CN101625338B

CN101625338B - 一种甾体激素复方片剂的检测方法

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Publication number: CN101625338B
Application number: CN2008100537660A
Authority: CN
Inventors: 李志耕; 刘要强
Original assignee: Tianjin Jinyao Group Co Ltd
Current assignee: Tianjin Jinyao Group Co Ltd
Priority date: 2008-07-07
Filing date: 2008-07-07
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2028-07-07
Also published as: CN101625338A

Abstract

一种甾体激素复方片剂的检测方法，能够检测复方片剂的有效成分地诺孕素和戊酸雌二醇以及有关物质，该方法为利用高效液相色谱法，采用氰基色谱柱，以乙腈和水混和溶媒为流动相，以205～225nm为检测波长，并采用梯度淋洗的方法检测有关物质。

Description

一种甾体激素复方片剂的检测方法

技术领域

本发明涉及一种药物制剂的检测方法，特别是一种甾体激素复方片剂有效成分的检测方法。

背景技术

地诺孕素(dienogest，CAS：65928-58-7)化学式如下图：

地诺孕素是一种混和性孕激素，它具有19-去甲睾丸酮衍生物和孕酮衍生物的职重性质，并且兼具独特的药效学和药动学性质。地诺孕素的内分泌药理学非常理想，它因仅结合于孕激素受体，故无雌激素、抗雌激素和雄激素活性，抗促性腺激素作用(抑制促卵泡激素和黄体激素的分泌)亦很弱。

戊酸雌二醇(estradiol valerate，CAS：979-32-8)分子式如下：

戊酸雌二醇是天然雌二醇的戊酸盐，具有天然雌二醇的药理作用，广泛适用于各种需要补充雌激素的症状。

Schring公司生产的地诺孕素与戊酸雌二醇复方片剂已于2001年在欧洲上市，商品名Climodien，规格为每片含有2mg地诺孕素与2mg戊酸雌二醇，用于治疗更年期综合症。然而对该地诺孕素与戊酸雌二醇复方片剂中两种有效成分的检测方法却并未一同公开。在研制国产地诺孕素与戊酸雌二醇复方片剂的过程中，我们遇到了无法快速高效的检测制得的复方片剂中有效成分含量的问题。现有技术中，Wehrberger，K.等((Centralinst.Microbiol.Exp.Therapy，Ger.Acad.Sci.，Jena GDR-6900，Ger.Dem.Rep.).Anal.Chem.Symp.Ser.，23(Adv.Steroid Anal.′84)，511-18(English)1985)公开了对地诺孕素利用HPLC进行分析的方法，色谱条件采用Lichrosorb RP-18固定相色谱柱，，以甲醇-水(55∶45)作为流动相，然而该文献中并未公开色谱分析时使用检测波长，并且我们发现在该条件下虽然两者能够分离，但戊酸雌二醇的出峰时间过晚，超过了60min，使仪器的利用效率大为降低。姜丽霞(高效液相色谱法测定复方戊酸雌二醇片中戊酸雌二醇和炔诺酮含量，浙江省医学科学院学报，2000年12月；21-21，29)公开了用HPLC在氰基固定相色谱柱上测定复方戊酸雌二醇片中戊酸雌二醇和炔诺酮含量的方法，色谱条件为：色谱柱选用ZORBAX CN(5μm，4.6mm×250mm)，流动相为乙腈∶水(47∶53)，流速为1.0ml/min，检测波长为280nm，AUFS(absorbanceunits full scale，满量程的吸光度单位)为0.32，检测温度为室温，进样量15μL，采用内标法定量，黄体酮为对照品。经过实验我们发现，与戊酸雌二醇的吸收度相比，地诺孕素在该方法的检测波长下吸收度过低，并且用该方法在检测地诺孕素与戊酸雌二醇复方片时我们发现该方法在测定该片剂的有关物质含量时，部分有关物质不能有效检出。陈宗岱等(用高效液相色谱法测定复方己酸孕酮注射液中两组分的含量，药物分析杂志14(6)1994；10-12)公开了利用HPLC测定复方己酸孕酮注射液中戊酸雌二醇和己酸孕酮的方法，色谱条件为：色谱柱采用PORASIL 10μm 3.9mm×30cm，流动相为正己烷-异丙醇(91∶9)，流速为0.6ml/min，检测波长采用280nm，当我们用该文献色谱分析条件用来分析地诺孕素与戊酸雌二醇复方片剂时，却发现，除了吸收度过低外，由于地诺孕素中具有强极性的氰基集团，在该条件下地诺孕素的出峰时间过长，严重影响了分析工作的效率，使得该方法的实用性很差。

发明内容：

为克服现有技术中的上述缺陷，实现用高效液相色谱法测定地诺孕素与戊酸雌二醇复方片剂中活性成分以及有关物质的目的，本发明提供了一种用高效液相色谱法检测地诺孕素与戊酸雌二醇复方片中活性成分含量的技术方案，其特征是所述的分析条件如下：

