CN101633892B - 漏声表面波核酸传感器杂交反应起点的判定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种漏声表面波核酸传感器杂交反应起点的判定方法，将传感器采集的相位信号用正交小波基进行6尺度小波分解，从第1尺度细节信号d1中找出小波变换模极大值点，若该模极大值点在其它5尺度细节信号d2～d6中相似位置均有对应的模极大值点，则判定该点为杂交反应起点；本发明为漏声表面波核酸传感器杂交反应起点的判定提供了一种统一、客观、科学的方法，可以避免传统目测判定中主观因素造成的人为误差，极大地提高传感器的检测准确性、重复性和灵敏度，且具有简便、快速、实时的特点，有着重要的实际应用价值，为后期自动判读软件的编写和传感器的临床应用奠定了坚实的基础。

Description

漏声表面波核酸传感器杂交反应起点的判定方法
技术领域
本发明涉及核酸传感器杂交反应起点的判定方法，特别涉及漏声表面波(leaky surface acoustic wave，LSAW)核酸传感器杂交反应起点的判定方法。
背景技术
随着分子生物学技术的发展，基因快速检测已成为临床病原学早期诊断的重要手段之一。核酸传感器由于具有高效、灵敏、特异、结构小巧、经济实用等特点，将在基因快速检测中发挥重要作用。
LSAW核酸传感器是利用压电晶体的特殊切向(如Y方向切割36度旋转，X方向传播LSAW)激励出LSAW，当LSAW传播路径表面的质量负载发生微小改变即晶体表面固定的探针与靶序列发生杂交反应时，晶体表面的边界条件将发生改变，导致LSAW传播的相位发生相应改变，此时从传感器输出换能器提取的电信号的相位变化，即可敏感地检测出与晶体表面固定的探针发生特异性反应的靶序列。
科学地判定杂交反应的起点和终点是LSAW核酸传感器应用于生物医学检测的基础。只有在正确判定杂交反应起点和终点的前提下，才能得到准确的检测数据，才能准确反映数据本身代表的生物学意义，进而进行各种分析统计。
LSAW核酸传感器杂交反应起始阶段的相位变化既包括靶序列和探针杂交反应所引起的相位变化，又包括加样所引起的相位变化。由于不同操作人员的加样力度和手法差异，传感器相位曲线在杂交反应起始阶段通常呈多样性表现，具体为有加样冲击峰或无加样冲击峰，且没有明显的标志性反应起点，这给杂交反应起点的判定造成较大困难。此外，传统的杂交反应起点的判定主要依靠目测，往往造成检测结果的人为误差，从而极大地影响了检测结果的准确性和重复性。
因此，建立一种简便快速、实时准确的LSAW核酸传感器杂交反应起点的判定方法具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种简便快速、实时准确的LSAW核酸传感器杂交反应起点的判定方法，可以避免目测判定中主观因素造成的人为误差，极大地提高传感器的检测准确性、重复性和灵敏度。
为达到此目的，本发明的LSAW核酸传感器杂交反应起点的判定方法，将传感器采集的相位信号用正交小波基进行6尺度小波分解，从第1尺度细节信号d1中找出小波变换模极大值点，若该模极大值点在其它5尺度细节信号d2～d6中相似位置均有对应的模极大值点，则判定该点为杂交反应起点。
进一步，当传感器采集的相位信号中有加样冲击峰时，采用db5正交小波基进行6尺度小波分解；
进一步，当传感器采集的相位信号中无加样冲击峰时，采用db1正交小波基进行6尺度小波分解。
本发明的有益效果在于：本发明为LSAW核酸传感器杂交反应起点的判定提供了一种统一、客观、科学的方法，可以避免传统目测判定中主观因素造成的人为误差，极大地提高传感器的检测准确性、重复性和灵敏度，且具有简便、快速、实时的特点，有着重要的实际应用价值，为后期自动判读软件的编写和传感器的临床应用奠定了坚实的基础。
附图说明
图1～图3为有加样冲击峰的情况：
图1显示加入靶序列后传感器的相位变化；
图2显示加入靶序列瞬间传感器的相位变化；
图3显示传感器采集的原始相位信号及小波变换后各子代信号频谱。
图4～图6为无加样冲击峰的情况：
图4显示加入靶序列后传感器的相位变化；
图5显示加入靶序列瞬间传感器的相位变化；
图6显示传感器采集的原始相位信号及小波变换后各子代信号频谱。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。
一、实验材料
1、LSAW传感器
