CN101606481B

CN101606481B - 鹅观草属植物无菌萌发方法

Info

Publication number: CN101606481B
Application number: CN2009100545750A
Authority: CN
Inventors: 解继红; 徐柱; 于靖怡; 陈立波; 刘雅学; 田青松; 李临杭; 马玉宝; 任卫波; 戴雅婷; 陈景芋; 马邢甲
Original assignee: Grassland Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Grassland Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2009-07-09
Filing date: 2009-07-09
Publication date: 2011-03-16
Anticipated expiration: 2029-07-09
Also published as: CN101606481A

Abstract

本发明属于生物技术领域，特别涉及鹅观草属植物种子无菌萌发与培育方法。本发明的生产方法包括：种子预处理：选择饱满，未受病虫害的种子，用自来水冲洗15-20min后放置在2-4℃条件下用无菌水浸种12-30h；之后，外植体消毒：将上述经过预处理的种子剥掉内外稃，用75％酒精消毒25-40秒，之后，用无菌水清洗3次，再用0.1％升汞溶液消毒1-4分钟，再用无菌水清洗5次，再用无菌滤纸吸干种子表面的水分，随之接种到固体培养基，培养基为MS或1/2MS培养基；之后，先在暗箱培养，待芽长至1-2厘米时，改用光照培养，之后，壮苗培养：待苗长至8-10厘米高时，转置1/2MS培养基，使苗高保持在10±2cm。本发明提高了鹅观草属植物萌发能力，发芽指数从14.48提高到42.06，获得整齐一致的无菌苗，满足鹅观草属植物种子栽培及遗传育种实验的需求。

Description

鹅观草属植物无菌萌发方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及鹅观草属植物种子无菌萌发与培育方法。

背景技术

鹅观草属Roegneria是C.Koch于1848年以高加索鹅观草R.caucasica C.Koch为模式种建立的，是小麦族中最大的属。全世界约有130余种。鹅观草属是一类具温寒特性的植物，具有广布性，集中在亚洲、欧洲和北美洲，其东界可到达北美北部的巴芬岛，西界可伸至大西洋海滨，北界已濒临北冰洋沿岸，南界扩展到了我国的滇、桂、台地区及美国西部的落基山脉。鹅观草属在我国约有70余种，从海平面之下-30米的吐鲁番盆地到海拔5500米的喜马拉雅山脊均有分布(西北植物学报，2002年22(4)，鹅观草属的地理分布，蔡联炳)，个别种类能在比较极端的环境下生存，因此，鹅观草属植物具有很强的适应能力，加之该属植物营养丰富，质地柔软，茎叶茂盛，适口性好，且具有多花多粒、耐湿等特性，是各类家畜夏秋放牧，冬春补饲的优良牧草。万永芳等用单花和多花注射接种法对小麦近缘野生植物16个属80个种276份材料进行了抗赤霉病鉴定和分析，结果表明鹅观草属对赤霉病既高抗侵入又高抗扩展，抗病性显著最强，该实验证明鹅观草属植物具有抗赤霉病特性，在随后的研究中，很多作物育种工作者将鹅观草属植物作为远缘杂交母本以期获得抗赤霉病杂种，近年来，随着染色体工程技术的发展，一些鹅观草属植物的优良基因已成功的导入小麦和大麦中，为麦类作物的改良提供了优质的中间材料。南京农业大学利用鹅观草、纤毛鹅观草和小麦杂交合成了普通小麦-鹅观草二体附加系、普通小麦-纤毛鹅观草二体附加系。鹅观草属植物还具有生态功能，它可以涵养水源，防风固沙，调节小气候，在改善生态环境中起着重要作用(草业科学，2007，24卷，4期，小麦族鹅观草属植物研究进展，肖海峻)。总之，无论从饲用价值、育种价值还是从生态价值考虑，鹅观草属植物都是表现优良的物种，值得引起人们的重视。

