米球表面上的PEG是理想的,因为PEG通过空间排斥机制防止血浆蛋白吸附、血小板粘附和血栓形成。在表面具有PEG的纳米球能够对凝固、免疫和炎症系统隐形。热力学也有利于在油相中用LTP富集壳聚糖。PEG-g-CHN的化学结构PEG-g-CHN——其一般结构已在上面说明——购自CarboMer,Inc(目录号7-00105)。线性聚氮丙啶在纳米球中的作用:
在纳米球制剂中掺入阳离子聚合物——线性聚氮丙啶(LPEI)用于两个主要目的。首先,LPEI浓缩pDNA,其防止在超声处理期间pDNA的剪切。这种剪切预防已经通过初步研究加以证明,所述研究显示超声处理的复合有LPEI的pDNA具有生物活性并且是完整的。浓缩发生是由于正电荷的LPEI和负电荷的pDNA之间的电荷吸引。N/P比是pDNA-LPEI复合物的离子平衡量度。LPEI的正电荷来源于LPEI的重复单元——NHCH2CH2,其具有43g/mol的分子量——的氮。质粒DNA主链中的负电荷来自脱氧核糖核苷酸的磷酸基团。核苷酸的平均分子量被假设为330g/mol。因此,1mgpDNA与1mgLPEI的复合物具有7.7的N/P比。幸运地,pDNA-LPEI复合物是亲水的,所以热力学将有利于它们在乳化过程中包囊到纳米球的内部水相中(图1)。因此,当纳米球的LTP降解时,pDNA-LPEI复合物可以被释放。
LPEI的第二个目的是其大大增加载体转染效率。细胞外流体或细胞质中的非复合pDNA的直接释放具有低的转染效率,原因在于其不能结合并通过细胞膜、逃避内体截留以及溶酶体降解。细胞膜,如同pDNA一样,具有负电荷。因而,pDNA将排斥细胞膜并不可能被内吞。将pDNA与阳离子聚合物如支化聚氮丙啶(BPEI)和LPEI复合将有助于中和其电荷。BPEI和LPEI都使DNA浓缩为直径50至100nm的复合物,其为能够被内吞的颗粒大小。这些复合物在低离子强度溶液中形成,以图控制所述复合物的总体大小。较小的复合物似乎比较大的复合物具有较高的转染效率和较小的毒性。许多研究显示,与BPEI相比,LPEI25kDa具有较高的转染效率和较低的细胞毒性。线性聚氮丙啶的化学结构在上式中,重复单元数n被选择,以使上述线性聚氮丙啶成分的分子量在大约5,000Da至大约50,000Da、或大约10,000Da至大约40,000Da、或大约15,000Da至大约30,000Da、或甚至大约20,000Da至大约25,000Da的范围内。在这里以及说明书和权利要求中的其它地方,各个范围界限可以被组合以形成额外的未公开的范围。在另一实施方式中,n被选择以使上述线性聚氮丙啶成分的分子量为大约25,000Da。
通过用LPEI浓缩pDNA而增强转染的确切机制是未知的。然而,怀疑LPEI能够逃避内体截留和最终的溶酶体降解。在另一方面,假设pDNA-LPEI通过“质子海绵理论”(protonspongetheory)逃避内体截留(图2)。在质子海绵理论中,在LPEI的主链结构中整合入的氨基基团具有低pKa,其显示了低于生理pH的缓冲特性。因而,内体中的LPEI干扰了区室的pH降低并且诱导出升高的离子渗透压以引起内体膨胀和随后的破裂。从而,内吞的pDNA-LPEI复合物可以被有效地输送到核。pDNA-LPEI复合物进入核并且表达的机制是未知的。认为LPEI和pDNA解离从而实现转染。其它的理论认为载体复合物仅仅在有丝分裂过程中能进入核。其他理论假定复合物或pDNA以通过平均直径25nm的核孔的方式扩散进入。方法:
通过克服障碍如:通过细胞膜、避开内体、保护DNA免受酶降解和剪切以及有效转染,可以实现采用非病毒载体的成功基因治疗。这些障碍将通过从L-酪氨酸聚磷酸酯(LTP)的共混聚合物、接枝到壳聚糖的聚乙二醇(PEG-g-CHN)和与线性聚氮丙啶(LPEI)复合的质粒DNA(pDNA)配制的纳米球来克服。超声处理的pDNA-LPEI复合物的琼脂糖凝胶电泳分析:
已知在纳米球合成的乳化步骤过程中进行超声处理可剪并破坏pDNA。因此,需要用PEG-g-CHN、LPEI或BPEI浓缩质粒DNA(pDNA)。为了确定用LPEI复合pDNA在纳米球合成的超声处理中是否保护pDNA免受剪切,进行了琼脂糖凝胶电泳分析。首先,所有用于下列实验中的水被蒸馏、去离子化(BarnsteadNanoPureII)并被高压灭菌(AmericanStandard25X-1),以失活DNAase。其次,采用QIAGEN质粒纯化试剂盒扩增PEF1-V5(Invitrogen)质粒DNA。分子量为25,000道尔顿的LPEI(PolyScienceInc.)在70℃以1mg/ml的浓度溶于dH2O。然后,质量比为1∶1的pDNA-LPEI(20μg/mlpDNA和20μg/mlLPEI)样品在37℃在500μL经高压灭菌的蒸馏和去离子H2O(dH2O)中浓缩45分钟。这些样品被制备三份,超声处理时间为两份30秒钟和1份1分钟。接着,将超声仪尖端(Branson102CCE)放置在pDNA-LPEI样品中并且超声处理30秒或1分钟。然后,从每一经超声处理的样品中取出30μL,并且与6μL6×染料(Sigma-Aldrich)混合,然后加载到含有溴化乙啶(0.5μg/ml,FisherScientific)的0.7%琼脂糖凝胶中。pDNA-聚合物复合物的转染效率和细胞毒性:
已经表明,用LPEI和BPEI复合pDNA大大增强了细胞转染;然而,它们在高剂量下具有毒性。以前的研究显示,转染随着增加pDNA和BPEI或LPEI之间的N/P比而增加。因此,具有低毒性的转染效率的优化是必要的。为了比较各种超声处理的和未经超声处理的pDNA-聚合物复合物的转染效率和细胞生存力,进行了X-Gal转染分析。首先,具有80%乙酰化的PEG-g-CHN(CarboMerInc.)在37℃在旋转下以3.33mg/ml的浓度溶于0.1N乙酸48小时。分子量为25,000道尔顿的LPEI(PolyScienceInc.)在70℃以1mg/ml的浓度溶于dH2O15分钟。分子量为50,000道尔顿的BPEI(PolyScienceInc.)被制备为30%的水溶液。然后,在37℃,在500μL的dH2O中,以20μg/ml的pDNA浓度,将1∶1、1∶2、1∶4和1∶8的pDNA-LPEI质量比;1∶1、1∶2和1∶8的pDNA-BPEI的质量比;以及1∶1和1∶10的pDNA-PEG-g-CHN质量比浓缩45分钟。接着,将原代人皮肤成纤维细胞(为KennethCalhounResearchCenter,AkronGeneralMedicalCenter的JudyFulton所赠)以25,333个细胞/孔的密度接种到孔组织培养板上,并在37℃用成纤维细胞饲养培养基(90%Dulbecco’sModifiedEagleMedium和10%胎牛血清,含1%的抗真菌剂)维持过夜。第二天,更换成纤维细胞饲养培养基。
接着,将200μLpDNA-LPEI复合物样品和200μL经超声处理的pDNA-LPEI复合物样品(每一样品4μgpDNA)加入到每一孔中。贮存pDNA和TE缓冲液被用作阴性对照。阳性对照为pDNA结合的FuGENE6(Roche,Indianapolis,IN)——一种商业转染试剂。通过将4μg的pDNA(40μL)与12μL的FuGENE6和148μL的DMEM温育15分钟来制备FuGENE6。细胞在37℃温育72小时。接着,用磷酸缓冲液溶液(PBS)洗涤细胞,用1%甲醛固定细胞,并且用X-Gal染色分析测定转染。随机拍摄5张照片。显示蓝色的细胞被成功转染并表达β-gal酶。通过将转染的(蓝色)细胞除以细胞总数来计算转染百分数。纳米球合成:
采用通过超声处理和溶剂蒸发技术制备的水和油的乳液来制备用LTP、PEG-g-CHN和pDNA-LPEI配制的纳米球(参见下面表1)。对于每一种纳米球制剂,在37℃,PEG-g-CHN以3.33mg/ml的浓度溶于0.1N乙酸48小时。根据由Gupta和Lopina建立的方法合成LTP。以100mg/ml的浓度将LTP溶于氯仿。接着,制备在dH2O中的5%聚乙烯吡咯烷酮。在70℃,以3、10或15mg/ml的浓度将LPEI溶于dH2O15分钟。然后,对于负载pDNA-LPEI复合物的纳米球,pDNA和LPEI各自以0.3、1.0和3.0mg/ml的浓度在dH2O中复合45分钟。接着,下面示出的纳米球制剂通过超声波仪(Branson102CCE)乳化1分钟。进行纳米球合成,重复6次。也配制了具有10%负载pDNA的一批纳米球,所述负载pDNA与等量的LPEI复合(表2)。空白纳米球和空白PLGA纳米球被配制为阴性对照(表2)。采用由叶轮(YamatoLab-StirrerLR400D)形成的水包油包水型(water-in-oil-in-water)乳液,产生额外批次的纳米球。表1-用于各种纳米球制剂的pDNA和LPEI的复合物 表2-纳米球制剂
接着,使氯仿蒸发5小时同时轻轻搅拌所述乳液。然后通过在15,000×g离心15分钟收集纳米球。之后,通过用高压灭菌的dH2O在15,000×g离心15分钟将纳米球洗涤3次。然后,所述纳米球在10mldH2O中壳式冷冻(shellfrozen),并且被放置在冷冻干燥机(LabconcoFreezone4.5)中72小时。最后,冻干的纳米球被储存在干燥器中。表征pDNA-LPEI负载纳米球的大小、形状、形态、降解和细胞毒性: 基本原理:细胞内输送pDNA到核应该通过避免在循环中的酶降解而增加转染效率。纳米球必须被内吞来完成细胞内输送。为了被内吞,纳米球必须模拟病毒的纳米范围。因此,有必要确认,以表明与最初研究中的空白纳米球相比,纳米球中1%负载的复合pDNA没有影响它们的大小、形状和形态。而且,当纳米球降解时测量其直径,表征降解概况。此外,暴露于纳米球的成纤维细胞必须具有与暴露于PLGA纳米球的成纤维细胞和未暴露的成纤维细胞相当的细胞生存力。假设,SEM和激光散射将显示1%复合pDNA负载的纳米球在大小、形状和形态学上与最初研究中的空白纳米球是相当的。而且,基于以前的研究,激光散射将示出纳米球在7天后被完全降解。活/死细胞分析将示出暴露于1%复合pDNA纳米球的成纤维细胞具有与未暴露的成纤维细胞相当的细胞生存力。纳米球的扫描电子显微术:
使用扫描电子显微镜(SEM,HitachiS2150),以定量比较1%复合pDNA负载的纳米球与空白纳米球和PLGA纳米球的大小、形状和形态。首先,1mg的纳米球悬浮在1ml蒸馏且去离子的H2O中。然后,200μL悬浮的微球体被吸到棒上、脱水、用银/钯溅射涂膜,并进行检测。空白纳米球、1%非复合纳米球、10%复合pDNA纳米球、叶轮形成的1%复合pDNA纳米球以及PLGA纳米球被用作对照。纳米球的激光散射:
动态激光散射被用作比较1%复合pDNA负载纳米球与空白纳米球的大小的额外方法。通过将1mg纳米球悬浮在10ml已经通过0.2μm过滤器的PBS中来制备纳米球样品。将悬浮纳米球在1000×g离心10秒以除去任何大的聚集体。然后,该样品被倾析入玻璃闪烁瓶中。动态激光散射系统(BrookhavenInstrumentsBI-200SM)通过正则化非负约束最小二乘(RegularizedNon-negativelyConstrainedLeastSquares(CONTIN))法来计算纳米球直径。纳米球大小的范围被报告为微分分布值。所述微分分布值在0至100之间变化,不是百分数,只是100。最高峰值或最常见值(modalvalue)被赋值为数100。例如,如果150nm的直径具有37的微分分布值而在200nm的直径下微分分布值为74,那么,该分布在200nm比在150nm具有两倍的量。微分分布值在对应的直径下是相对量。空白纳米球、1%非复合纳米球、10%复合pDNA纳米球、叶轮形成的1%和空白PLGA纳米球将被用作对照。纳米球的降解:
为了量化纳米球在体外的释放持续时间和降解,使用激光散射。根据本文描述的程序进行光散射样品和程序。然后,在37℃温育所述纳米球并且轻微地摇动11天。在第0、1、2、3、4、7和11天,进行激光散射,以测量纳米球直径。通过Brookhaven软件计算纳米球平均直径并且每天报告。空白纳米球、1%非复合纳米球和空白PLGA纳米球被用作对照。暴露于纳米球之后的细胞生存力:
