CN101639941B - Cb法微核图像中双核淋巴细胞的准确快速提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及辐射生物剂量学领域中CB法微核图像中双核淋巴细胞区域的准确、快速自动提取，实现步骤如下：对采集的RGB格式、尺寸为1500×1000pixel微核图像MN_rgb进行代数减运算(R分量-B分量)，获得图像MN_rb；对图像MN_rb进行中值滤波(5×5窗口)和形态学滤波(disk，r＝6)，并剔除边界粘连的区域，获得图像MN_m；然后利用圆度阈值和灰度阈值筛选Area∈[1000pixel，3500pixel]目标区域中的独立淋巴细胞；利用圆度阈值、灰度阈值和延展度筛选Area∈[3500pixel，8000pixel]目标区域中的串联细胞，并进行分离；判别独立的或分离后的淋巴细胞是否为双核淋巴细胞。本发明设计的方法实现了CB法微核图像中双核淋巴细胞的自动提取，具有提取准确、快速等优点，为研制CB法微核图像的自动分析系统迈出了至为关键的一步。

Description

CB法微核图像中双核淋巴细胞的准确快速提取方法

技术领域

本发明涉及辐射生物剂量学领域中微核(Micronucleus，MN)的自动化检测，是一种微核图像计算机自动分析中目标区域的提取方法，特别是放射医学领域中可用作辐射生物剂量计的CB法微核图像中双核淋巴细胞的准确、快速、自动提取方法。

技术背景

人外周血淋巴细胞胞质分裂阻滞法(Cytokinesis-block，CB法)微核试验的主要分析指标是微核率，计算公式为：p(‰)＝x/n×1000‰，式中p为每千个双核淋巴细胞中的微核数；n为观察的双核淋巴细胞数；x为n个双核淋巴细胞中所含的微核数。其中，双核淋巴细胞区域的准确、快速提取是CB法微核图像自动分析的关键技术和难题，直接影响着双核淋巴细胞的准确判别和微核率的准确计数。

针对微核图像中双核淋巴细胞区域的提取问题，对检索到的有关文献进行研究发现，其实现方法主要可分为两类：一是单阈值分割方法或边缘检测方法，仅能够获取细胞核(微核)的信息，记为方法I；二是双阈值分割方法，能同时获取细胞质和细胞核(微核)的信息，记为方法II。方法I和方法II各有优缺点，详见表1。

表1微核图像分割方法的分类与比较

对于方法I，即单阈值分割方法或边缘检测方法，只能获取细胞核(微核)信息，在判别双核淋巴细胞时无法利用细胞的轮廓信息加以限制，其缺陷是：

(1)易将如下情况误判为双核淋巴细胞：①有粘连的两个单核细胞，其内部单核的面积和周长接近，尽管这种情况较少，见图1(a)；②两个临近的裸核，其面积和周长接近，较为常见，见图1(b)、(c)和(f)；③尤其是图1(f)中，有4个面积相近的细胞核，不知将判别为几个双核细胞。这都将会导致双核淋巴细胞的误计数(假阴性)，从而影响微核率的准确计数。

(2)不能识别有粘连的双核，见图1(d)，但是淋巴细胞中双核有粘连的情况却是较为常见的，而且在双核细胞中占据一定比例，如若不能对其进行识别，将会影响计数统计。

(3)对于双核位于细胞一侧、而微核位于另一侧的情况(较为常见)，见图1(e)，根据文献[3]中的后续自动分析步骤：①找到双核质心连线的中点O(X，Y)；②以该中点为圆心、以半径为R1作圆，正好将该双核包含在内，记为圆O1；③将圆O1扩大10％，记为圆O2(其半径为R2)，并认为圆O2最接近细胞的原始大小；④再判断圆O2内部的微核情况。由图1(e)可以看到，MN-3能被包含在圆O2内部，MN-2却被劈成两部分，而MN-1却位于圆O2之外，这将会漏掉MN-1，甚至还会漏掉MN-2，从而导致微核的误计数(假阳性)。