在此研究背景下，发明人发现鹅观草属植物种子粒小，营养成分储藏少，休眠度高，发芽不一致，若想得到整齐一致的无菌苗存在很多困难。目前，无菌播种、萌发技术已经成功应用于花卉、药材等根茎类植物中，若将现有技术应用在鹅观草属植物中存在很多不足：首先，由于鹅观草属植物种皮结构致密，难点之一就是消毒，按照已有的方法如已经获得专利的兰属植物种子无菌萌发与植株培育方法，专利号：200510010764；大豆转基因中子消毒处理方法，专利号：02150780.5，用以上消毒方法都不适合鹅观草属植物，不是种子消毒不彻底，大量材料被污染，就是消毒剂处理时间太长，会对种子造成毒害作用，出现畸形苗；其次不能解决萌发不一致的问题，在试验中发现接入到培养基的种子有好多不萌发，无法得到整齐一致的无菌苗。

发明内容

本发明的目的是利用无菌播种技术，获得整齐一致的鹅观草属植物无菌苗材料。

本发明目的实现由以下技术方案完成：

生产方法的步骤如下：

1)种子预处理：选择饱满，未受病虫害的种子，用自来水冲洗15-20min后放置在2-4℃条件下用无菌水浸种12-30h；之后，

2)外植体消毒：将上述经过预处理的种子剥掉内外稃，用75％酒精消毒25-40秒，之后，用无菌水清洗3次，再用0.1％升汞溶液消毒1--4分钟，再用无菌水清洗5次，再用无菌滤纸吸干种子表面的水分，随之接种到固体培养基，培养基为MS或1/2MS培养基；之后，

3)先在暗箱培养，待芽长至1-2厘米时，改用光照培养，之后，

4)壮苗培养：待苗长至8-10厘米高时，转置1/2MS培养基，使苗高保持在10±2cm。

在步骤1)中将选好的种子先用自来水冲洗15-20min后，然后在4℃条件下用无菌水浸种24h；在步骤2)中，用75％酒精消毒30秒，之后，再用0.1％升汞溶液消毒3分钟，之后，在接种到固体培养基接种时种胚朝上方向，种胚面裸露于空气中；在步骤3)中，接种后，暗箱培养，待芽长至1-2厘米后，改用每天12小时光照培养，光照培养条件为：温度23-27℃，相对湿度30-50％，每天光照12小时，培养基PH5.8，琼脂7g/L；在步骤4)中，待苗长至8-10厘米高时，转置1/2MS培养基，15天剪苗，使苗高保持在10cm。

本发明和现有技术比较具有的优点：一是，消毒方法：本发明首先将种子低温浸种后，再剥掉种皮，这样避免了种皮结构致密复杂导致消毒不彻底这一问题，然后采用0.1％升汞溶液进行消毒，升汞有剧毒，消毒时间长对种子有毒害作用，所以本发明剥掉种皮，使得消毒时间缩短且消毒彻底，升汞的消毒效果好于其他消毒剂如次氯酸钠，本发明中，鹅观草属种子污染率为0；二是，萌发能力：本发明低温浸种12-30小时，打破其休眠，在接种时注意种胚向上且不把整个种子埋于培养基中，并为不同的鹅观草属植物种子选择了相应的最佳培养基，这样克服了鹅观草属植物传统萌发存在的发芽不一致问题，提高了萌发能力，发芽指数从14.48提高到42.06，可以获得整齐一致的无菌苗，满足鹅观草属植物种子栽培及遗传育种实验的需求；三是，幼苗生长：本发明采用暗箱培养诱导萌发，萌发后待芽长至1-2厘米时(需要一周左右)，采用每天12小时光照培养，待苗长至8-10厘米高时(培养2周时间左右)，将培养基换为1/2MS培养基，该培养基有助于鹅观草属植物种子生根和壮苗，在幼苗培养过程中每半个月左右定期剪苗，使苗高保持在10cm左右，从而促进其分蘖，克服出现弱苗现象，提高幼苗移栽后的存活率。