采用活/死细胞分析(Invitrogen)测定暴露于1%复合pDNA纳米球之后的原代人皮肤成纤维细胞的细胞生存力。首先,原代人皮肤成纤维细胞(为KennethCalhounResearchCenter,AkronGeneralMedicalCenter的JudyFulton所赠)以25,333个细胞/孔的密度接种到24孔组织培养板上,并在37℃用成纤维细胞饲养培养基(90%Dulbecco’sModifiedEagleMedium和10%胎牛血清,含1%的抗真菌剂)维持过夜。第二天,更换成纤维细胞饲养培养基。成纤维细胞暴露于400μg纳米球中。在1、3、7和11天后,根据制造商的说明书进行活/死细胞分析。空白纳米球、pDNA-LPEI、pDNA-FuGENE6、10%pDNA纳米球、叶轮形成的1%复合pDNA纳米球以及空白PLGA纳米球被用作对照。量化并表征pDNA-LPEI的纳米球负载和释放
基本原理:复合pDNA的持续释放将降低给药次数。为了进行短期基因治疗,期望完整的复合pDNA持续释放大约7天。因此,表征、量化并且在结构上检验了复合pDNA在7天内的释放。假设,基于初步研究,持续释放将在至少三天的过程中被观察到。而且,基于初步结果,预期在释放样品和阴性对照的转染效率之间具有显著差异。AFM被假定为显示从1%复合pDNA纳米球释放的完整pDNA-LPEI复合物。所释放的pDNA-LPEI复合物将不会与贮存pDNA-LPEI复合物在大小上具有显著差异。pDNA存纳米球中的负载效率:
应用(MolecularProbes)荧光分析,测定各种纳米球制剂的负载效率。所有pDNA纳米球制剂的负载通过在37℃将2mg纳米球溶于0.2ml氯仿1小时来测定。然后,加入等体积的高压灭菌的TE缓冲液并且轻轻摇动2分钟。氯仿和TE之间的相分离在30分钟后被允许形成。然后,该混合物在10,000×g离心5秒。接着,取样200μL的TE上清液。根据制造商的说明书应用(MolecularProbes)荧光分析确定pDNA的量。从纳米球释放的pDNA的琼脂糖凝胶电泳:
从1%复合pDNA负载的纳米球的pDNA-LPEI释放被表征。每一批叶轮形成的1%复合pDNA纳米球和10%复合pDNA纳米球也被分析。空白和1%非复合纳米球被用作对照。首先,2mg的每一纳米球制剂悬浮在500μLTE缓冲液中并且在37℃在持续旋转的条件下温育。接着,在30分钟、1小时、3小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天之后,在10,000×g离心纳米球悬浮液,收集450μL上清液并且用等体积的新鲜TE缓冲液替换。而且,释放样品被冻干并且被重悬在100μL的TE缓冲液中。通过琼脂糖凝胶电泳分析释放自1%非复合pDNA负载的纳米球的pDNA和pDNA-LPEI的结构完整性。首先,来自每一释放时间点和纳米球制剂的30μL样品与6μL6×加载染料混合并且被加载到含有溴化乙啶的0.8%琼脂糖凝胶中。基于转染的纳米球释放模式:
采用原代人皮肤成纤维细胞,用X-Gal转染分析来测定释放自纳米球的pDNA-LPEI的生物活性的量。根据该文第3.2.4部分中的方案维持细胞。接着,40μL释放样品被加入到饲养培养基中。应用200ng(2μL)、1.9μL的FuGENE6和96.1μL的DMEM的混合物,用贮存pDNA转染对照成纤维细胞。贮存pDNA、从空白纳米球的释放物、1%非复合pDNA负载的纳米球以及TE缓冲液将被用作阴性对照。接着,用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞,用1%甲醛固定细胞并且使用X-Gal染色分析来测定转染。随机拍摄5张照片。显示蓝色的细胞被成功转染并表达β-gal酶。通过将转染的细胞(蓝色)数除以细胞总数来计算转染百分数。释放的pDNA-LPEI的原子力显微术(AtomicForceMicroscopy):
采用原子力显微镜(AFM,VeccoNanoscopeIII)表征释放的pDNA-LPEI复合物的物理结构。首先,分析浓度为20μg/ml的pDNA和pDNA-LPEI贮存样品,以获得基准图像。通过将20μL的释放物吸取到硅晶片(由阿克伦大学化学工程系的Bi-minZhangNewby馈赠)上制备样品,脱水并应用AFM显像。空白纳米球、贮存pDNA和贮存pDNALPEI复合物将被用作对照。将释放pDNA-LPEI复合物的结构与贮存pDNA-LPEI复合物的结构进行比较。验证纳米球被细胞吸收并且相对于单独的pDNA获得较高转染效率:
基本原理:需要验证通过从被内吞的纳米球持续释放的pDNA-LPEI复合物的转染相对于单独的pDNA的总体增强。因此,纳米球的内吞和转染效率的增加被验证。假设,FITC标记的纳米球的细胞摄取将被显示并且应用共聚焦显微镜来验证。此外,转染效率的显著差异被假定存在于暴露于4μgpDNA的对照细胞和暴露于400μg1%或10%复合pDNA负载的纳米球的细胞之间。纳米球的细胞摄取:
为了确定LTP/PEG-g-CHN/LPEI纳米球是否通过内吞作用被吸收,将原代人成纤维细胞暴露于FITC标记的纳米球并且用共聚焦显微镜(OlympusFluoview)显示。首先,根据上述第3.2部分中的纳米球合成方法,产生FITC负载(1%)的纳米球,只是用在1mlDMSO中的3mg/mlFITC溶液代替1ml的dH2O。接着,将人皮肤成纤维细胞以25,333个细胞/孔的密度在24孔组织培养板中接种到无菌German玻璃细胞培养盖玻片(Fisher)上并在37℃用成纤维饲养培养基维持过夜。第二天,更换成纤维细胞饲养培养基。然后,将1mgFITC标记的纳米球悬浮在1mldH2O中。接着,将80μL的悬浮纳米球加入到每一孔的饲养培养基中。将未任何暴露于FITC负载纳米球的人皮肤成纤维细胞接种到German玻璃盖玻片上,用作阴性对照。温育24小时之后,用PBS洗涤成纤维细胞并用1%甲醛PBS固定10分钟。接着,用PBS洗涤该细胞,然后将2.5μL的6.6μM罗丹明鬼笔环肽贮存液(MolecularProbes)在PBS中稀释至100μL并且加到每一盖玻片上。在室温温育20分钟后,用PBS洗涤细胞。然后所述盖玻片被封固到带有含DAPI(Vectorlaboratories)的Vectashield封固剂的玻片上。除去过多的封固剂;密封盖玻片并且储存在4℃。接着,首先应用荧光显微镜(Axiovert200,CarlZeiss),显示FITC标记的纳米球的细胞摄取,然后用NEOUCOM的带有2个荧光通道(FITC和罗丹明)的共聚焦显微镜(OlympusFluoview)显示,并且用光电管拍照。共聚焦显微镜辅助设备由NEOUCOM的JeanetteG.Killius提供。纳米球的转染效率:
为了定性检测1%和10%复合pDNA负载纳米球的转染效率,以直接加入纳米球的方式对原代人成纤维细胞进行X-Gal转染分析。首先,将人成纤维细胞以25,333个细胞/孔的密度接种到24孔组织培养板并在37℃用成纤维饲养培养基维持过夜。第二天,更换成纤维细胞饲养培养基。接着,将2mg纳米球悬浮在500μL饲养培养基中。然后,100μL的悬浮纳米球被加入到细胞。应用200ng(2μL)、1.9μL的FuGENE6和96.1μL的DMEM的混合物,用贮存pDNA转染对照成纤维细胞。在温育3、5、7、9和11天后,用在PBS中的1%甲醛固定成纤维细胞10分钟。接着,根据制造商的说明书进行X-Gal转染分析。对于每一转染结果(对于每一时间点,n=3),应用具有20×放大倍数的透镜的显微镜(Axiovert200,CarlZeiss)选择3个随机视野,并采用CannonPowerShotG5相机捕捉亮视野图像。显示蓝色的细胞被成功转染并表达β-gal酶。空白纳米球、4μg复合pDNA、与FuGENE6一起的pDNA、空白TE缓冲液和4μgpDNA被用作对照。统计学:
所有的定量研究重复进行6次,通过把握度分析进行确定,其中α=0.05。非参数Kruskal-Wallis方差分析被用于确定每一样品组内的统计学差异。当p≤0.05时,所有的结果都被认为是显著的。如果在样品组内没有发现显著性差异,那么该样品被认为是正态分布。然后在正态分布的样品组之间进行Tukey方差分析。如果p≤0.05,则所有结果被认为是显著的。结果: 初步结果:超声处理的pDNA-LPEI复合物的琼脂糖凝胶电泳分析:
以往研究已经显示,与聚阳离子聚合物复合的pDNA在凝胶的加载孔中产生高分子量条带。这些条带对于超声处理的样品1∶1pDNA-LPEI和对于贮存1∶1pDNA-LPEI而言可在凝胶中见到(图3)。凝胶中没有见到pDNA剪切的证据。如果未复合pDNA被超声处理,对pDNA的剪切和破坏可以被显示为凝胶中低分子量拖带。然而,电泳凝胶表明,pDNA被复合到LPEI,且pDNA在超声处理期间没有被剪切。pDNA-聚合物复合物的转染效率和细胞毒性:
1∶1pDNA-LPEI、1∶1pDNA-PEG-g-CHN和1∶10pDNA-PEG-g-CHN的复合物的体内加入产生了高细胞生存力,其与空白细胞和只用pDNA转染的细胞相当,如图4所示。暴露于1∶1pDNA-LPEI、1∶1pDNA-PEG-g-CHN和1∶10pDNA-PEG-g-CHN的细胞达到汇合群体,所述汇合群体继续增殖和生长(图4)。1∶1pDNA-LPEI复合物具有与建立的转染试剂FuGENE6几乎相同——如果不更好的话——的细胞生存力(图4)。然而,暴露于1∶2、1∶4、1∶8、1∶10pDNA-LPEI和1∶1、1∶2、1∶8pDNA-BPEI的细胞没有继续生长并且发生细胞死亡(图4)。
暴露于1∶1pDNA-LPEI(4μgLPEI)的成纤维细胞产生大约为30%的最高转染百分数(图5和6),其比公认的转染试剂FuGENE6的大约12%的转染百分数高得多。pDNA与BPEI和PEG-g-CHN的复合物产生低的转染百分数。因此,由于PEG-g-CHN的低转染和BPEI的高细胞毒性,不考虑将它们用于将来的结合研究。X-Gal转染分析显示,在贮存pDNA-LPEI与30秒超声处理和1分钟超声处理的pDNA-LPEI的转染之间没有显著性差异(p=0.1019)(图5和图6)。应用Kruskal-Wallis检验确定统计学上无意义。当p<0.05,转染差异被认为是显著的。因此,以1∶1的质量比复合pDNA与LPEI可保护pDNA免于超声处理过程中的剪切。纳米球的扫描电子显微术:
扫描电子显微术(SEM)被用于检测纳米球的形态、大小和形状。由SEM获得的图像显示所有纳米球制剂具有平滑的表面形态(图7至图11)。1%复合pDNA纳米球的直径范围在100至500nm之间(图7至图11)。由于SEM的局限性,具有100nm或100nm以下直径的纳米球难以显示。所有纳米球制剂的形状是球形(图7至图11)。叶轮形成的1%复合纳米球的SEM图像显示了直径范围在100至500nm之间(图10),其与超声波仪形成的1%复合pDNA纳米球相当。相似地,10%复合pDNA纳米球在SEM图像中显示出具有100至500nm之间的直径范围。融合在一起的纳米球也可在SEM图像中见到(图7至图11)。纳米球的激光散射:
动态激光散射被用作定量测量纳米球直径范围的额外方法。纳米球直径的频数被报道为微分分布值。激光散射测量空白纳米球直径范围,在156至562nm之间(图12)。还测量到较大的颗粒,其范围为7至10μm。这些较大的颗粒可能是纳米球的聚集体或真实的微粒体。纳米球中pDNA-LPEI复合物的1%包囊作用似乎对纳米球的直径几乎没有影响。激光散射显示1%复合pDNA纳米球的直径范围在128至716nm之间(图13)。叶轮形成的1%复合pDNA纳米球具有稍微较小和较窄的直径范围,在92至349nm之间(图14)。较小的纳米球群体的范围在24至49nm之间。也从叶轮形成的1%复合pDNA纳米球测量到范围在1000至3000nm之间的微球体(图14)。出乎意料的是,10%复合pDNA纳米球的直径范围在14至594nm之间(图15)。较小的直径测量值可以是pDNA-LPEI复合物。纳米球的降解:
动态激光散射被进一步用于表征纳米球的降解。所述降解被换算为7天后纳米球平均直径的减少。空白纳米球在37℃在PBS中7天后被完全降解(图16),其反映了LTP膜的降解。空白纳米球在3天后几乎失去其直径的75%。3天后,平均纳米球直径变成1.9μm至500nm。7天后,平均直径为2nm(图16)。1%复合pDNA纳米球的降解模式在第0天至第1天具有意想不到的直径增加(图17),这可能是由于纳米球的聚集。而且,1%复合pDNA纳米球的直径在第7天稳定为40nm,其可以是pDNA-LPEI复合物或该复合物的聚集体。图18示出了叶轮形成的1%复合pDNA的类似的降解模式。对于10%复合pDNA纳米球,观察到类似的降解模式(图19)。在第0天至第1天,10%复合pDNA纳米球的平均直径从421nm增加至711nm。然而,在第2天,所述平均直径开始减少到297nm。在第7天,平均直径被测量,仅仅为1nm,并被确定为完全降解。暴露于纳米球之后的细胞生存力:
采用LIVE/DEAD细胞分析,测定暴露于1%pDNA纳米球24小时之后的人皮肤成纤维细胞的生存力。在LIVE/DEAD细胞分析中,代谢活跃的细胞将C-刃天青还原为红色荧光C-试卤灵,而死细胞或垂死的细胞发出绿色荧光,因为它们的质膜受到损害并且能透过核染料SYTOX。在具有与死细胞核相同的滤光器的情况下发出绿色荧光的纳米球通过它们与较大豆形核相对的更小且更圆球形而被区分开。在图20至29中,死细胞被用黄色圈出以提高它们的可见性。细胞生存力是活细胞的百分比,其通过下面的等式计算:细胞生存力=[(红色细胞)/(红色细胞+绿色细胞)]×100
将阳性对照缓冲液、40μLTE缓冲液和160μLdH2O加入到成纤维细胞中24小时之后产生98%±1%的细胞生存力(图20和29)。在荧光图像中,只观察到几个绿色的核,但是可以在多个代谢活跃的细胞中见到红色荧光试卤灵(图20)。向成纤维细胞中加入4μg的pDNA(200μL,20μg/μL)也产生99%±1%的高细胞生存力(图21和29)。阴性对照——暴露于2mMH2O3小时的成纤维细胞——具有0%±0%的生存力(图22和图29)。阴性对照的每一核都发出绿色荧光。暴露于400μg1%复合pDNA纳米球的成纤维细胞具有97%±2%的生存力(图25和图29)。类似的结果见于叶轮形成的1%复合pDNA纳米球和PLGA纳米球中,其分别显示出94%±1%和98%±1%的生存力(图26、27和29)。然而,随着4μg复合到LPEI的pDNA和4μg复合到FuGENE6转染试剂的pDNA的加入,生存力降低,其产生91%±3%和90%±4%的生存力(图23、24和29)。随着100μg10%复合pDNA纳米球的加入,可见到最低的成纤维细胞生存力,其导致86%±2%的生存力(图28和29)。
进行统计学分析以确定在基因载体和对照之间的显著性差异。首先,KruskalWallis非参数方差检验显示,在基因载体的每一组内没有显著性差异,这表示样品为正态分布。因此,在基因载体组间进行了Tukey方差分析,因为每一种具有正态分布样本。平均值的Tukey比较发现,在1、3、7和11天后,1%pDNA纳米球的生存力与TE缓冲液、PLGA纳米球或pDNA的生存力没有显著性差异(p>1.000)。1天后,只发现10%pDNA纳米球的生存力与TE缓冲液相比具有显著性差异(p=0.0003)。3天和7天后,TE缓冲液的生存力分别显著不同于pDNA-FuGENE6(p<0.0001)和10%pDNA纳米球(p=0.0047)和(p=0.0021)。在11天后,TE缓冲液显著不同于空白纳米球(p<0.0001)、pDNA-FuGENE6(p<0.0001)、10%pDNA纳米球(p<0.0001)和pDNA-LPEI(p=0.0006)。pDNA负载进入纳米球:
采用DNA定量分析,确定pDNA进入纳米球中的负载效率。当pDNA与LPEI复合时,观察到荧光减少。因此,应用pDNA-LPEI复合物的滴定,获得发射荧光和浓度的标准曲线。根据标准曲线确定pDNA-LPEI的负载。通过下列等式定义负载效率:负载效率=[(来自纳米球的pDNA的测定量)/(纳米球中pDNA的量)]×100
超声波仪形成的1%和10%pDNA纳米球的负载效率分别为40%±3%和13%±1%(图30)。40%负载效率是指用于制备纳米球的pDNA-LPEI的40%在乳化期间被包囊到纳米球中。叶轮形成的1%pDNA纳米球产生高得多的负载效率,为89%±8%(图30)。
进行统计学分析以确定在负载效率之间的显著性差异。首先,KruskalWallis非参数方差检验表明在纳米球的每一组内没有显著性差异,这表示样品呈正态分布。因此,在纳米球的组间进行Tukey方差分析,因为每一纳米球具有正态分布样本。Tukey检验显示所有纳米球制剂的负载效率彼此具有显著性差异(p<0.0001)。从纳米球释放的pDNA的琼脂糖凝胶电泳:
为了定性表征纳米球的释放,进行琼脂糖凝胶电泳。在凝胶电泳中,pDNA由于电荷梯度而从孔迁移通过凝胶。当pDNA与阳离子聚合物LPEI以1∶1的质量比(7.7N/P比)复合时,其失去其负电荷并且不能迁移通过凝胶。因而,保留在孔中的条带被确定为pDNA-LPEI复合物。空白纳米球的琼脂糖凝胶电泳导致1kbDNA梯以下的低分子量条带(快速迁移粒子)(图31)。这些低分子量条带被确定为纳米球的降解产物或较小的纳米球。
1%复合pDNA纳米球释放的凝胶电泳维持进行7天的持续时间(图32)。凝胶中从高到低的分子量条纹被确定为由超声处理剪切的pDNA。剪切的pDNA从0.5小时释放至第2天(图32D至J)。在0.5小时之后,大多数剪切的pDNA被释放。非复合的超螺旋二聚体pDNA和松弛型pDNA二聚体可在0.5小时至第2天的释放中观察到(图32D至J)。从0.5小时至第7天,pDNA-LPEI复合物被释放(图32D至O)。pDNA-LPEI的最大释放出现在0.5小时至第1天(图32D至I)。pDNA-LPEI条带在第2天至第7天仍然可见,但是UV荧光逐渐随着每一个时间点的过去变得越来越微弱(图32J至O)。降解产物或小的纳米球可在0.5小时至第7天的释放中观察到,在0.5小时后强度最大(图32D至O)。
来自10%复合pDNA纳米球的释放的电泳凝胶与1%复合pDNA纳米球的释放的电泳凝胶类似,但是具有较大的pDNA和pDNA-LPEI强度(图33)。同样,10%负载的纳米球显示出在7天的期间内的释放。亮的pDNA-LPEI条带从0.5小时到第4天在孔中观察到(图33D到K),而稍微较弱的条带在第6天和第7天观察到(图33L至M)。剪切的pDNA、松弛型二聚体和超螺旋二聚体也在0.5小时至第7天释放(图33D至K)。然而,在10%复合pDNA纳米球释放中比在1%负载的纳米球中观察到更低的降解产物(或小纳米球)强度。
叶轮形成的1%复合pDNA纳米球产生与超声波仪形成的纳米球类似的释放。然而,叶轮纳米球在0.5和1.5小时后表现出pDNA-LPEI、剪切的pDNA、松弛型和超螺旋二聚体pDNA以及降解产物的最大释放(图34D至E)。在3小时至7天之间见到较弱的pDNA-LPEI条带(图34F至O)。
来自1%非复合pDNA纳米球的pDNA释放仅在释放的前2天在琼脂糖凝胶电泳分析中可见,如图35所示。在第1和第2天释放的pDNA(图35C至D)显然在纳米球配制过程中受到超声处理剪切。然而,在第2天释放时由LPEI或PEG-g-CHN进行的pDNA浓缩(图35D)以仍在孔中的亮条带表示。这种浓缩可以通过纳米球降解时吸收(leeching)LPEI和PEG-g-CHN来解释。然后,pDNA能够与这些聚合物的任一种形成聚合物。这种琼脂糖凝胶释放研究进一步表明在通过超声处理进行乳化而将pDNA包囊到纳米球中之前复合pDNA的重要性。基于转染的纳米球释放模式:
使用得自释放样品的转染百分数来量化各种纳米球制剂的释放模式。然而,从1%pDNA纳米球释放样品中得到的转染不足。只从1%pDNA纳米球的第2天释放样品中获得转染(图36和37)。转染不能从任何其它释放时间点获得。从叶轮形成的1%pDNA纳米球和10%pDNA纳米球获得释放模式(图36和37)。来自10%pDNA纳米球和叶轮形成的1%纳米球的模式显示出最初的快速释放,然后在7天后稳定。纳米球的细胞摄取:
用暴露于FITC负载的纳米球的人皮肤成纤维细胞的共聚焦显微术来证实纳米球的细胞摄取。首先,采用具有3通道荧光的荧光显微镜(Axiovert200,CarlZeiss)进行初步研究。成纤维细胞核用Hoechst核染色进行染色并发出蓝色荧光。细胞骨架用罗丹明鬼笔环肽进行染色并发出红色荧光。这些细胞染色可以在对照成纤维细胞(图39)和暴露于100μgFITC纳米球的成纤维细胞58(图38)中观察到。FITC标记的纳米球发出绿色荧光(图38)。然而,这些荧光图像只是表明纳米球摄取,原因在于它们的二维数。
因此,对暴露于100μgFITC负载的纳米球的成纤维细胞应用共聚焦显微术,获得摄取的三维分析。共聚焦显微术产生0.5μm的成纤维细胞样品切片。这些切片显示了在成纤维细胞骨架内的各种深度的纳米球(图40)。切片深度被报告在图40中的每一图像的的左上角。纳米球出现的位置被以黄色圈出(图40)。在1um的深度,细胞骨架是可见的,但是看见很少的纳米球。然而,在2和3μm的深度,许多纳米球出现(图40)。这些纳米球之后在3.5和4.0μm的深度消失。细胞骨架内纳米球的出现和消失证实了它们被摄取到成纤维细胞中。纳米球的转染效率:
纳米球的可控持续转染通过暴露于400μg1%复合pDNA纳米球的人皮肤成纤维细胞的X-Gal染色来显示。X-Gal染色被用于确定用表达lacZ的pDNA转染的细胞百分数。lacZ基因的产物——β-半乳糖苷酶,催化X-gal的水解在细胞内产生蓝色。转染百分数被用于确定纳米球的转染效率。转染百分数通过下列方程式计算:转染百分数=[(蓝色细胞)/(总细胞)]×100
在3天、5天、7天、9天和11之后,暴露于4μgpDNA(200μL,20μg/ml)的成纤维细胞显示出没有转染,其与单独的缓冲液相当(图41)。将成纤维细胞暴露于4μg以1∶1的质量比与LPEI复合的pDNA,3天后获得25%±5%的高转染百分数(图41)。然而,转染百分数在5天、7天、9天和11天后分别开始减少至5%±1%、2%±1%、2%±1%和2%±1%(图41至47)。也观察到与FuGENE6复合的pDNA的转染百分数逐渐减少。使用FuGENE6的最大转染效率发生在第3天,为15%±2%的转染百分数。类似于LPEI,转染效率在第5天、7天、9天和11天减少到5%±2%、2%±1%、3%±1%、3%±1%(图41至45、48和49)。
不同于与LPEI和FuGENE6复合的pDNA,纳米球显示了可控并持续的转染(图41至45)。使用1%复合pDNA纳米球的每日转染模式显示最初的延迟到第5天止,峰值在7天后达到,并且持续到第11天(图46至49)。1%复合pDNA纳米球在第3天、5天、7天、9天和11天的转染效率为1%±1%、4%±1%、10%±1%、8%±1%和6%±1%(图41至49)。应用叶轮形成的1%复合pDNA纳米球的探索性研究发现了与超声波仪形成的1%复合pDNA纳米球相似的转染结果。使用叶轮形成的纳米球,转染模式被延迟至第7天。然而,叶轮形成的纳米球的转染比超声波仪形成的纳米球的转染更低。叶轮形成的1%复合pDNA纳米球在第3天、5天、7天、9天和11天分别达到0%、0%、3%、3%和2%的转染效率。使用10%复合pDNA纳米球的额外的探索性转染研究不能获得任何转染。使用10%复合pDNA纳米球,没有成纤维细胞被转染。
为了建立在基因载体的转染效率之间的显著性差异,进行统计学分析。首先,KruskalWallis非参数方差检验表明在载体的每一组内没有显著差异,这说明该载体样品是正态分布的。然后,在基因载体的组间进行Tukey方差分析,因为每一组具有正态分布样本。在第3天,发现与pDNA-LPEI和pDNA-FuGENE6的转染百分数相比,1%pDNA纳米球的转染百分数具有显著差异(p<0.0001)。在第5天,没有发现1%pDNA纳米球的转染百分数与pDNA-LPEI的转染百分数(p=0.9989)或pDNA-FuGENE6(p=0.9996)的转染百分数相比具有显著差异。然而,在第7天,显著差异存在于1%pDNA纳米球与pDNA-LPEI(p=0.0146)和pDNA-FuGENE6(p=0.0121)之间。此外,没有观察到在第7天、第9天或第11天纳米球转染之间具有显著差异(分别为p=0.9949、p=0.8292、p>1.00)。没有发现在第5天、第9天和第11天1%pDNA纳米球和pDNA-LPEI之间在转染百分数上具有显著差异(p=0.9989、p=0.1769和p=0.2863)以及在第5天、第9天和第11天1%pDNA纳米球和pDNA-FuGENE6之间在转染百分数上具有显著差异(p=0.9996、p=0.3176、p=0.7329)。超声处理的pDNA-LPEI复合物的凝胶电泳:
凝胶电泳显示,将pDNA与聚合物如LPEI复合可防止pDNA在纳米球产生的超声处理步骤过程中大规模降解。通过LPEI复合pDNA,产生浓缩和结构上比单独的pDNA更稳定的包装。这种更小并且更坚固的包装能够经受存在于超声处理产生的乳液中的大量能量和力。单独超声处理pDNA可降解pDNA并使其对于转染失活。pDNA-聚合物复合物的转染效率和细胞生存力:
pDNA和LPEI复合物在转染细胞同时保持可接受的细胞生存力方面是最有效的pDNA-聚合物复合物。LPEI具有比FuGENE6、BPEI和PEG-g-CHN更好的转染效率,这被认为是由于其逃避内体的能力。此外,LPEI显示出比FuGENE6和BPEI更高的细胞生存力。pDNA与LPEI的最佳质量比是1比1,其对应于7.7N/P。与其它的质量比相比,pDNA和LPEI的1∶1质量比产生具有最高转染效率的中性电荷的复合物,这是完全中性电荷的结果。进一步的研究必须探究pDNA-LPEI复合物的结构和大小,从而更好地理解其转染机制。纳米球合成:
应用超声处理和叶轮方法产生水和油乳液,可以从L-酪氨酸聚磷酸酯、PEG-g-CHN和pDNA-LPEI合成纳米球。这些纳米球制剂第一次尝试获得pDNA的可控并持续的细胞内输送,用于基因治疗。超声处理和叶轮方法对于产生pDNA负载的纳米球都是有效的。表征pDNA-LPEI负载的纳米球的大小、形状、形态、降解和细胞毒性: 纳米球的SEM:
纳米球的形状、表面形态和大小在生物相容性和被内化的能力中发挥了主要作用。球形和平滑颗粒证明有利于在循环和生物系统中的运送。同时,当通过微循环时,不规则和粗糙的颗粒造成问题。已经显示,纤维性颗粒应激细胞并且引起免疫反应。以前的研究显示,颗粒的细胞内化是大小依赖性的。真核细胞能够内化直径在50nm至1μm范围内的纳米颗粒。因此,纳米球必须以小于1μm的直径产生,用于基因的细胞内输送。扫描电子显微术(SEM)显示,我们的1%pDNA纳米球是球形的、平滑的并且直径范围在200至700nm之间(图7和图8)。理想地,这些1%pDNA纳米球可以被人细胞内化并且应该有利于通过循环。SEM也表明,当与空白纳米相比时,将pDNA-LPEI复合物包囊进纳米球不改变形状、表面形态和大小(图9)。叶轮形成的纳米球的SEM图像也显示了球形、平滑的表面形态和200至700nm之间的直径范围。与超声处理方法相比,叶轮方法能够产生较小的纳米球。10%pDNA纳米球比1%pDNA纳米球显得稍微不太圆和平滑,其可归因于pDNA-LPEI复合物聚集。纳米球的激光散射:
来自动态激光散射的结果再次证实了用SEM发现到的纳米球直径范围。激光散射显示,所有的纳米球制剂具有接近正态分布的直径。叶轮形成的纳米球的直径分布比超声波仪形成的纳米球的直径更小并且更狭窄(100nm至500nm),其可归因于叶轮乳液中产生的较大能量。而且,叶轮形成的纳米球以水包油包水乳液产生,其可以具有白超声处理乳液更大的乳液稳定性。因此,所有的pDNA纳米球制剂在大小上有利于细胞内化。
应用激光散射,也可以观察到纳米球聚集。纳米球聚集显示为具有1至10μm直径的颗粒(图12至14)。聚集可归因于在纳米球洗涤步骤过程中表面活性剂被洗掉。SEM图像也显示纳米球的聚集,其确认了一些纳米球确实在重悬之后聚集。此外,10%pDNA负载纳米球的激光散射示出了直径在14至42nm之间的纳米颗粒群(图15)。这些较小的纳米颗粒被假定为pDNA-LPEI复合物,其由于它们的高浓度而没有被包囊。pDNA和LPEI的复合物在1∶1的质量比(N/P=7.7)时通常具有50nm的大小。超声处理可以使复合物更小或将它们分开。纳米球的降解:
基于平均直径随时间改变的纳米球降解,显示所有pDNA纳米球制剂在7天后被完全降解。这种降解模式与在PBS中温育的LTP膜的7天降解相当,其是可预期的,原因在于纳米球是大约90%的LTP。所有纳米球制剂在3天后降解大约75%(图16至19),其也与在PBS中温育的LTP膜相当。LTP经历水解降解,这是为什么PBS在本研究中被用作溶剂的原因。纳米球的降解结果是纳米球将如何在体内降解的良好指示剂,因为PBS模拟了体内的生理盐浓度。然而,进一步的研究需要着重于纳米球在蛋白质存在下的降解。未来的研究必须测量纳米球在血清或细胞培养基中的降解。尽管如此,血清在与激光散射一起使用可能引起问题,原因在于血清蛋白在激光散射中可见。
关于超声波仪形成的pDNA纳米球的平均直径从第0天至第1天的增加可以通过增加的聚集来解释(图16至19)。当纳米球开始降解时,许多表面活性剂被除去,其允许聚集更容易地发生。而且,pDNA-LPEI复合物可以被包囊或接近超声波仪形成的纳米球的表面。在降解1天后,更多的pDNA-LPEI复合物将被暴露。纳米球表面上pDNA-LPEI复合物的存在由于pDNA和LPEI之间的电荷相互作用也增加了聚集。这种直径增加在叶轮形成的pDNA纳米球和空白纳米球中没有见到(图17和图18)。聚集的这种缺乏支持了这样的理论,纳米球表面上的pDNA-LPEI复合物引起聚集。空白纳米球不含pDNA-LPEI复合物并且叶轮形成的pDNA纳米球由于水包油包水乳液而具有更好的包囊作用。水包油包水乳液应该将pDNA-LPEI复合物包囊进纳米球内更深。暴露于纳米球后的细胞生存力:
LIVE/DEAD细胞分析表明1%pDNA纳米球具有与缓冲液、单独的pDNA和PLGA纳米球相当的生存力。其它的基因载体如LPEI和FuGENE6在与人皮肤成纤维细胞温育1天和11天之间显示了增加的毒性。1%pDNA纳米球通过包囊有毒的LPEI和以可控并持续的速率释放它而避免了这些毒性作用。纳米球防止了LPEI的强毒性作用,以前的研究显示其在高浓度对细胞有毒性。高的细胞生存力也部分由于用于制备纳米球的无毒聚合物。LTP是生物相容性聚合物,其由氨基酸L-酪氨酸和磷酸基团——两种都是在体内天然发现的——合成。LTP的水解降解产生L-酪氨酸和磷酸盐,两者都无毒。也已经显示PEG和壳聚糖是无毒的。1%pDNA纳米球以其有效浓度在体外与成纤维细胞一起使用是安全的,因为它们具有与缓冲液、pDNA和PLGA纳米球相当的生存力。
LIVE/DEAD细胞分析也证明纳米球的降解。纳米球发出绿色荧光这一事实提供了观察纳米球在全部11天中降解时荧光减少的机会(图25至29)。而且,当使用LIVE/DEAD细胞分析时,pDNA-LPEI和pDNAFuGENE6复合物也发出绿色荧光。将来量化这些复合物的研究可以使用这种分析的变化而进行。这种数据能够证明是有价值的,因为在低浓度下量化pDNA-LPEI复合物是不可能的。量化并表征负载并从纳米球释放pDNA-LPEI: 纳米球中的pDNA-LPEI的负载:
PicoGreen分析显示,负载效率在各种pDNA纳米球制剂中不同。10%pDNA纳米球具有最低的负载效率,为13%,其可以归因于pDNA-LPEI浓度超过了纳米球最大负载。微粒和纳米颗粒具有最大的负载,其不能随额外的负载材料而增加。在纳米球收集和洗涤步骤中,过量未包囊的pDNA-LPEI被洗掉。1%pDNA纳米球具有次高的负载效率,为40%。需要进一步的研究以确定1%的pDNA-LPEI浓度是否是用于在这种纳米球制剂中负载的最佳浓度。用于纳米球制剂的超声处理方法依赖于内部水相中的亲水性pDNA-LPEI的随机包囊,原因在于热力学有利性。然而,当亲水性pDNA-LPEI陷进外部水相中时,低的包囊可能发生,这也是热力学上有利的。叶轮形成的1%纳米球具有最高的负载,为89%。叶轮方法由于其形成的特性而获得较高的负载效率,其包括最初的油包水乳液。不同于超声处理方法——其中pDNA-LPEI能够在外部和内部水相中随机聚集,最初的油包水乳液对内部水相内的几乎所有pDNA-LPEI施压。热力学促进pDNA-LPEI只存在于水相中。在超声处理和叶轮系统中导致负载降低的的共同因素是乳化过程中pDNA-LPEI的破坏。乳液产生大量的能量,其可剪切并破坏pDNA,这在未复合pDNA纳米球的释放中得到证实(图35)。从纳米球释放的pDNA的琼脂糖凝胶电泳:
凝胶电泳示出了在整个7天从纳米球持续释放PDNA-LPEI复合物。1%pDNA纳米球的电泳凝胶显示在前2天中发现最大释放,其对应于图17中观察到的纳米球降解。凝胶电泳也显示纳米球正在释放未复合和降解的pDNA。未复合pDNA的量显得少于pDNA-LPEI的复合条带,这意味着pDNA-LPEI复合物的大多数保持完整。然而,超声处理过程使一些pDNA-LPEI解复合。如用于纳米球、以相同的1∶1质量比的pDNA-LPEI复合物的贮存液显示出在凝胶中没有解复合的pDNA。然后,一些解复合的pDNA由于超声处理而降解并且在凝胶中以微弱的踪迹出现。该微弱的踪迹由不同长度的各种pDNA组成。pDNA和LPEI的解复合和降解可由超声处理过程中产生的大量能量造成。以前的研究显示,超声处理能够降解pDNA。来自未复合pDNA纳米球的释放显示,pDNA在纳米球形成期间被完全降解。从10%pDNA纳米球的释放比从1%pDNA纳米球的释放更多并更易于显示,原因在于存在的pDNA和pDNA-LPEI增加。叶轮形成的1%pDNA纳米球显示较少的解复合pDNA,其可能意味着被施加到乳液中的能量较少。
在非复合pDNA纳米球释放中发现的完全剪切的pDNA进一步表明在包囊到纳米球中之前复合pDNA的重要性。通过超声处理方法单独将pDNA包囊进纳米球导致产生无效的基因载体,因为pDNA不再具有生物活性。基于转染的纳米球释放模式:
使用纳米球释放的转染效率以便生成释放模式是不成功的,原因在于不能从1%pDNA纳米球的释放来转染细胞。只有1%pDNA纳米球的第2天的释放获得转染。转染的这种缺失可以归因于在释放的实验步骤期间pDNA生物活性的丧失。释放物的冻干和重悬可能破坏pDNA的生物活性。此外,低转染可能是对于1%pDNA纳米球发现的低负载效率的结果。只有40%的预期pDNA-LPEI被包囊在纳米球中,其能导致低转染。这种假设被由来自10%pDNA纳米球和叶轮形成的1%纳米球——其比1%pDNA纳米球具有更高的负载——的释放而获得的较高转染所支持。在这些纳米球中存在更多的pDNA-LPEI,其导致更大的释放。为了通过所述释放获得转染,将来的释放研究必须用较大量的1%pDNA纳米球进行。其它将来的研究可以量化放射性标记的pDNA-LPEI的释放,因为规章制度和成本阻止了当前研究中的这些研究。验证:纳米球由细胞摄取并且相比于单独的pDNA获得更高的转染效率: 纳米球的细胞摄取:
共聚焦荧光显微术已经证实了在24小时之后纳米球由原代人皮肤成纤维细胞摄取。可以见到单独的纳米球出现和消失在成纤维细胞的细胞骨架内,这证明它们在细胞的内部。此外,纳米球仅仅需要24小时来被成纤维细胞摄取,这确保了纳米球在它们被内化之前不完全降解。这些纳米球的快速摄取对于确保pDNA-LPEI的内部释放是重要的,其应该提高了转染效率。具有纳米球的成纤维细胞的单独荧光图像仅仅示出了纳米球的摄取。尽管如此,共聚焦图像示出了对于成纤维细胞见到的许多纳米球可能位于细胞的内部。一些纳米球也可以还粘附到细胞膜上。纳米球在细胞内的具体位置目前是未知的。然而,纳米球被假定为存在于内体中,在其中它们被降解。Leong的研究显示,内化的纳米球通常在内体中被发现。需要未来的研究来证明纳米球在内体中的位置。用于内体染色的分析可以证明纳米球被包含在内体中。而且,未来的研究也可以证实纳米球如何摄取纳米球。必须进行确定受体介导内吞作用的酶促方法以证明内吞作用实际上是纳米球内化的方法。纳米球的转染效率:
暴露于1%pDNA纳米球的人皮肤成纤维细胞的X-Gal染色显示了可控且持续的转染。该转染被认为是可控的,因为直到它们暴露于细胞之后5天才观察到转染。不同于以前建立的基因载体如LPEI和FuGENE6,当使用1%pDNA纳米球时,转染延迟到第5天。这种延迟是纳米球花时间到达细胞、被内化以及在细胞内降解的结果。来自1%pDNA纳米球的最大转染在第7天达到并且持续到第11天。在第7天至11天在纳米球诱导的转染之间没有发现显著差异这一事实表明转染是持续的。该持续转染得以实现,原因在于纳米球降解的时间框为7天(图17)。相应于凝胶电泳中示出的pDNA-LPEI的7天释放,pDNA-LPEI在细胞中内部释放以达到可达至少11天的持续转染。11天之后终止转染研究,因为培养的成纤维细胞达到了环境的极限。
1%pDNA纳米球的可控且持续转染与LPEI和FuGENE6的初始爆发和衰减的转染形成了鲜明对比。所建立的基因载体LPEI和FuGENE6最初达到了非常高的转染。然而,LPEI和FuGENE的转染在3至11天降低,原因在于它们不能控制或维持它们的转染。阳离子聚合物和脂质核酸复合物(lipoplexes)可容易地被细胞和生物系统清除。基因载体如LPEI必须被掺入到可降解的系统中以获得可控或持续的转染。可降解的纳米球提供了控制并维持利用LPEI的转染的手段。