所用的流动相为乙腈∶水＝70∶30～50∶50(体积比)

所用的色谱柱为采用氰基键合硅胶为填料的色谱柱

检测波长为205～225nm

检测温度为20～40℃，优选在室温下检测(20～30℃)

操作方法为，精密称取片粉适量，用流动相配制成样品浓度(以戊酸雌二醇计)为10～500μg/ml的溶液，量取5～50μL的溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。

如上所述的分析方法，其特征是优选：

所用的流动相为乙腈∶水＝60∶40(体积比)；

用流动相配制成的样品溶液浓度为10～50μg/ml；

进样量为10～50μL。

流速为0.6～1.5ml/min

其中，特别优选：

进样量为20μL。

流速为1ml/min

用流动相配制成的样品溶液浓度(以戊酸雌二醇计)为40μg/ml；

更进一步地，本发明还提供了一种公开了一种用高效液相色谱法同时检测地诺孕素与戊酸雌二醇复方片有效成分含量和有关物质含量的技术方案，其特征是于所述的分析条件如下：

所用的流动相为乙腈与水混和溶媒流动相，采用梯度淋洗方法，梯度程序见下表

时间(min)

乙腈％(v/v)

水％(v/v)

0～10	30～40	60～70
			10～25	70～80	20～30
25～30	30～40	60～70
			30～35	30～40	60～70

所用的色谱柱为采用氰基键合硅胶为填料的色谱柱

检测波长为205～225nm

操作方法为，精密称取样品片粉适量，用流动相配制成浓度(以戊酸雌二醇计)为100～500μg/ml的溶液，量取10～50μL的溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。

如上所述的分析方法，其特征是梯度程序优选：

时间(min)	乙腈％(v/v)	水％(v/v)
			0～10	30	70
10～25	80	20
			25～30	30	70
30～35	30	70

优选样品溶液浓度(以戊酸雌二醇计)为200μg/ml；

色谱仪进样量为20μL。

在确定本发明技术方案所用的检测波长，我们分别对戊酸雌二醇和地诺孕素进行了紫外-可见吸收光谱的检测(见图1和图2)，根据现有技术，应选取吸收度大的波长作为检测波长。从光谱图中可以看出，在现有技术中使用的280nm波长下，地诺孕素的吸收度几乎为零，如果使用该波长进行检测，则地诺孕素基本无法检出。而通过分析谱图，我们发现在205～220nm的波长下，两种有效成分吸收度基本相同，因此在使用该波长范围作为检测波长时，两种有效成分的校正因子基本一致，便于生产过程中对片剂质量的控制，并且通过检测我们发现，在这个波长范围内两种有效成分的线性范围都足以满足检测需要。此外，在实验中我们意外地发现，在检测制得片剂的有关物质含量时，在其它条件相同时，只有采用205～225nm的检测波长才能检测出所有的杂质种类，并且由于在此波长下，作为有效成分的地诺孕素和戊酸雌二醇的吸收度相近，同时，我们意外发现，各种杂质在该检测波长下也具有和有效成分相近的吸收度，因此我们选定205～225nm为本发明技术方案中所用的检测波长。

附图说明：

图1：戊酸雌二醇紫外-可见吸收光谱图

图2：地诺孕素紫外-可见吸收光谱图

图3：实施例1所得液相色谱图

图4：实施例2所得液相色谱图

图5：实施例3所得液相色谱图

图6：实施例4所得液相色谱图

图7：实施例5所得液相色谱图

图8：实施例6所得液相色谱图

具体实施方式

本部分公开是具体实施例是为了更好的实现本发明的技术方案，不能解释为对本发明实施方式的限制。

在本部分的实施例采用的设备如下

色谱仪型号：岛津(shimadzu)LC-10A

检测器型号：SPD-10A紫外检测器

色谱柱CN-3 inertsil φ4.6×250mm，5μm。

自制复方片剂每片含有2mg戊酸雌二醇和2mg地诺孕素

供试液配制方法：精密量取样品片粉适量，加流动相溶解，配制成适当浓度(以戊酸雌二醇计)的溶液。

外标法标准溶液配制：精密量取地诺孕素与戊酸雌二醇标准品(含量＞99.5％)，分别用流动相配制成一定浓度的标准溶液，制作标准曲线，在本发明技术方案所涉及的浓度范围内，两种活性成分的标准曲线都具有很好的线性。

