CN101584722A - 皮肤保养草本复方 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种改善老化皮肤的草本组合，即皮肤保养草本复方，其包含人参、五加皮及红花的萃取物。本发明组合进一步包含沉香及乳香的萃取物。

Description

皮肤保养草本复方
技术领域
本发明涉及老化皮肤保养的草本复方。
背景技术
皮肤是一个非常复杂的器官，它包含两种组织：表皮与真皮。表皮是多层分化的组织，具有障壁作用。真皮是结缔组织，其细胞包埋在由胶原蛋白、弹性蛋白、糖蛋白及其它大分子组成的基质中。胶原蛋白占皮肤干重的70-80％，它赋予皮肤张力。弹性蛋白质是真皮中的少量蛋白质，它赋予皮肤弹性(Emmanuelle Noblesse；et al.J.Invest.Dermatol.2004；122：621-630)。糖蛋白带高电荷，可吸引水分子，使皮肤饱满丰润。
皮肤老化在临床相关的组织学表现，包括因表皮基层细胞的有丝分裂及分化减少、网嵴变平、表皮附属物减少、与表皮内纤维母细胞及微血管数减少所导致的表皮变薄(Chung，J.H.，et al.，J.Invest.Dermatol.2001；117：1218-1224.Li L.et al.，Arch.Dermatol.Res.2006；297：412-416.Tagami H.Arch.Dermatol.Res.2008；300(Suppl.1)：S1-S6)。在老化期间皮肤的构造成分也会改变(Fisher G J.，et al.，Arch.Dermatol.2002；138：1462-1470)。这些导致障壁及缓冲作用降低，感染及损伤率增加，伤口愈合率及质量降低。
引起皮肤老化的因子包括：胶原蛋白或弹性蛋白缺乏所显示的遗传性疾病，例如真皮松弛(Cutis laxa)；过量环境紫外线照射所导致包括弹性物质堆积及过早的皮肤老化；及年龄老化(Robert L.，et al.，Biogerontology2000；1：123-131.Giacomoni P.U.，et al.，Biogerontology 2001；2：219-229)。一般皆知皮肤真皮内胶原蛋白及弹性蛋白的质和量的改变会高度影响到皮肤的外表。这些蛋白质受到多样内在及外在因子的攻击而改变，使得弹性降低，生成皱纹，皮肤松弛。第一型及第三型的胶原蛋白在年龄老化的过程中生成减少，而光照更使之恶化，使得受损的胶原蛋白无法被取代。紫外线照射及年龄老化过程中，基质金属蛋白分解酶(Matrixmetalloproteinase，MMP)会增加，而这些酶会把胶原蛋白切成片段(Varani J.，et al.，Am.J.Pathol.2006；168(6)：1861-1868)。
年龄老化也使皮肤中水含量、硫化糖蛋白及糖醛酸的量减少(Jung J.W.，et al.，J.Dermatol.Sci.1997；14(1)：12-19)。参与真皮及结缔组织的结构及恒定的糖胺聚糖及蛋白聚糖也会随年龄改变(Boris Vuillermoz，et al.，Molecular and Cellular Biochemistry 2005；277：63-72)。硫酸乙酰肝蛋白聚糖是一种蛋白多糖的次类，调节细胞增殖与蛋白质分解，以及基质黏着与聚合，其量也会随老化而减少。另一种糖胺聚糖的次类，玻尿酸，能维持表皮及真皮结构与功能的完整性，在老化过程中其代谢也会被干扰(Carrino D.A.，et al.，Arch.Biochem.Biophys.2000；373(1)：91-101；WillenM.D.，et al.，1991；96(6)：968-974)。
胶原蛋白及弹性蛋白的交互连结对胶原蛋白的张力及弹性蛋白弹性是不可或缺的，两者皆是结缔组织结构完整性及功能所必备的(
Figure A20091014049600051