尽管1%pDNA纳米球的成功转染,但对于10%pDNA纳米球和叶轮形成的纳米球发现不良结果。使用10%pDNA纳米球不能完成转染。同时,叶轮形成的1%pDNA纳米球显示了非常低的转染,但是仍然展示出可控且持续的转染。然而,在第5至11天,通过叶轮纳米球获得的持续转染与LPEI和FuGENE6不具有显著差异。低转染或转染缺乏可能是10%pDNA纳米球中pDNALPEI复合物的大小的结果。研究表明,pDNA-LPEI复合物的大小越小,转染越多。而且,研究表明,溶液中pDNA和LPEI的浓度越高,形成的复合物越大。当低于1%pDNA纳米球、10%pDNA纳米球以及叶轮形成的1%pDNA纳米球分别形成复合物时,pDNA和LPEI的浓度都是0.3mg/ml、1mg/ml和3mg/ml。浓度的这种增加可能增加pDNA-LPEI复合物的大小,其减少了转染。此外,细胞生存力研究表明,10%pDNA纳米球比1%pDNA纳米球对细胞更有毒性。细胞毒性的增加导致差的细胞功能和较低的基因表达。
从LTP和PEG-g-CHN的掺合物配制的、包囊pDNA-LPEI的纳米球可以用作可控且可持续的非病毒基因载体。由超声处理和溶剂蒸发产生的水和油乳液产生纳米球并且导致pDNA-LPEI的包囊化。这种制造方法产生球形、平滑并且直径为大约100至700nm的纳米球。这些纳米球在37℃在PBS中在7天内降解。这种降解模式导致pDNA-LPEI在7天内释放,其中大多数释放发生在前2天内。1%pDNA纳米球制剂显示了高于其它建立的基因载体如LPEI和FuGENE6的细胞生存力。这些纳米球的细胞生存力与TE缓冲液、pDNA和PLGA纳米球的细胞生存力相当。这些纳米球的高细胞生存力部分是由于所使用的聚合物的生物相容性和纳米球的大小。纳米球大小也提供适合于细胞内化的范围。由成纤维细胞进行的纳米球摄取在24小时内完成,这允许有时间用于pDNA-LPEI的细胞内输送。这种细胞内输送导致人皮肤成纤维细胞的可控且持续的转染。这些纳米球通过将主要基因表达延迟至施用后5天来实现可控的转染。最大转染在第7天达到并且持续进行至第11天,其与基因载体如LPEI和FuGENE6的开始爆发转染并然后衰退不同。因此,从LTP、PEG-g-CHN和pDNA-LPEI配制的纳米球可能是有价值的载体,所述载体用于细胞内输送针对需要几个星期治疗的疾病的治疗基因。聚氨酯实施方式:
在另一实施方式中,本发明涉及在其主链中包含至少一个氨基酸的聚合物。而在另一实施方式中,本发明涉及聚合物,所述聚合物在其主链中包含至少一个氨基酸,从而产生生物降解性,并且在一些实施方式中,产生可控的生物降解性。仍在另一实施方式中,本发明涉及基于磷酸酯和/或氨基甲酸乙酯的聚合物,所述聚合物在其主链中具有至少一个氨基酸,从而产生生物降解性。在仍另一实施方式中,本发明涉及用于生物材料应用的L-酪氨酸基磷酸酯聚合物和/或L-酪氨酸基氨基甲酸乙酯聚合物。
氨基酸在用于不同生物材料应用的聚合物合成中的用途是已知的(见例如美国专利第6,221,997号,其公开了含侧链氨基酸的聚氨酯)。L-酪氨酸已经被大量用于生物相容和/或生物可降解的聚合物的合成,所述聚合物用于不同的生物材料应用,特别是着重于组织工程。具体而言,已经研究了L-酪氨酸基假多聚(氨基酸)用于生物材料应用,其中脱氨基酪氨酰己基酯(DTH)作为聚合物的结构单元。研究了DTH基聚碳酸酯、polyirnminocarbonate、聚磷酸酯和几种其它聚合物用于生物材料应用。然而,由于关于降解性、物理化学特性以及可加工性的几个限制,这些聚合物的应用受到限制。
而且,在调节聚合物结构和材料的相关特性中的困难已经限制了使用这些材料用于广泛应用的机会。
生物相容性聚氨酯目前被作为用于制造组织工程支架的可选方案加以研究。几个研究显示,容易地进行合成和调节结构导致与生物材料应用有关的宽范围特性。聚氨酯通常从三种成分——大二醇(macrodiol)(即多羟基化合物)、二异氰酸酯和二醇或二胺基增链剂——合成并且具有如下所示的一般结构。这能够组成聚合物的软链段和硬链段,其最终能够被开发出各种性能。-M-(D(CD)n-M)m-上式是L-酪氨酸基聚氨酯聚合物的一般示意性式,其中M=大二醇,D=二异氰酸酯,而C=增链剂。
研究了氨基酸基增链剂在非常有限的情况下用于聚氨酯。苯丙氨酸基增链剂和赖氨酸基异氰酸酯被用于聚氨酯的合成。
在本发明的一个实施方式中,本发明涉及基于DTH作为增链剂(见下面的结构)合成和表征聚氨酯:
两个羟基基团的存在使得DTH能够在聚氨酯的合成中用作增链剂。DTH是从L-酪氨酸和其脱氨基代谢物脱氨基酪氨酸合成的二肽部分,能够有效地用于由传统的大二醇和二异氰酸酯制成的预聚物的链延长。苯丙氨酸基增链剂是由羧酸(氨基酸)和低分子量二醇(如乙二醇)的羟基连接形成的二酯。然而,DTH基增链剂是酰胺产物,其使在酶促条件下潜在可降解。
本发明使用传统的两步聚氨酯合成法来合成L-酪氨酸基聚氨酯,在第一步中,在催化剂的存在下,DMF(二甲基甲酰胺)作为溶剂的情况下,大二醇与二异氰酸酯在100℃至120℃反应3至4小时。在第二步中,将反应混合物冷却至室温并且加入DTH增链剂。进一步使反应在70℃至80℃继续进行10至12小时。最后,通过将反应混合物倒入冷的氯化钠浓缩液中来淬灭反应。根据聚合物的状况,产物被过滤或离心。
在一种实施方式中,用于合成聚氨酯的大二醇(多羟基化合物)是基于聚乙二醇(PEG)和聚己酸内酯(PCL)的二醇。潜在无毒的脂肪族二异氰酸酯——1,6-己二异氰酸酯(hexamethylenediisocyanate,HDI)被用作二异氰酸酯,而DTH是增链剂。使用如下表3中所述的这种组合合成两种聚氨酯,如下面详细说明的。表3
聚氨酯 | 大二醇 | 二异氰酸酯 | 增链剂 |
聚合物A | PEG | HDI | DTH |
聚合物B | PCL | HDI | DTH |
在一种实施方式中,按照本发明的方法形成的聚氨酯用于各种生物医学应用,包括但不限于生物支架应用。已经研究了用于生物材料应用的聚氨酯的各种应用。这种聚氨酯的一个标准取决于用于形成聚氨酯的成分的生物相容性。
在一种实施方式中,使用生物相容性多羟基化合物——包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丁二醇(PTMG)、聚己内酯二醇(PCL)或其两种或两种以上的合适组合,本发明的聚氨酯如上所提及被形成并且在下面进一步详细讨论。几种芳香族和脂肪族二异氰酸酯可以与本发明联合使用。这样的芳香族和脂肪族二异氰酸酯包括但不限于,4,4’-二苯甲烷二异氰酸酯(MDI)、甲苯二异氰酸酯(TDI)、1,6-己二异氰酸酯(HDI)、和其两种或两种以上的合适组合。合适的增链剂是1,4-丁二醇(BD)、1,2-乙二胺(EA)、脱氨基酪氨酰己基酯(DTH)或它们的组合。
在一种实施方式中,如上所提及的,使用脱氨基酪氨酰己基酯(DTH)作为增链剂,形成本发明的聚氨酯。这允许氨基酸或氨基酸官能团掺入到本发明的聚氨酯中。在另一实施方式中,氨基酸部分可以作为二异氰酸酯或增链剂掺入到聚氨酯结构中。
链段聚氨酯的合成包括两个步骤:(i)首先,聚二醇与二异氰酸酯以异氰酸酯封端的预聚物得以形成的化学计量比反应;和(ii)使异氰酸酯封端的预聚物与低分子量二醇或二胺化合物反应以延伸链。
由于从其形成的链段的生物相容特性,两种不同的多羟基化合物被用于本发明:聚乙二醇(Mw1000)(PEG)和聚己内酯二醇(Mw1250)(PCL)。应该注意到,本发明不仅仅限于上面给出的化合物或分子量。相反,各种PEG和PCL分子量可以与本发明联合应用,以形成期望的聚氨酯。
在一种实施方式中,由于其潜在的生物相容性,所使用的二异氰酸酯是脂肪族1,6-己二异氰酸酯(HDI)。增链剂是脱氨基酪氨酰己基酯,其是基于L-酪氨酸和其代谢物脱氨基酪氨酸(DAT)的双酚二肽分子。 聚合物的合成:聚合物的合成包括两个步骤:(i)增链剂DTH的合成和(ii)聚氨酯的合成。除非另外说明,所有的化学制品和溶剂都以收到时的状态使用,并且购自SigmaAldrich。蒸馏水被用于所有目的。DTH合成:DTH的合成对于本领域普通技术人员是已知的并且被描述在各种文献来源中。简而言之,通过碳二亚胺连接反应,从L-酪氨酸的己酯(TH)和脱氨基酪氨酸合成DTH。所述反应步骤在下文中概述,而反应方案被示于下面。
步骤(i)最初在0℃,在亚硫酰氯(0.05摩尔)的存在下,通过1-己醇(50mL)酯化L-酪氨酸的羧酸基团(0.05摩尔),接着在80℃反应12小时。将反应冷却至室温后获得的反应产物在冷乙醚中完全沉淀。然后,过滤产物并且用冷的醚洗涤以获得白色固体,其是L-酪氨酸己酯的氯化物盐。
步骤(ii):将白色固体重新溶解在蒸馏水中并且随后通过0.5M碳酸氢钠溶液中和直到所述溶液的pH稍微呈碱性(pH-7.5)。在该点,由于酪氨酸己酯(TH)的形成,溶液变混浊。在醚中萃取酪氨酸己酯(TH),并且所述醚被蒸发至完全干燥以获得酪氨酸己酯(TH),为灰白色固体。
步骤(iii):TH和DAT的连接通过N-乙基-N′-二甲基氨丙基碳二亚胺的盐酸盐(EDC.HCl)介导。典型地,在0℃,TH、DAT和EDC.HCl以等摩尔比被加入到作为溶剂的99%纯的四氢呋喃(THF)中。在那之后,反应被允许在室温下继续进行12小时。在12小时结束时,反应混合物被倒入到其4倍体积的蒸馏水中并且在有机相中通过二氯甲烷(DCM)萃取。
步骤(iv):用0.1NHCl溶液、0.1N碳酸钠溶液和浓缩的氯化钠溶液洗涤有机DCM相,以除去副产物。干燥有机DCM相,并且在真空下蒸发溶剂以获得脱氨基酪氨酰己基酯(DTH),为黄色粘性油。聚氨酯的合成:
聚氨酯的合成是缩合型聚合,典型地包括异氰酸酯(-NCO)与羟基(-OH)反应形成氨基甲酸酯(-NHCO)键。该聚合通常是两步的过程,其导致链段聚氨酯的形成:(i)多羟基化合物与二异氰酸酯反应形成异氰酸酯封端的预聚物和(ii)通过预聚物与增链剂反应进行链延伸。使用PEG和PCL作为多羟基化合物,用HDI(二异氰酸酯)和DTH(增链剂)合成两种不同的聚氨酯。反应在惰性(完全干燥的氮,N2)气氛下,在完全干燥并且脱湿环境中进行。PEG和PCL在40℃在真空下干燥48小时以除去夹带水。用作溶剂的N,N′-二甲基甲酰胺(DMF)经氢化钙(CaH2)、随后经分子筛进行干燥。
使用高纯度(>99%)级的二异氰酸酯。聚氨酯合成的详细方案被总结在下面:
步骤(i):使多羟基化合物(PEG或PCL)与HDI以12的摩尔比在作为溶剂的DMF和0.1%辛酸亚锡催化剂中反应形成预聚物。典型地,在干燥的惰性气氛,并且伴随着持续搅拌的情况下,5mmol的多羟基化合物被加入到40mlDMF中,而10mmol的HDI和2至3滴辛酸亚锡被加入到反应混合物中。
步骤(ii):温度升高至110℃并且使反应在此温度保持3小时。3小时之后,所述反应冷却至室温(-25℃)同时持续搅拌。反应的温度被小心地维持在±3℃的范围内。
步骤(iii):在第二步,将DTH以与预聚物的摩尔比1∶1加入。典型地,10mLDMF中的5mmol的DTH被加入。
步骤(iv):然后反应温度逐步升高至80℃并且该反应被允许继续进行12小时。反应温度被控制在±3℃的范围内。12小时之后,通过将反应倒入冷的浓缩氯化钠水溶液中猝灭反应。此时,固体聚氨酯聚合物从反应混合物中沉淀出。
步骤(v):对于PEG基聚氨酯,将聚合物以凝胶的形式悬浮在水中。最终聚合物被离心出并且重悬在水中,然后离心。该过程重复进行至少三次以除去杂质和未反应的物质。然后,最终聚合物在40℃在真空中干燥48小时。所述聚合物是微黄白色粘性固体。用于PEG基聚氨酯的术语是PCL-HDI-DTH。
步骤(iv):对于PCL基聚氨酯,聚合物作为固体聚合物被悬浮。最终聚合物被过滤出并且用水洗涤。这种洗涤被重复至少3次以除去杂质和未反应物质。然后,该最终聚合物在40℃在真空中干燥48小时。所述聚合物是浅黄白色固体。用于PEG基聚氨酯的术语是PCL-HDI-DTH。
合成的聚氨酯被储存在干燥器中,用于表征和将来实验的目的。两种聚氨酯的结构在下面示出。其中,n是大约5至大约25的范围内的整数,m是1至大约4的范围内的整数,而p是大约20至大约200的范围内的整数。在另一实施方式中,m等于1。在仍另一实施方式中,n是大约7至少大约22范围内的整数,或大约10至大约20范围内的整数,或甚至大约12至大约17范围内的整数。在仍另一实施方式中,p是大约30至大约180范围内的整数,或大约50至大约175范围内的整数,或大约75至150的整数,或甚至大约100至大约125的整数。在这里以及在说明书和权利要求中的其它地方,各个范围界限可以被组合以形成另外的未公开的范围。