在同一块钽酸锂(LiTaO3)晶体上制备检测和参比两个通道，每个通道由一个LSAW谐振器构成；LiTaO3晶体为Y方向切割36度旋转，X方向传播LSAW；金膜和LiTaO3晶体之间是金属铬；叉指换能器是用真空镀膜的方法先在基片表面镀制一层金属膜，再利用光刻技术刻出叉指电极的图形。
2、数据采集系统及相位记录分析软件
使用多功能网络分析仪(日本ADVANTEST公司R3767CG型)采集实验数据；自行研发的相位记录分析软件BSMS 1.0具有实时记录相位变化，自动绘制相位变化趋势图及分析结果等功能。
3、主要试剂
人乳头状瘤病毒(HPV)基因双体肽核酸(bis-PNA)探针序列：5′-SH-(CH2)6-(Lys)3-ttttcttcct-(egl)3-tccttctttt-Lys-3’(SH为巯基，Lys为赖氨酸，egl为linker分子)，由成都川抗派德生物医药科技有限公司合成。
pBR322-HPV18质粒购自ATCC公司；质粒抽提试剂盒购自博大泰克公司；胶回收试剂盒购自Omega公司；限制性核酸内切酶EcoR I购自TaKaRa公司。
PBS缓冲液：Na+浓度为20mmol/L，pH为6.6，含有浓度为1mmol/L的乙二胺四乙酸。piranha液：由质量百分浓度为30％的过氧化氢和浓H2SO4按体积比为1∶3混合而得。
二、实验方法
1、LiTaO3晶振金膜表面的预处理
在LiTaO3晶振金膜表面滴加少许piranha液，浸泡10分钟，超纯水反复清洗，再依次用浓度为1mol/L的NaOH和浓度为1mol/L的HCl各浸泡10分钟，超纯水反复清洗，氮气吹干，备用。
2、LSAW传感器的稳定性检测
将预处理后的LSAW传感器以同轴电缆线联入多功能网络分析仪，室温下检测两个谐振器的插入损耗，将两个谐振器的插入损耗调整至最小。
3、LSAW传感器对HPV基因的实时检测
(1)HPV基因的抽提：pBR322-HPV18质粒含有HPV基因，用质粒抽提试剂盒抽提pBR322-HPV18质粒，所得质粒用EcoR I酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒切胶回收纯化HPV基因，具体操作按试剂盒说明书进行。
(2)HPV基因bis-PNA探针的固定：将LSAW传感器在空气中稳定30分钟后，检测通道和参比通道各加入PBS缓冲液20μL，稳定30分钟，检测通道再加入终浓度为2μmol/L的HPV基因bis-PNA探针5μL，室温下反应1小时使探针固定在金膜表面，吸干溶液，去离子水清洗3次，氮气吹干，备用。参比通道不固定任何探针。
(3)HPV基因的实时检测：将固定有HPV基因bis-PNA探针的LSAW传感器在空气中稳定至平衡，检测通道和参比通道各加入PBS缓冲液20μL，稳定10分钟，再各加入终浓度为100μg/L的HPV基因25μL进行杂交反应，计算机自动采集两个通道的相位变化数据。
三、实验结果及杂交反应起点的判定
在分析LSAW核酸传感器杂交反应起始阶段的信号变化规律时发现，传感器的相位信号为典型的非平稳信号，是由许多不同频率组成的复杂信号。该信号在某一段时间内是连续变化的，这种变化可以分为慢变化(对应低频部分)和快变化(对应高频部分)两部分，慢变化(低频)部分包含了信号的主要信息。非平稳信号的既往研究结果显示，通过小波变换分析信号奇异点可以准确判定信号起点。
数学上称无限次可导函数是光滑的或没有奇异性，若函数在某点有间断或某阶导数不连续，则称函数在此点有奇异性，该点就是奇异点。因此，奇异点即信号中的突变点。
小波变换是时间-频率的局部化分析，它通过伸缩平移运算对信号逐步进行多尺度细化，最终达到高频处时间细分，低频处频率细分，从而可聚焦到信号的任意细节。当小波函数可看作某一平滑函数的一阶导数时，信号小波变换模的局部极值点对应于信号的突变点；当小波函数可看作某一平滑函数的二阶导数时，信号小波变换模的过零点对应于信号的突变点；因此，采用检测小波变换模的局部极值点或过零点的方法可以检测信号的突变点。比较来说，用局部极值点的方法进行检测更具优越性。因此，本发明采用检测小波变换模的局部极值点的方法判定杂交反应的起点。
LSAW核酸传感器是通过叉指换能器采集相位信号。发明人分析大量数据后发现，将叉指换能器采集的相位信号进行多尺度小波分解，各尺度细节信号的波形相似，且信号奇异点也在相似位置同时出现，而噪音的产生是杂乱无章的，其产生的奇异点不会在相似位置同时出现。因此，在多尺度细节信号中相似位置出现且幅度近似的奇异点就是信号的突变点。
