CN101583377A - 纤维化的治疗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及治疗纤维化的方法和组合物。本发明一方面提供了能够增加干细胞和/或祖细胞在纤维化部位可利用的和/或植入的数目的试剂在制备与抗纤维化试剂联用来治疗纤维化的药物中的用途。在给予个体能够增加干细胞和/或祖细胞在纤维化部位可利用的和/或植入的数目的试剂之前、同时或之后给予所述个体抗纤维化试剂。所述纤维化可以是特发性肺纤维化。抗纤维化试剂可以是RhoA、RhoAGTPases、TGF－β1或CTGF或RhoA信号通路的其他任何成员的调节剂，或者能调节细胞因子信号传导抑制子1(SOCS 1)、细胞因子信号传导抑制子3(SOCS 3)或TLR9的作用，或者可以是他汀类化合物或其衍生物。

Description

纤维化的治疗

本发明涉及治疗纤维化的方法和组合物。

纤维化是一种病变，其特征在于在修复或反应过程中，过量的纤维结缔组织、过量的细胞外介基质(ECM)、过多的瘢痕或过量的胶原沉积物在器官或组织中形成或发展。与纤维化相关的疾病包括：特发性肺纤维化；皮肤纤维化，例如硬皮病或外伤和手术后产生的皮肤瘢痕；眼纤维化，例如眼硬化症、结膜和角膜上的瘢痕以及结膜上生出的翼状胬肉；胰腺和肺的囊性纤维化；心内膜心肌纤维化；特发性心肌病；肝硬化；纵隔纤维化；进行性大块纤维化；增生性纤维化；肿瘤纤维化。肺结核可以导致肺部的纤维化。

特发性肺纤维化描述了瘢痕发生在肺间质(或者实质)组织的一组疾病，该组织支撑着气囊或气泡。在特发性肺纤维化发展过程中，这些气囊被纤维组织替代，导致组织发生重构。这破坏了肺泡-毛细血管界面，导致了肺组织功能的丧失，降低了肺将氧转运到血液的能力。这种残酷的疾病会导致肺脏发生进行性的结构重组，从临床上来说，这种疾病以呼吸短促、慢性咳嗽、运动锻炼耐力逐渐减少和全身疲劳为特征。这种疾病可以发展数年，或者快速发展，导致患者体虚、呼吸衰竭和最终死亡。

肺内纤维化可以发生在诸如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺气肿的慢性呼吸道炎症疾病的支气管壁内，以及长期吸烟者的呼吸道内。此外，无论在肺实质(间质)还是支气管壁内，纤维化的存在和持续都会导致原位结构重塑，从而使肺脏失去其精确的解剖学功能和呼吸能力。

特发性肺纤维化与许多不同的病因相关，包括自身免疫紊乱，遗传易感性，长期接触职业的、环境的、和/或吸入的污染物例如灰尘、病毒、胃食管反流物(gastro-oesopageal reflux)等。全世界约有5百万以上的人患有特发性肺纤维化，其中今年大约新增了50,000病例，据预测还会增加-2005年报道了有40,000人死于该疾病。该疾病的预后差-从确诊开始平均预期寿命为2.9年。然而，临床结果取决于年龄、生活方式、最初表现方式和组织学分期。发病的平均年龄为40至60岁，然而有一些报道的病例发生在3岁的儿童。

特发性肺纤维化的标志是呼吸道上皮细胞(AEC)完整性的显著破坏。这反映了异常的创伤修复，其可能是由于不适当的上皮-间充质信号传导(epithelial-mesenchymal signalling)和异常的肺干细胞分化所造成的。一个或连续的多个微损伤引起了AEC完整性的显著破坏且在原位有多种增生/化生表型。邻近位置是截然不同的成纤维细胞和成肌纤维细胞增生和分泌活跃的“成纤维细胞病灶”，伴有异常的胶原合成和过量的细胞外基质沉积。无论是常居的还是新募集到肺中的肺干细胞，都有分化成上皮细胞和间充质细胞系的潜力。

目前仍不清楚为何内源性祖细胞无法使肺泡上皮组织在特发性肺纤维化中再生，并且也不清楚这是否是由于不适当的终末细胞分化或凋亡所致。关于前者，可能性包括以下几种：(i)为了恢复上皮细胞-成纤维细胞之间的平衡，发生了异常的上皮-间充质的转分化；(ii)成纤维细胞和成肌纤维细胞是从固有的组织特异性前体库发育而来；(iii)成纤维细胞表型来源于祖细胞。所有的这些都是可能存在的机制，并且可能共同存在；这些机制的存在受局部环境的特定发病阶段调节。

到目前为止，仍没有能够终止或逆转肺内促纤维化进程的可以利用的有效治疗方法。传统的治疗方法利用单一的或联用的免疫抑制剂和/或抗炎试剂，例如糖皮质激素、咪唑硫嘌呤、环孢素、环磷酰胺、氨甲喋呤、羟化氯喹，忽略了各种有限的临床反应；但没有一种药物看起来能够对停止和/或延缓纤维化的进展、促进肺脏的修复以及使肺脏恢复正常的功能和/或接近正常的功能起到作用。因此，这类患者的病情总是随着不可逆转的呼吸衰竭而恶化(Walter等人(2006)Proc AmThorac Soc 3，330-338)。虽然已经使用捐献的健康的肺移植物来替代纤维化的肺，但是对这种移植物的临床需求远远超出了可利用的供给。

因此，目前需要新的且有效的治疗纤维化的方法，特别是治疗特发性肺纤维化的方法。

本发明一方面提供了能够增加干细胞和/或祖细胞在纤维化部位可利用的和/或植入的数目的试剂在制备药物中的用途，所述药物与抗纤维化试剂联用来治疗纤维化。

本发明另一方面提供了治疗纤维化的方法，该方法包括给予需要给药的个体与抗纤维化试剂联用的试剂，所述试剂能够增加干细胞和/或祖细胞在纤维化部位可利用的和/或植入的数目。

“能够增加干细胞和/或祖细胞在纤维化部位可利用的和/或植入的数目的试剂”可以是能用于这种目的任何分子或细胞。在本发明的一个实施方案中，该试剂是治疗有效量的干细胞和/或祖细胞。因此，本发明可以包括提供给个体一定量的干细胞和/或祖细胞。然而，本发明也包括“能够增加干细胞和/或祖细胞在纤维化部位可利用的和/或植入的数目的试剂”增加了内源性干细胞和/或祖细胞的数目的情形。

本发明所用的“增加干细胞和/或祖细胞的数目”，包括所述试剂增加了募集到纤维化部位的干或祖细胞实际的数目的情形。然而，本发明也包括了下述情形：所述试剂不增加干细胞和/或祖细胞的数目，但使已存在的干细胞和/或祖细胞能够更好地植入纤维化部位，从而在治疗学上有助于对纤维化的治疗。例如，所述试剂促进了干细胞或祖细胞产生功能性的细胞和/或组织，从而恢复正常或接近正常的有益于健康的活性或功能。因此，本发明所用的“植入”，包括所述试剂增加了植入纤维化部位的干细胞或祖细胞数目的情形。

本发明所用的“纤维化部位”是指待治疗的个体体内的纤维化部位。因此，体内的实际位置将取决于患者所患有的特定的纤维化病症。例如，如果待治疗的个体患有特发性肺纤维化，那么纤维化部位点是在肺实质。在诸如慢性炎症性呼吸道疾病的其他情况，纤维化部位点可以在支气管气道/空隙。

本发明所用的“与...联用”，包括在给予个体能够增加干细胞和/或祖细胞在纤维化部位可利用的和/或植入的数目的试剂之前、同时或之后给予所述个体抗纤维化试剂。同样，如果药物或方法包括治疗有效量的干细胞和/或祖细胞，所用的“与...联用”可以包括所述干细胞和/或祖细胞在给予个体前，用所述抗纤维化试剂预孵育。

在本发明的实施方案中，能够增加干细胞和/或祖细胞在纤维化部位可利用的和/或植入的数目的试剂与抗纤维化试剂同时给患者使用。优选地，在这种实施方案中，药物包含能够增加干细胞和/或祖细胞在纤维化部位可利用的和/或植入的数目的试剂和抗纤维化试剂的组合。

在本发明可选的实施方案中，将能够增加干细胞和/或祖细胞在纤维化部位可利用的和/或植入的数目的试剂给予之前已使用过抗纤维化试剂的个体。这两种治疗成分的给药间隔时间取决于使用的抗纤维化试剂的性质，这一点是本领域技术人员所能理解的。例如，如果抗纤维化试剂在个体体内只能短时间内有效，所述能够增加干细胞和/或祖细胞在纤维化部位可利用的和/或植入的数目的试剂需要稍后就给予患者，且趁抗纤维化试剂仍有效力时给予。

本发明所用的“抗纤维化试剂”包括能减少个体体内纤维化的试剂。下面将进一步举例说明抗纤维化试剂，其包括RhoA、RhoAGTPases、TGF-β1和CTGF信号分子或者RhoA信号通路的其他成员的调节剂。这种试剂还包括调节细胞因子信号传导抑制子1(SOCS 1)、细胞因子信号传导抑制子3(SOCS 3)或者SOCS 3的受体TLR9的作用的试剂。在本发明的优选的实施方案中，抗纤维化试剂是他汀类化合物或其衍生物。

本发明所用的“个体”包括任何易患纤维化的动物，优选脊椎动物；更优选诸如家畜类动物或人的哺乳动物；最优选地，所述个体是人。

本发明所用的“纤维化”包括任何病变，其特征在于在修复或反应过程中，过量的纤维结缔组织、过量的细胞外介质(ECM)、过多的瘢痕或过量的胶原沉积物在器官或组织中形成或发展。与纤维化相关的疾病包括：特发性肺纤维化；皮肤纤维化，例如硬皮病或外伤和手术后产生的皮肤瘢痕；眼纤维化，例如眼硬化症、结膜和角膜瘢痕以及结膜上生出的翼状胬肉；胰腺和肺的囊性纤维化；心内膜心肌纤维化；特发性心肌病；肝硬化；纵隔纤维化；进行性大块纤维化；增生性纤维化；肿瘤纤维化。肺结核也可能导致肺部的纤维化。因此，本发明能用于治疗包括肺脏、眼、皮肤、肾、肝、胰脏和关节在内的各种器官和组织的纤维化。

优选地，所述纤维化是特发性肺纤维化。特发性肺纤维化是瘢痕出现在肺的间质(或者实质)组织的一组疾病。肺纤维化的发生也可以出现在诸如哮喘、COPD(慢性阻塞性肺病)、肺气肿的慢性炎症性呼吸道疾病的支气管壁内或者吸烟者的肺内。

在本发明的可选实施方案中，纤维化是指眼部或皮肤的纤维化。皮肤纤维化病症的实例包括硬皮病或外伤和手术后产生的皮肤瘢痕。眼部纤维化病症的实例包括眼硬化症、结膜和角膜上的瘢痕以及结膜上生出的翼状胬肉。

本发明涉及新颖且令人惊喜的发现，即抗纤维化试剂具有促进干/祖细胞原位分化成治疗性细胞类型的作用。尽管不希望限制于任何特定的理论，本发明人相信抗纤维化试剂可以将纤维化限制于一个位置从而建立干细胞或祖细胞可以成功植入的局部环境，有助于愈合反应。局部未纤维化的环境可以帮助干或祖细胞原位分化成治疗性细胞类型，这一点在本发明之前未曾披露过。此外，现有技术中也没有关于将抗纤维化试剂与干细胞和/或祖细胞结合以提高干或祖细胞的治疗效果的技术启示。这一令人意想不到的效果导致了一种有效的纤维化治疗方法。

干细胞是具有在体内分化成许多细胞类型的潜能的细胞。理论上来说，只要器官是存活的，干细胞就可以分裂，并不限于补充其他细胞。分化后，子细胞保持干细胞的潜能或成为其他类型的细胞如肺细胞并且呈现其特性，因此通过替代受损组织有望治愈许多疾病。这些现象可以在特定的生理学环境和实验条件中被诱发。

总之，干细胞疗法代表了一种治疗方法，通过该方法可以治疗退化性和/进行性型疾病(例如那些由机体无法替代的细胞类型的过早死亡或功能障碍而导致的疾病)的方法。加入干细胞可以帮助成核且促进功能细胞和/或组织的发生以替代那些失去了功能的细胞和/或组织，从而恢复正常的有益于健康的活性/功能，这一点是被期待的。

为了本发明的目的，使用的“干细胞”包括无能(nullipotent)、全能(totipotent)或多能(pluripotent)细胞，且祖细胞(或前体细胞)包括专能(multipotent)细胞。为了避免疑义，本发明的药物和方法可以包括治疗有效量的干细胞或祖细胞，或者是干细胞和祖细胞两者。

全能细胞是能够生长成所有的胚胎外细胞、胚胎细胞或成体细胞的细胞。因此，可知全能细胞最终可以生长成胚胎中或成体中的任何一种类型的分化细胞。相比之下，多能细胞是能够生长成某些胚胎外细胞、以及所有的胚胎细胞或成体细胞的细胞。因此，可以看出，多能细胞能够生长成的细胞类型比全能细胞的更有限。无能细胞是没有外部分化信号的作用就不能进行再分化的细胞。专能(multipotent)细胞是能够响应合适的环境信号(例如在可溶性生长因子或细胞或其子代定位的基质的作用下)生长成多种不同细胞类型的细胞，但是与多能细胞、无能细胞或全能细胞相比，其在形成潜在的谱系方面更为有限。

用于本发明的优选的培养条件视待培养的生物细胞的类型来决定。既应该考虑细胞(例如干细胞或祖细胞)的性质、细胞的来源、又要考虑细胞被利用的方式。合适的培养条件为本领域技术人员所熟知。

可以用于本发明的合适的干细胞来源是来自植入前胚胎的内细胞群/外胚叶的细胞。这类胚胎干细胞(ES)容易得到并且能够生长成所有可能的胚胎细胞和成体细胞系。特别是，本发明中可以使用未分化的人ESC(H1细胞系，来源于WiCell Research Institute，Inc，Madison，WI：www.wicell.org)；这种细胞系可以通过商业途径购得。可以用于本发明的另一种干细胞的来源是脐带来源细胞。

来自如H1的确立的符合伦理的细胞系或者脐带来源细胞的未分化胚胎干细胞(ESC)，可以以未分化的形式提供给个体。可选择地，ESC和间充质干细胞(MSCs)在植入患者之前发生分化但不需要纯化，或者在植入之前发生分化且经纯化。关于间质干细胞，可以从待治疗的个体中获得。获得的这些间充质干细胞可以在给药之前就被诱导分化成肺泡上皮细胞。

祖细胞也可以用于本发明中。祖细胞由干细胞分裂产生，但它们所经历的细胞分裂周期数有限。干细胞快速分裂产生一个细胞池，后者随后进而分化、整合形成组织。能用于本发明的祖细胞类型的实例，例如是间质干细胞或骨髓基质细胞(MSC)。MSCs是专能干细胞(multipotent stem cells)，其能够分化成多种细胞类型。所使用的祖细胞类型应取决于待治疗的纤维化病症。

根据特异性细胞标记从一群细胞中选择祖细胞是常规实践，这一点是本领域技术人员所能理解的常规技术。因此，例如适用于治疗特发性肺纤维化的祖细胞优选被诱导分化成肺泡上皮细胞系。这种分化是以细胞表面存在谱系标志物为特征，例如：层粘连蛋白5和表面活性蛋白的表达；另外，TTF-I(远端肺上皮细胞)、CC10(Clara细胞)、水通道蛋白5+Tlα(I型细胞)也被认定为属于广谱类的肺上皮细胞系。这类细胞表面标志物与原-成纤维细胞(pro-fibroblast)/成肌纤维细胞谱系表达标志物如α-SMA、I和III前胶原显著不同。

可以理解，选择用于本发明的生物细胞的精确性质基于利用该细胞的治疗用途来确定。例如，在治疗肺部时，优选使用来源于肺的生物细胞；若要实施上皮的治疗，优选使用上皮细胞；若要实施眼部的治疗，优选使用与例如角膜、结膜的修复部位有关的眼部相关细胞。因此，待培养的细胞通常根据要实施的治疗来选择。适于收集用于本发明的治疗性应用的生物细胞的方案会根据所使用的细胞的来源而变化。细胞收集方案是已知的，且本领域技术人员可以很容易地确定优选的方案。

若本发明的药物或方法用于治疗特发性肺纤维化，优选将要使用的干或祖细胞诱导分化成呼吸道上皮祖细胞。优选地，用于本发明的干或祖细胞分化成肺泡上皮细胞。这些已分化的干或祖细胞在提供给个体之前可以或者可以不从未分化的干或祖细胞中纯化出来。

本领域的技术人员会理解，用于诊断纤维化疾病的方法取决于待评估的纤维化的特定类型。例如，若所述纤维化是特发性肺纤维化时，那么可以通过胸腔的高分辨率CT扫描来进行诊断，所述CT扫描结果可由肺脏活检支持。使用这种诊断评估，可以选择用本发明的药物或方法来治疗的个体。有关特发性肺纤维化的诊断的更多信息可在Demedts and Costabel(2002)Eur Respir J 19，794-796中找到。诊断与皮肤和眼部相关的纤维化病症的方法同样是已知的。

在本发明的治疗方法中以及在本发明的药物的用途中，可以将治疗有效量的干细胞或祖细胞给予需治疗的个体。本发明文中所用的“治疗有效量”是指合适细胞的任何量，该细胞当给予患有所述细胞对其有效的纤维化疾病的个体时，导致纤维化的减轻、缓解或消退。

上述的“能够增加干细胞和/或祖细胞在纤维化部位可利用的和/或植入的数目的试剂”可以是能够增加内源性干细胞和/或祖细胞的数目的试剂。

本文中所用的“增加内源性干细胞和/或祖细胞数目”包括试剂使内源性干细胞和/或祖细胞的数目，或者使所述细胞的植入物增加了2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍的情形。

可选择地，“能够增加干细胞和/或祖细胞在纤维化部位可利用的和/或植入的数目的试剂”可以包含治疗有效量的干细胞和/或祖细胞以及增加内源性干细胞和/或祖细胞数目的试剂两者。

如上所述，本发明的“抗纤维化试剂”包括能够减轻个体体内的纤维化的试剂。下面进一步了抗纤维化试剂的实例，其包括RhoA、RhoA GTPases、TGF-β1、CTGF信号分子或者RhoA信号通路的诸如内皮素-1(ET-1)的其他成员的调节剂。该试剂还包括调节细胞因子信号传导抑制子1(SOCS 1)、细胞因子信号传导抑制子3(SOCS 3)或者SOCS 3的受体TLR9的作用的试剂。

本发明人最近表明了RhoA在纤维化性肺疾病的发病过程中起到了重要作用。类似地，已表明，Rho GTPases在转化生长因子β1(TGF-β1)以及包括结缔组织生长因子(CTGF)在内的下游信号分子的活化中起到了关键作用，所述下游信号分子是一些重要的纤维生成因子，负责胶原合成、ECM沉积、其他必要的促-纤维化的细胞组分/可溶组分的动员。因此，可以认为调节RhoA、RhoA GTPases、TGF-β1、CTGF信号分子作用的试剂是抗纤维化试剂。

RhoA的特异性靶向或抑制其活化的处理可以提供新的抗纤维化治疗方法。本发明人在这项研究中证明了他汀类药物能够用作抗纤维化试剂，最有可能是通过作为RhoA或RhoA GTPases活性的调节剂。

因此，在本发明的药物和方法的一个实施方案中，抗纤维化试剂是他汀类化合物或其衍生物。

他汀类药物(statins)是一组广泛使用处方药物，主要用于降低血液中胆固醇水平。已知他汀类药物通过阻断酶，即3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的还原酶来干扰胆固醇合成。

在2000年，他汀类药物是排名第二的畅销类药物，全球的销售额接近160亿美元。在美国，他汀类药物的销售额从1997年的36亿美元增加到2000年的90亿美元。单是阿托伐他汀在2000年就大约开出了4800万张处方单，使它成为美国当年配发最频繁的药物。他汀类药物包括洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、罗苏伐他汀(rosuvastatin)。

洛伐他汀：其系统(IUPAC)名为[8-[2-(4-羟基-6-氧代-噁烷(oxan)-2-基)乙基]-3，7-二甲基-1，2，3，7，8，8a-六氢萘酚-1-基]2-甲基丁酸酯。它的分子式为C₂₄H₃₆O₅，分子量为404.54g/mol。洛伐他汀是一种白色的、非吸湿的结晶性粉末，其不溶于水，微溶于乙醇、甲醇、乙腈。

普伐他汀：其系统(IUPAC)名为3，5-二羟基-7-[6-羟基-2-甲基-8-(2-甲基丁酰氧基)-1，2，6，7，8，8a-六氢萘酚-1-基]-庚酸，它的分子式为C₂₃H₃₆O₇，分子量为424.528g/mol。

氟伐他汀：其系统(IUPAC)名为7-[3-(4-氟苯基)-1-(1-甲基乙基)-1H-吲哚-2-基]-3，5-二羟基-庚-6-烯酸，它的分子式为C₂₄H₂₆FNO₄，分子量为411.466g/mol。

西立伐他汀：其系统(IUPAC)名为(E，3R，5S)-7-[4-(4-氟苯基)-5-(甲氧基甲基)-2，6-二异丙基-2-基-吡啶-3-基]-3，5-二羟基-庚-6-烯酸，其分子式为C₂₆H₃₄FNO₅，分子量为459.55g/mol。

阿托伐他汀：其系统(IUPAC)名为[R-(R^*，R^*)]-2-(4-氟苯基)-β，Δ-二羟基-5-(1-甲基乙基)-3-苯基-4-[(苯胺基)羰基]-1H-吡咯-1-庚酸，它的分子式为C₃₃H₃₄FN₂O₅，分子量为558.64g/mol。

辛伐他汀：其系统(IUPAC)名为[(1S，3R，7R，8S，8aR)-8-[2-[(2R，4R)-4-羟基-6-氧代-噁烷(oxan)-2-基]乙基]-3，7-二甲基-1，2，3，7，8，8a-六氢萘酚-1基]2，2-二甲基丁酸酯。分子式为C₂₅H₃₈O₅，分子量为418.566g/mol。

匹伐他汀：其系统(IUPAC)名为(E)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)对二苯酚-3-基]-3，5-二羟基-庚-6-烯酸。分子式为C₂₅H₂₄FNO₄，分子量为421.461g/mol。

罗苏伐他汀：其系统(IUPAC)命为7-[4-(4-氟苯基)-6-(1-甲基乙基)-2-(甲基-甲基磺酰-胺)-嘧啶-5-基]-3，5-二羟基-庚-6-烯酸。它的分子式为C₂₂H₂₈N₃FO₆S，分子量为481.539g/mol。

可以使用上述的抗纤维化活性测定来确定能用于本发明的药物和方法的他汀类化合物或其衍生物的量。并且，他汀类药物的治疗有效量是已知的，也能够从合适的供应商处获得，或者例如也可以从美国食品饮料协会(US FDA)的网站：www.fda.gov上获得。

所述的他汀优选是辛伐他汀。

本发明中所用的“他汀或其衍生物”包括能够调节RhoA或RhoAGTPases活性的结构上相关的化合物。也包括他汀类药物的前体药物形式。此外，下面谈到的他汀类药物的纳米颗粒形式也被认为是他汀类化合物的衍生物。下面的实施例1中提供了一种可以评价化合物对纤维化影响的测定。因此，该测定能够用于确定结构上与他汀相关的化合物是否仍然能够起到调节RhoA或RhoA GTPases活性的作用。本申请中所使用的术语“前体药物”是指他汀的前体或衍生形式，其能够被酶促活化或转化为更有效的母体形式。

如上所述，调节RhoA、RhoA GTPases、TGF-β1和CTGF信号分子或者RhoA信号通路的其他成员的作用的试剂，可以在本发明中用作抗纤维化试剂。本文中所用的“调节剂”，优选指降低这类分子的数量或功能的试剂。然而，该试剂也可以破坏所述分子在信号通路中的作用。

本文中所用的“降低...数量或功能”包括该试剂使这类信号分子的数量或功能比正常的数量或功能降低了2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍的情形。

所述试剂可以包括，例如，反义分子、核酶和诸如特异性信号分子的中和抗体的拮抗剂。

RhoA、RhoA GTPases、TGF-β1和CTGF信号分子是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员可以很容易地识别对应于这些信号分子中的每一种的核酸和多肽序列。例如，RhoA序列的UniProt登陆号为P06749/Q9UEJ4。TGF-β1的UniProt登陆号为P01137/Q9UCG4。CTGF的UniProt登陆号为P29279/Q96QX2。

可以使用链接http://www.ebi.uniprot.org/uniprot-srv/index.do来进行UniProt数据库的检索。

反义寡核苷酸是单链核苷酸，其能够特异性结合到互补的核苷酸序列。通过结合到合适的靶序列，形成了RNA-RNA、DNA-DNA或RNA-DNA双链体。这些核酸通常称为“反义核酸”，因为它们与基因的正义或编码链互补。最近，已经证明如果寡核苷酸结合到DNA双链体上，也可能形成三链螺旋体。已发现寡核苷酸能够识别DNA双螺旋体大沟处的序列。由此形成了三螺旋体。这表明合成序列-特异性分子是可能的，该序列-特异性分子通过形成合适的大沟氢键特异性结合双链DNA。

上述的寡核苷酸通过与靶核酸结合可以抑制靶核酸的功能。这可以是，例如，阻断转录、加工、加poly(A)、复制、翻译或者促进细胞的抑制机制(例如促进RNA的降解)的结果。

采用标准的实验操作在实验室制备反义寡核苷酸，这可以为本领域技术人员所理解。然后可以将反义分子提供给个体，例如通过呼吸道递送。首先发现了反义寡核苷酸能够在劳斯肉瘤病毒、水泡性口炎病毒、单纯疱疹病毒1型，猴病毒和流感病毒的细胞培养物中抑制病毒复制或表达。之后，通过反义寡核苷酸来抑制mRNA的翻译在包括兔网织红细胞裂解液和麦芽提取物在内的无细胞体系中得到了深入地研究。使用与AIDS HIV逆转录病毒RNA互补的寡核苷酸，已在体外证实了通过反义寡核苷酸对病毒功能的抑制。

通常，反义寡核苷酸的长度为15到35个碱基。例如，已表明，20-mer(部分)的寡核苷酸抑制表皮生长因子受体mRNA的表达，以及25-mer(部分)的寡核苷酸降低促肾上腺皮质激素的表达达90％以上。然而，可以理解，使用长度不在这个范围的寡核苷酸也是理想的，例如10、11、12、13或14个碱基，或者36、37、38、39、40个碱基。设计对应于RhoA、RhoA GTPases、TGF-β1和CTGF信号分子或者RhoA信号通路的其他成员的核酸的反义分子属于常规技术，且可以很容易地由本领域技术人员完成。

本文中所用的“反义”，包括所有RNA干扰的方法，基于本发明的目的，其被视为一类反义技术。

调节RhoA、RhoA GTPases、TGF-β1和CTGF信号分子或者RhoA信号通路的其他成员的另外方法是使用能够切割编码这些蛋白的RNA或DNA的核酶。可以在与用于反义分子的载体基本上相同的载体中，或者使用与用于反义分子的载体基本上相同的载体来支配表达所述核酶或核酶蛋白的基因。可以理解，从细胞特异性启动子元件或可调节启动子来表达反义分子或核酶可以是理想的。

本发明的这类基因构建体可以采用本领域所熟知的方法来制备。

调节RhoA、RhoA GTPases、TGF-β1和CTGF信号分子或者RhoA信号通路的其他成员的另外方法是使用一种或多种用作这些多肽拮抗剂的试剂。

术语“拮抗剂”是本领域技术人员所熟知的。本文中所定义的“拮抗剂”包括任何能够改变RhoA、RhoA GTPases、TGF-β1和CTGF信号分子或者RhoA信号通路的其他成员的水平和/或功能的试剂。拮抗剂的实例，包括能结合到多肽且影响多肽功能的化学配体；更广义地来说，其也可以包括结合到所述多肽的一种的抗体或抗体片段，使得该多肽不能发挥其正常的功能。拮抗剂也可以改变所述多肽的亚细胞定位，通过这种方式减少功能性多肽的数量。

本文中所用的“抗体”，包括完整的单克隆和多克隆抗体分子以及抗体片段(诸如，例如，Fab和F(ab′)2片段)。Fab和F(ab′)2片段缺少完整抗体的Fc片段，从循环中清除得更快，且较少发生完整抗体的非特异性组织结合。

调节RhoA、RhoA GTPases、TGF-β1和CTGF信号分子或者RhoA信号通路的其他成员的另外方法是利用这些分子的显性失活形式。例如，可以修饰多肽以产生RhoA或RhoA GTPase显性失活形式，但是该多肽不能在Rho的信号通路中起作用。可选择地，所述显性失活形式可以无法在细胞内正确地运输。

修饰多肽序列的方法是本领域的常见技术，且可以被本领域技术人员容易地利用。多肽序列的修饰对该多肽功能的影响可以使用下面实施例1中所述的测定来评估。

另外的“抗纤维化药剂”包括调节细胞因子信号传导抑制子1(SOCS 1)、细胞因子信号传导抑制子3(SOCS 3)或SOCS 3的受体TLR9的作用的试剂。本发明中所用的“调节剂”优选指增加这类分子的数量或功能，或者破坏细胞-细胞或细胞-介质的相互作用以增加分子数量或功能的试剂。

已表明，在包括肝在内的器官的纤维化病变中，SOCS 3的表达缺失和/或下调。本发明人也表明了在肺纤维化部位SOCS 3的表达发生了相似的下调。因此，在本发明药物和方法的一个实施方案中，抗纤维化试剂是SOCS 3的表达或活性的激活剂。

SOCS 1和SOCS 3是STAT-诱导的STAT抑制剂(SSI)的成员，也已知属于细胞因子信号传导抑制子(SOCS)家族。SSI家族成员是细胞因子可诱导的细胞因子信号传导负调节子。

下文提供了人SOCS 1和SOCS 3的蛋白序列。有关蛋白和核酸序列的另外信息可以在UniProt数据库中检索到。

SOCS 1蛋白序列(UniProt登陆号为ol5524、ol5097、q9nsa7)：

MVAHNQVAAD    NAVSTAAEPR    RRPEPSSSSS    SSPAAPARPR    PCPAVPAPAP

GDTHFRTFRS    HADYRRITRA    SALLDACGFY    WGPLSVHGAH    ERLRAEPVGT

FLVRDSRQRN    CFFALSVKMA    SGPTSIRVHF    QAGRFHLDGS    RESFDCLFEL

LEHYVAAPRR    MLGAPLRQRR    VRPLQELCRQ    RIVATVGREN    LARIPLNPVL

RDYLSSFPFQ    I

SOCS 3蛋白序列(UniProt登陆号为ol4543、ol4509)：

MVTHSKFPAA    GMSRPLDTSL    RLKTFSSKSE    YQLVVNAVRK    LQESGFYWSA

VTGGEANLLL    SAEPAGTFLI    RDSSDQRHFF    TLSVKTQSGT    KNLRIQCEGG

SFSLQSDPRS    TQPVPRFDCV    LKLVHHYMPP    PGAPSFPSPP    TEPSSEVPEQ

PSAQPLPGSP    PRRAYYIYSG    GEKIPLVLSR    PLSSNVATLQ    HLCRKTVNGH

LDSYEKVTQL    PGPIREFLDQ    YDAPL

在一个实施方案中，抗纤维化试剂可以是SOCS 1或SOCS 3多肽，或者其功能片段或变体、或其融合体。合成SOCS 1和SOCS 3多肽的方法是本领域技术人员所熟知的常规技术。

抗纤维化试剂也包括能够提高SOCS 3信号分子的受体TLR9的数量或功能的试剂。

TLR9是用于配体的Toll样受体的成员。下面提供了人TLR9的蛋白序列。有关蛋白和核酸序列的另外信息可以在UniProt数据库中检索到。

TLR9蛋白序列(UniProt登陆号为q9nr96、q6uvz2、q9hd68、q9hd69、 q9hd70、q9nyc2、qgnyc3)：

MGFCRSALHP    LSLLVQAIML    AMTLALGTLP    AFLPCELQPH    GLVNCNWLFL

KSVPHFSMAA    PRGNVTSLSL    SSNRIHHLHD    SDFAHLPSLR    HLNLKWNCPP

VGLSPMHFPC    HMTIEPSTFL    AVPTLEELNL    SYNNIMTVPA    LPKSLISLSL

SHTNILMLDS    ASLAGLHALR    FLFMDGNCYY    KNPCRQALEV    APGALLGLGN

LTHLSLKYNN    LTVVPRNLPS    SLEYLLLSYN    RIVKLAPEDL    ANLTALRVLD

VGGNCRRCDH    APNPCMECPR    HFPQLHPDTF    SHLSRLEGLV    LKDSSLSWLN

ASWFRGLGNL    RVLDLSENFL    YKCITKTKAF    QGLTQLRKLN    LSFNYQKRVS

FAHLSLAPSF    GSLVALKELD    MHGIFFRSLD    ETTLRPLARL    PMLQTLRLQM

NFINQAQLGI    FRAFPGLRYV    DLSDNRISGA    SELTATMGEA    DGGEKVWLQP

GDLAPAPVDT    PSSEDFRPNC    STLNFTLDLS    RNNLVTVQPE    MFAQLSHLQC

LRLSHNCISQ    AVNGSQFLPL    TGLQVLDLSH    NKLDLYHEHS    FTELPRLEAL

DLSYNSQPFG    MQGVGHNFSF    VAHLRTLRHL    SLAHNNIHSQ    VSQQLCSTSL

RALDFSGNAL    GHMWAEGDLY    LHFFQGLSGL    IWLDLSQNRL    HTLLPQTLRN

LPKSLQVLRL    RDNYLAFFKW    WSLHFLPKLE    VLDLAGNQLK    ALTNGSLPAG

TRLRRLDVSC    NSISFVAPGF    FSKAKELREL    NLSANALKTV    DHSWFGPLAS

ALQILDVSAN    PLHCACGAAF    MDFLLEVQAA    VPGLPSRVKC    GSPGQLQGLS

IFAQDLRLCL    DEALSWDCFA    LSLLAVALGL    GVPMLHHLCG    WDLWYCFHLC

LAWLPWRGRQ    SGRDEDALPY    DAFVVFDKTQ    SAVADWVYNE    LRGQLEECRG

RWALRLCLEE    RDWLPGKTLF    ENLWASVYGS    RKTLFVLAHT    DRVSGLLRAS

FLLAQQRLLE  DRKDVVVLVI  LSPDGRRSRY  VRLRQRLCRQ  SVLLWPHQPS

GQRSFWAQLG  MALTRDNHHF  YNRNFCQGPT  AE

在一个实施方案中，抗纤维化试剂可以是TLR9多肽或者其功能片段或变异体，或其融合体。合成TLR9多肽的方法是本领域技术人员所熟知的常规技术。

本发明中所用的SOCS 1，SOCS 3和TLR9的“其功能片段或变异体”包括能在本发明中用作抗纤维化试剂的多肽。所述变异体由基因编码，该基因中可以取代有与初始密码子编码相同的氨基酸的不同密码子。可选地，取代的密码子可以编码不同的氨基酸，所述氨基酸不会影响该蛋白的功能或免疫原性，或者可以改善该其功能或免疫原性。例如，可以利用定点突变或其他技术来产生单突变或多点突变，诸如替代、插入、删除和转座，这会为本领域技术人员所理解。

本发明中所用的“其融合体”，包括SOCS 1、SOCS 3或TLR9多肽融合到任何其他的多肽或脂质的情形。例如，为了易化所述多肽的纯化，可以将所述多肽融合到诸如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或蛋白质A的多肽。这类融合体的实例为本领域技术人员所熟知。类似地，所述多肽可以融合到诸如His6的寡-组氨酸标签序列或融合到被抗体识别的抗原决定基如熟知的Myc标签抗原决定基。

抗纤维化试剂也包括增加SOCS 1、SOCS 3或TLR9数量或活性的试剂。这类试剂的实例包括增加编码SOCS 1、SOCS 3或TLR9的核酸基因的表达水平或翻译效率的试剂。

本发明中所用的“提高...数量或功能”，包括所述试剂将SOCS 1、SOCS 3或TLR9的数量或功能比正常的数量或功能增加了2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍的情形。

关于本发明的这个实施方案，本发明人已确定了在纤维化组织中，由于SOCS 3基因的甲基化，SOCS 3表达是下降的。因此，减少SOCS3基因座的甲基化的试剂，例如染色质重塑因子，能够导致SOCS 3蛋白水平的增加。这类试剂可以包括DNA甲基化调节剂，例如阿扎胞苷(azacitidine)或2-嘧啶肌苷(Zebularine)。

本说明书的实施例1提供了评价化合物对纤维化影响的测定。因此，该测定能够用作筛选手段以鉴定所测试的化合物能否在本发明中用作抗纤维试剂。该测定也可以用来鉴定针对RhoA、RhoA GTPases、TGF-β1和CTGF信号分子或者RhoA信号通路的其他成员的抗体能否用作拮抗剂，以及鉴定这些多肽的突变型是否可以用作该分子的显性失活形式。因此，对于本领域技术人员来说，使用所述测定常规地鉴定用于本发明的其他抗纤维化试剂是可能的。

本发明的另外实施方案是药物还包含免疫抑制剂和/或抗炎剂和/或DNA甲基化的调节剂，或者给予个体所述免疫抑制剂和/或抗炎试剂和/或DNA甲基化的调节剂的情形。

可以用于本发明的这方面的免疫抑制剂和/或抗炎剂的实例包括糖皮质激素、硫唑嘌呤、环孢素、环磷酰胺、甲氨喋呤或羟化氯喹。DNA甲基化的调节剂的实例包括阿扎胞苷或2-嘧啶肌苷(Zebularine)。

本发明的药物可以根据现有技术的已知操作来制备。可以基于药物给药的优选途径来确定合适的制剂。本发明的药物优选制备成适于吸入给药、局部给药、眼部给药、注射给药或者植入给药的剂型。

如上所述，通过本发明的药物或方法来治疗的纤维化病症优选特发性肺纤维化。并且，抗纤维化试剂优选他汀类化合物或其衍生物。在本发明的这种实施方案中，他汀或他汀衍生物优选制备成用于经鼻内或通过吸入递送到肺的气雾剂。

经鼻或通过吸入给药的他汀或他汀衍生物通常以干粉吸入剂或气雾喷剂包装的形式来递送，所述干粉吸入剂或气雾剂来自采用了合适的推进剂的增压容器、泵、喷雾器(spray)或喷雾器(nebuliser)；所述推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、诸如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134A3)或者1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(HFA 227EA3)的氢氟烷、二氧化碳或其他合适的气体。如果是增压的气雾剂，剂量单位可以通过所提供的阀的递送计量来确定。所述增压容器、泵、喷雾器(spray)或喷雾器(nebuliser)可以容纳活性化合物的溶液或悬液，例如采用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂，该溶液或悬液中还可以包含诸如山梨聚糖醇三油酸酯的润滑剂。在吸入器(inhaler)或吸入器(insufflator)中使用的胶囊和药筒(例如，用凝胶制成的)可以配制成含有粉末状混合物，该混合物为本发明的化合物与诸如乳糖或淀粉的合适的粉基的混合物。

气雾剂或干粉剂制剂优选设计成每一计量剂量(metered dose)或“每次喷出的药物(puff)”包含了合适量的递送给个体的他汀或他汀衍生物。可以理解，使用的气雾剂的总日剂量在不同患者之间会不同，且该总日剂量可以在一天内以一次剂量给予，或者更通常，以分次剂量给予。

如果他汀或他汀衍生物以气雾剂的形式递送到个体，可以想到该化合物会被配制成纳米颗粒。纳米颗粒剂型的他汀类及他汀衍生物可以采用本领域的已知技术制备。对于经鼻内或通过吸入到肺的递送方式，纳米颗粒剂型的他汀或他汀衍生物的直径优选小于10μm，以能够沉积在远端呼吸道和实质。更优选地，纳米颗粒的直径为5至7μm。

如上所述，采用本发明的药物或方法治疗的纤维化病症可以是眼部的纤维化。如果使用的抗纤维化试剂是他汀类化合物或其衍生物，在本发明的这种实施方案中，他汀或他汀衍生物优选制备成适用于递送到眼部的液体剂型。用作眼药时，他汀或他汀衍生物可以配制成在等渗的、已调整pH值的、无菌盐水中的微粉悬浮液；或者，优选地，配制成在等渗的、已调整pH值的、无菌盐水中的溶液；任选地，与诸如苯甲基氯的防腐剂结合。

此外，通过使用本发明的药物或方法来治疗的纤维化病症可以是皮肤的纤维化。若使用的抗纤维化试剂是他汀类化合物或其衍生物，在本发明的这种实施方案中，他汀或他汀衍生物优选制备成适用于直接用到皮肤上的局部给药的剂型。

对于皮肤的局部应用，他汀或他汀衍生物可以配制成含有活性化合物的合适的软膏，悬浮于或溶解在例如下述的一种或多种的混合物中：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯类化合物、乳化蜡和水。可选地，它们可以被制备成合适的洗剂或乳剂，悬浮或溶解在诸如下述的一种或多种的混合物中：矿物油、山梨糖醇酐单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二醇、苯甲醇和水。

在本发明的药物或方法涉及生物细胞的使用时，优选制备成包含在合适的液体载体中的生物细胞的制剂。该液体载体优选是非免疫原性的，且可以包含盐溶液、细胞培养基或蒸馏水。注射用制剂可以是上述的制剂，或者也可以采用凝胶形式，所述制剂优选能通过被治疗的个体的身体所溶解。适用于植入的制剂可以采用上述的用于注射或吸入的形式，也可以包含接种于支架或基质上的生物细胞，所述支架或基质可以提供新组织生长的基础。

本发明的药物不包含生物细胞时，可以采用用于治疗剂给药的另外形式。因此，例如，药物可以是粉末、片剂、胶囊、液体、软膏、乳剂、凝胶、水凝胶、气雾剂、喷雾剂、胶束、透皮药贴、脂质体的形式或任何其他适用于人或动物给药的形式。可以理解，赋形剂应该是能被其给药的个体良好耐受的赋形剂。

液体赋形剂可以用于制备溶液、悬浮液、乳剂、糖浆、酏剂和增压的组合物。液体赋形剂可以包含合适的药物添加剂，诸如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、增甜剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、增色剂、粘性调节剂、稳定剂或渗透压调节剂。用于口服和肠胃外给药的液体赋形剂的合适的实例包括水(部分含有上述的添加剂，例如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素纳溶液)、醇(包括单羟基醇和多羟基醇，例如乙二醇)和它们的衍生物，以及油类(例如，分馏获得的椰子油和花生油)。若采用肠胃外给药，赋形剂也可以是诸如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯的油酯。无菌的液体赋形剂用于肠胃给药的无菌液体形式组合物中。用于增压组合物的液体赋形剂，可以是卤代烃或其他药学上可以接受的推进剂。

无菌溶液或悬浮液形式的液体药物组合物，能够用于诸如肌肉的、鞘内的、硬膜外的、腹腔的或皮下的注射。无菌溶液也可以通过静脉内给药。化合物可以制备成无菌的固体组合物，在给药时使用无菌水、盐溶液或其他合适的无菌注射介质将所述固体组合物溶解或悬浮。赋形剂包括必要的且无活性的粘合剂、悬浮剂、润滑剂、香料、甜味剂、防腐剂、干燥剂和衣料。

可以理解，本发明中所使用的且配制成药物的干或祖细胞的数目、或能够增加内源性干和/或祖细胞数目的试剂的量、或抗纤维化试剂的量，依其生物活性和生物利用度而定，所述生物活性和生物利用度取决于给药模式和所使用的试剂或细胞的物理化学性质。给药的频率也受到上述因素的影响，特别是受到这些细胞或试剂在被治疗个体的体内的半衰期的影响。

给药的最佳剂量可以由本领域技术人员来确定，且会随着所使用的特定的细胞或试剂、制剂的药效强度、给药模式以及待治疗的疾病状况的进展而变化。依赖于待治疗的特定个体的其他因素会导致调整剂量的需要，所述因素包括个体年龄、体重、性别、饮食习惯和给药时间。

若抗纤维化试剂为他汀或其衍生物，用于本发明的药物或方法的化合物的剂量优选低于用于控制高血脂的剂量。

已知的操作，诸如那些制药工业常规使用的那些操作(例如，体内试验、临床试验等)，可以用来确立组合物的具体制剂和精确的治疗方案(例如，试剂或细胞的日剂量和给药频率)。

日剂量可以以单次给药(例如，每日一次性口服药片或每日一次注射)给予。可选地，使用的细胞或试剂可以需要一天内两次或更多次给药，这取决于药理学、毒理学或药效学研究结果。

本发明的另一方面提供了组合物，其包含能够增加干细胞和/或祖细胞在纤维化部位可利用的和/或植入的数目的试剂与抗纤维化试剂。

本发明的另一方面提供了药物组合物，其包含能够增加干细胞和/或祖细胞在纤维化部位可利用的和/或植入的数目的试剂、抗纤维化试剂以及药学上可以接受的载体。

本发明中所用的“能够增加干细胞和/或祖细胞在纤维化部位可利用的和/或植入的数目的试剂”和“抗纤维化试剂”，包括与本发明前述方面相关的本发明上述的这些特征的所有实施方案。特别优选的是本发明的组合物和药物组合物包括治疗有效量的干和/或祖细胞的情形。

同样优选的是抗纤维化试剂为他汀类化合物或其衍生物的情形。在这一实施方案中，优选将药物组合物制备成用于经鼻内的或者通过吸入递送到肺的气雾剂。

因此，本发明的组合物和药物组合物可以包含治疗有效量的干和/或祖细胞以及他汀类化合物或其衍生物。

本发明也提供了制备药物组合物的方法，该方法包括将能够增加干细胞和/或祖细胞在纤维化部位可利用的和/或植入的数目的试剂与抗纤维化试剂以及药学上可接受的赋形剂结合。

在本发明的实践中，“药学上可接受的赋形剂”是本领域技术人员已知的、用于配制药物组合物的任何生理学赋形剂。

在一个优选的实施方案中，药物赋形剂可以包括他汀类化合物或其衍生物，并且可以制备成用于经鼻内的或者通过吸入递送到肺的气雾剂。

本发明另一方面提供了上文定义的用于医学的组合物或药物组合物，该组合物或药物组合物与本发明的前述方面相关。

下面将结合附图和实施例来描述本发明的实施方案，其中，

图1：鉴定抗纤维化试剂的筛选模型；

图2：肺泡上皮细胞的创伤修复模型的图像；

图3：上皮细胞创伤愈合的时间图；

图4：他汀治疗对创伤修复的作用；

图5：肺成纤维细胞中的SOCS3基因的表达；

图6：鼠ESC细胞的分化过程中的CTGF基因的表达；

图7：鼠ESC细胞的分化过程中的αSMA基因的表达；

图8：分化中的干细胞的细胞周期蛋白D1和DAPI染色；

图9：SOCS-3基因的表达-正常肺成纤维细胞；

图10：IPF肺成纤维细胞中的SOCS-3基因的表达；

图11：间接接触模型；

图12：与肺成纤维细胞共培养后的A549的创伤愈合应答；

图13：在与IPF来源的肺成纤维细胞间接共培养的过程中，A549AEC的细胞扩散/迁移；

图14：直接接触模型；

实施例1：用于评价试剂的抗纤维化特性的测定

测定目的：为评价影响受创伤的肺泡上皮细胞层的ESC迁移、植入和修复的因素。

下述测定可以用作筛选手段以鉴定抗纤维化试剂以及可以用于实现抗纤维化效果的试剂的量。

对于在肺纤维化中成功地应用基于干细胞的策略，关键的问题在于祖细胞、纤维化刺激物和损伤的肺泡上皮细胞之间的相互作用如何影响创伤修复的效果。为了解决这一问题，我们采用了特异性适应的肺泡上皮的创伤模型来研究：(i)损伤的上皮细胞是否足以指引干细胞的分化；如果不可以，ESC是否需要被分化和/或预先从非靶细胞群中纯化出来；(ii)这些相互作用是如何由纤维化刺激物的叠加式存在调节的。作为第一步，这一模型提供了对ESC的植入进行可控的、定量的生理学分析，没有与体内模型相关的潜在的复杂因素如植入的细胞被清除到肺外组织和免疫原性。获得的信息会为将来ESC的体内植入操作提供信息。将ESC细胞群接种于transwell培养小室内，置于单层的肺泡AEC(其受到机械性创伤)的上方(图1)；可以通过用试验刺激物(例如，从动物/患者模型中得到的生长因子和/或支气管肺泡灌洗液)的调节选择性改变细胞的环境。还将用收集自相同小鼠的薄的肺组织切片替代单层的AEC来进行单独研究。

研究的ESC细胞群可以包括(i)未分化的细胞；(ii)按照AEC祖细胞方案分化但未纯化的细胞；(iii)已分化且纯化的AEC祖细胞。ESC用通用的荧光细胞追踪染料CDFA-SE标记，用于使用激光扫描共聚焦显微镜的实时地时序显影(time series visualization)，以追踪ESC向上皮细胞单层或肺组织内的迁移和植入。分析包括：(a)植入和迁移的定量：将含有植入的ESC的上皮细胞/组织固定于福尔马林中；对组织进行冷冻切片；经DAPI染色后观察到细胞核；用荧光显微镜检查来定量迁移的细胞；(b)表型：基于分化的肺上皮细胞(SPC、SPB、SPA、CC10、水通道蛋白5)、分化的间充质细胞(α-SMA、溶胶原蛋白I和III、波形蛋白、脯氨酰-羟化酶β)、分化的内皮细胞(CD31)、分化的巨噬细胞(CD68)以及未分化的ESC(Oct4、CD9)的标志物，通过免疫荧光确定迁移的/植入的细胞的表型。在给定条件下，也评价了上皮细胞创伤愈合的标记(signs)和修复的速率。创伤细胞/组织层中凋亡细胞的检测利用膜联蛋白V-cy3进行分析。拍摄荧光图像及相位图像，且将荧光凋亡细胞表示为存在的细胞总数的百分比。

将待测试抗纤维化活性的试剂(图1中所示的“介质(mediator)”)加入到培养基中。随后通过比较用测试试剂进行的测定中与一个或多个“对照”测定(培养基中不加入测试试剂)中显示的纤维化程度来评价所述试剂对纤维化的影响。如本领域技术人员可以理解的，这种测定也可以用来确定可以用于提供“抗纤维化”效应的试剂的量。

因此，上述的程序可以用作评价化合物对纤维化影响的测定。所以，该测定可以用作鉴定测试的化合物能否用作本发明的抗纤维化试剂的筛选手段。该测定也可以用于鉴定针对RhoA、RhoA GTPases、TGF-β1、CTGF信号分子或者RhoA信号通路的其他成员的抗体能否用作拮抗剂，以及鉴定这些多肽的突变型能否用作该分子的显性失活形式。因此对本领域技术人员来说，使用该测定来常规鉴定用于本发明另外的抗纤维试剂是可能的。

实施例2：肺泡上皮细胞创伤修复模型的数据

1、表明来自肺纤维化患者的支气管肺泡灌洗液(BALF)抑制上皮细胞修复的数据。

在本研究中，使用了肺泡上皮细胞创伤修复模型。A549肺泡上皮细胞(AEC)单层受到机械性创伤(被吸管头刮擦；图2示出了上皮细胞单层的创伤部位)，并且与从健康的、不吸烟的志愿者或特发性肺纤维化患者(IPF)分离得到的支气管肺泡灌洗液一起孵育。处理后24小时的过程中，监测创伤的愈合情况。

采用这种模型，我们的结果表明了(图3)与正常对照组的灌洗液相比，存在于纤维化的BAL中的因子显著抑制了修复(p＜0.05)。也研究了抑制上皮细胞修复的机制。我们的结果表明了IPF BAL抑制细胞的扩散和迁移达2.6倍。另外，来自纤维化BAL中的因子显著减少了创伤边缘的增殖细胞数(p＜0.05)。

通过这些数据，我们认为在纤维化肺内(如在我们模型中通过BAL所示的)的诸如CTGF、TGF、ET-I的促纤维化生长因子能成功抑制肺泡上皮细胞的修复和/或再生。对修复或再生的这种抑制使得肺纤维化一直存在。我们的数据表明了需要调节肺内的纤维化环境，以使修复得以启动。

2、他汀类化合物治疗能够改善上皮细胞修复且阻碍纤维化的BAL的抑制效应的证据。

采用上述的AEC创伤修复模型，我们检测了基于他汀的化合物能否改善肺泡上皮细胞的修复。图4所示的数据是使用A549上皮细胞和辛伐他汀得到的。从该数据可以看出，他汀改善创伤修复模型中的创伤愈合。

3、在IPF成纤维细胞中，细胞因子信号传导抑制子3(SOCS3)的表达缺失，且SOCS3可能是新的治疗靶点。

通过实时PCR，检测了用10％FCS或TGFβ(5ng/ml)处理的肺成纤维细胞中SOCS3基因的表达水平。结果(图5)显示在来源于IPF的肺成纤维细胞中SOCS3的表达基本上缺失，这说明了这些细胞对于诸如TGFβ的生长因子的过量表达呈高反应性。

我们已确定了在来源于IPF的肺成纤维细胞中SOCS3的表达水平下降是由于SOCS3基因沉默而导致的，SOCS3基因沉默是由于发生了DNA甲基化。这一发现提示提高SOCS3的表达水平可以起到降低肺纤维化的作用。提高SOCS3的表达水平的机制包括：将SOCS3的重组蛋白导入肺上皮细胞中、通过降低SOCS3的甲基化水平来提高SOCS3的基因表达水平以及增加SOCS3受体蛋白的量。

下面给出了有关SOCS3和肺纤维化的进一步信息。

实施例3：干细胞和纤维化

1、在响应TGFβ时，干细胞表达了重要的致纤维化介质-提示干细胞在致纤维化的环境中参与了纤维化且使得纤维化一直存在。

当干细胞与TGFβ接触时，我们测定了干细胞中致纤维化标志物的基因表达水平。结果表明，在干细胞分化和生长的过程中表达了结缔组织生长因子(CTGF)(图6)和α-平滑肌肌动蛋白(SMA)(图7)，这两者都是干细胞分化为纤维化的和成肌纤维细胞的细胞表型的重要标志物。

2、干细胞的增殖和细胞周期调控受到依赖于分化状态的周期蛋白D1调节。

周期蛋白D1是一种公认的细胞周期调节蛋白，其表达被认为与纤维化有关。因此，我们采用免疫组织化学染色方法来检测在干细胞分化过程中的周期蛋白D1的水平。从图8中可以看出，周期蛋白D1的表达水平在细胞分化的过程中发生变化：第4天和第8天，周期蛋白D1在干细胞中表达，但是不参与未分化阶段的干细胞的增殖。DAPI染色作为使视野内存在的所有细胞的细胞核染色的对照。

图6到图8显示的数据表明：当干细胞处于偏向纤维化的环境，即患有IPF个体的肺部环境中时，干细胞会沿着成纤维细胞/成肌纤维细胞的谱系增殖，而不向肺泡上皮细胞分化，而向肺泡上皮细胞分化对于肺的修复是必需的。

4、讨论

上述的发现支持治疗肺纤维化的组合方法。首先，使用他汀或他汀衍生物可以中断、逆转或减缓肺内的促纤维化环境(例如，通过降低生长因子的表达和/或释放)，并因此下调成纤维细胞增殖、胶原合成和细胞外基质沉积。通过操纵如SOCS3的特异的抗纤维化分子靶标，也可以达到相似的结果。那么可以采用干细胞疗法来提高损伤的肺泡上皮细胞的再生能力。

实施例4：SOCS-3作为肺纤维化的一种新介质

背景：

IPF是一种独特的病因不明的慢性肺纤维化病症；预后一直很差，且诊断后的平均存活时间为2.9年。对常规的治疗试剂的反应极不寻常。成纤维细胞的病灶形成与肺泡上皮细胞破环的独特的组织学特征是由包括生长因子过表达和进行性成肌纤维细胞增殖在内的复杂的细胞水平和分子水平的事件形成的。我们在最近的研究中已经证明辛伐他汀(已知具有降血脂作用)的抗纤维化潜能，即能够通过Rho信号传导通路¹破坏转化生长因子(TGF)-β与结缔组织生长因子(CTGF)的相互作用，从而中断细胞水平的促纤维化分化²。我们现在已经证明了在来源于IPF的肺成纤维细胞中SOCS3的基因表达被显著抑制(p＜0.05)，这一点说明这些细胞会对已知在IPF中过表达的生长因子和细胞因子呈“高反应性”。尽管不希望受限于任何理论，我们认为SOCS-1和SOCS-3表达水平的下调会使纤维化疾病一直存在；随后发生的SOCS蛋白及通路的调节可以恢复一些有助于控制纤维化的必要的负反馈调节机制。

方法学：

人肺成纤维细胞的培养

在达尔伯克改良的伊格尔培养基DMEM(Dulbecco′s ModifiedEagle′s Medium，DMEM，Gibco-BRL，Paisley，UK)培养基中培养肺成纤维细胞系(CCD8LU-正常的成人肺成纤维原细胞，以及HIPF、LL29和LL97a-来源于IPF的肺成纤维原细胞)。该培养基中添加了1％抗生素的/抗真菌的溶液(10,000单位的青霉素，10mg链霉素，25μl两性霉素B；Gibco-BRL)、L-谷氨酸(2mM，Gibco-BRL)和10％胎牛血清(FCS，Labtech，Sussex，UK)。所有的细胞操作程序都必须于无菌环境下在二级层流柜中(BSB 4a flow cabinet，Gelaire Flow Laboratories，Buckinghamshire，UK)使用无菌产品进行。所述的细胞系在37℃于5％湿润的CO₂下置于Galaxy B培养箱(Scientific Laboratory Supplies Ltd)中培养。成纤维细胞去血清培养48小时后，将细胞与浓度为5ng/ml的人重组转化生长因子(TGF)-β接触培养达24小时。

SOCS3的实时RT-PCR

使用2μl cDNA样品来评价每种细胞类型和条件中的SOCS3基因表达。引物和探针组是“根据要求预定测定(predesigned assay ondemand)”探针(Applied Biosystems，Foster City，CA)，因此，它们由制造商设计、测试和标准化，以实现可重复的表达分析。将引物和cDNA添加到包含必需的PCR反应试剂的TaqMan通用PCR反应混合液(Applied Biosystems)中，并用无核酶的水补足反应体积。实时PCR在ABI prism 7,000系统(Applied Biosystems)中进行。每个样品一式两份进行检测；采用相对标准曲线的分析方法来测定靶基因表达的平均量。以管家基因β-肌动蛋白的表达作为参照对SOCS3的表达进行标准化处理，图5、9、10示出了该数据。

结论：

我们证明了与正常的肺成纤维细胞相比，来源于IPF的肺成纤维细胞中的SOCS3基因表达显著下降(p＜0.05)[图5]。这表明来源于IPF的肺成纤维细胞对生长因子和细胞因子(例如TGF-β)是高度敏感的，已知这些生长因子和细胞因子在纤维化的肺内被显著上调。在应答生长因子和血清时，SOCS3的表达发生改变，尽管与来源于IPF的肺成纤维细胞[图9和图10]相比，正常肺成纤维细胞中的SOCS3的诱导幅度显著升高(高于6倍的诱导)。因此，在来源于纤维化肺的成纤维细胞中SOCS-3的表达明显降低，并且这些相同的成纤维细胞对来自诸如TGF-β和血清的重要的致纤维化生长因子的刺激反应较弱。因此，SOCS3及其信号通路的失调对肺纤维化疾病的持续存在有病理学意义。

参考文献：

1.Watts KL，Sampson EM，Schultz GS，Spited MA.Am J RespirCell Mol Biol.2005；32(4)：290-300；

2.Watts KL，Spiteri MA.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2004；287(6)：L1323-32；

3.Wormald S，Zhang JG，Krebs DL et al.JBC.2006.281(16)：11135-11143；

4.Ogata H，Chinen T，Yoshida T et al.Oncogene.2006；25(17)：2520-253。

实施例5：关于上皮细胞创伤修复模型的另外数据

上皮创伤愈合的体外测定

利用A549肺泡上皮细胞进行创伤愈合测定。使用实施例1所述的的上皮创伤-愈合体外测定(Geiser T等人.Am J Respir Crit CareMed.2001；163：1384-1388)，利用人A549肺泡上皮样细胞(AmericanType Culture Collection，Rockville，MD)来确定上皮的修复活性。简言之，将A549上皮细胞在含有10％的胎牛血清最小必需培养基(MEM)中于12孔板中培养48小时直至汇合，然后用吸管头机械性创伤细胞分别将来自每位患者的BALF的浓缩液加入到受创伤的上皮单层(实验重复三次)，并且在整个24小时的时间段内测量创伤面积。

初期的实验结果显示了使用BALF的100倍稀释液能获得最佳的创伤-愈合活性范围(最大效应的50％)。肺泡上皮细胞修复的速率表示为创伤面积缩小的百分比，并且将该结果与用来自健康供体(对照)的BALF的相同倍数稀释液(100倍)获得的上皮细胞修复速率相比较。除了分析创伤修复的机制外，还如前述的文献(Geiser T等人.Am JPhysiol：2000；279：1184-1190)来测定细胞扩散/迁移和细胞增殖。

共培养研究：

如下所述来设计共培养模型，该模型涉及A549AEC和肺成纤维细胞(正常成年的肺成纤维细胞CCD8和来源于IPF的肺成纤维细胞LL29、LL97a、HIPF)。

a)间接接触模型(图11)：将肺成纤维细胞(正常的或来源于IPF的)接种到跨膜小室(transmembrane well)(微孔膜的孔径为0.8μM)中，允许可溶性因子在不同类型细胞之间移动。A549AEC接种到12孔板，且受到上述的机械性创伤。在24小时内监测AEC细胞的创伤愈合。

图12所示结果说明了在非直接接触模型中AEC与成纤维细胞的共培养影响了上皮细胞的创伤修复。与预期的一样，在含有10％FCS的培养基中进行共培养，使创伤部位接近完全愈合。然而，在无血清条件下的共培养会影响修复；与正常对照的肺成纤维细胞(CCD8)相比，来源于IPF的肺成纤维细胞在第24小时产生了显著促进修复的应答。

通过测量在创伤边缘和细胞单层内的细胞的核间距离来研究修复机制。不管有无共培养条件，在细胞单层内和创伤边缘处的细胞的核间距离都没有变化(参见图13)。

b)直接接触模型(图14)。将A549AEC接种到transwell小室(微孔膜的孔径为3μM，每小室100,000个细胞)内且使其生长至汇合。然后，将transwell小室翻转且静置在皮氏培养皿中，小心地将成纤维细胞接种(每孔接入100,000个细胞)到膜的下表面，放置在培养箱中4个小时使成纤维细胞能够贴壁。确认细胞贴壁后，将多余的培养基小心去除。将接种了成纤维细胞和上皮细胞的transwell小室置入干净的12孔板中，并将顶部和底部都填满培养基(MEM)，允许细胞直接接触使得细胞能够迁移以及可溶性因子能够在不同类型细胞之间移动。小心地对A549AEC层实施机械性创伤(用吸管头刮擦)，在整个24小时的时间段内监测创伤愈合情况。不同类型细胞产生的可溶性因子可以穿膜，且孔径也足够大到允许细胞通过孔进行迁移以与创伤修复过程相互作用。

本发明研究了直接接触模型的结果。进行了图像技术的优化，使得可以对用于通过共聚焦显微镜成像的不同类型细胞进行双重染色。将所有细胞都用若丹明标记的鬼笔环肽(phalloidin)标记，以实现所需要的对成纤维细胞标志物的满意成像，所述若丹明标记的鬼笔环肽可以染色成纤维细胞，而不对上皮细胞进行非特异性标记。这使得我们能够评估是否存在任何成纤维细胞跨膜迁移以参与修复过程，也使得在24小时的固定时间点将肺泡上皮细胞的创伤愈合情况成像。最初采用黏着斑蛋白-cy3(vinculin-cy3)来染色的尝试并不成功，因为该抗体不能对成纤维细胞群进行特异性染色，并且在上皮细胞类型内产生了显著的非特异性染色。使用抗脯氨酰羟化酶β(Novus)的一抗单克隆抗体和若丹明标记的羊抗小鼠的二抗，优化了染色结果并且实现了对肺成纤维细胞的成功标记。使用浓度为1μg/ml至10μg/ml的一抗以及随后使用浓度为10μg/ml的二抗，顺利实现了对肺成纤维细胞的成功标记(无非特异性上皮细胞污染)。

Claims (18)

1.能够增加干细胞和/或祖细胞在纤维化部位可利用的和/或植入的数目的试剂在制备药物中的用途，所述药物与抗纤维化试剂联用来治疗纤维化。

2.治疗纤维化的方法，其包括给予需要给药的个体与抗纤维化试剂联用的试剂，所述试剂能够增加干细胞和/或祖细胞在纤维化部位可利用的和/或植入的数目。

3.如前述权利要求中的任一项所述的用途或方法，其中所述能够增加干细胞和/或祖细胞在纤维化部位可利用的和/或植入的数目的试剂是治疗有效量的干细胞和/或祖细胞。

4.如权利要求3所述的用途或方法，其中所述治疗性的干细胞和/或祖细胞分化成肺泡上皮细胞。

5.如权利要求1或2所述的用途或方法，其中所述能够增加干细胞和/或祖细胞在纤维化部位可利用的和/或植入的数目的试剂增加了内源性干细胞和/或祖细胞的数量。

6.如权利要求1或2所述的用途或方法，其中在给予个体能够增加干细胞和/或祖细胞在纤维化部位可利用的和/或植入的数目的试剂之前、同时或之后给予所述个体抗纤维化试剂。

7.如前述权利要求中的任一项所述的用途或方法，其中所述纤维化是特发性肺纤维化、眼部纤维化或皮肤纤维化。

8.如权利要求7所述的用途或方法，其中所述纤维化是特发性肺纤维化。

9.如前述权利要求中的任一项所述的用途或方法，其中所述抗纤维化试剂是RhoA、RhoA GTPases、TGF-β1或CTGF、或RhoA信号通路的其他任何成员的调节剂，或者调节细胞因子信号传导抑制子1(SOCS 1)、细胞因子信号传导抑制子3(SOCS 3)或者TLR9的作用。

10.如前述权利要求中的任一项所述的用途或方法，其中所述抗纤维化试剂是他汀类化合物或其衍生物。

11.如权利要求10所述的用途或方法，其中所述他汀是洛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、西立伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、匹伐他汀、罗苏伐他汀。

12.如前述权利要求中的任一项所述的用途，其中所述药物还包含免疫抑制剂和/或抗炎试剂和/或DNA甲基化的调节剂。

13.如权利要求1至12中的任一项所述的方法，其中还给予所述个体免疫抑制剂和/或抗炎试剂和/或DNA甲基化的调节剂。

14.组合物，其包含能够增加干细胞和/或祖细胞在纤维化部位可利用的和/或植入的数目的试剂和抗纤维化试剂。

15.药物组合物，其包含能够增加干细胞和/或祖细胞在纤维化部位可利用的和/或植入的数目的试剂和抗纤维化试剂以及药学上可接受的载体。

16.如权利要求14或15所述的组合物或药物组合物，其被配制成用于经鼻内或者通过吸入递送到肺的气雾剂。

17.制备如权利要求15所述的药物组合物的方法，所述方法包含将能够增加干细胞和/或祖细胞在纤维化部位可利用的和/或植入的数目的试剂和抗纤维化试剂与药学上可接受的赋形剂结合。

18.如权利要求14至17中的任一项所述的组合物或药物组合物，其用于医学。

Images