而在仍另一实施方式中,m、n和p被选择以使上述聚氨酯化合物的分子量在大约4,000Da至大约1,000,000Da,或大约5,000Da至大约900,000Da,或大约10,000Da至大约800,000Da,或大约30,000Da至大约750,000Da,或大约50,000Da至大约600,000Da,或大约75,000Da至大约500,000Da,或大约100,000Da至大约400,000Da,或大约150,000Da至大约350,000Da,或大约200,000Da至大约300,000,或甚至大约225,000Da至大约250,000Da的范围内。在这里以及在说明书和权利要求中的其它地方,各个范围界限可以被组合以形成另外的未公开范围。在另一实施方式中,m、n和p被选择以使PEG-HDI-DTH的分子量为大约98,000Da。在另一实施方式中,m、n和p被选择以使PCL-HDI-DTH的分子量为大约246,000Da。聚合物表征:
通过各种技术来表征聚合反应和聚氨酯,以确定结构并理解所述聚合物的基本性质。初步表征研究包括结构、热和机械表征。结构表征:
通过1H-NMR、13C-NMR和FT-IR研究进行结构表征。在300MHzVarianGemini仪器中进行NMR,其中对于PEG-HDI-DTH,使用d-二甲基亚砜溶剂(作为内标,对于1HNMR为δ=2.50ppm,而对于13CNMR为39.7ppm),而对于PCL-HDI-DTH,使用氯仿(作为内标,对于1HNMR为δ=7.27ppm,而对于13CNMR为77.0ppm)。对于纯样品,采用NicoletNEXUS870FT分光光度计进行FT-IR分析,进行16次扫描。FT-IR分析也被用于研究聚合反应的进程。使用四氢呋喃(THF)作为溶剂和聚苯乙烯作为内标,通过凝胶渗透色谱(GPC)确定聚合物的分子量。通过在室温将10mg固体聚合物溶解在10mL溶剂中,检查聚合物在多种溶剂中的溶解性。热表征:
通过示差扫描热量法(differentialscanningcalorimetry)(DSC)和热重分析法(thermogravimetricanalysis(TGA)),表征聚氨酯的热行为。从-80℃至250℃,用DSCQ100V7.0Build244(UniversalV3.7ATA)仪器以10℃/min的扫描速率进行DSC。从0℃至600℃,在氮气氛下,用TGAQ50V5.0Build164(UniversalV3.7ATA)仪器以20℃/min的速率进行TGA。平均10mg的固体样品被用于两个实验。机械表征:
在室温下,以100N的称重传感器(loadcell)和100mm/min的十字头速度,通过Instron拉伸测试机(InstronTensileTestingMachine),测量聚氨酯膜的拉伸性能。膜从按重量计10%的聚合物溶液(对于PEG-HDI-DTH为DMF,而对于PCL-HDI-DTH为氯仿)浇铸,而允许溶剂室温蒸发,然后在50℃在真空中干燥48小时以除去残留的溶剂。样品尺寸为20mm×6mm×-0.3mm,具有10mm的净长度。对于每一样品,取5个测量值的平均值。聚合反应:
表4总结了两种聚合物的组成,包含硬链段和软链段的相对贡献。DTH合成的收率为大约85%,而聚氨酯的收率为大约70至80%。结果可重复,在±5%的范围内,具有合理的聚氨酯纯度。表4 NMR表征:
在图51和52中分别示出了PEG-HDI-DTH和PCL-HDI-DTH的1HNMR(连同峰归属)。PEG-HDI-DTH:δ0.8(在己基基团中的CH3-,DTH),1.2(在DTH的己基链中的-CH2),1.3(在HDI己基链中的-CH2-),1.4(在HDI中的-NH-CH2-CH2-),2.7(在DTH中的-CH2-CH2-CO-),2.9(在HDI中的-NH-CH2-和在DTH中的-C6H4-CH2-CH2-),3.0(在DTH中的-C6H4-CH2-CH),3.5(在PEG中的-O-CH2-CH2-O-),3.6(在PEG中的-CH2-CH2-O-CO-),4.0(在DTH中的-CO-O-CH2-CH2-),4.4(在DTH中的-NH-CH-(CO-)CH2-),6.9和7.1(在DTH中的两个-C6H4-)。
PCL-HDI-DTH:δ0.8(在己基基团中的CH3-,DTH),1.2至1.7(在DTH、HDI和PCL中的CH2),2.3(在PCL中的-CO-CH2-),2.8(在DTH中的-CH2-CH2-CO-),2.9(在HDI中的-NH-CH2-和在DTH中的-C6H4-CH2-),3.1(在DTH中的-C6H4-CH2-CH),4.0(在DTH和PCL中的-CO-O-CH2-CH2-),4.8(在DTH中的-NH-CH-(CO-)CH2-),6.7和6.9(在DTW中的两个-C6H4-)。
在图53和54中分别示出了PEG-HDI-DTH和PCL-HDI-DTH的13CNMR(连同峰归属)。PEG-HDI-DTH:δ13.9(在己基基团中的-CH3,DTH),21.9至27.9(在DTH、HDI的己基链中的CH2),29.2至30.8(在DTH、HDI的己基链中的CH2),36.0(在DTH中的-CH2-CH2-CO),37.5(在DTH中的-C6H4-CH2-CH),54.6(在DTH中的-NH-CH-(CO)-CH2-),62.9(在PEG中的-CH2-CH2-O-CO-NH-),64.8(在DTH中的-CH2-CH2-CO-),68.9(在PEG中的-CH2-CH2-O-CO-NH-),69.8(在PEG中的-O-CH2-CH2-O-),121.5和128.8(在DTH中的两个-C6H4-),156.0至158.1(在氨基甲酸乙酯羰基中的-NH-CO-O-),171.6(在DTH中的酯羰基和酰胺羰基)。
PCL-HDI-DTH:δ14.2(在己基基团中的CH3-,DTH),22.7至28.6(在DTH、HDI、PCL的己基链中的CH2),29.9至31.5(在DTH、HDI的己基链中的CH2),34.1(在DTH中的-CH2-CH2-CO),34.3(在PCL中的-CH2-CH2-CO-O),40.5(在DTH中的-C6H4-CH2-CH),53.5(在DTH中的-NH-CH-(CO)-CH2-),64.3(在PCL中的-CO-O-CH2-CH2-),129.5和130.4(在DTH中的两个-C6H4-),156.0(在氨基甲酸乙酯羰基中的-NH-CO-O-)和172.0(在DTH中的酯羰基和酰胺羰基),173.7(在PCL中的酰胺羰基)。
来自1H和13CNMR的峰归属说明所有三种成分都存在于聚合物链中。然而,由于对某些质子和碳相似的化学环境的存在,有相当多的峰重叠,其使得归属成为一项艰巨的任务。一般而言,对于PEG-和PCL-基聚氨酯,特征峰的存在显示聚合物由相应软链段连同HDI和DTH一起组成。最重要的是氨基甲酸乙酯键的存在,其对于PEG-和PCL-基聚氨酯都由1HNMR中的2.9ppm和13CNMR中的156ppm来指示。这清楚地说明氨基甲酸乙酯键通过缩聚反应形成。然而,光谱中一些未归属的峰对应于由可能的副反应形成的材料和未反应材料/溶剂。但是,这种峰的强度与归属的峰相比相当低,这说明聚合具有合理的纯度。FT-IR表征:
聚氨酯的FT-IR光谱在图55中被示出。两种聚合物的光谱示出了聚氨酯的特征峰。对于PEG-HDI-DTH,特征1100cm-1代表PEG链段的脂肪族醚键,而在1540cm-1周围的峰代表氨基甲酸乙酯键和DTH链段的酰胺键的N-H弯曲/C-N拉伸。而且,1620cm-1代表DTH链段的芳香族拉伸。1715至1730cm-1区域中的特征峰代表氨基甲酸乙酯键的羰基。羰基峰的分布表明了氨基甲酸乙酯羰基基团的氢键程度,其指示不同链段之间的相互作用。大约3330cm-1的宽肩表示氢键合的N-H拉伸。对于PCL-HDI-DTH,观察到类似的峰,但是由于PCL的己内酯单元的强羰基吸收,在大约1730cm-1的区域周围的峰被遮蔽。FT-IR分析支持聚氨酯的结构。
起始材料、中间预聚物和最终聚合物的的FT-IR一起在图56中示出。在1500至1700cm-1周围的峰的出现代表相比于PEG和PCL在预聚物中形成氨基甲酸乙酯键。大约1630cm-1的峰代表C=O(酰胺I)的拉伸,而1540cm-1代表N-H弯曲振动(酰胺II),其指示氨基甲酸乙酯键的形成。与HDI的异氰酸酯峰相当的在2280cm-1的峰表示两种预聚物都是异氰酸酯封端的。加入DTH导致最终聚合物中在2280cm-1处异氰酸酯峰的完全消失,其表示形成最终聚氨酯的反应完成。而且。在最终聚合物中大约1620cm-1周围的峰表示DTH的芳香环结构的C=C。在大约1715cm-1处的峰代表氨基甲酸乙酯的酰胺I和酰胺(在DTH中)中结合的游离非氢键合的C=O,而在1740cm-1处的肩代表PEG-HDI-DTH中的DTH的酯C=O。类似地,大约1715cm-1代表氨基甲酸乙酯的酰胺I和酰胺(在DTH中)中结合的游离非氢键合的C=O,而在1730cm-1处代表PEG-HDI-DTH中的己内酯单元和DTH的酯C=O。
表5总结了聚合物的分子量,其表明聚氨酯都具有显著高的分子量。与作为起始材料的PEG和PCL的分子量相比,最终聚合物的分子量显示了聚氨酯的形成。聚氨酯的低多分散指数表明分子量的分布不宽并且聚合得到控制。然而,与PCL基聚氨酯相比,PEG基聚氨酯的分子量较低。虽然不意图受到任何一种理论的束缚,但是这或许由于前体PEG中残余水的存在,其通过反应掉二异氰酸酯而抑制聚合物的高分子量。考虑在溶液聚合中促进聚合物分子量的不同因素,这些结果在±10%的范围内是可重复的。表5
聚氨酯的溶解性:表6示出了一般溶剂中聚氨酯的溶解性特征。表6
聚合物 | Mn(103) | Mw(103) | 多分散指数 |
PEG-HDI-DTH | 79 | 98 | 1.24 |
PCL-HDI-DTH | 150 | 246 | 1.64 |
溶剂/聚合物 | PEG-HDI-DTH | PCL-HDI-DTH |
二氯甲烷 | 几乎可溶 | 几乎可溶 |
氯仿 | 几乎可溶 | 可溶 |
DMF(二甲基甲酰胺) | 可溶 | 几乎可溶 |
THF(四氢呋喃) | 可溶 | 可溶 |
甲醇 | 不溶 | 不溶 |
乙醇 | 不溶 | 不溶 |
醋酸乙酯 | 不溶 | 不溶 |
丙酮 | 不溶 | 不溶 |
聚合物的溶解性显示聚氨酯在极性非质子溶剂中是可溶的而在水和质子溶剂中是不溶的。聚氨酯在丙酮、醋酸乙酯——其是极性并且是质子惰性的——中也是不溶的,表明聚氨酯的不同相对于溶解性的贡献不同。但是一般而言,溶解性特征表示聚氨酯对于实践目的而言是可溶的。热表征:
聚氨酯的DSC差示热分析图在图57中示出。两种聚合物的示差扫描量热法(DSC)分析显示了关于聚氨酯结构的形态信息。聚氨酯的双相形态是由于软链段和硬链段的存在。由于链段的相容性不同,发生相当多的相混合或相分离。链段的相容性源于不同的相互作用,包括但不限于氢键合、偶极相互作用、范德华相互作用等等。
聚氨酯的DSC差示热分析图示出了PEG-HDI-DTH在-40℃和PCL-HDI-DTH在-35℃的不同玻璃化转变(Tg),其对应于软链段玻璃化转变温度。来自纯均聚物Tg′s(对于PEG为-67℃,而对于PCL为-62℃)的Tg′s的移动表明在聚氨酯的软链段和硬链段之间的一定程度的相混合。对于PEG-HDI-DTH,三个额外的吸热被观察到:在0℃、50℃和162℃。对于PCL-HDI-DTH,也在5℃、52℃和173℃观察到类似的吸热,其中在31℃还有额外的一个吸热。硬链段Tg的不存在表示硬链段是相对晶状的区域,原因在于聚合物主链中存在芳香环结构。已经观察到硬链段,其原样可能在于具有芳香基作为聚合物主链的侧链基团的无定形硬链段。
而且,苯丙氨酸基聚氨酯的融化吸热的缺乏表明硬链段主要是无定形的。在162℃的吸热代表了微晶硬链段区域的融化,而在0℃和50℃的其它转变代表该硬链段区域的短程有序和长程有序的解离。聚氨酯的短程有序实际上代表了软链段和硬链段之间的相互作用,该相互作用实际上有助于聚氨酯的相混合行为。长程有序代表硬链段区域内的“未指明的”相互作用。PEG-HDI-DTH的软链段融化吸热的缺乏表明了软链段的无定形性。PEG的结晶性降低,原因在于在PEG链末端的硬链段的存在以及在于硬链段部分分散在聚氨酯软链段内。PEG-HDI-DTH中的低分子量PEG和高硬链段含量有利于这种特征。对PTMO基聚氨酯和苯丙氨酸基聚氨酯进行了类似的观察。PCL-HDI-DTH在173℃的类似吸热代表微晶硬链段区域的融化,而在0℃和52℃的其它转变分别代表所述硬链段区域的短程有序和长程有序的解离。
