CN103994964A - 针对荧光显微图像的凋亡细胞形态的量化分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及凋亡细胞形态的量化分析，为能够有效地从图像中分割出细胞个体，自动计算细胞二维形态学参数，大大缩短图像分析时间，本发明采取的技术方案是，针对荧光显微图像的凋亡细胞形态的量化分析方法，包括如下步骤：1)采集待处理的若干对荧光显微细胞图像；2)对一对图像中的光镜图像运用中值滤波，灰度拉伸，形态学开运算进行图像预处理；3)利用Otsu算法自动寻找阈值；4)获得分割后的二值图像；5)采用形态学膨胀和腐蚀的方法填充孔洞、去除小区域以及边界上不完整的目标；6)对分割后的二值图像根据染色结果判定细胞的状态；7)输出每个细胞的参数计算结果。本发明主要应用于凋亡细胞形态的量化分析方法。

Description

针对荧光显微图像的凋亡细胞形态的量化分析方法

技术领域

本发明涉及一种凋亡细胞形态的量化分析方法，尤其是一种针对荧光显微细胞图像的荧光染色结果和二维形态参数提取，属于显微图像处理及应用技术领域，涉及细胞凋亡的形态学观测领域、凋亡细胞的染色法检测领域、图像增强领域、图像阈值分割领域、图像中目标边缘检测领域、二维形态参数计算领域以及相关领域。具体讲，涉及针对荧光显微图像的凋亡细胞形态的量化分析方法。

技术背景

细胞凋亡(apoptosis)或称程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)，它是不同于细胞坏死(necrosis)的另外一种死亡方式，用来描述具有确定形态学变化的细胞死亡过程，Kerr等人最早定义这一系列形态学变化为细胞凋亡(apoptosis)。细胞凋亡过程是细胞本身在一定的生理或病理条件下，按照自身的程序主动性、生理性的死亡的过程，涉及到一系列基因的激活、表达以及调控作用。凋亡过程主要包括细胞皱缩，染色质凝集，核膜的完整性消失，细胞膜出泡(membrane blebbing)以及细胞DNA断裂，最后形成凋亡小体。凋亡细胞会迅速被邻近的吞噬细胞所吞噬，以避免细胞碎片引起炎症。

细胞凋亡的形态学检测被认为是鉴定细胞凋亡的金标准，但是由观察者进行细胞计数和形态结构的分析不仅容易使观察者眼睛疲劳，而且掺杂了较强的主观因素和缺少客观的定量标准，会产生较大的误差。目前对细胞的形态学特征描述大都通过观察细胞显微图像，进行定性的文字描述，而对细胞的形态特征的量化描述则较为少见，这一点也是高效细胞图像分析的障碍所在。随着技术的不断发展，人们对检测结果的客观性和准确性要求越来越高。

在针对凋亡细胞荧光显微图像的分析中，准确分析形态变化和定量测量形态参数是关键，需要建立针对单个细胞和细胞群的分割与特征提取自动图像处理算法，便于快速、准确地量化分析凋亡细胞的形态特征。

近年来，人们研制了许多用于细胞分析和自动识别的系统，对细胞图象进行自动分析，统计细胞个数和测量各个细胞的有关参数，如面积、周长、体积等。这些细胞分析和自动识别系统减少了主观干扰，减轻了相关人员的工作负担，提高了分析的准确性。根据对一些细胞图像处理相关软件产品的了解发现，它们的算法都涵盖了图像处理的基本方法，而在具体的图像分析中各有侧重，如某些软件和算法在与显微镜配套进行图像读入和图像质量改善方面功能比较强大，而某些的优势在数据分析统计、报表输出等方面。然而通用的图象处理软件只具备一些常见的处理手段，对于一些难于识别的图象信息以及针对一些具体用户需解决的问题，通用软件不能满足要求。且现有的分析方法在面对大样本的细胞图像分析时显得力不从心，要求自主研发出解决方案，或使用有内置算法的商业软件包。目前所使用的商业软件在细胞图像自动分割方面不能达到快速、准确的要求，并没有特别针对凋亡细胞的形态分析，且无法与染色结果相结合进行正常细胞与凋亡细胞的区分和分析。