附图说明

图1本发明工艺框图。

具体实施方案

以下结合附图通过实施例对本发明技术内容及相关技术做进一步详述，但本发明的技术并不局限于此。

实施例一：

材料来源：采集于内蒙古呼和浩特市清水河县鹅观草属05-68材料，在资源圃内培育，种子腊熟期收种。

培养方法：

1、种子预处理：选择饱满，未受病虫害的种子，用自来水冲洗15-20min后放置在4℃条件下用无菌水浸种24h；

2、外植体消毒：将上述经过预处理的种子剥掉种皮，先用75％酒精消毒30秒，无菌水清洗3次，再用0.1％升汞溶液消毒3分钟，无菌水清洗5次，最后用无菌滤纸吸干种子表面的水分，接种到固体培养基；培养基：MS培养基，将种子种胚朝上方向接种；

3、培养条件：在整个培养过程中，种子无菌萌发采用暗箱培养，待芽长至1-2厘米时(需要1周左右)，采用光照培养，培养条件为：温度23-27℃，相对湿度30-50％：每天光照12小时，培养基PH5.8，琼脂7g/L；

4、壮苗培养：待苗长至8-10厘米高时(培养2周时间左右)，转置1/2MS培养基，定期剪苗(半个月左右)，使苗高保持在10cm左右，促使其生根，分蘖并达到壮苗效果。

实施例二：

材料来源：采集于山西省偏关鹅观草属05-28材料，在资源圃内培育，种子腊熟期收种。

与实施例1的区别是，在步骤1，选择饱满，未受病虫害的种子，用自来水冲洗15min后放置在4℃条件下用无菌水浸种12h；步骤3，1/2MS培养基，将种子种胚朝上方向接种。

实施例三：

材料来源：采集于阿尔山好森沟林场鹅观草属05-11材料，在资源圃内培育，种子腊熟期收种。

与实施例1的区别是，在步骤1，选择饱满，未受病虫害的种子，用自来水冲洗15min后放置在4℃条件下用无菌水浸种20h。

实施例四：

材料来源：采集于内蒙古呼伦贝尔盟根河市鹅观草属05-24材料，在资源圃内培育，种子腊熟期收种。

培养方法按实施例1方法进行。

虽然以上已经参照附图对按照本发明目的的构思和实施例作了详尽说明，但本领域普通技术人员可以认识到，在没有脱离权利要求限定范围的前提条件下，仍然可以对本发明作出各种改进和变换，而这些改进和变换仍然应当属于本发明的保护范围。

Claims

1.鹅观草属植物无菌萌发方法，其特征在于，按照以下步骤：

1)种子预处理：选择饱满，未受病虫害的种子，用自来水冲洗15～20min后放置在2～4℃条件下用无菌水浸种12～30h；之后，

2)外植体消毒：将上述经过预处理的种子剥掉内外稃，用75％酒精消毒25～40秒，之后，用无菌水清洗3次，再用0.1％升汞溶液消毒1～4分钟，再用无菌水清洗5次，再用无菌滤纸吸干种子表面的水分，随之接种到固体培养基，接种时种胚朝上方向，种胚面裸露于空气中，培养基为MS或1/2MS培养基；之后，

3)先在暗箱培养，待芽长至1～2厘米后，改用每天12小时光照培养，光照培养条件为：温度23～27℃，相对湿度30～50％，每天光照12小时，培养基PH5.8，琼脂7g/L，之后，

4)壮苗培养：待苗长至8～10厘米高时，转置1/2MS培养基，15天剪苗，使苗高保持在10cm。

2.根据权利要求1所述的鹅观草属植物无菌萌发方法，其特征在于，在步骤1)中将选好的种子先用自来水冲洗15～20min后，然后在4℃条件下用无菌水浸种24h。

3.根据权利要求1所述的鹅观草属植物无菌萌发方法，其特征在于，在步骤2)中，用75％酒精消毒30秒，之后，再用0.1％升汞溶液消毒3分钟。