在31℃的额外吸热可能由于软链段的融化。PCL相对地更具晶态显示了由于在此温度的链迁移导致的融化。尽管由于酯键的偶极相互作用和相对较低的硬链段含量导致相混合,PCL软链段的结晶性较少受到影响。相混合现象存在于两种聚氨酯中,但是PCL基聚氨酯显示出比PEG-基聚氨酯较低程度的混合。晶态PCL软链段实际上更内聚,其防止了硬链段和软链段在分子水平的混合,而相对无定形和非极性的PEG软链段在不同链段之间提供了更多的整合。聚氨酯的这些特有的特征表明聚氨酯的两种相形态与可变程度的相混合/分离行为一起存在。聚合物的相对结晶性主要由H-键合硬链段贡献。聚氨酯的DSC分析提供关于聚氨酯的相形态的重要信息。
聚氨酯的热重分析(TGA)在图58中示出。TGA分析显示当PEG-HDI-DTH在大约250℃和PCL-HDI-DTH在大约300℃开始降解时,这些聚合物是热稳定的。PEG基聚氨酯的较早开始可能是由于PEG软链段的缔合水分子。两种聚氨酯显示了两阶段降解,所述两阶段降解在性质上与聚氨酯的两相结构一致。
与纯的聚酪氨酸相比,聚合物的融化在相对较低的温度进行,显示出其在材料加工中的适用性,所述材料用于组织工程应用中的支架的实践目的。高降解温度显示出聚合物可加工的温度范围足够大。机械表征:
图59显示聚氨酯的典型应力-应变曲线。表7总结聚氨酯的拉伸性能。
聚氨酯的机械性能显示PEG基聚氨酯的机械强度比PCL基聚氨酯低。聚氨酯的机械性能主要由占优势的软链段控制。与相对更具晶态的PCL相比,PEG-HDI-DTH的较低拉伸强度、弹性模量和伸长模量(断裂时)主要是由于无定形和挠性PEG软链段所致。由于硬链段和软链段的相混合,硬链段的贡献相对较少。因而,聚氨酯的机械性能更多地由软链段形态控制。聚氨酯的机械性能的差异可以直接与聚氨酯的结构和形态相关。具有较高程度相分离的聚氨酯显示出比相混合聚氨酯更好的拉伸性能。这可能是由于硬链段区域的无序引起的。如DSC分析所示,晶状PCL软链段抑制相混合并且因此导致更多的相分离形态,所述相分离形态导致更高的拉伸性能。除此之外,分子量的影响与拉伸性能直接相关。与PEG基聚氨酯相比,PCL基聚氨酯具有显著更高的分子量,其改善了拉伸性能。而且,PEG的高亲水性通常导致较低的聚合物机械性能。结果和讨论:
初步的物理和化学表征显示聚氨酯能够使用DTH作为增链剂进行合成。1H和13CNMR表明芳香部分的存在,其最后证明了包含作为增链剂的DTH。而且,IR表征表明氨基甲酸乙酯和聚合物的酰胺基团(1650至1700cm-1)的存在。GPC分析初步得出这样的结论:聚合过程具有足够高的分子量和相对窄的分子量分布。溶解性研究说明这些聚合物在大多数溶剂中部分至全部可溶。
热表征研究显示两种聚合物都具有大约150℃的融化温度(来自DSC分析),而分解在大约300℃开始(来自TGA分析)。这些结果显示材料加工的广泛热范围。
聚合物在生理pH7.4和体温37℃的水解降解说明PEG基聚氨酯在这些条件下是可降解的,而PCL基聚氨酯在类似的条件下潜在地较少可降解。这些结果进一步被这样的事实支持:PCL基聚氨酯的水摄取(大约5%)相比于它们的PEG基对应物(大约70%)低。结论:
L-酪氨酸基聚氨酯的初步结果表明这些聚合物可以容易地通过两步法合成。表征结果显示这些材料适合于生物材料应用。进一步和详细的表征,包括这些聚合物的机械和生物特性,目前正在研究中,用于组织工程应用。本发明说明L-酪氨酸基DTH可以被用作增链剂,用于合成聚氨酯。这些聚合物具有用于生物材料应用的潜能。
基于本发明,L-酪氨酸基磷酸酯聚合物可以被合成,所述L-酪氨酸基磷酸酯聚合物在较短的时间段内,例如在少于20天内,少于15天或甚至少于7至10天内降解。在另一方面,本发明也使合成可在几个月至一年的时期内降解的L-酪氨酸基氨基甲酸乙酯聚合物成为可能。在另一实施方式中,本发明使形成L-酪氨酸基磷酸酯聚合物和L-酪氨酸基氨基甲酸乙酯聚合物的共聚物成为可能,从而允许进一步控制其降解速率。掺合物:
在另一实施方式中,本发明涉及与L-酪氨酸聚氨酯聚合物掺合的L-酪氨酸聚磷酸酯聚合物。在这种实施方式中,根据掺合物中每一成分的组成,可能获得各种降解时间。虽然不希望被束缚于任何一种实施方式,但是作为一般规则,本发明的L-酪氨酸聚磷酸酯聚合物比在本文公开的L-酪氨酸聚氨酯聚合物(大约1个月至几个月或更长的降解时间)在更短的时间内(例如通常少于大约2周,少于大约7天)降解。因此,基于共混聚合物中每一种的百分比,能够获得广泛的期望降解时间,用于各种生物医学应用。
在另一实施方式中,本发明涉及各种L-酪氨酸聚磷酸酯聚合物的均聚物、共聚物或掺合聚合物混合物,如本文所公开的。在仍另一实施方式中,本发明涉及各种L-酪氨酸聚氨酯聚合物的均聚物、共聚物或掺合聚合物混合物,如本文所公开的。
虽然已经特别就本文详述的一些具体实施方式对本发明进行了详细描述,但是其它实施方式可以达到相同的结果。本发明的变化和修改对于本领域普通技术人员将是显而易见的并且本发明意图在所附的权利要求中覆盖所有这样的修改和等同物。
Claims (22)
1.将核酸输送到细胞的组合物,其包含:
至少一种合成聚合物微胶囊或纳米胶囊,所述胶囊具有内部水相、内部油相和表面,其中所述胶囊包括在所述胶囊的内部油相中的一种或多种材料,所述材料选自L-酪氨酸聚磷酸酯、L-酪氨酸聚氨酯或其任何组合;
在所述胶囊的表面上的用于增强生物相容性的添加剂,其选自PEG-g-壳聚糖和两性PEG种类的一种或多种;和
在所述胶囊的内部水相中的用于帮助DNA转运穿过细胞膜的添加剂,所述添加剂选自线性聚氮丙啶、PEG-g-壳聚糖和其任何组合的一种或多种,
其中所述L-酪氨酸聚磷酸酯由下面的式子限定:
其中重复单元数x被选择以使上述L-酪氨酸聚磷酸酯的分子量在降解之前在5,000Da至40,000Da的范围内,并且R是烷基或芳基基团;并且
其中所述L-酪氨酸聚氨酯包含生物相容性大二醇,其选自聚乙二醇、聚丁二醇、聚己内酯二醇和其组合;芳香族或脂肪族二异氰酸酯,其选自,4,4’-二苯甲烷二异氰酸酯、甲苯二异氰酸酯、1,6-己二异氰酸酯和其组合;和脱氨基酪氨酰己基酯。
2.权利要求1所述的组合物,其中所述重复单元数x被选择以使上述L-酪氨酸聚磷酸酯的分子量在降解之前在7,500Da至30,000Da的范围内。
3.权利要求1所述的组合物,其中所述重复单元数x被选择以使上述L-酪氨酸聚磷酸酯的分子量在降解之前在10,000Da至25,000Da的范围内。
4.权利要求1所述的组合物,其中所述重复单元数x被选择以使上述L-酪氨酸聚磷酸酯的分子量在降解之前在15,000Da至20,000Da的范围内。
5.权利要求1所述的组合物,其中所述L-酪氨酸聚磷酸酯适合于生物医学应用。
6.权利要求1所述的组合物,其中所述L-酪氨酸聚磷酸酯是可生物降解的。
7.权利要求6所述的组合物,其中所述L-酪氨酸聚磷酸酯稳定至少1周。
8.权利要求6所述的组合物,其中所述L-酪氨酸聚磷酸酯稳定至少2周。
9.权利要求6所述的组合物,其中所述L-酪氨酸聚磷酸酯稳定1个月以下。
10.权利要求1所述的组合物,其中所述L-酪氨酸聚氨酯由下面所示式子限定:
其中重复单元数m、n和p被选择以使上述聚氨酯化合物的分子量在4,000Da至1,000,000Da的范围内。
11.权利要求10所述的组合物,其中所述重复单元数m、n和p被选择以使所述上述聚氨酯化合物的分子量在10,000Da至800,000Da的范围内。
12.权利要求10所述的组合物,其中所述重复单元数m、n和p被选择以使所述上述聚氨酯化合物的分子量在30,000Da至750,000Da的范围内。
13.权利要求10所述的组合物,其中所述重复单元数m、n和p被选择以使所述上述聚氨酯化合物的分子量在50,000Da至600,000Da的范围内。
14.权利要求10所述的组合物,其中所述重复单元数m、n和p被选择以使所述上述聚氨酯化合物的分子量在75,000Da至500,000Da的范围内。
15.权利要求10所述的组合物,其中所述重复单元数m、n和p被选择以使所述上述聚氨酯化合物的分子量在100,000Da至400,000Da的范围内。
16.权利要求10所述的组合物,其中所述L-酪氨酸聚氨酯适合于生物医学应用。
17.权利要求10所述的组合物,其中所述L-酪氨酸聚氨酯是可生物降解的。
18.权利要求17所述的组合物,其中所述L-酪氨酸聚氨酯适合于生物医学应用。
19.权利要求1所述的组合物,其中所述L-酪氨酸聚磷酸酯包括至少一种具有下面所示式子的聚合物成分:
其中x是10到80范围内的整数,并且R是烷基或芳基基团。
20.权利要求1所述的组合物,其中所述L-酪氨酸聚氨酯包括至少一种具有下面所示式子的聚合物成分:
其中n是5至25的范围内的整数,m是1至4的范围内的整数,而p是20至200的范围内的整数。
21.权利要求1所述的组合物,其中至少一个寻靶部分布置在所述胶囊的表面上并且可用于结合到靶分子,其中所述寻靶部分包括能够与靶分子如抗体、抗体片段、抗原、跨膜蛋白、糖蛋白以及它们的任何组合特异性结合的任何部分。
22.权利要求1所述的组合物,其中所述胶囊包括L-酪氨酸聚磷酸酯。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US85943606P | 2006-11-16 | 2006-11-16 | |
US60/859,436 | 2006-11-16 | ||
US95973107P | 2007-07-16 | 2007-07-16 | |
US60/959,731 | 2007-07-16 | ||
PCT/US2007/024075 WO2008063562A2 (en) | 2006-11-16 | 2007-11-16 | Materials and methods of introducing genetic material into living cells |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101646417A CN101646417A (zh) | 2010-02-10 |
CN101646417B true CN101646417B (zh) | 2015-11-25 |
Family
ID=39430335
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200780049727.7A Expired - Fee Related CN101646417B (zh) | 2006-11-16 | 2007-11-16 | 将遗传物质引入活细胞的材料和方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20110223664A1 (zh) |
EP (1) | EP2091517B1 (zh) |
CN (1) | CN101646417B (zh) |
CA (1) | CA2669846C (zh) |
WO (1) | WO2008063562A2 (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9422393B2 (en) * | 2012-11-13 | 2016-08-23 | Syracuse University | Water-triggered shape memory of PCL-PEG multiblock TPUs |
CN103665384B (zh) * | 2013-05-20 | 2016-10-05 | 中国药科大学 | 新型阳离子接枝共聚物及多重复合非病毒基因载体制备方法和应用 |
BR102017016440A2 (pt) * | 2017-07-31 | 2019-03-19 | Universidade Federal Do Rio Grande Do Sul | Composição para terapia gênica do sistema nervoso central, processo de obtenção e uso da mesma |