J M.，et al.，Am.J.Pathol.2005；167(4)：927-936)。在发育及老化过程中，胶原蛋白纤维间的交互连结被认为是必要的修饰因子之一，由谷氨酰转移酶(Glutamyltransferase)和赖氨酰氧化酶(Lysyl oxidase)媒介产生适当的交互连结，在发育中是很重要的。但是，老化过程中胶原蛋白纤维非酶性的交互连结是由糖化作用或活性氧群所造成(Elgawish A.，et al.；J.Biol.Chem.1996；271(22)：12964-12971)。在老化期间，胶原蛋白与弹性蛋白增加的交互连结会影响到皮肤的弹性。胶原蛋白交互连结的分解者，例如N-苯甲酰甲基噻唑(N-phenacylthiazolium，PTB)已被视为能反转蛋白质交互连结增加的治疗药剂(Wolffenbuttel B.H.R.，et al.，Proc.Natl.Acad.SciUSA 1998；95：4630-4634)。
越来越多的证据显示，紫外线照射会使皮肤产生活性氧群。增多的活性氧群能克服抗氧化防御机制的抑制力。随着时间经过，细胞内会累积对脂质、蛋白质及DNA分子的氧化伤害，可能会导致与年龄相关的皮肤上光老化的增加。证据也显示人类皮肤曝露在紫外线下，会促进分解基质酶，即基质金属蛋白分解酶(MMP)的合成，诸如MMP-1、-2、-3、-7、-8、-9、-12，皆能分解胶原蛋白及蛋白聚糖(Sander C.S.，et al.，J.Invest.Dermatol.2002；118：618-625；Inomata S.，et al.，J.Invest.Dermatol.2003；120：128-134；Praveen K.V.，et al.，J.Invest.Dermatol.2004；122：1480-1487)。
因太阳光或UVA照射而敏感化人类胶原蛋白及弹性蛋白，使得过氧化氢产生。其可以通过抗氧化剂或过氧化氢酶(Catalase)的处理而反转(Wondrak G T.，et al.，J.Invest.Dermatol.2003；121(3)：578-586)。已知活性氧群包括超氧(O2 -)、单氧(1O2)、氢氧自由基(OH-)、过氧化氢(H2O2)，会攻击及分裂糖胺聚糖成低分子量的片段。在这些活性氧群中，氢氧自由基具有高活性，同时攻击力最强。氧化压力的增加会促进MMP的活性，并降低胶原蛋白的生成(Siwik D.A.，et al.，Am.J.Physiol.Cell Physiol.2001；280：C53-C60)。
预防活性氧生成及以抗氧化剂消除活性氧，已知可以有效的控制皮肤的老化，例如皱纹及/或松弛的形成(Hu HL.，et al.，Mechanisms of Ageingand Development 2000；121：217-230)。
在许多情况下，皮肤色素会增加，例如紫外线活化黑色素细胞、荷尔蒙不平衡或遗传基因的影响。UVA引起的氧化压力会促进黑色素生成及严重的皮肤损伤。酪氨酸酶是黑色素生成的速率决定酶。市面上的美白剂例如维生素C及其衍生物，对苯二酚及其衍生物，抑制酪氨酸酶或抑制5，5-二羟吲哚-2-羧酸(5，5-dihydroxyindole-2-carboxylic acid)聚合，或防止黑色素的不正常沉淀。许多亚洲女性较喜爱浅色光亮肤色，因此皮肤美白剂的研发有市场需求。
发明内容
皮肤老化包括年龄老化及光照老化。皮肤在年龄老化过程中会因为被太阳光照，尤其是紫外线的照射而加速皮肤的变化，包括黑斑，因胶原蛋白改变导致的皱纹，归因于糖胺聚糖改变、汗水及皮脂的干燥，因缺乏张力与弹性的皮肤松弛，易于瘀青、脆弱的血管导致的挫伤与流血、弹性纤维变性造成的角质化及变薄所造成的隔绝与垫塞不足。
因此，本发明提供一种拥有有效性科学证明的天然草本组合，可以刺激真皮纤维母细胞增生来取代衰老及凋亡细胞，刺激能增强坚固性及具有抗皱纹能力的胶原蛋白合成，刺激能增加含水量及光泽的糖胺聚糖合成，活性抗氧物质(1，1-二苯甲基-2-三硝基酚基阱基(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl))自由基清除的抗氧化，抗UV诱导的MMP效应而能消除皱纹，抗酪氨酸酶能达到抑制黑色素形成达到美白及去除色素的效果。因此，本发明的草本组合可以全方位对抗导致皮肤老化的各种因子。
更明确言，本发明提供一种改善老化皮肤的草本组合，包含人参、五加皮及红花的萃取物。在一较佳实施例中，本发明的组合进一步包含沉香及乳香。
本发明提供的萃取物包含人参、五加皮及红花，其重量比例成分为0.1～1∶0.1～1∶0.03～0.3；另包含沉香及乳香，其重量比例成分为0.3～3∶0.3～3。
在另一较佳实施例中，本发明的组合物另包含药学上或化妆品可以接受的赋形剂、稀释剂或载体。