称取自制复方片剂所用辅料适量，用流动相溶解、过滤，量取20μL注入液相色谱仪，图谱显示辅料在此色谱条件下，无色谱峰出现，不干扰主药测定。

在测定自制复方片剂的有关物质时，采用主成分自身对照法，计算有关物质含量。所述主成分自身对照法即当杂质峰面积与成分峰面积相差悬殊时，所采用的有关物质测定方法。在测定前，先将供试品稀释成一定浓度的溶液作为对照溶液，进样，调节检测器的灵敏度或进样量，使对照溶液中的主成分色谱峰面积满足准确测量要求。测量时记录时间应为主成分保留时间的倍数。根据测得的供试品溶液的各杂质峰面积及其总和并与对照溶液主成分的峰面积比较，计算有关物质限度。

实施例1：(有效成分测定)

检测波长220nm 流速1.0ml/min

进样量20μL 供试液浓度40μg/ml 流动相乙腈∶水＝60∶40

检测方法：将供试液注入色谱仪，记录谱图，谱图见图3，其中地诺孕素保留时间为4.510min，戊酸雌二醇保留时间为7.475min。

实施例2：(有效成分测定)

检测波长：205nm 流速0.8ml/min

进样量15μL 供试液浓度20μg/ml 流动相乙腈∶水＝70∶30

检测方法：检测方法：将供试液注入色谱仪，记录谱图，谱图见图4，其中地诺孕素保留时间为3.927min，戊酸雌二醇保留时间为4.683min。

实施例3(有效成分测定)

检测波长：210nm 流速1.2min/L

进样量40μL 供试液浓度40μg/min流动相乙腈∶水＝50∶50

检测方法：将供试液注入色谱仪，记录谱图，谱图见图5，其中地诺孕素保留时间为4.702min，戊酸雌二醇保留时间为8.943min。

实施例4(有关物质测定)

供试液浓度 200μg/ml

其它初始条件如实施例1

梯度程序如下：

检测方法：将供试液注入色谱仪，按照梯度程序进行色谱分析，记录谱图，采用主成分自身对照法来确定有关物质含量。谱图见图6，其中地诺孕素保留时间为8.382min，戊酸雌二醇保留时间为23.586min。

实施例5(有关物质测定)

供试液浓度 300μg/ml

初始条件如实施例2

梯度程序如下：

时间(min)	乙腈％(v/v)	水％(v/v)
			0～10	35	65
10～25	75	25
			25～30	35	65
30～35	35	65

检测方法同实施例4，谱图见图7，其中地诺孕素保留时间为7.918min，戊酸雌二醇保留时间为23.986min。

实施例6(有关物质测定)

供试液浓度 400g/ml

初始条件如实施例5

梯度程序如下

时间(min)	乙腈％(v/v)	水％(v/v)
			0～10	40	60
10～25	30	70
			25～30	40	60
30～35	40	60

检测方法同实施例4，谱图见图8，其中地诺孕素保留时间为7.518min，戊酸雌二醇保留时间为24.168min。

注：实施例4-6采用同样的供试液。

Claims

1.一种地诺孕素与戊酸雌二醇复方片剂中活性成分含量的检测方法，其特征是采用高效液相色谱分析，色谱条件如下：

所用的流动相为乙腈∶水＝70∶30～50∶50，体积比；

所用的色谱柱为采用氰基键合硅胶为填料的色谱柱；

检测波长为205～225nm；

检测温度为20～40℃。

2.如权利要求1所述的色谱分析方法，其特征是

所用的流动相为乙腈∶水＝60∶40，体积比。

3.如权利要求2所述的色谱分析方法，其特征是：

用流动相配制成的供试液浓度以戊酸雌二醇计为10～50μg/ml；

进样量为10～50μL，流速为0.6～1.5ml/min。

4.如权利要求1至3中任一所述的色谱分析方法，其特征是：

所用的流动相为乙腈∶水＝70∶30，体积比。

5.如权利要求1至3中任一所述的色谱分析方法，其特征是：

所用的流动相为乙腈∶水＝50∶50，体积比。

6.一种地诺孕素与戊酸雌二醇复方片剂中活性成分和有关物质含量的检测方法，其特征是采用高效液相色谱分析，色谱条件为：

采用所用的色谱柱为采用氰基键合硅胶为填料的色谱柱；

检测波长为205～225nm；

检测温度为20～40℃；

并采用梯度淋洗程序如下：

时间，min 乙腈％，v/v 水％，v/v 0～10 30～40 60～70 10～25 70～80 20～30 25～30 30～40 60～70 30～35 30～40 60～70

。

7.如权利要求6所述的色谱分析方法，其特征是梯度程序优选：

时间，min 乙腈％，v/v 水％，v/v 0～10 30 70 10～25 80 20 25～30 30 70 30～35 30 70

。

8.如权利要求6所述的色谱分析方法，其特征是梯度程序优选：

时间，min 乙腈％，v/v 水％，v/v 0～10 35 65 10～25 75 25 25～30 35 65 30～35 35 65

。

9.如权利要求6至8中任一所述的色谱分析方法，其特征是用流动相配制成的供试液浓度以戊酸雌二醇计为100-500μg/m1；进样量为10～50μL，流速为0.6～1.5ml/min。