发明内容

为了克服现有的细胞图像分析方法中无法与染色结果相结合进行正常细胞与凋亡细胞的区分和分析的缺陷，本发明提供一种针对凋亡细胞的二维形态分析方法，该方法不仅能够有效地从图像中分割出细胞个体，自动计算细胞二维形态学参数，无需使用者手动勾画细胞轮廓，大大缩短了图像分析时间，而且能够结合染色结果进行凋亡细胞与正常细胞的分类和计数，提供一种运用形态学特征参数对细胞凋亡状态的量化表达，为细胞图像的处理及凋亡细胞与正常细胞的形态学差异分析提供现代化手段以及更精确的数据。本发明采取的技术方案是，针对荧光显微图像的凋亡细胞形态的量化分析方法，包括如下步骤：

1)采集待处理的若干对荧光显微细胞图像，一对图像中包括一幅光镜图像和一幅用于检测细胞凋亡的三染色荧光图像，图像中包含有正常细胞和凋亡细胞；

2)对一对图像中的光镜图像运用中值滤波，灰度拉伸，形态学开运算进行图像预处理，对一对图像中的荧光图像进行三通道分离，进行灰度拉伸；

3)利用Otsu算法自动寻找阈值，对一对图像进行分割，图像的灰度值在直方图上分为m级，灰度级i的像素数为n_i，则总像素数为各灰度值的概率为p_i＝n_i/N,整体图像的灰度平均值在某一阈值处分割成两组，即C₀＝{1～k}和C₁＝{k+1～m}，分别求得两组的概率(公式1和公式2)和灰度平均值，进而求得两组总的方差见公式(3),阈值的选择为当此方差最大时k的取值见公式(4)：

${\mathrm{\ω}}_0=\underset{i=0}{\overset{k}{\mathrm{\Σ}}}{p}_i=\mathrm{\ω}\left(k\right)---\left(1\right)$

${\mathrm{\ω}}_1=\underset{i=k+1}{\overset{m}{\mathrm{\Σ}}}{p}_i=1-\mathrm{\ω}\left(k\right)---\left(2\right)$

${\mathrm{\σ}}^2\left(k\right)={\mathrm{\ω}}_0{({\mathrm{\μ}}_0-\mathrm{\μ})}^2+{\mathrm{\ω}}_1{({\mathrm{\μ}}_1-\mathrm{\μ})}^2={\mathrm{\ω}}_0{\mathrm{\ω}}_1{({\mathrm{\μ}}_1-{\mathrm{\μ}}_0)}^2=\frac{{[\mathrm{\μ\ω}\left(k\right)-\mathrm{\μ}\left(k\right)]}^2}{\mathrm{\ω}\left(k\right)[1-\mathrm{\ω}\left(k\right)]}---\left(3\right)$

k^*＝arg max_kσ²(k)   (4)

公式(1)中的参数说明如下：

ω₀，ω(k)：C₀组概率；

公式(2)中的参数说明如下：

ω₁，1-ω(k)：C₁组概率；

公式(3)中的参数说明如下：

μ₀：C₀组灰度平均值；

μ₁：C₁组灰度平均值；

μ：整体图像的灰度平均值；

μ(k)：前k级灰度平均值公式(4)中的参数说明如下：

k^*：阈值；

4)通过公式(3)和(4)，计算并获得图像分割的阈值，从而获得分割后的二值图像；

5)对阈值分割后的二值图像，采用形态学膨胀和腐蚀的方法填充孔洞、去除小区域以及边界上不完整的目标；

6)对分割后的二值图像根据染色结果进行正常细胞(只在B通道有染色结果)、早期凋亡细胞(G通道有染色结果但R通道无染色结果)、晚期凋亡细胞(R通道有染色结果)的分类；为了匹配已分类的位于荧光图像细胞核和与其对应的位于光镜图像细胞，计算细胞与其细胞核的中心距离；根据先验知识，在此类图像中细胞与其细胞核的中心距离不大于20个像素，据此条件，搜索到与某个细胞对应的细胞核，由细胞核的染色和分类结果，来判定细胞的状态；

7)对各匹配后的细胞进行参数计算，对各状态下的若干细胞参数进行对比统计分析，输出每个细胞的参数计算结果。

还包括如下步骤：根据多幅图像中正常细胞、早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的计数结果，经统计学处理，以图形或数据方式表达，对凋亡率和整体凋亡状态进行分析；作为其中的分析方法和检测手段，将各状态下的细胞形态学特征参数用统计学方法综合分析，得到各状态下的细胞多参数分析结果，根据其改变量化反映不同状态下细胞的形态学差异，通过图形和数据直观的表达此差异。

与已有技术相比，本发明的技术特点与效果：

本发明的一个优点在于使用阈值法与多种预处理方法结合，分割速度快，无需人为介入，降低细胞形态观察中的主观因素。

本发明的另一个优点在于针对凋亡细胞三染色荧光图像进行自动的染色结果读取和细胞状态分类，便于大量细胞荧光图像的快速处理及凋亡率计算等应用，减少由于观察者经验不同带来的人为判断差异、提高测量数据的一致性。

本发明的另一个优点在于提出了选择合适的描述凋亡细胞特征的参数组合并量化描述凋亡细胞二维形态的方法。

附图说明

图1是本发明一个实施例中一对图像的分割示意图。选用双氧水诱导凋亡的HL-60细胞。图1中101.光镜图像原图，102.光镜图像预处理后图像，103.光镜图像Otsu方法分割后的二值图像，104.光镜图像经过形态学方法处理后的二值图像，111.三荧光图像原图，112.三荧光图像B通道分割后二值图像，113.三荧光图像G通道分割后二值图像，114.三荧光图像R通道分割后二值图像。

图2是本发明一个实施例中一对图像的细胞状态判断示意图。选用双氧水诱导凋亡的HL-60细胞。图2中201.光镜图像原图，202.光镜图像分割后的二值图像，203.三荧光图像原图，204.正常细胞核图像，205.早期凋亡细胞核图像，206.晚期凋亡细胞核图像，207.匹配对应的细胞与细胞核，状态判断结果示意。

图3是本发明一个实施例的其中两个参数统计结果在不同细胞状态下的对比分析。

具体实施方式

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：

针对凋亡细胞二维形态分析方法，包括以下步骤：

1)采集待处理的若干对荧光显微细胞图像，一对图像中包括一幅光镜图像和一幅用于检测细胞凋亡的三染色荧光图像(Hoechst33342，双苯咪唑类核酸染料，可渗透正常细胞膜进入细胞内，染色结果呈蓝色；Annexin V，一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合，染色结果呈绿色；PI，碘化丙啶核酸染料,不能通过正常的细胞膜，只能标记晚期凋亡细胞核，染色结果呈红色)，图像中包含有正常细胞和凋亡细胞。

2)对一对图像中的光镜图像运用中值滤波，灰度拉伸，形态学开运算等方法的结合进行图像预处理。对一对图像中的荧光图像进行三通道分离，进行灰度拉伸。

3)利用Otsu算法自动寻找阈值，对一对图像进行分割。图像的灰度值在直方图上分为m级，灰度级i的像素数为n_i，则总像素数为各灰度值的概率为p_i＝n_i/N,整体图像的灰度平均值在某一阈值处分割成两组，即C₀＝{1～k}和C₁＝{k+1～m}，分别求得两组的概率(公式1和公式2)和灰度平均值，进而求得两组总的方差见公式(3),阈值的选择为当此方差最大时k的取值见公式(4)：

${\mathrm{\ω}}_0=\underset{i=0}{\overset{k}{\mathrm{\Σ}}}{p}_i=\mathrm{\ω}\left(k\right)---\left(1\right)$

${\mathrm{\ω}}_1=\underset{i=k+1}{\overset{m}{\mathrm{\Σ}}}{p}_i=1-\mathrm{\ω}\left(k\right)---\left(2\right)$

${\mathrm{\σ}}^2\left(k\right)={\mathrm{\ω}}_0{({\mathrm{\μ}}_0-\mathrm{\μ})}^2+{\mathrm{\ω}}_1{({\mathrm{\μ}}_1-\mathrm{\μ})}^2={\mathrm{\ω}}_0{\mathrm{\ω}}_1{({\mathrm{\μ}}_1-{\mathrm{\μ}}_0)}^2=\frac{{[\mathrm{\μ\ω}\left(k\right)-\mathrm{\μ}\left(k\right)]}^2}{\mathrm{\ω}\left(k\right)[1-\mathrm{\ω}\left(k\right)]}---\left(3\right)$

k^*＝arg max_kσ²(k)   (4)

公式(1)中的参数说明如下：

ω₀，ω(k)：C₀组概率；

公式(2)中的参数说明如下：

ω₁，1-ω(k)：C₁组概率；

公式(3)中的参数说明如下：

μ₀：C₀组灰度平均值；

μ₁：C₁组灰度平均值；

μ：整体图像的灰度平均值；

μ(k)：前k级灰度平均值公式(4)中的参数说明如下：

k^*：阈值；

4)通过公式(3)和(4)，计算并获得图像分割的阈值，从而获得分割后的二值图像。

5)对阈值分割后的二值图像，采用形态学膨胀和腐蚀的方法填充孔洞、去除小区域以及边界上不完整的目标。

6)对分割后的二值图像根据染色结果进行正常细胞(Hoechst33342+,AnnexinV-,PI-)、早期凋亡细胞(AnnexinV+,PI-)、晚期凋亡细胞(PI+)的分类。为了匹配已分类的细胞核(位于荧光图像)和与其对应的细胞(位于光镜图像)，计算细胞与其细胞核的中心距离。根据先验知识，在此类图像中细胞与其细胞核的中心距离不大于20个像素，据此条件，可以搜索到与某个细胞对应的细胞核，由细胞核的染色和分类结果，来判定细胞的状态。

7)对各匹配后的细胞进行参数计算，对各状态下的若干细胞参数进行对比统计分析。输出每个细胞的参数计算结果。

8)上述细胞形态学分析方法还包括：根据多幅图像中正常细胞、早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的计数结果，经统计学处理，以图形或数据方式表达，对凋亡率和整体凋亡状态进行分析；作为其中的分析方法和检测手段，将各状态下的细胞形态学特征参数用统计学方法综合分析，得到各状态下的细胞多参数分析结果，根据其改变量化反映不同状态下细胞的形态学差异，通过图形和数据直观的表达此差异。

下面结合附图1、附图2、附图3以及表1、表2、表3，以双氧水诱导HL-60细胞凋亡的三次重复实验所得到的3组图像(每组40对图像)的处理分析为例，对本发明进一步说明。

参考附图1，本发明涉及预处理方法与Otsu阈值法及分割后处理等多种方法结合的细胞图像分割。参考附图2，本发明涉及三荧光染色结果读取和细胞凋亡状态判断。参考附图3，本发明涉及不同凋亡状态下细胞形态参数组合统计对比分析。本发明的实施方式不受特定细胞种类的限制，可以被用于任意光学显微镜拍摄的任意类圆细胞光镜图像和荧光图像的处理分析。本发明的实施方式不受特定细胞荧光染料的限制，可被用于任何能够区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞的三种染料的组合，只需将其染色结果转换至RGB三通道即可。

对每一对图像分别进行分割。其过程包括两个部分：光镜图像分割以及三荧光图像分通道分割。按照附图1，对一对图像中的光镜图像(101)运用中值滤波，灰度拉伸，形态学开运算等方法的结合进行图像预处理(102)；利用Otsu算法自动寻找阈值，对预处理后的图像，图附图1中的102进行分割得到二值图像(103)，进而采用形态学膨胀和腐蚀的方法填充孔洞、去除小区域以及边界上不完整的目标，如附图1中的104、附图2中的202。对一对图像中的荧光图像(111)进行三通道分离，灰度拉伸，对RGB三个通道分别进行与光镜图像相同的处理过程，得到其分割结果(112-114)。

对每个细胞进行凋亡状态判断。此过程首先需要进行细胞核染色结果读取。对正常细胞核(Hoechst33342+,AnnexinV-,PI-)，染色结果显示蓝色，荧光图像的三个通道只有B通道能够提取出分割目标；对于早期凋亡细胞(AnnexinV+,PI-)，染色结果显示细胞膜着绿色，细胞核着蓝色，荧光图像的三个通道B通道、G通道能够提取出分割目标，R通道则不能；对晚期凋亡细胞(PI+)，细胞核着红色，因此G通道能够提取出的分割目标均被认为是晚期凋亡细胞核。结合三个通道的提取结果，可以得到正常细胞核(204)、早期凋亡细胞核(205)以及晚期凋亡细胞核(206)。为了匹配已分类的细胞核(位于荧光图像)和与其对应的细胞(位于光镜图像)，计算细胞与其细胞核的中心距离。根据先验知识，在此类图像中细胞与其细胞核的中心距离不大于20个像素，据此条件，可以搜索到与某个细胞对应的细胞核，由细胞核的染色和分类结果，来判定细胞的状态(207)。

在确定每个细胞的细胞膜、细胞核的轮廓以及其凋亡状态后，按照表1所列的二维形态参数计算方法，计算每个细胞的形态参数，输出每个细胞的参数计算结果。

表1.凋亡细胞形态参数

本例中一共分析了3组图像，细胞数和状态分类结果如表2。以人为分类结果作为标准(认为人为分类的结果准确率为100％)，由正确分类的细胞与细胞总数之比计算准确率，此自动分类方法的准确率达到90％以上。

表2.细胞数和状态分类结果

表3中列出了本例中HL-60细胞三个状态下的特征参数统计结果。尽管膜周长、核面积等参数标准差较大，它们仍然具有很大的组间差异(P值小于0.05的单因素方差分析测试)。三种状态下，细胞膜的形状因子的平均值是0.8601，0.6982，0.7228，反映出正常细胞更接近圆形，而早期凋亡细胞膜因为“起泡”和“皱缩”而表现出更不规则的形状。圆度，椭圆度，光滑指数和凹点数量等参数表现出同样的差异。核的参数在不同阶段细胞之间也存在巨大差异，可以看出早期凋亡细胞的核形状比其他两个状态的细胞更接近椭圆。正常细胞各参数的标准偏差较小，反映了正常细胞具有相对稳定的形态，而凋亡细胞则相反。根据ANOVA检验结果，这些参数中，只有细胞的核膜中心距在三种状态下的细胞之间没有显著性差异(ANOVA检验的p值大于0.05)，但可以由它的变化反映出细胞核的边集现象，对于早期凋亡细胞，这一参数的平均值较大时，因为染色质边通常发生在这个阶段。

表3.细胞形态参数统计分析

尽管在本文中使用HL-60细胞图像作为图解说明的示例，但是在本文中公开的图像分析方法基本上可应用于任意类圆细胞图像；所选择的形状参数组合针对HL-60细胞的形态研究具有代表性，可较好地描述其形态特点，也可选择任意形态学参数组合来描述所研究细胞的形态特点。

以上结合附图对本发明的具体实施方式作了说明，仅为本发明优选的实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，本发明的保护范围由随附的权利要求书限定，任何根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种针对荧光显微图像的凋亡细胞形态的量化分析方法，其特征是，包括如下步骤：

1)采集待处理的若干对荧光显微细胞图像，一对图像中包括一幅光镜图像和一幅用于检测细胞凋亡的三染色荧光图像，图像中包含有正常细胞和凋亡细胞；

2)对一对图像中的光镜图像运用中值滤波，灰度拉伸，形态学开运算进行图像预处理，对一对图像中的荧光图像进行三通道分离，进行灰度拉伸；

3)利用Otsu算法自动寻找阈值，对一对图像进行分割，图像的灰度值在直方图上分为m级，灰度级i的像素数为n_i，则总像素数为各灰度值的概率为p_i＝n_i/N,整体图像的灰度平均值在某一阈值处分割成两组，即C₀＝{1～k}和C₁＝{k+1～m}，分别求得两组的概率(公式1和公式2)和灰度平均值，进而求得两组总的方差见公式(3),阈值的选择为当此方差最大时k的取值见公式(4)：

${\mathrm{\ω}}_0=\underset{i=0}{\overset{k}{\mathrm{\Σ}}}{p}_i=\mathrm{\ω}\left(k\right)---\left(1\right)$

${\mathrm{\ω}}_1=\underset{i=k+1}{\overset{m}{\mathrm{\Σ}}}{p}_i=1-\mathrm{\ω}\left(k\right)---\left(2\right)$

${\mathrm{\σ}}^2\left(k\right)={\mathrm{\ω}}_0{({\mathrm{\μ}}_0-\mathrm{\μ})}^2+{\mathrm{\ω}}_1{({\mathrm{\μ}}_1-\mathrm{\μ})}^2={\mathrm{\ω}}_0{\mathrm{\ω}}_1{({\mathrm{\μ}}_1-{\mathrm{\μ}}_0)}^2=\frac{{[\mathrm{\μ\ω}\left(k\right)-\mathrm{\μ}\left(k\right)]}^2}{\mathrm{\ω}\left(k\right)[1-\mathrm{\ω}\left(k\right)]}---\left(3\right)$

k^*＝arg max_kσ²(k)   (4)

公式(1)中的参数说明如下：

ω₀，ω(k)：C₀组概率；

公式(2)中的参数说明如下：

ω₁，1-ω(k)：C₁组概率；

公式(3)中的参数说明如下：

μ₀：C₀组灰度平均值；

μ₁：C₁组灰度平均值；

μ：整体图像的灰度平均值；

μ(k)：前k级灰度平均值公式(4)中的参数说明如下：

k^*：阈值；

4)通过公式(3)和(4)，计算并获得图像分割的阈值，从而获得分割后的二值图像；

5)对阈值分割后的二值图像，采用形态学膨胀和腐蚀的方法填充孔洞、去除小区域以及边界上不完整的目标；

6)对分割后的二值图像根据染色结果进行正常细胞，即只在B通道有染色结果；早期凋亡细胞，即G通道有染色结果但R通道无染色结果；晚期凋亡细胞，即R通道有染色结果的分类；为了匹配已分类的位于荧光图像细胞核和与其对应的位于光镜图像细胞，计算细胞与其细胞核的中心距离；根据先验知识，在此类图像中细胞与其细胞核的中心距离不大于20个像素，据此条件，搜索到与某个细胞对应的细胞核，由细胞核的染色和分类结果，来判定细胞的状态；

7)对各匹配后的细胞进行参数计算，对各状态下的若干细胞参数进行对比统计分析，输出每个细胞的参数计算结果。

2.如权利要求1所述的针对荧光显微图像的凋亡细胞形态的量化分析方法，其特征是，还包括如下步骤：根据多幅图像中正常细胞、早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的计数结果，经统计学处理，以图形或数据方式表达，对凋亡率和整体凋亡状态进行分析；作为其中的分析方法和检测手段，将各状态下的细胞形态学特征参数用统计学方法综合分析，得到各状态下的细胞多参数分析结果，根据其改变量化反映不同状态下细胞的形态学差异，通过图形和数据直观的表达此差异。