在较佳的实施例中，本发明的赋形剂、稀释剂或载体可由下列物质但不限于这些物质来调配成霜剂、乳剂、精华液、喷剂、水剂、锭剂、胶囊、颗粒散剂、粉剂或水溶液剂型。
在一较佳实施例中，该组合物通过局部、皮肤贴、口服、皮内或皮下注射等方式投给。
在一较佳实施例中，该组合物刺激一种反应选自下列群组包含纤维母细胞增殖、胶原蛋白合成或糖胺聚糖合成。
在一较佳实施例中，本发明的组合物抑制MMP-2的活性系基于过氧化物或UV照射及抑制一种反应选自下列群组包含酪氨酸酶活性或黑色素形成。在另一较佳实施例中，该组合物具有抗氧化活性。
在一较佳实施例中，本发明的组合物具有抗老化效应针对取代老化的真皮纤维母细胞、抗皱纹、增加皮肤含水量、增进老化皮肤的之坚固性、增加皮肤含水量、去除色素或促进白晰。
本发明另提供一种改善老化皮肤的方法，包含将人参、五加皮及红花的萃取物所形成的组合物投给目标个体。在一较佳实施例中，该组合物另包含沉香及乳香。
以下实施例并非完全表示本发明所能涵盖的完全范围。更进一步言，本发明亦可以使用于其它实施方式。在此举出例证解释本发明在此说明书所及的申请范围。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
附图说明
图1.真皮纤维母细胞以不同的草本组合处理，所有的草本组合溶于含25μg/ml维生素C的培养液中，其最终浓度为0.01mg/ml。
A1至A4：以CM23a处理
B1至B4：以CM23b处理
C1至C4：以CM23处理
D1至D4：以维生素A(1μM)处理
E1至E4：以PBS处理，作为对照组。
第1-2列：以天狼星红染胶原蛋白
第3-4列：以蕃红欧染葡萄糖胺
图2.真皮纤维母细胞以不同的草本组合处理，所有的草本组合溶于含25μg/ml维生素C及0.05mM H2O2的培养液中，其最终浓度为0.01mg/ml。
A1至A4：以CM23a处理
B1至B4：以CM23b处理
C1至C4：以CM23处理
D1至D4：以维生素A(1mM)处理
E1至E4：以PBS处理，作为对照组。
第1-2列：以天狼星红染胶原蛋白
第3-4列：以蕃红欧染葡萄糖胺
图3.真皮纤维母细胞被草本组合处理后的培养液的酶谱法(Zymography)。潜性及活性MMP-2显现在分子量72K及66K处。
第1列：空白
第2列：CM23a 0.02mg/ml处理
第3列：CM23b 0.02mg/ml处理
第4列：CM230.02mg/ml处理
第5列：对照
图4.真皮纤维母细胞培养液的MMP，在细胞外以草本组合处理的酶谱法。
第1列：空白
第2列：对照
第3列：对照
第4列：CPFa 1mg/ml
第5列：CPFa 2mg/ml
第6列：CPFb 1mg/ml
第7列：CPFb 2mg/ml
第8列：CPF+1mg/ml
第9列：CPF+2mg/ml
第10列：CM23a 1mg/ml
第11列：CM23a 2mg/ml
第12列：CM23b 1mg/ml
第13列：CM23b 2mg/ml
第14列：CM23 1mg/ml
第15列：CM23 2mg/ml
第16列：CPF+1mg/ml+CM23a 1mg/ml
第17列：CPF+1mg/ml+CM23b 1mg/ml
第18列：CPF+1mg/ml+CM23 1mg/ml
第19列：多西环素1mM
图5.真皮纤维母细胞培养液的MMP，各别在细胞外以草本组合处理的酶谱法。
第1列：分子量标示
第2列：空白
第3列：对照
第4列：CPFa 1mg/ml
第5列：CPFa 2mg/ml
第6列：CPFb 1mg/ml
第7列：CPFb 2mg/ml
第8列：CPF+1mg/ml
第9列：CPF+2mg/ml
第10列：CM23a 1mg/ml
第11列：CM23a 2mg/ml
第12列：CM23b 1mg/ml
第13列：CM23b 2mg/ml
第14列：CM23 1mg/ml
第15列：CM23 2mg/ml
第16列：CPF+1mg/ml+CM23a 1mg/ml
第17列：CPF+1mg/ml+CM23b 1mg/ml
第18列：CPF+1mg/ml+CM23 1mg/ml
第19列：多西环素0.5mM
第20列：对照
图6.B16F10酪氨酸酶的酶谱法，胶条内的酪氨酸酶各别以草本组合加上受质L-DOPA处理，在酪氨酸酶分子量66K处形成黑色素带。