一般信号奇异性分为两种情况：一种是信号在某一时刻其幅值发生突变，引起信号的不连续，信号的突变处称为第一类间断点；另一种是信号外观上很光滑，幅值没有发生突变，但是信号的一阶微分有突变产生且一阶不连续，信号的突变处称为第二类间断点。分析LSAW核酸传感器采集的相位信号，可见有加样冲击峰时属于第一种情况，无加样冲击峰时属于第二种情况。
利用小波变换检测信号奇异点时，应选择合适的小波函数和尺度。如果尺度选择太小，则受噪声的影响较大；如果尺度选择过大，则信号突变点所对应的小波变换模极大值的幅度衰减较厉害，将使信号的突变特征不明显甚至消失。
基于上述认识，发明人根据LSAW核酸传感器相位信号响应的特点，用MATLAB 7.0语言编写程序，利用小波变换和小波奇异性检测原理，对传感器采集的相位信号运用正交小波基进行多尺度小波分解以检测杂交反应起点。根据小波变换检测第一类间断点的原理，研究发现，有加样冲击峰时，采用db5小波基进行6尺度小波分解，可以非常清楚地观察到信号的突变点。根据小波变换检测第二类间断点的原理，研究发现，采用db1小波基进行6尺度小波分解，可以非常清楚地观察到信号的突变点。具体结果如下：
1、有加样冲击峰的情况
(1)传感器采集的相位信号
图1显示了加入靶序列后传感器的相位变化，图2显示了加入靶序列瞬间传感器的相位变化，其中，S1～S2段是传感器在加入靶序列前的液相稳定状态，在S2点时加入靶序列进行杂交反应，S2～R1段为加样冲击峰，R1-R2段反映杂交反应的全过程；如图所示，加样冲击力使相位陡降至Q点，随着加样完成，冲击力消失，相位又反弹，由于非特异性吸附的影响，相位不会反弹至S2的高度，而是略低于此高度的R1点；杂交反应实际是在Q-R1段时间内开始，在相位曲线上虽然有明显的杂交反应起始特征，但没有精确的标志性反应起点。
(2)相位信号的小波变换
采用db5小波基对传感器采集的相位信号进行6尺度小波分解，结果如图3所示，其中a6为原始相位信号，d1～d6为小波变换后的各子带信号；从第1尺度细节信号d1中可以看出，相位信号在t＝576秒处具有模极大值点，信号的不连续性相当明显，且其余5尺度细节信号d2～d5也在大致相同的位置清晰地显示出模极大值点。因此，判定该点为杂交反应起点。
2、无加样冲击峰的情况
(1)传感器采集的相位信号
图4显示了加入靶序列后传感器的相位变化，图5显示了加入靶序列瞬间传感器的相位变化，其中，S1-S2段是传感器在加入靶序列前的液相稳定状态，在S2点时加入靶序列进行杂交反应，与图2不同的是，图5在加入靶序列后没有出现明显的加样冲击峰，S2-R段较好地反映了杂交反应的全过程，但在S2-R段曲线上没有出现明显的标志性反应起点。
(2)相位信号的小波变换
采用db1小波基对传感器采集的相位信号进行6尺度小波分解，结果如图6所示，其中a6为原始相位信号，d1～d6为小波变换后对应的各子带信号；从第1尺度细节信号d1中可以看出，相位信号在t＝1339秒处具有模极大值点，信号的不连续性相当明显，其余5尺度细节信号d2～d5也在大致相同的位置清晰地显示出模极大值点。因此，判定该点为杂交反应起点。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (1)

1.漏声表面波核酸传感器杂交反应起点的判定方法，其特征在于：将传感器采集的相位信号用正交小波基进行6尺度小波分解，从第1尺度细节信号d1中找出小波变换模极大值点，若该模极大值点在其它5尺度细节信号d2～d6中相似位置均有对应的模极大值点，则判定该点为杂交反应起点；当传感器采集的相位信号中有加样冲击峰时，采用db5正交小波基进行6尺度小波分解；当传感器采集的相位信号中无加样冲击峰时，采用db1正交小波基进行6尺度小波分解。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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王云霞 等.漏声表面波生物传感器不同检测方法的实验研究.《中华医院感染学杂志》.2008,第18卷(第3期),第349-352页. *

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