采用方法II，即双阈值分割的方法，在判别淋巴细胞时，从理论上讲由于能够利用细胞质的信息(即细胞轮廓)加以限制，故应该可以克服方法I存在的缺陷。文献[6]通过寻找微核图像灰度直方图中的两个局部最小值来确定分割双阈值，然而微核图像的灰度直方图中往往并非恰好仅有两个局部最小值(可能仅有1个，还可能有3个、甚至更多个)，且分割效果不理想。文献[7]则先计算使微核图像的熵最小时的阈值T1，然后利用公式T2＝T1+(h2-h1)/3计算得到第2个分割阈值T2，其中h1和h2分别为灰度直方图中左侧和右侧边缘处的灰度值，1/3为一经验值，该方法有时会出现T2＞255的情况，导致无法正常进行分割，且分割效果也不理想。文献[6]和[7]中所采用的两种方法不可靠，且对微核制片质量要求非常高。

分割迅速、应用较为广泛的双阈值分割方法主要有最大类间方差法、最大熵法和迭代法，而不是文献[6，7]中采用的方法。由于细胞核(微核)与细胞质、细胞质与背景的对比度较低，而且背景和细胞质的颜色不均匀，导致双阈值分割的方法难以准确、快速的将细胞质区域提取出来。图2(a)和(d)分别为两幅微核图像(CB法培养)，RGB格式，尺寸1500×1000pixel，分别采用最大熵法和迭代法对其进行双阈值分割；图2(b)和(e)分别为分割出的细胞质区域，可以看出，细胞质区域被大量的污染区域所包围、干扰；图2(c)和(f)分别为分割出的细胞核(微核)区域，可以看出，细胞核(微核)区域又被部分细胞质所包围、干扰。

可见，采用方法II，在分割细胞质、细胞核(微核)的具体实现过程中存在着严重的干扰，难以准确、快速的将细胞质信息、细胞核(微核)信息分别提取出来。

由上述分析可见，在CB法微核图像的自动分析过程中：

(1)若采用方法I，处理速度较快，但由于该方法仅有细胞核(微核)的信息可利用，却无细胞质信息(即细胞轮廓)可利用，存在着较为严重的缺陷，易产生假计数；

(2)若采用方法II，理论上可同时利用细胞质和细胞核的信息来判别双核淋巴细胞，与方法I相比，识别应该更准确，但双阈值分割方法难以准确分割出细胞质的信息；

(3)考虑到微核图像快速自动分析的要求，其他更为复杂的分割算法也不宜采用。

因此，若想实现双核淋巴细胞区域的准确、快速自动识别，就必须要切实解决细胞质的准确分割这一难题。

发明内容

本发明的目的便是解决上述难题，设计出了一种CB法微核图像中双核淋巴细胞区域的准确、快速、自动提取的方法。

按照标准方法(中华人民共和国卫生行业标准-WS/T187-1999，淋巴细胞微核估算受照剂量方法)进行微核制片，对于采集(显微镜物镜放大倍数20×)到的RGB格式的微核图像，本发明中双核淋巴细胞目标区域的快速准确提取是按照如下步骤完成的：

1代数减运算

对于采集到的RGB格式的微核图像MN rgb(尺寸为1500×1000pixel)，进行代数减运算(R分量-B分量，其中R为红色分量、B为蓝色分量)。利用代数减运算初步获得的目标图像MN rb中，还含有椒盐噪声和面积大小不一的污染区域，需要分别采用中值滤波和形态学滤波的方法进行处理。

2中值滤波

对代数减运算得到的目标图像MN rb采用中值滤波(5×5窗口)进行滤波降噪，主要考虑了如下因素：

(1)微核图像分割时大量存在的是椒盐噪声，中值滤波恰好可以较好的滤除图像中的椒盐噪声，且同时能较好的保护目标区域的边界；(2)中值滤波的缺点是“有时会滤除图像中的细线状的和小块的目标区域”，然而微核图像中不存在细线状目标(核质桥除外)，所滤除的“小块目标区域”也远达不到微核的大小，即微核不会被滤除，细胞核更不会被滤除；(3)与其它滤波算法相比，中值滤波算法简单、运算量小，能够满足微核图像快速分析的需要；(4)后续采用形态学滤波和面积阈值方法滤除微小目标时，不至于再对每个噪声和污点都进行分析，可以提高运算速度。

3形态学滤波

中值滤波后的目标图像(已转化为二值图像)，采用半径为6的圆盘(disk，r＝6)先进行开运算、然后再进行闭运算，滤除图像中的杂质和面积较小的污染区域，而保留下淋巴细胞区域和面积稍大的少数污染区域，同时目标区域内部的小孔洞也能被填充。对于保留的面积稍大的少数污染区域，需要进一步采用设定面积阈值和灰度均值的方法来进行剔除。

4剔除边界区域

对于和整幅微核图像边界有粘连的目标区域进行剔除。

5面积阈值

计算并统计一定数量(＞200)独立淋巴细胞的面积(Area)分布情况，设定其面积分布范围为[A1，A2]，可以对Area＜A1和Area＞A2的目标区域进行剔除。Area＞A1的目标区域为淋巴细胞区域和少数面积较大的污染区域，对于污染区域采用灰度阈值进行剔除。

在物镜20×、目镜10×时观察微核样片，视野中的淋巴细胞、细胞核及微核均能用肉眼看清楚，且大小合适。物镜20×下采集微核图像，尺寸设定为1000×750pixel，目测确定500个独立的淋巴细胞，计算并统计其面积分布情况。500个独立淋巴细胞的面积分布见图3，面积平均值为2223.5pixel，其中Area∈[1000，3500]的细胞百分比为98.2％；而Area∈[1000，1500]的细胞仅占观测细胞总数的7.6％，其中绝大部分为单核淋巴细胞，且细胞核被细胞壁紧紧裹住，导致这些淋巴细胞的面积偏小。因此，设定淋巴细胞的面积下限值A1＝1000pixel。

对于面积超过3500pixel的目标区域，主要是面积巨大的淋巴细胞或者是有粘连的细胞区域，故可设置A2＝3500pixel。因此，通过设定面积阈值[1000，3500pixel]能够初步完成对独立淋巴细胞区域的初步提取。

对于Area＞3500pixel区域中有粘连的淋巴细胞，可分为三种情况，即细胞串联、细胞并联、细胞串并联，见图4。其中串联的细胞区域的粘连较为简单，且所占比例较大，应予以分离和判别；而并联和串并联细胞区域的粘连情况较为复杂，即便人工观察也比较费力，采用计算机图像分析时更加困难，极易导致错误计数，且浪费时间，故不予分析。

如果不分析粘连细胞区域，则设定A2＝3500pixel；如果对粘连的淋巴细胞区域进行分离和识别，则应该合理的设置面积上限阈值A2，从而保留粘连的细胞区域；本识别方法中仅对串联的细胞区域进行识别。细胞串联可以是2个细胞串联，也可以是3个串联，甚至是更多个(但较为少见)，见图4(a)和(d)；细胞并联则至少要有3个细胞，见图4(b)；而细胞的串并联至少要有4个细胞，见图4(c)。因此，将3个细胞的平均面积之和作为上限阈值，即2223.5×3＝6670.5pixel，并适当扩大为A2＝8000pixel。

6圆度阈值

圆度，也称形状因子(Figure parameter，FP)，主要用来描述目标区域边界的复杂程度，其值介于0～1之间。目标区域越接近圆形，其圆度值越接近1；而其它形状的目标区域的圆度值都小于1；边界越复杂，圆度值越小。圆度计算公式为： $\mathrm{FP}=4\mathrm{\π}{A}_0/P_0^2,$ 式中A₀为目标区域的面积；P₀为目标区域的周长(即区域边界8链码的长度)。

计算并统计一定数量(＞200)独立淋巴细胞的圆度值，当FP≥0.5时，目标区域为独立的淋巴细胞或边界较为光滑的污染区域；当FP＜0.5时，目标区域为有粘连的细胞区域或形态不规则的污染区域。因此，设定圆度阈值FP＝0.5。

7灰度阈值

对于Area∈[A1，A2]的目标区域，由于污染区域内部不含细胞核，其灰度均值偏高(记为μ_s)，而细胞区域内部含有细胞核(微核)，其灰度均值偏低(记为μ_c)。计算出整幅微核图像的灰度均值(记为μ₀)，满足μ_c＜μ₀＜μ_s，设置一个较小的调节阈值δ(δ＝8)，若某区域的灰度均值μ_grey≥(μ₀-δ)，即为污染区域，进行剔除。保留下来的目标区域，其Area＞A1、灰度均值μ_grey＜(μ₀-δ)，即为淋巴细胞区域。

图5为一幅微核图像，其内部的11个目标区域已用其外接矩形标记，分别计算其灰度均值、面积和圆度，结果见表2。其中图5的灰度均值为163.05。

表2图5内部各子区域的面积、灰度均值和圆度值

No.	1	2	3	4	5	6
							Area	4110.5	1610.5	6430.6	2176.1	2173.4	4459.4
μgrey	111.2011	126.0523	131.0372	132.7787	125.4393	129.6939
							FP	0.6228	0.6387	0.6099	0.6201	0.6436	0.4422
No.	7	8	9	10	11
							Aera	1267.9	2597.4	3723.9	1066.5	1317.5
μgrey	138.1755	163.3106	165.3452	167.3453	156.6102
							FP	0.4233	0.3353	0.1981	0.5956	0.5468

由表2可以看出：首先采用面积阈值，即满足Area∈[1000，3500]的目标区域有2、4、5、7、8、10、11；然后利用圆度阈值筛选，即满足FP＞0.5的目标区域为2、4、5、10、11；再利用灰度阈值筛选，区域10和11的灰度均值分别为167.3453和156.6102，均明显大于2，4，5区域的灰度均值，故只保留子区域2，4和5。对照图5可以看出，目标区域2、4和5均为独立的淋巴细胞，已被准确的提取出来。

8串联淋巴细胞的提取

对于3500＜Area＜8000pixel、FP＜0.5、μ_grey＜(μ₀-δ)的区域，能够准确的判别为有粘连的淋巴细胞区域。延展度(Elongation，El)，也称体态比，指目标区域的短轴与长轴之比，其值介于0～1之间。目标区域越接近圆形或方形时El值越接近于1，若El值越小则表示目标区域越扁平，该特征可把较纤细的物体与方形或圆形物体区分开。统计一定数量(＞200)粘连淋巴细胞的延展度，设定延展度阈值El＝0.8，当El＜0.8时，目标区域为串联的淋巴细胞。9双核淋巴细胞的判别

对于提取出来的淋巴细胞区域2、4和5，再按如下准则判别其是否为双核淋巴细胞：

(1)淋巴细胞轮廓内部含两个独立的细胞核，若为单核、三核、四核及多核，均舍弃；

(2)双核面积接近、色度深浅相同；

(3)如果双核之间有一个或多个核质桥连接，桥宽不应宽于主核直径的1/4；

(4)双核边界可以粘连，但不应该重叠，若粘连则必须能识别各自的界限。

本发明与已有的微核图像分割方法比较，双核淋巴细胞目标区域的提取效果理想，而且速度较快，既克服了方法I的缺陷，又彻底解决了方法II难以实现的双核淋巴细胞轮廓的提取问题，为微核图像的自动分析提供了技术保障。本发明对双核淋巴细胞区域的提取，首先根据微核图像的特点进行了代数减运算，然后逐步增加条件、筛选出了图像中所需的目标区域。这种分析思路同样适用于其它显微图像中特定目标区域的提取。

附图说明

图1为方法I所不能正确判别和计数的微核图像；

图2为方法II分割出的细胞质和细胞核(微核)图像；

图3为500个独立淋巴细胞的面积分布直方图；

图4为淋巴细胞串联、并联、串并联的示意图；

图5为将图11中各目标区域的轮廓与图8相叠加的效果图，其中02和05子区域为双核淋巴细胞；

图6是本发明提取双核淋巴细胞的流程框图；

图7为本发明设计的CB法微核图像自动分析的流程图；

图8为一幅实际的微核图像；

图9为采用代数减运算(R分量-B分量)得到的二值图像；

图10为采用中值滤波和形态学滤波，并移除边界目标后的图像(已取反显示)；

图11为采用面积阈值方法滤除Area＜A1目标区域后的图像。

具体实施方式

本发明中有关算法的实现是在MATLAB7.0中实现的，实施步骤如下：

1代数减运算

MN0＝imread(‘Name.jpg’)；％读入微核图像Name.jpg

MN_rb＝[MN0(:，:，1)]-[MN0(:，:，3)]；％代数减，R分量-B分量

2中值滤波

MN_m＝medfilt2(MN_rb，[55])；％对MN_rb进行中值滤波，5×5窗口

3形态学滤波

sel＝strel(′disk′，6)；％建立r＝6的圆盘结构元素

MN_close＝imclose(MN_m，se1)；％形态闭运算

MN_open＝imopen(MN_close，se1)；％形态开运算

se2＝strel(′disk′，1)；％建立r＝1的圆盘结构元素

SM＝imerode(MN_open，se2)；％边界平滑，腐蚀运算1次

SM1＝imerode(SM，se2)；％再腐蚀运算1次

4移除边界目标

SM2＝imclearborde(～SM 1)；％移除边界粘连区域

5独立淋巴细胞的判别条件为：

$\left\{\begin{array}{c}\mathrm{Area}\&Element;[1000\mathrm{pixel},3500\mathrm{pixel}]\\ \mathrm{FP}\&GreaterEqual;0.5\\ {\mathrm{\&mu;}}_{\mathrm{grey}}<({\mathrm{\&mu;}}_0-\mathrm{\&delta;})\end{array}\right.$

6串联淋巴细胞的判别与分离

串联淋巴细胞区域的判别条件为：

$\left\{\begin{array}{c}\mathrm{Area}\&Element;[3500\mathrm{pixel},8000\mathrm{pixel}]\\ \mathrm{FP}<0.5\\ \mathrm{El}<0.8\\ {\mathrm{\&mu;}}_{\mathrm{grey}}<({\mathrm{\&mu;}}_0-\mathrm{\&delta;})\end{array}\right.$

串联淋巴细胞的分离，参考并改进了傅蓉等人在《计算机工程与应用》，2007，43(17)：21-23上发表的“基于凹点搜索的重叠细胞图像自动分离的算法研究”，即首先寻找分离点对，然后连接分离点对。分离点对位于串联细胞区域的轮廓上，且满足条件：①分离点对位于细胞的连接处，②点对之间的距离是局部最短的，并增加一个条件，即“③点对连线上各像素点的灰度值接近”，以防有细胞核或微核被连线分割。

7双核淋巴细胞的判别

(1)提取一个独立的淋巴细胞区域(或分离开的串联淋巴细胞)，由于此时淋巴细胞仅由细胞质、细胞核(微核)两部分构成，利用Otsu方法进行单阈值分割细胞核(微核)；

(2)对淋巴细胞轮廓内的目标区域(细胞核、微核)进行标记，判别是否有且仅有两个面积相近、且足够大的区域，其圆度值和灰度均值也应相近；

(3)如果两个细胞核有粘连，利用延展度(即区域的短轴和长轴之比)进行判别，并进行分离；

(4)如果满足上述3条，则判别为一个双核淋巴细胞。

Claims (4)

1.一种CB法微核图像自动分析中双核淋巴细胞区域的自动提取方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)对微核图像进行代数减运算，红色(R)分量减蓝色(B)分量，初步获得淋巴细胞区域；

(2)利用中值滤波和形态学滤波，滤除脉冲噪声和杂质；

(3)统计确定一定数量独立淋巴细胞的面积分布阈值[A1，A2]，Area＜A1的区域予以剔除，Area＞A1的目标区域分为独立淋巴细胞、粘连淋巴细胞、面积较大的污染；

(4)利用灰度阈值，滤除Area＞A1目标区域中的污染区域；

(5)利用面积阈值、圆度阈值和灰度阈值，识别区分独立的淋巴细胞区域和有粘连的淋巴细胞区域；

(6)对于独立的淋巴细胞区域，利用其轮廓内双核的面积比值、圆度值、灰度均值，判别其是否为双核淋巴细胞；

(7)利用圆度阈值和延展度判别出粘连淋巴细胞中的串联细胞，并进行分离，对于并联或串并联的粘连淋巴细胞不予分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述微核图像的微核标本按照中华人民共和国卫生行业标准WS/T187-1999下的《淋巴细胞微核估算受照剂量方法》进行制备；在物镜放大倍数20×，目镜放大倍数10×的普通显微镜下自动采集微核图像，保存为RGB格式。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述面积阈值的上限和下限是统计尺寸为1500pixel×1000pixel微核图像中的一定数量独立淋巴细胞得到的，下限A1＝1000pixel，上限A2＝3500pixel；如果微核图像尺寸改变，则A1和A2的值需按照微核图像面积改变的比例进行调整。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：若需要对所述粘连的淋巴细胞区域进行分离和识别，则需扩大面积上限阈值A2＝8000pixel，从而能保留下粘连的细胞区域；若不需分析粘连细胞区域，则可设置A2＝3500pixel，以将其剔除。

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