第1列：空白
第2列：对照
第3列：CPFa 1mg/ml
第4列：CPFa 2mg/ml
第5列：CPFb 1mg/ml
第6列：CPFb 2mg/ml
第7列：CPF+1mg/ml
第8列：CPF+2mg/ml
第9列：CM23a 1mg/ml
第10列：CM23a 2mg/ml
第11列：CM23b 1mg/ml
第12列：CM23b 2mg/ml
第13列：CM23 1mg/ml
第14列：CM23 2mg/ml
第15列：CPF+1mg/ml+CM23a 1mg/ml
第16列：CPF+1mg/ml+CM23b 1mg/ml
第17列：CPF+1mg/ml+CM23 1mg/ml
第18列：多西环素0.5mM
第19列：对照
图7.MEWO酪氨酸酶的酶谱法，胶条内的酪氨酸酶各别以草本组合加上受质L-DOPA处理，在酪氨酸酶分子量66K处形成黑色素带。
第1列：空白
第2列：对照
第3列：CPFa 1mg/ml
第4列：CPFa 2mg/ml
第5列：CPFb 1mg/ml
第6列：CPFb 2mg/ml
第7列：CPF+1mg/ml
第8列：CPF+2mg/ml
第9列：CM23a 1mg/ml
第10列：CM23a 2mg/ml
第11列：CM23b 1mg/ml
第12列：CM23b 2mg/ml
第13列：CM23 1mg/ml
第14列：CM23 2mg/ml
第15列：CPF+1mg/ml+CM23a 1mg/ml
第16列：CPF+1mg/ml+CM23b 1mg/ml
第17列：CPF+1mg/ml+CM23 1mg/ml
第18列：多西环素0.5mM
第19列：对照
图8.B16F10细胞以CPF+或维生素C或对苯二酚处理三天。细胞在PBS中离心下来成小球。黑色素形成较少的细胞小球颜色较浅。
瓶1：对照
瓶2：维生素C 0.1mM
瓶3：对苯二酚0.01mM
瓶4：CPF+0.001mg/ml
瓶5：CPF+0.003mg/ml
瓶6：CPF+0.01mg/ml
图9.B16F10酪氨酸酶的酶谱法。B16F10细胞以草本组合处理三天后将细胞打破检测其酪氨酸酶的活性，酪氨酸酶在分子量66K处形成黑色素带。
第1列：空白
第2列：对照
第3列：维生素C 0.1mM
第4列：对苯二酚0.01mM
第5列：CPF+0.001mg/ml
第6列：CPF+0.003mg/ml
第7列：CPF+0.01mg/ml
图10.MEWO细胞以CPF+或维生素C或对苯二酚处理三天。细胞在PBS中离心下来成小球。黑色素形成较少的细胞小球颜色较浅。
瓶1：对照
瓶2：维生素C 0.1mM
瓶3：对苯二酚0.01mM
瓶4：CPF+0.001mg/ml
瓶5：CPF+0.003mg/ml
瓶6：CPF+0.01mg/ml
图11.MEWO酪氨酸酶的酶谱法。MEWO细胞以草本组合处理三天后将细胞打破检测其酪氨酸酶的活性，酪氨酸酶在分子量66K处形成黑色素带。
第1列：空白
第2列：对照
第3列：维生素C 0.1mM
第4列：对苯二酚0.01mM
第5列：CPF+0.001mg/ml
第6列：CPF+0.003mg/ml
第7列：CPF+0.01mg/ml
具体实施方式
实施例一、组合及制备方法
CPF+组合
CPF+包含人参、五加皮及红花，其成分重量百分比例为0.1～1∶0.1～1∶0.03～0.3。
CPF+制备方法
1.红花以5至10倍的水在100±5℃下回流一小时，上清液以400网目过筛，此上清液浓缩干燥，称为CPFa。
2.人参和五加皮以5至10倍的50±10％酒精在100±5℃下回流一小时，进行两次。二次上清液以400网目筛选，此上清液浓缩干燥称为CPFb。
将1.的上清液加上2.的上清液混合、浓缩、干燥，称为CPF+。
CM23组合
CM23包含沉香及乳香其重量百分比例为0.3～3∶0.3～3。
CM23制备方法
沉香及乳香以5至10倍的水或50±10％酒精或95％酒精在100±5℃下回流一小时，进行两次。二次上清液以400网目过筛、浓缩、干燥。称为CM23a(水萃)、CM23b(50±10％酒精萃)、CM23(95％酒精萃)。
实施例二、刺激真皮纤维母细胞分裂
人类真皮纤维母细胞以DMEM培养液+10％FCS(胎牛血清)+100Units/ml Penicillin(青霉素)+100μg/ml Streptomycin(链霉素)+2mMGlutamine(谷酰胺)+0.1mM Sodium pyruvate(丙酮酸钠)培养液(Complete-medium(完全培养液)，C-medium)在含5％二氧化碳，37℃下培养。
1×104细胞种植于96孔培养皿内，24小时后，加入含草本组合的新鲜C-medium继续培养。4天后，以含0.5mg/ml PBS(磷酸盐缓冲液)的MTT(细胞活性测试)取代，在相同情况下培养4小时，然后将MTT培养液吸掉，加入含0.04N盐酸的Isopropanol(异丙醇)将形成的Formazan(甲臜)溶解，然后读取570nm波长的吸光值。
表1刺激真皮纤维母细胞分裂的作用
Figure A20091014049600151
如表1所示，CM23在0.1mg/ml的浓度下对细胞有毒性，在0.03及0.01mg/ml时有稍微刺激细胞分裂的作用。CPF+表现出类似的效果。
实施例三、刺激真皮纤维母细胞合成胶原蛋白及葡萄糖胺
5×104细胞种植于48孔培养皿中，3至4天让细胞长满，C-medium含有或不含过氧化氢、加上25μg/ml维生素C及草本组合，或雀异黄素(Genistein)或维生素A。七天后，细胞以10％福尔马林固定，然后用天狼星红(Sirius Red)、蕃红欧(Safranin O)或艾尔逊蓝(Alcian Blue，pH2.5)染色。
A.在不含过氧化氢的C-medium中，与雀异黄素比较对真皮纤维胶原母细胞合成胶原蛋白及葡萄糖胺的刺激作用。
表2真皮纤维胶原母细胞合成胶原蛋白及葡萄糖胺的刺激作用
  CPFa   CPFb   CPF+  CM23a   CM23b   CM23   雀异黄素   控制组
  天狼星红   ++   ++   +++   ++   +++   ++++   ++   ++
  蕃红欧   ++   ++   +++   ++   +++   ++++   ++   ++
  艾尔逊蓝   +++   +++   +++   ++   +++   ++++   ++   ++
如表2所示，CM23具最强刺激胶原蛋白及葡萄糖胺合成的作用，CPF+次之，雀异黄素在10μM的浓度下没有明显的作用。
B.在含0.1mM过氧化氢的C-medium中，与雀异黄素比较对真皮纤维胶原母细胞合成胶原蛋白及葡萄糖胺的刺激作用。
表3含0.1mM过氧化氢的C-medium中，真皮纤维胶原母细胞合成胶原蛋白及葡萄糖胺的刺激作用
  CPFa   CPFb   CPF+  CM23a   CM23b   CM23   雀异黄素   控制组
  天狼星红   +   +   ++   +   ++   +++   +   +
  蕃红欧   +   +   ++   +   ++   +++   +   +
  艾尔逊蓝   ++   ++   +   +   +   +++   +   +
如表3所示，在0.1mM过氧化氢下，CM23具最强刺激胶原蛋白及葡萄糖胺合成的作用，CPF+次之，雀异黄素在10μM的浓度下没有明显的作用。
C.所示在不含过氧化氢的C-medium中，与维生素A比较对真皮纤维胶原母细胞合成胶原蛋白及葡萄糖胺的刺激作用。
如图1所示，CM23具最强刺激胶原蛋白及葡萄糖胺合成的作用，维生素A在1μM浓度下没有明显作用。
D.在含0.05mM过氧化氢的C-medium中，与维生素A比较，对真皮纤维母细胞合成胶原蛋白及葡萄糖胺的刺激作用。
如图2所示，在0.05mM过氧化氢下，CM23具最强刺激胶原蛋白及葡萄糖胺合成的作用，维生素A在1μM浓度下没有明显作用。
E.与维生素A比较，不同浓度的草本组合对真皮纤维母细胞合成胶原蛋白、葡萄糖胺及玻尿酸的刺激作用。
表4草本组合对真皮纤维母细胞合成胶原蛋白、葡萄糖胺及玻尿酸的刺激作用
如表4所示，CPF+及CM23对刺激胶原蛋白、葡萄糖胺、玻尿酸的合成与剂量成正反应，CPF+比CM23刺激玻尿酸的合成的作用更强。维生素A在10μM浓度下没有明显作用。
F.与维生素A比较，不同浓度的草本组合在UV照射下，对真皮纤维母细胞合成胶原蛋白、葡萄糖胺及玻尿酸的刺激作用。
细胞在草本组合或维生素A处理一周后，PBS洗两次，然后在PBS中以UV365nm照射20mJ/cm2，新鲜DMEM取代，24小时后，细胞固定染色。
表5草本组合在UV照射下，对真皮纤维母细胞合成胶原蛋白、葡萄糖胺及玻尿酸的刺激作用
Figure A20091014049600181
如表5所示，CPF+及CM23对刺激胶原蛋白、葡萄糖胺、玻尿酸的合成与剂量成正反应，CPF+比CM23刺激玻尿酸的合成的作用更强。维生素A在10μM浓度下没有明显作用。UV照射会引导MMP活化因而分解细胞外基质。与表4比较，UV照射使胶原蛋白、葡萄糖胺及玻尿酸的沉积普遍较少，但UV似乎不影响草本组合的刺激作用。
实施例四、草本组合处理真皮纤维母细胞后其MMP的活性
5×104细胞种植于48孔培养皿中，2至3天后，细胞长满，培养液以含25μg/ml维生素C，0.02mg/ml草本组合之新鲜C-medium取代。七天后，细胞用PBS洗，在不含FCS的DMEM内培养24小时。培养液收集后，用牛血清球蛋白作标准品以BioRad蛋白检测液测定蛋白含量，将培养液调成等蛋白质浓度，然后以不含还原剂，两倍浓度SDS样品液混合。然后以含0.1％gelatin(明胶)的10％SDS polyacrylamide gel(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺胶)电泳。电泳完后，胶体用2.5％Triton X-100溶液洗三次，每次15分钟，然后在发展液(50mM Tris-HCl pH7.6，10Mm CaCl2，50mMNaCl，0.05％Brij35)中在37℃下处理24小时，胶体以含0.1％CoomassieBlue(考马斯蓝)R250，40％Methanol(甲醇)及10％Acetic acid(醋酸)染色，MMP-2(基质金属蛋白酶-2，一种gelatinase，明胶酶)在胶体中呈现白色色带(72K，68K)。
如图3所示，活性(68K)及潜性(72K)MMP-2都被CM23所抑制，而活性MMP-2则被CM23a，CM23b所抑制。
实施例五、草本组合对真皮纤维母细胞培养液内MMP的抑制作用
长满的真皮纤维母细胞的不含FCS的培养液收集起来作为MMP来源。
10μl的培养液与等体积溶于0.1M pH6.8磷酸缓冲液的草本组合在37℃下作用一小时，然后加上等体积不含还原剂的2倍浓度之SDS样品液，两小时后以含0.1％gelatin之10％SDS polyacylamide gel电泳。电泳完成后，胶体用2.5％Triton X-100溶液洗三次，每次15分钟，然后在发展液(50mM Tris-HCl pH7.6，10mM CaCl2，50mM NaCl，0.05％Brij35)中在37℃下处理24小时，胶体以含0.1％Coomassie Blue R250，40％Methanol及10％Acetic acid染色，MMP-2(gelatinase)在胶体中呈现白色色带(72K，68K)。
如图4所示，CPF+抑制MMP-2活性呈剂量反应，CM23较CPF+有抑制活性作用，CM23b抑制活性最强，CPF+与CM23有加成作用，Doxycycline(多西环素)在1mM的浓度下约抑制50％MMP-2的活性。
实施例六、草本组合对以胶体分离真皮纤维母细胞的MMP的抑制作用
真皮纤维母细胞的培养液以含0.1％gelatin的10％SDSpolyacrylamide gel电泳。分离后，经2.5％Triton X-100洗三次后，胶体依每个样品的凹槽切条，每条在含草本组合的发展液中，在37℃下处理24小时，然后胶条以含0.1％Coomassie Blue R250染色，40％Methanol及10％Acetic acid染色，MMP-2(gelatinase)呈现白色色带。
如图5所示，CM23系列抑制MMP-2活性，呈剂量反应。CPF+系列较CM23系列强，CPFb抑制活性最强，多西环素在1mM的浓度下约抑制50％MMP-2的活性。
实施例七、细胞外酪胺酸酶活性及黑色素形成
小鼠B16F10黑色素癌细胞或MEWO人黑色素细胞于DMEM+10％FCS+100Units/ml Penicillin+100μg/ml Streptomycin+2mM Glutamine+0.1mM Sodium pyruvate(C-medium)在含5％二氧化碳37℃下培养。长满的细胞以CelLytic细胞溶解液将细胞打破，13000rpm离心的上清液测定蛋白质含量。20μg的蛋白质量以不含还原剂的SDS样品液处理然后在10％SDS polyacrylamide gel电泳。电泳完后，以pH6.8，0.1M的磷酸缓冲液洗二次，每次30分钟。将胶体依样品槽切条，每条分别在含0.5mM L-DOPA，pH6.8，0.1M的磷酸缓冲液与草本组合在37℃下隔夜反应，形成的黑色素在胶体上呈黑色带。
如图6所示，CPF+系列依剂量抑制小鼠酪氨酸酶。CPFb及CPF+显现相似的抑制强度，在相同实验条件下，CM23系列没有抑制作用，CPF+加上CM23系列似乎有减低抑制作用。
如图7所示，CPF+系列依剂量抑制人酪氨酸酶。CPFb及CPF+显现相似的抑制强度，在相同实验条件下，CM23系列没有抑制作用，CPF+加上CM23系列并没有减低抑制作用，人的酪氨酸酶与小鼠酪氨酸酶反应不一样。
实施例八、细胞内酪氨酸酶的抑制作用
2.5×105小鼠B16F10黑色素癌细胞或人MEWO黑色素癌细胞培养于6孔培养皿中，在5％CO2，37℃下培养。细胞长满后，草本组合加入DMEM+2％FCS中处理三天。处理完后，细胞用CelLytic(Sigma)溶解液打破(1×107/125μl)。13000rpm离心上清液测定蛋白质含量。20μg的蛋白质量以不含还原剂的SDS样品液处理，然后在10％SDS polyacylamidegel电泳。电泳完后，以含pH6.8，0.1M的磷酸缓冲液洗二次，每次30分钟。将胶体依样品槽切条，每条分别在含0.5mM L-DOPA，pH6.8、0.1M的磷酸缓冲液与草本组合在37℃下隔夜反应，形成的黑色素在胶体上呈黑色带。
如图8所示，B16F10细胞，CPF+依剂量抑制黑色素形成，在0.01mg/ml的浓度下，其作用强度相似于0.01mM对二苯酚。
如图9所示，B16F10细胞液，CPF+系列依剂量抑制酪氨酸酶，在0.01mg/ml的浓度下，它完全抑制了酪氨酸酶的活性，在0.01mg/ml的浓度下，其作用强度相似于0.01mM对二苯酚。
如图10所示，MEWO细胞，CPF+依剂量抑制黑色素形成，在0.01mg/ml的浓度下，其作用强度相似于0.01mM对二苯酚。
如图11所示，MEWO细胞液，CPF+系列依剂量抑制酪氨酸酶，在0.001mg/ml的浓度下，它完全抑制了酪氨酸酶的活性，在0.01mg/ml的浓度下，其作用强度强于0.1mM维生素C及0.01mM对二苯酚。
实施例九、以DPPH(二苯联苦基)自由基方法检测CPF+及CM23清除自由基的能力
不同浓度的草本组合与0.2mM DPPH在室温避光下作用30分钟，维生素C及维生素E作正对照，以光谱仪检测波长517nm吸收。
表6CPF+及CM23清除自由基的能力
Figure A20091014049600211
如表6所示，CPF+在0.1mg/ml浓度下清除71.5％的自由基，与0.001mM维生素C及0.01mM维生素E有相似的强度。
实施例十、人体使用经验
表7本发明制成的精华液的组成分及比例
  成份   内含物比例(％)
  丁二醇(Butylene glycol)   7.00
  合成酯(Triethylhexanoin)   5.00
  丙三醇(Glycerin)   5.00
  丁二醇(Butyl glycol)   5.00
  聚季铵盐-39(Polyquaternium-39)   2.00
  丙烯酸/C10-30烷基丙烯酸聚合物(Acrylates/C10-30 alkyl acrylatecrosspolymer   0.40
  聚羧乙烯(Carbomer)   0.10
  聚山梨醇酯(Polysorbate-20)   0.10
  氢氧化钠(Sodium hydroxide)   0.05
  玻尿酸钠(Sodium hyaluronate)   0.05
  甲基异噻唑啉酮(Methylisothiazolinone)   0.03
  苯并异噻唑啉酮(Benzisothiazolinone)   0.02
  芳香(Fragrance)   0.10
  CPF+   0.362
  CM23   0.438
  水   74.35
  总计   100.00
10位女性，年龄25到50岁，参加本发明的精华液测试。它们照日常惯用方式保养皮肤，但是晚上在清洗脸部后不使用任何保养品。一周清除原先保养品残存后，每晚在清洗脸部后涂上精华液。使用六周后，50％参试者综合性自评脸部皮肤改善50％。使用十二周后，90％参试者综合性自评脸部皮肤改善75％。自评项目包括紧实、含水量、皱纹、光泽、及美白(每项评分1-5，第六周及的12周总评分与基线比较)。
总结
如表1所示，CM23及CPF+在0.03，0.01mg/ml的浓度下，刺激真皮纤维母细胞的分裂，增加的程度正好补充因老化而减少的数目。它们也会刺激胶原蛋白及葡萄糖胺的合成(表2-5，图1-2)。在0.1mM过氧化氢的存在下，CPF+及CM23保留其刺激作用，而雀异黄素(10μM)或维生素A(1μM)无法有刺激作用。在紫外线照射下，CPF+及CM23依然可以依剂量刺激胶原蛋白及葡萄糖胺的沉积，所以在过氧化氢或紫外线照射下本发明草本组合仍具保护细胞的活性。
如图3所示，CM23系列抑制活性及潜性真皮纤维母细胞的MMP-2。CM23活性最强。在细胞外系统测试中(图5)，CM23b与CM23活性相似，在图4内，CPF+可能在电泳过程中与酵素/受质complex中被分离，所以活性较低。
如图6及7，在细胞外测试系统中，CPF+抑制小鼠B16F10及人类MEWO的酪氨酸酶活性及黑色素合成。当以草本组合处理细胞，如图8到11所示，两种细胞的酪氨酸酶活性及黑色素形成都被依剂量而抑制。CPF+亦具清除自由基的作用。
CPF+及CM23刺激真皮纤维母细胞的分裂，合成胶原蛋白及葡萄糖胺(不论在正常或H2O2或UV以下)，使得皮肤在年龄或是光促老化过程中产生的皱纹、松弛、干燥得到改善。CPF+亦具有抗氧化作用。将CM23及CPF+组合起来可以对抗皮肤老化：使皱纹更平滑、松弛变紧实、干燥变保湿、暗沉变光泽、黑斑变美白。本发明这些性质更由人类使用经验实施例得到证实(表7)。

Claims (12)

1.一种改善老化皮肤的草本组合物，其特征在于包含人参、五加皮及红花的萃取物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于进一步包含沉香及乳香的萃取物。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于人参、五加皮及红花萃取物的重量百分比例为0.1～1∶0.1～1∶0.03～0.3。
4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于沉香及乳香萃取物的重量百分比例是0.3～3∶0.3～3。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于进一步包含药学上或化妆品上可以接受的赋形剂、稀释剂或载体。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于赋形剂、稀释剂或载体调配成为霜剂、乳剂、精华液、喷剂、水剂、锭剂、胶囊、颗粒散剂、粉剂或水溶液剂型。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于其通过局部、皮肤贴、口服、皮内或皮下注射等方式投给。
8.根据权利要求1所述项的组合物，其特征在于其可刺激一反应产生，该反应选自下列群组包含纤维母细胞增殖、胶原蛋白合成或糖胺聚糖合成。
9.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于其可抑制由过氧化物或UV照射所导致的基质金属蛋白分解酶-2活性。
10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于其可抑制一反应，该反应选自下列群组包含酪氨酸酶活性或黑色素形成。
11.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于其具有抗氧化活性。
12.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于该改善老化皮肤针对取代老化的真皮纤维母细胞、抗皱纹、增进老化皮肤的坚固性、增加皮肤含水量、去除色素或促进白晰。
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