CN112898517B (zh) * | 2021-01-23 | 2022-06-21 | 湖北世丰新材料有限公司 | 一种生物型聚氨酯及其制备方法及其应用 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6221997B1 (en) * | 1997-04-28 | 2001-04-24 | Kimberly Ann Woodhouse | Biodegradable polyurethanes |
ATE216712T1 (de) * | 1997-06-18 | 2002-05-15 | Guilford Pharm Inc | Zweistufige lösungspolymerisation von hochmolekularen poly(phosphorestern) |
US6593308B2 (en) | 1999-12-03 | 2003-07-15 | The Regents Of The University Of California | Targeted drug delivery with a hyaluronan ligand |
US20040156904A1 (en) * | 2003-02-12 | 2004-08-12 | The Research Foundation Of State University Of New York | Biodegradable polymer device |
BRPI0409663A (pt) | 2003-04-25 | 2006-04-18 | Penn State Res Found | método e sistema para o envio sistêmico de compostos bioativos derivados de lipìdeo de detenção de crescimento |
US7727969B2 (en) * | 2003-06-06 | 2010-06-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Controlled release nanoparticle having bound oligonucleotide for targeted delivery |
WO2006080951A2 (en) * | 2004-07-01 | 2006-08-03 | Yale University | Targeted and high density drug loaded polymeric materials |
US20070141134A1 (en) * | 2005-12-16 | 2007-06-21 | Kosak Matthew K | Shielded micelles for polynucleotide delivery |
US20090011004A1 (en) * | 2005-12-30 | 2009-01-08 | Philadelphia Health & Education Corp., D/B/A/ Drexel University Of College Of Medicine | Improved carriers for delivery of nucleic acid agents to cells and tissues |
-
2007
- 2007-11-16 WO PCT/US2007/024075 patent/WO2008063562A2/en active Application Filing
- 2007-11-16 US US12/515,111 patent/US20110223664A1/en not_active Abandoned
- 2007-11-16 CN CN200780049727.7A patent/CN101646417B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2007-11-16 EP EP07862076.2A patent/EP2091517B1/en not_active Not-in-force
- 2007-11-16 CA CA2669846A patent/CA2669846C/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Debanjan Sarkar et al.L-Tyrosine Based Polyurethane Blends for Tissue Engineering Applications.《http://aiche.confex.com/aiche/2005/ techprogram/P23097. HTM》.2005,1. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2091517A4 (en) | 2010-10-27 |
CN101646417A (zh) | 2010-02-10 |
CA2669846A1 (en) | 2008-05-29 |
US20110223664A1 (en) | 2011-09-15 |
WO2008063562A9 (en) | 2008-07-10 |
EP2091517B1 (en) | 2013-05-29 |
EP2091517A2 (en) | 2009-08-26 |
WO2008063562A3 (en) | 2008-10-16 |
CA2669846C (en) | 2015-02-10 |
WO2008063562A2 (en) | 2008-05-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Feng et al. | Construction of functional aliphatic polycarbonates for biomedical applications | |
Wang et al. | Bioapplications of hyperbranched polymers | |
Aluri et al. | Development of l-tyrosine-based enzyme-responsive amphiphilic poly (ester-urethane) nanocarriers for multiple drug delivery to cancer cells | |
Gupta et al. | Amino acid derived biopolymers: Recent advances and biomedical applications | |
ES2376888T3 (es) | Materiales supramoleculares activos biológicamente, modulares biorreabsorbibles o biomédicos | |
Prabaharan et al. | Amphiphilic multi-arm-block copolymer conjugated with doxorubicin via pH-sensitive hydrazone bond for tumor-targeted drug delivery | |
CA2649672C (en) | Delivery of ophthalmologic agents to the exterior or interior of the eye | |
Wu et al. | Synthesis and characterization of ionic charged water soluble arginine-based poly (ester amide) | |
Joshi et al. | Development of l-lysine based biodegradable polyurethanes and their dual-responsive amphiphilic nanocarriers for drug delivery to cancer cells | |
CA2596011C (en) | Polymer particle delivery compositions and methods of use | |
Itaka et al. | Progress and prospects of polyplex nanomicelles for plasmid DNA delivery | |
US9114177B2 (en) | Block copolymer having phenylboronic acid group introduced therein, and use thereof | |
CN102083972B (zh) | 由内源性携带氨基的单体形成的聚阳离子基因载体 | |
Fu et al. | Dendrimer/DNA complexes encapsulated in a water soluble polymer and supported on fast degrading star poly (DL-lactide) for localized gene delivery | |
Najer et al. | An amphiphilic graft copolymer-based nanoparticle platform for reduction-responsive anticancer and antimalarial drug delivery | |
JP2009530484A (ja) | アルキレン−ジカルボキシラート含有の生分解性ポリ(エステル−アミド)および使用法 | |
AU2006255262A1 (en) | Therapeutic polymers and methods of use | |
Han et al. | Recent advances of poly (ester amide) s-based biomaterials | |
CN101646417B (zh) | 将遗传物质引入活细胞的材料和方法 | |
Yao et al. | Biodegradable pH-sensitive polyurethane micelles with different polyethylene glycol (PEG) locations for anti-cancer drug carrier applications | |
Saxena et al. | Development of L-amino-acid-based hydroxyl functionalized biodegradable amphiphilic polyesters and their drug delivery capabilities to cancer cells | |
Ansari et al. | 2, 2-Bis (hydroxymethyl) propionic acid based cyclic carbonate monomers and their (co) polymers as advanced materials for biomedical applications | |
JP2009513783A (ja) | 芳香族二塩基酸含有ポリ(エステルアミド)ポリマーおよび使用の方法 | |
Wu et al. | From macro to micro to nano: the development of a novel lysine based hydrogel platform and enzyme triggered self-assembly of macro hydrogel into nanogel | |
Zhao et al. | Reduction responsive and surface charge switchable polyurethane micelles with acid cleavable crosslinks for intracellular drug delivery |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20151125 Termination date: 20171116 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |