CN101619353A - 将单分子dna连接到单个磁珠上的方法 - Google Patents

Abstract

一种生物技术领域的将单分子DNA连接到单个磁珠上的方法：将DNA荧光标记，之后进行如下操作：在DNA的3’端标记生物素，5’端标记地高辛；或者在DNA的3’端标记地高辛，5’端标记生物素；将DNA置于玻璃上进行免疫反应，流水洗涤；再进行第二次免疫反应；将DNA内切酶加到磁珠周围，待DNA分子被降解后，用微枪尖逐一收集携带片段DNA的磁珠，并将其置于磁铁上；利用内切酶切割目的DNA，在连接酶作用下，将目的DNA片段与磁珠上的DNA片段连接。本发明的方法可以获得目的片段序列信息；可实现DNA的单分子测序；将纳米孔制作成阵列，与诱饵阵列配合，可提高测序通量。

Description

将单分子DNA连接到单个磁珠上的方法

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的DNA处理方法，具体是一种将单分子DNA连接到单个磁珠上的方法。

背景技术

单分子测序的基本操作是：用一个带有单个纳米孔传感器的薄膜将电泳槽分为两极，在负极电泳液中，将一条被测核酸片段的一端固定在一个支持物上，用核酸外切酶从自由端逐个降解核酸的组分(4种碱基)，它们在中性至微碱性pH下带负电荷，在外加电场作用下，被释放的碱基按原来在核酸上的顺序依次从负极向正极移动时通过纳米孔，因4种碱基的分子量和三维结构不同，所以，在穿越纳米孔时，对离子流的阻碍程度和穿越时间就会不同，膜片钳记载各碱基留下的特异性电信号-“笔迹”，从而获得目的片段的序列信息。但如何有效地将目的片段放置到电泳槽中，一直没有非常有效的方法。

经对现有文献检索发现，Dapprich，J.&Nicklaus等在《生物成像》上发表了“通过监控珠子移位将DNA连接到被光学捕获在微结构的珠子上”一文(Dapprich，J.&Nicklaus，N.DNA attachment to optically trapped beadsin microstructures monitored by bead displacement.Bioimaging 6：25～32(1998))，文中评述：他们的研究结果可获得一个磁珠只连接一个核酸片段。但该方法需要光学镊等设备，步骤比较繁琐，效率也比较低。因此，本发明要要解决的技术问题是如何方便地将目的片段固定，进而放置到电泳槽中。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种将单分子DNA连接到单个磁珠上的方法。本发明的方法可以获得目的片段序列信息，与阵列技术结合，可以提高测序通量；可实现DNA的单分子测序；将纳米孔制作成阵列，与诱饵阵列配合，可提高测序通量。

本发明是通过以下技术方案实现的，

本发明涉及一种将单分子DNA连接到单个磁珠上的方法，包括如下步骤：

步骤一，将DNA荧光标记，之后进行如下操作：在DNA的3’端标记生物素，5’端标记地高辛；或者在DNA的3’端标记地高辛，5’端标记生物素；

步骤二，将DNA置于表面用抗地高辛被覆的玻璃上进行免疫反应，流水

；或将DNA置于表面用抗链霉生物素被覆的玻璃上进行免疫反应，流水洗涤；

步骤三，如果步骤二是地高辛-抗地高辛免疫反应，则将抗链霉生物素被覆的磁珠添加到玻璃表面，进行第二次免疫反应；如果步骤二是生物素-抗链霉生物素免疫反应，则将抗地高辛被覆的磁珠添加到玻璃表面，进行第二次免疫反应；

步骤四，将DNA内切酶加到磁珠周围，待DNA分子被降解后，用微枪尖逐一收集携带短片段DNA的磁珠，并将其置于磁铁上；

步骤五，利用DNA内切酶切割目的DNA，在连接酶作用下，将目的DNA片段与磁珠上的DNA片段连接。

步骤一中，所述荧光标记为花青类染料、吲哚类染料、咪唑类染料、菲锭类染料或双链DNA染料。

步骤一中，所述荧光标记为YOYO-1、溴化乙锭、Hoechst 33342或7-AAD。

步骤三中，所述磁珠为微米磁珠或纳米磁珠。

步骤四中，在加入DNA内切酶前，利用磁棒旋转磁珠，去除连接≥2条DNA分子的磁珠。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：用高分辨率纳米孔作传感器，在保持被外切酶释放的碱基按顺序进入纳米孔条件下，可以获得目的片段序列信息，与阵列技术结合，可以提高测序通量。将携带目的片段的磁珠，用电磁力、光学镊或纳米定位器控制住DNA的行进速度，与纳米孔结合，可实现DNA的单分子测序；将纳米孔制作成阵列，与诱饵阵列配合，可提高测序通量。

附图说明

图1为核酸单分子操作示意图。

具体实施方式

以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

步骤一，将DNA用YOYO-1荧光标记，之后在DNA的3’端标记生物素，5’端标记地高辛；

步骤二，将DNA置于表面用抗地高辛被覆的玻璃上，使DNA的5’端与玻璃表面的抗地高辛发生免疫反应而固定在表面，流水洗去未被固定的DNA分子；

步骤三，将抗链霉生物素被覆的微米或纳米磁珠添加到玻璃表面，使磁珠上的抗链霉生物素与DNA的3’端的生物素发生免疫反应，流水洗去未与DNA连接的自由磁珠；此时，玻璃表面上的DNA分子，3’端与玻璃表面连接，5’端与磁珠连接；

步骤四，用微枪头吸取适量DNA内切酶混合液，在荧光显微镜辅助下，将酶切混合液加到磁珠周围，待DNA分子被降解后，用微枪尖收集携带一个短片段λDNA的磁珠，并将其置于磁铁上，这种带有粘性末端的DNA-磁珠复合物将用作“诱饵”，连接目的DNA片段；可进一步将这种诱饵与目的片段连接的复合物制作成陈列；

步骤五，将待研究的基因组DNA用同与步骤四相同的DNA内切酶切割，产生可与诱饵上粘性末端互补的粘性末端，在T4连接酶作用下，将一个基因组DNA片段与诱饵的DNA连接。

选用以下两种方法中的任何一种进行检测：

(1)用携带一个纳米孔的薄膜将电泳槽两极隔开，使两极之间的离子交换只能通过纳米孔进行，将dsDNA与dsDNA外切酶绑定，清洗后固定于负极盛有无镁离子的酶切缓冲液的电泳槽中，打开膜片钳，当添加镁离子激活内切酶时，记载被释放出的核苷酸穿越纳米孔的事件数，即外切酶酶活性(碱基数/秒)。用高分辨率纳米孔作传感器，使被外切酶切割而释放的核苷酸按原顺序进入纳米孔，由于各个碱基的分子量和三维结构不同，都会留下自己独特的电信号，即对离子流的阻碍程度和穿孔时间，这样再将电信号转换为序列信息，实现外切酶辅助的纳米孔测序。将纳米孔制作成与步骤四相匹配的阵列，可以提高测序通量；

(2)用带有一个单纳米孔的薄膜将电泳槽两极隔开，使两极电泳缓冲液之间的离子交换只能通过纳米孔进行，将带有目的DNA片段的磁珠复合物做变性处理，可以用化学变性剂如尿素或甲酰胺，也可以高温变性，使磁珠只携带一个单链DNA片段，将它置于负极，在外加电场作用下，带负电荷的DNA分子被电场牵引向正极移动，用电磁力、光学镊或纳米定位器控制住DNA的行进速度，先使DNA自由端进入纳米孔，并按约1碱基/ms或更慢的速度穿越纳米孔，所制作的纳米孔深度在亚纳米级，即纳米孔的深度等于或小于相邻碱基间的距离。由于DNA上碱基的大小和三维结构不同，穿越纳米孔时对离子流产生的阻力也不同，膜片钳记载每一个碱基穿越纳米孔时留下的电信号，最后，将电信号转换为序列信息，实现DNA的单分子测序。将纳米孔制作成阵列，与诱饵阵列配合，以提高测序通量。

本实施例的结果：用膜片钳结合纳米孔检测3’→5’和5’→3’切割方向的dsDNA外切酶活性，能在单分子水平上适时监测外切酶的活性，精确获得外切酶的切割速度。用高分辨率纳米孔作传感器，在保持被外切酶释放的碱基按顺序进入纳米孔条件下，可以获得目的片段序列信息，与阵列技术结合，可以提高测序通量。将携带目的片段的磁珠，用电磁力、光学镊或纳米定位器控制住DNA的行进速度，与纳米孔结合，可实现DNA的单分子测序。将纳米孔制作成阵列，与诱饵阵列配合，以提高测序通量。

实施例2

步骤一，将DNA用溴化乙锭进行荧光标记，之后将其3’端用生物素标记，5’端用地高辛标记；

步骤二，将DNA置于表面用抗链霉生物素被覆的玻璃上，使DNA的3’端生物素与玻璃表面的抗链霉生物素发生免疫反应而固定在表面，流水洗去未被固定的DNA分子；

步骤三，将抗地高辛被覆的微米或纳米磁珠添加到玻璃表面，使磁珠上的抗地高辛与DNA的5’端的地高辛发生免疫反应，流水洗去未与DNA连接的自由磁珠。此时，玻璃表面上的DNA分子，5’端与玻璃表面连接，3’端与磁珠连接。只有极少数的磁珠与一条以上DNA分子连接，可以通过磁棒旋转磁珠而加以鉴别，因为单一DNA分子在旋转磁珠时没有明显位移，而连接一条以上DNA分子的磁珠将会发生明显的位移缩短；

步骤四，用微枪头吸取适量DNA内切酶混合液，在荧光显微镜辅助下，将酶切混合液加到磁珠周围，待DNA分子被降解后，用微枪尖收集携带一个短片段λDNA的磁珠，并将其置于磁铁上，这种带有粘性末端的DNA-磁珠复合物将用作“诱饵”，连接目的DNA片段。诱饵可以制作成阵列，提高检测通量；

步骤五，将待研究的基因组DNA用与收集诱饵时相同的内切酶切割，产生可与诱饵上粘性末端互补的粘性末端，在T4连接酶作用下，将一个基因组DNA片段与诱饵的DNA连接。

检测方法同实施例1。

实施效果：用膜片钳结合纳米孔检测3’→5’和5’→3’切割方向的dsDNA外切酶活性，能在单分子水平上适时监测外切酶的活性，精确获得外切酶的切割速度。用高分辨率纳米孔作传感器，在保持被外切酶释放的碱基按顺序进入纳米孔条件下，可以获得目的片段序列信息，与阵列技术结合，可以提高测序通量。将携带目的片段的磁珠，用电磁力、光学镊或纳米定位器控制住DNA的行进速度，与纳米孔结合，可实现DNA的单分子测序。将纳米孔制作成阵列，与诱饵阵列配合，以提高测序通量。

实施例3

步骤一，将DNA用Hoechst 33342进行荧光标记，之后3’端用地高辛标记，5’端用生物素标记；

步骤二，将DNA置于表面用抗地高辛被覆的玻璃上，使DNA的3’端地高辛与玻璃表面的抗地高辛发生免疫反应而固定在表面，流水洗去未被固定的DNA分子；

步骤三，将抗链霉生物素被覆的微米或纳米磁珠添加到玻璃表面，使磁珠上的抗链霉生物素与DNA的5’端的生物素发生免疫反应，流水洗去未与DNA连接的自由磁珠。此时，表面上的DNA分子，3’端与玻璃表面连接，5’端与磁珠连接；

步骤四，用微枪头吸取适量DNA内切酶混合液，在荧光显微镜辅助下，将酶切混合液加到磁珠周围，待DNA分子被降解后，用微枪尖收集携带一个短片段λDNA的磁珠，并将其置于磁铁上，这种带有粘性末端的DNA-磁珠复合物将用作“诱饵”，连接目的DNA片段；

步骤五，将待研究的基因组DNA用与收集诱饵时相同的内切酶切割，产生可与诱饵上粘性末端互补的粘性末端，在T4连接酶作用下，将一个基因组DNA片段与诱饵的DNA连接。

检测方法同实施例1。

实施效果：用膜片钳结合纳米孔检测3’→5’和5’→3’切割方向的dsDNA外切酶活性，能在单分子水平上适时监测外切酶的活性，精确获得外切酶的切割速度。用高分辨率纳米孔作传感器，在保持被外切酶释放的碱基按顺序进入纳米孔条件下，可以获得目的片段序列信息，与阵列技术结合，可以提高测序通量。将携带目的片段的磁珠，用电磁力、光学镊或纳米定位器控制住DNA的行进速度，与纳米孔结合，可实现DNA的单分子测序。将纳米孔制作成阵列，与诱饵阵列配合，以提高测序通量。

实施例4

步骤一，将DNA用7-AAD进行荧光标记，之后3’端用地高辛标记，5’端用生物素标记；

步骤二，将DNA置于表面用抗链霉生物素被覆的玻璃上，使DNA的5’端生物素与玻璃表面的抗链霉生物素发生免疫反应而固定在表面，流水洗去未被固定的DNA分子；

步骤三，将抗地高辛被覆的微米或纳米磁珠添加到玻璃表面，使磁珠上的抗地高辛与DNA的3’端的地高辛发生免疫反应，流水洗去未与DNA连接的自由磁珠。此时，表面上的DNA分子，5’端与玻璃表面连接，3’端与磁珠连接；

步骤四，用微枪头吸取适量DNA内切酶混合液，在荧光显微镜辅助下，将酶切混合液加到磁珠周围，待DNA分子被降解后，用微枪尖收集携带一个短片段λDNA的磁珠，并将其置于磁铁上，这种带有粘性末端的DNA-磁珠复合物将用作“诱饵”，连接目的DNA片段；

步骤五，将待研究的基因组DNA用与收集诱饵时相同的内切酶切割，产生可与诱饵上粘性末端互补的粘性末端，在T4连接酶作用下，将一个基因组DNA片段与诱饵的DNA连接。

检测方法同实施例1。

实施效果：用膜片钳结合纳米孔检测3’→5’和5’→3’切割方向的dsDNA外切酶活性，能在单分子水平上适时监测外切酶的活性，精确获得外切酶的切割速度。用高分辨率纳米孔作传感器，在保持被外切酶释放的碱基按顺序进入纳米孔条件下，可以获得目的片段序列信息，与阵列技术结合，可以提高测序通量。将携带目的片段的磁珠，用电磁力、光学镊或纳米定位器控制住DNA的行进速度，与纳米孔结合，可实现DNA的单分子测序。将纳米孔制作成阵列，与诱饵阵列配合，以提高测序通量。

Claims (5)

1、一种将单分子DNA连接到单个磁珠上的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，将DNA荧光标记，之后进行如下操作：在DNA的3’端标记生物素，5’端标记地高辛；或者在DNA的3’端标记地高辛，5’端标记生物素；

步骤二，将DNA置于表面用抗地高辛被覆的玻璃上进行免疫反应，流水洗涤；或将DNA置于表面用抗链霉生物素被覆的玻璃上进行免疫反应，流水洗涤；

步骤三，如果步骤二是地高辛-抗地高辛免疫反应，则将抗链霉生物素被覆的磁珠添加到玻璃表面，进行第二次免疫反应；如果步骤二是生物素-抗链霉生物素免疫反应，则将抗地高辛被覆的磁珠添加到玻璃表面，进行第二次免疫反应；

步骤四，将DNA内切酶加到磁珠周围，待DNA分子被降解后，用微枪尖逐一收集携带短片段DNA的磁珠，并将其置于磁铁上；

步骤五，利用DNA内切酶切割目的DNA，在连接酶作用下，将目的DNA片段与磁珠上的DNA片段连接。

2、根据权利要求1所述的将单分子DNA连接到单个磁珠上的方法，其特征是，步骤一中，所述荧光标记为花青类染料、吲哚类染料、咪唑类染料、菲锭类染料或双链DNA染料。

3、根据权利要求2所述的将单分子DNA连接到单个磁珠上的方法，其特征是，步骤一中，所述荧光标记为YOYO-1、溴化乙锭、Hoechst 33342或7-AAD。

4、根据权利要求1所述的将单分子DNA连接到单个磁珠上的方法，其特征是，步骤三中，所述磁珠为微米磁珠或纳米磁珠。

5、根据权利要求1所述的将单分子DNA连接到单个磁珠上的方法，其特征是，步骤四中，在加入DNA内切酶前，利用磁棒旋转磁珠，去除连接≥2条DNA分子的磁珠。