CN101563100B - 用于预防和治疗牙周病、改善牙周创伤愈合以及促进口腔健康的新药物靶标 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纤溶酶原活化途径成员和具有直接或通过纤溶酶原活化途径活化纤溶酶原能力的化合物用于下列的用途：预防、防止和治疗牙周病包括种植体周围炎，牙周创伤愈合以及促进人和非人对象的口腔健康。

Description

用于预防和治疗牙周病、改善牙周创伤愈合以及促进口腔健康的新药物靶标
技术领域
本发明涉及用于预防、防止和/或治疗感染性牙周病(例如牙龈炎和牙周炎)以及影响牙龈组织的坏死性病症的化合物和方法，还涉及一般性促进口腔健康，并且还涉及改善局部牙周创伤(例如手术创伤)的愈合。特别的，本发明涉及用于预防和治疗感染性牙周病、促进口腔健康和改善牙周创伤愈合的新方法。
背景技术
牙周病
牙周病是一种影响支持并固定牙齿的组织(又称为牙周)的慢性炎性疾病。它是由于特定牙龈下微生物与宿主免疫和炎性应答之间不平衡的相互作用引起的(1)。它影响几乎四分之三的成年人群体，并且被认为是人类最常见的疾病之一。涉及牙周病的组织是牙床(gum)，其包括牙龈(gingiva)、牙周韧带、牙骨质和牙槽骨(图1)。牙龈(gingiva)是覆盖牙一部分以及牙槽骨一部分的粉红色角质化黏膜。牙周韧带是牙床的主要部分。牙骨质是覆盖牙下部的钙化结构。牙槽骨是颌骨(上颌和下颌)的一系列突起，牙齿就嵌于其中。牙周病起始的区域是牙齿和牙床之间的袋-牙龈沟。
感染、炎症和随后的宿主防御及创伤愈合都是牙周病的标志。此疾病开始于围绕牙齿的牙龈中的多种细菌感染(2)。在健康口腔中，已发现了超过500种微生物。在牙周病中，已经研究了几种潜在的牙周病病原体，其包括：牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、直肠弯曲杆菌(Campylobacter rectus)、伴放线放线杆菌(Actinobacillusactinomcetemcomitans)和具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)，其被认为代表了大部分的病原微生物。这些微生物可在宿主细胞中诱导多种因子，例如IL-1、IL-6、TNF以及酶，其被认为直接或间接地造成不可逆的组织破坏，包括牙床、牙槽骨、牙根外层的破坏以及最终导致牙齿缺失。另外，严重牙周病可导致呼吸变差、心脏病和中风、糖尿病、呼吸疾病和怀孕期间早产。还有其它的病因，例如吸烟/使用烟草、遗传、怀孕和青春期、压力、药物、糖尿病、营养不良以及其它的全身性疾病。
另一种形式的牙槽骨感染性破坏(即种植体周围炎(Periimplantitis))非常类似于牙周炎，其可发生于将异质材料手术植入到颌中之后。此植入方法常被称为骨结合(3)，其需要所述异质材料(即牙种植体，常由钛制成)与活骨之间的紧密接触。此方法用于在丧失天然牙之后恢复咬合，目前是治疗无牙症(edentulism)的标准方法。骨结合牙种植体和天然牙之间的主要区别是种植体周围缺少真正的牙周组织。正常牙齿是悬在允许牙齿在牙槽骨中生理性移动的胶原性纤维网络中，而牙植入物则牢固地与骨相连接而不没有软组织介入。尽管存在与骨组织连接上的此主要差异，但是在感染过程中牙和植入物的病理改变的许多关键特征是一样的，例如通过生物膜形成和定殖的感染、炎症应答以及免疫防御。因此，种植体周围炎是一种在功能上影响骨结合植入物周围组织的炎症/感染性过程，其导致支持骨的丧失。种植体周围炎可导致完全的脱落和植入物丧失，即使在已经进行了大量针对解决种植牙周感染的治疗的情况下。种植体周围炎还随种植体周围软组织的可逆性炎性/感染性改变但没有任何骨丧失的情形下发生。已报道软组织中种植体周围炎的发病率是8-44％，而骨中种植体周围炎的发生率则是1-19％。发病率的广泛性至少在部分上是由于在实体限定上的差异。种植体周围炎的发病率最可能与植入物的已植入年数相关。因为牙植入物治疗引入的相对较晚，所以其数量可能会随着年数增加。考虑到对牙和牙植入物感染的炎症应答和免疫防御的相似性很大，可以将种植体周围炎看作是影响植入异质材料的一种牙周病形式。
牙周病是口腔整体健康的一个重要方面。口腔健康指口腔及相关组织的健康状况，其使得个体能够在没有活动性疾病、不适或尴尬的情况下进食、说话和社交，这有助于总体的健康状况。口腔健康的主要标志包括唾液和牙床组织中的细菌菌群以及牙床组织中的组织坏死和炎症。口腔健康是总体健康的组成部分，其不应被看作是孤立的。
自第二次世界大战以来，抗生素和其它抗微生物药物已被广泛用于治疗感染性疾病。抗微生物剂针对致病微生物的成功是现代医学的巨大成就之一。但是，许多抗微生物剂已不再像过去一样有效。产生抗生素抗性的一个关键因素是感染性生物快速适应新环境条件的能力。随着时间进展，一些细菌已发展出逃避抗生素作用的方式。广泛使用抗生素被认为刺激了演化性适应，这使得细菌能够经受这些过去如此强力的药物而生存下来。最终，对抗微生物难度的增加导致了在医院或其它环境下获得感染风险的增加。药物抗性对于有严重疾病患者的医院来说是一个特别困难的问题，这些患者在没有抗生素帮助的情况下不太能够对抗感染。因此，人们越来越意识到，非常需要新的治疗策略来改善抗感染的感染防御。
牙周病的治疗包括保守性(非手术)方法和手术方法。保守治疗由被称为洁治(scaling)和根面平整(rootplaning)的深度清洁以及牙龈刮除(gingival curettage)组成。此治疗目的是除去定植于受影响根表面上的生物膜并重建可发生愈合的环境。在良好口腔卫生的情况下，这会保持健康的正常牙龈。牙周手术治疗由骨手术、牙龈/牙周移植、牙龈翻瓣术、系带切断术、牙龈切除术、引导组织再生/骨增量组成。然而，尽管多种治疗方法已经成功地改善了牙周病的治疗，但口腔健康的巨大挑战依然存在。这些挑战因素包括口腔细菌对抗生素的抗性增加、对总体改善口腔健康的更简单方法的需要、昂贵且冗长的牙齿护理过程、压力巨大的现代生活以及在发达国家和发展中国家贫困人群中更加沉重的牙齿负担。因此，非常需要用于预防和治疗牙周病、促进口腔健康以及改善牙周创伤愈合的新方法。
坏死
坏死是指细胞和活组织的非程序性或意外死亡。其相比于凋亡(细胞程序性死亡的一部分)而言是较为无序的。与凋亡相反，通过免疫系统吞噬细胞清除细胞碎片通常更加困难，因为无秩序的细胞死亡不发送出告知邻近吞噬细胞来吞噬该垂死细胞的“吃掉我”的细胞信号。此信号传递的缺乏使得对免疫系统而言，定位通过坏死而死去的死亡细胞并使之再循环比确定是否细胞已经历凋亡更困难。在坏死中，在细胞膜损坏后细胞内容物的释放是产生炎症的原因。坏死有许多原因，包括外伤、感染、癌症、梗塞、毒液进入(invenomation)和炎症。细胞中一种重要系统的严重损坏导致其它系统的继发损坏，即所谓的“级联效应”。坏死由特定的酶引起，所述酶由溶酶体释放，能够消化细胞成分或整个细胞自身。细胞所受的损伤可危及溶酶体膜，或者可能引发造成酶释放的无组织链式反应。与凋亡不同，通过坏死而死亡的细胞可释放破坏其它细胞的有害化学物质。活检材料的坏死通过固定或者冷冻而停止。
坏死发生于某些类型的牙周病中。坏死性牙龈炎是一种炎性破坏性牙龈病症，其特征为牙间隙坏死性溃疡、自发出血、快速发生疼痛和臭气。除非适当治疗，坏死性牙龈炎有明显的复发倾向并导致大量牙周支持物的丧失。
目前，有四种治疗坏死的主要治疗方法。第一种是手术，其最为快速，因此当存在大的坏死区域或者深的伤痕时推荐使用。第二种是机械方法，其包括水疗法、聚糖酐(dextranomer)和创伤冲洗。第三种是酶方法，所用的酶主要是胶原酶(例如Santyl)，但是，当存在感染时其起效太慢；第四种是通过自溶方法，其通过创伤流体中的酶进行，但是疗效非常慢。然而，这四种治疗方法中没有一种可给出功能和外观上令人满意的坏死去除及组织重建。因此，非常需要新的治疗策略以实现成功的坏死去除。
纤溶酶原活化系统(PA系统)
纤溶酶(plasmin)是PA系统的关键成员。它是一种能够降解ECM的一些成员(包括纤维蛋白、明胶、纤连蛋白、层粘连蛋白和蛋白聚糖)的广谱蛋白酶(4)。另外，纤溶酶可将一些前基质金属蛋白酶(pro-MMP)转化成活性MMP。因此，已表明纤溶酶可能是细胞外蛋白水解的一种重要上游调控因子(5；6)。纤溶酶通过两种生理性PA(tPA或uPA)中任一种的蛋白水解切割从酶原纤溶酶原形成。因为纤溶酶原以相对高的水平存在于血浆和其它体液中，所以PA系统的调节主要在PA合成和活性水平上进行。PA系统成员的合成受不同因素(例如激素、生长因子和细胞因子)的高度调节。另外，存在纤溶酶和PA的特异性生理抑制剂。纤溶酶的主要抑制剂是α2-抗纤溶酶。PA的活性受PAI-1和PAI-2的调控，PAI-1抑制uPA和tPA，而PAI-2主要抑制uPA。某些细胞还具有uPA的特异性细胞表面受体(uPAR)，其可引导对细胞表面的蛋白水解活性(8；9)。
纤溶酶原(planminogen)是一种由790个氨基酸组成的单链糖蛋白，其分子量是约92kDa(7；8)。纤溶酶原主要在肝脏中合成，并且在大多数细胞外体液中含量很高。在血浆中，纤溶酶原的浓度是约2μM。因此，纤溶酶原构成了组织和体液中蛋白水解活性的大量潜在来源(9；10)。纤溶酶原以两种分子形式存在：Glu-纤溶酶原和Lys-纤溶酶原。天然分泌且未切割的形式具有氨基端(N端)谷氨酸，因此被称为Glu-纤溶酶原。但是，在纤溶酶存在时，Glu-纤溶酶原在Lys76-Lys77被切割成Lys-纤溶酶原。相比于Glu-纤溶酶原，Lys-纤溶酶原具有对纤维蛋白更高的亲和力，并且以更高的速率被PA活化。这两种形式的纤溶酶原都可以在Arg560-Val561肽键处被uPA或tPA切割，导致形成二硫键连接的两条链的蛋白酶纤溶酶(11)。纤溶酶原的氨基端部分含有5个同源三环即所谓的三环域(kringle)，羧基端部分含有蛋白酶结构域。一些三环域含有赖氨酸结合位点，其介导纤溶酶原与纤维蛋白及其抑制剂α2-AP的特异性相互作用。一个新的且有趣的发现是纤溶酶原的由三环域1-4组成的38kDa片段是血管发生的强效抑制剂。此片段被称为血管抑素(angiostatin)，其可通过被一些MMP蛋白水解切割而由纤溶酶原产生。
纤溶酶的主要底物是纤维蛋白，纤维蛋白的分解对于预防病理性血凝块形成至关重要(12)。纤溶酶也具有针对ECM一些其它成员(包括层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖和明胶)的底物特异性，表明纤溶酶在ECM重构中也起到重要作用(8；13；14)。纤溶酶还可以通过其将一些前-MMP转化为活性MMP(MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9)的能力间接降解ECM的其它成员。因此，已表明纤溶酶可能是细胞外蛋白水解的重要上游调控蛋白(15)。另外，纤溶酶具有活化潜伏形式的某些生长因子的能力(16-18)。在体外，纤溶酶还切割补体系统的成员，由此释放趋化性补体片段。
已表明在细菌侵入过程中PA系统通过多种机制在一些阶段参与其中(19)。大量的病原表达纤溶酶(原)受体(20；21)。细菌还影响哺乳动物细胞分泌PA及其抑制剂(22；23)。例如，已发现在被多种细菌感染的细胞中uPA的产生增加(24)。到目前为止，纤溶酶原活化在发病机制中的作用的体内证据存在于一些细菌中，例如鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)、疏螺旋体(Borrelia)和A族链球菌。
纤溶酶原与一些细菌表面存在的受体的结合将这些细菌转换成蛋白水解生物体。在革兰氏阴性菌中，丝状表面附属物形成纤溶酶原受体的主要部分(25；26)。在革兰氏阳性菌中，已鉴定出表面结合分子是纤溶酶原受体(27；28)。结果，可在可导致哺乳动物ECM降解的微生物(例如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、鼠疫耶尔森氏菌和伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi))的表面上产生纤溶酶。另外在人血浆中，细菌蛋白酶还可直接活化潜伏的前胶原酶或者使蛋白酶抑制剂失活，因此加剧组织破坏和细菌穿过组织屏障的播散(29；30)。
牙周病和牙周创伤的模型
牙周病的模型包括自发型和诱导型。牙周组织暴露于富含微生物的环境。口腔中持续发生细菌侵入和随后的宿主防御，通常保持平衡。此宿主-细菌平衡的破坏引起多种类型的牙周病。这可能是由于口腔微生物菌群、吞噬细胞功能改变和/或特异性免疫应答之间的失衡而引起的。在约2％的美国青少年和约20％的美国成年人中发生严重的牙周病。
通过某些细菌物种诱导牙周病提供了牙周炎的确定模型。常用的牙周病原体包括牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、直肠弯曲杆菌(Campylobacter rectus)、伴放线放线杆菌(Actinobacillusactinomcetemcomitans)和具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)，其被认为代表了大部分的病原微生物菌群。它们具有或可在宿主细胞中诱导一些因子，例如IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子、表面相关蛋白、菌毛、囊泡、毒素和酶，其被认为直接或间接造成牙周支持组织的不可逆丧失。
牙周创伤是常见的，尤其是在牙周手术过程中。可通过在小鼠牙床组织诱导切口创伤来建立牙周创伤模型。其后可评价创伤的愈合模式以及候选药物或化合物的作用。
用于治疗感染(例如坏死和牙周病)的当前方法具有上述缺点。因此，本领域仍然需要治疗牙周病和改善口腔健康的改进策略和手段。
发明内容
本发明涉及纤溶酶原活化途径成员以及具有活化纤溶酶原能力的化合物可用于预防和治疗牙周病和组织坏死、用于牙周创伤愈合(例如手术创伤)和用于促进口腔整体健康的新的改进策略的新发现。施用纤溶酶原和/或纤溶酶原活化途径其它成员或者具有活化纤溶酶原能力的化合物，通过活化炎症细胞、加速角质形成细胞迁移、杀死细菌、去除坏死组织和增强细胞因子表达而在防止细菌诱导感染和促进牙周创伤愈合上起到多方面作用。在天然条件下纤溶酶原缺陷型小鼠中大量存在牙周病还提供了用于研究牙周病的极好动物模型，以及提供了用于鉴定和评价针对牙周病、牙周创伤改善和促进口腔整体健康的多个方面的治疗方法和新药和筛选方法。
因此，本发明提供了作为纤溶酶原活化途径成员或者具有直接或通过纤溶酶原活化途径活化纤溶酶原之能力的活性药剂或化合物在制备用于在需要治疗的对象中预防、防止和/或治疗牙周病(尤其是感染性牙周病)和/或去除牙床组织中坏死的药物组合物中的用途，所述药物组合物包含有效量的所述化合物/药剂或者两种或更多种这些药剂/化合物的组合。优选地，所述活性剂选自：纤溶酶原激活剂、tPA、uPA、链激酶、沙芦普酶(saruplase)、阿替普酶(alteplase)、瑞替普酶(reteplase)、替奈普酶(tenecteplase)、阿尼普酶(anistreplase)、孟替普酶(monteplase)、拉诺普酶(lanoteplase)、帕米普酶(pamiteplase)、葡激酶(straphylokinase)以及纤溶酶原活化途径成员的重组形式和变体。更优选地，所述活性剂选自纤溶酶或纤溶酶原及其衍生物例如纤溶酶或纤溶酶原的三环域(kringledomain)、纤溶酶或纤溶酶原的蛋白片段、小纤溶酶原(mini-plasminogen)和小纤溶酶(mini-plasmin)以及纤溶酶或纤溶酶原的合成衍生物。最优选地，所述活性剂是纤溶酶原及其衍生物。所述活性剂可以本领域已知的任意施用途径施用。优选地且非限定性地，施用途径包括局部施用(topicalapplication)、牙龈内注射和静脉内注射。所述药剂还可存在于涂敷在牙周组织被感染区域的创伤敷料中，如果可能的话，从其中转移到牙周组织的被感染部位上。所述组合物可以是凝胶、洗剂、香膏(balm)、膏(paste)(牙膏)、含漱溶液(gargling solution)(漱口液)或创伤敷料的一部分。
本发明还提供了作为纤溶酶原活化途径成员的化合物或活性剂或者具有直接或通过纤溶酶原活化途径活化纤溶酶原能力的化合物在制备用于在需要治疗的对象中改善解决方案和/或促进牙周创伤和手术牙周创伤(尤其感染性牙周创伤和手术感染性牙周创伤)愈合的药物组合物中的用途，所述药物组合物包含有效量的所述化合物/药剂或者两种或更多种这些药剂/化合物的组合。优选地，所述活性药剂选自：纤溶酶原激活剂、tPA、uPA、链激酶、沙芦普酶、阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶、阿尼普酶、孟替普酶、拉诺普酶、帕米普酶、葡激酶以及纤溶酶原活化途径成员的重组形式和变体。更优选地，所述活性剂选自纤溶酶或纤溶酶原。最优选地，所述活性药剂是纤溶酶原。所述活性剂可以本领域已知的任意施用途径施用。优选地且非限定性地，施用途径包括局部施用、牙龈内注射和静脉内注射。所述药剂还可存在于施用于牙周组织创伤区域上的创伤敷料、凝胶、洗剂、香膏、膏、含漱溶液和牙膏中，如果可能的话，从其中转移到牙周组织的受伤部位上。
另外，本发明还提供了促进口腔健康的方法，其包括施用包含下列物质的组合物：作为纤溶酶原活化途径成员的活性剂，或者具有活化纤溶酶原能力的化合物，或者两种或更多种这些药剂的组合。优选地，所述活性药剂选自：纤溶酶原激活剂、tPA、uPA、链激酶、沙芦普酶、阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶、阿尼普酶、孟替普酶、拉诺普酶、帕米普酶、葡激酶和所述纤溶酶原活化途径成员的重组形式和变体。更优选地，所述活性剂选自纤溶酶或纤溶酶原。最优选地，所述活性剂是纤溶酶原，例如Glu-纤溶酶原或Lys-纤溶酶原。所述活性剂可以本领域已知的任意施用途径施用。所述组合物可以是凝胶、洗剂、香膏、膏或创伤敷料的一部分。优选地且非限定性地，施用途径包括局部施用，例如牙膏或使用含漱溶液，其可用于增强牙齿的抗腐败性和促进口腔健康。
本发明还提供了一种在宿主防御受阻或受损的情况下启动宿主防御以治疗牙周病尤其感染性牙周病的方法，所述方法包括施用作为活性成分的纤溶酶或纤溶酶原。在一个特定实施方案中，本发明的方法可用于在纤溶酶或纤溶酶原的局部或全身缺陷/损伤的情况下改善抗牙周病的宿主防御。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种通过施用化合物或药物(其为纤溶酶或纤溶酶原及其衍生物、纤溶酶原激活剂、或者增强纤溶酶活性的化合物)来预防、防止和治疗牙周病(尤其感染性牙周病)、改善牙周创伤(例如手术创伤)愈合以及促进人或非人对象的口腔健康的方法。优选地，局部施用所述化合物以达到在被感染区域中的高浓度。
另外，本发明还提供了一种通过施用组合物来减轻或预防口腔坏死形成的方法，所述方法包括局部或全身施用包含作为纤溶酶原活化途径成员的化合物或具有活化纤溶酶原能力的化合物的组合物。所述组合物可以是凝胶、洗剂、香膏、膏或创伤敷料的一部分。作为替代，所述组合物可以全身施用。在一个实施方案中，将本发明方法与整形手术联合用于牙周组织以减少感染、溃疡和坏死的发生和形成。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗、预防和防止牙周病尤其感染性牙周病的药物组合物，其包含有效量的作为纤溶酶原活化途径成员的化合物或者具有活化纤溶酶原能力的化合物。所述纤溶酶原活化途径成员可选自：纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、Glu-纤溶酶原、纤溶酶、纤溶酶原和纤溶酶的三环域、小纤溶酶原、小纤溶酶、纤溶酶原激活剂、tPA和uPA。优选地，所述纤溶酶原途径成员是纤溶酶原或纤溶酶。所述具有活化纤溶酶原能力的化合物可选自：链激酶、沙芦普酶、阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶、阿尼普酶、孟替普酶、拉诺普酶、帕米普酶、葡激酶以及所述纤溶酶原活化途径成员的重组形式和变体。
在又一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗、预防和/或防止牙周病尤其感染性牙周病的方法，所述方法包括给需要此治疗的对象施用权利要求1-16的包含有效量的化合物的药物组合物，所述化合物是纤溶酶原活化途径成员或者具有直接或通过纤溶酶原途径活化纤溶酶原能力的化合物。所述纤溶酶原活化途径成员可选自：纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、Glu-纤溶酶原、纤溶酶、纤溶酶原和纤溶酶的三环域、小纤溶酶原、小纤溶酶、纤溶酶原激活剂、tPA和uPA。优选地，所述纤溶酶原途径成员是纤溶酶原或纤溶酶。所述具有活化纤溶酶原能力的化合物可选自：链激酶、沙芦普酶、阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶、阿尼普酶、孟替普酶、拉诺普酶、帕米普酶、葡激酶以及所述纤溶酶原活化途径成员的重组形式和变体。
在又一个实施方案中，本发明提供了一种用于促进牙周创伤尤其是感染性牙周创伤愈合的药物组合物，其包含有效量的纤溶酶原活化途径成员或者具有活化纤溶酶原能力的化合物。所述纤溶酶原活化途径成员可选自：纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、Glu-纤溶酶原、纤溶酶、纤溶酶原和纤溶酶的三环域、小纤溶酶原、小纤溶酶、纤溶酶原激活剂、tPA和uPA。优选地，所述纤溶酶原途径成员是纤溶酶原或纤溶酶。所述具有活化纤溶酶原能力的化合物可选自：链激酶、沙芦普酶、阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶、阿尼普酶、孟替普酶、拉诺普酶、帕米普酶、葡激酶以及所述纤溶酶原活化途径成员的重组形式和变体。
在又一个实施方案中，本发明提供了一种促进牙周创伤尤其是感染性牙周创伤愈合的方法，所述方法包括向有此治疗需要的对象施用包含有效量化合物的药物组合物，所述化合物是纤溶酶原活化途径成员或者具有直接或通过纤溶酶原活化途径活化纤溶酶原能力的化合物。所述纤溶酶原活化途径成员可选自：纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、Glu-纤溶酶原、纤溶酶、纤溶酶原和纤溶酶的铰三环域、小纤溶酶原、小纤溶酶、纤溶酶原激活剂、tPA和uPA。优选地，所述纤溶酶原途径成员是纤溶酶原或纤溶酶。所述具有活化纤溶酶原能力的化合物可选自：链激酶、沙芦普酶、阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶、阿尼普酶、孟替普酶、拉诺普酶、帕米普酶、葡激酶以及所述纤溶酶原活化途径成员的重组形式和变体。
具体实施方案
对于预防和治疗牙周疾病、愈合牙周创伤以及保持口腔健康的改善
根据本发明，提供或增强纤溶酶原和/或纤溶酶可用于预防、防止和治疗牙周疾病，加速牙周创伤愈合和促进口腔健康。这可以通过多种不同的方式实现。例如，通过用上调纤溶酶、纤溶酶原或纤溶酶原激活剂表达的活性剂、药物、激素、细胞因子、抗体或其它化合物治疗患者；降低任意这些成员的降解；可增加纤溶酶原和/或纤溶酶的局部或全身水平。在另一个实施方案中，通过直接施用纤溶酶/纤溶酶原蛋白及其衍生物增加局部纤溶酶或纤溶酶原的水平。在又一个实施方案中，通过施用纤溶酶或纤溶酶原激活剂增强纤溶酶活性。在另一个实施方案中，使用人工、重组或细菌的纤溶酶原激活剂例如链激酶和葡激酶。在又一个实施方案中，使用纤溶酶原蛋白序列的片段例如合成肽、三环域、小纤溶酶原或小纤溶酶。
纤溶酶原活化途径成员或者具有活化纤溶酶原能力的化合物可通过纯化来自细菌、人或其它动物的所述成员或化合物，或者通过在酵母(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))、在细菌(例如大肠杆菌(E.coli))和在哺乳动物细胞系(例如中国仓鼠卵巢细胞系)中重组产生而制得。所述成员可以是野生型或经修饰/突变的。还可使用保留全长成员所期望活性的至少一部分的成员的片段。在一个优选实施方案中，使用人纤溶酶原的基本上纯的制备物。在又一个优选实施方案中，使用人纤溶酶的基本上纯的制备物。在又一个优选实施方案中，使用小纤溶酶原、小纤溶酶或纤溶酶原蛋白序列片段的基本上纯的制备物。
应用
本发明方法用于预防、防止和治疗牙周病、愈合牙周创伤和促进日常生活的口腔健康。这些动物包括但不限于脊椎动物例如人和家养动物(包括狗、猫、马、牛、猪)以及家禽。在一个实施方案中，应用本发明方法以在人中控制牙周病。人或非人对象可以患有或不患有妨碍牙周病愈合的病症。在另一个实施方案中，应用本发明方法以改善牙周创伤的愈合。所述牙周创伤包括但不限于外伤性创伤(由于外伤导致)创伤和手术创伤。在一个特定实施方案中，所述对象是计划接受、正在接受或者已经接受了口腔牙周区域整形手术的人。在这样的情况下，可在手术之前和/或之后应用或施用包含例如纤溶酶原的组合物。在又一个实施方案中，应用本发明方法以促进口腔健康。在这样的情况下，可应用或施用包含增加纤溶酶原、纤溶酶或小纤溶酶水平/活性的方法的组合物，以促进口腔健康。
组合物和治疗
本发明的活性剂用于调节药物靶标的生物学活性，它们用于治疗在其中观察到ECM降解、宿主防御和/或创伤愈合受损的病症。特别的，它们可用于预防和治疗牙周病、愈合牙周创伤和促进口腔健康。
因此，可将本发明的活性剂配制成适于体内施用的生物学相容形式药物组合物以施用给对象。适于体内施用的生物学相容形式指在其中治疗效果超过任何毒性作用的待施用活性剂形式。所述活性剂可施用给包括人和动物的活生物体。本发明活性剂的活性量定义为实现所期望结果必需的在剂量和时间上的有效量。例如，活性剂的治疗活性量可以根据一些因素例如疾病状态、年龄、性别和个体体重以及抗体在个体中引发所期望应答的能力而变化。可调整药物剂量以提供最佳治疗反应。例如，可每天施用分为几次的剂量，或者可根据治疗情况紧急程度所指示来按比例减少剂量。
可通过便利的方式来施用所述组合物，例如通过注射(皮下、静脉内等)、口服施用、吸入、直肠施用或透皮施用。根据施用途径，可将所述活性剂包被在保护所述药剂免受可能使所述药剂失活的酶、酸和其它天然条件的作用的材料中。因此，合适的施用途径包括局部、静脉内、肌内、皮内、口服、直肠和阴道内施用。一个优选的施用途径是局部施用或口服施用。
可通过本来已知的用于制备可施用给对象的可药用组合物的方法来制备本文所述组合物，使得有效量的一种或多种活性剂与可药用载体组合于混合物中。合适的载体描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company，Easton，Pa.，USA 1985)。在此基础上，所述组合物包括但不限于：活性剂以及一种或多种可药用载体或稀释剂在具有合适pH且与生理流体等渗的缓冲溶液中的溶液。
可用于递送本发明活性剂的载体的实例包括但不限于：凝胶、膏、香膏、蜡、洗剂、护肤霜(skin cream)、漂洗溶液(rinsing solution)、含有/不含有填充剂(bulking agent)的干粉以及本领域已知的用于局部递送的多种其它形式。所述组合物还可以以粉末或喷雾溶液、或含漱液的形式局部递送。作为替代，本发明组合物还可存在于创伤敷料、垫、绷带、纱布或施加到目的区域的其它物品中，所述组合物从中转移到所需区域。这些装置还包括缓慢释放装置(其在较长时间段里持续释放纤溶酶原或本发明的其它药剂)，或者可包括立即释放装置，其在使用时立即释放纤溶酶原或本发明的其它药剂。
在制备药用组合物之后，可以将其置于合适的容器内，并加上治疗适应症的标签。对于本发明组合物的施用，这样的标签将包括用量、频率和施用方法。
所述组合物可以以固定间隔施用，例如一天一次或两次，或者添加到敷料或缓慢释放装置中，其可视情况进行更换。就促进口腔健康而言，可通过在使用时形成组合物来立即施用所述组合物。
参考下述详细描述并结合附图，更易于理解本发明的上述特征和许多其它优点。
附图说明
图1.正常健康牙床组织(A)、炎性牙龈炎(B)和牙周感染牙周炎(C)的照片。
图2.在体外创伤愈合模型中存在于生长培养基中的纤溶酶原促进角质形成细胞迁移。
图3.未处理的8-12周龄野生型和纤溶酶原缺陷型小鼠颌的形态。注意：在纤溶酶原缺陷型小鼠的牙龈组织中存在坏死组织(N，红色)和严重的骨间隔(bone septa)降解(B)，而野生型小鼠的牙床组织则完全正常。在高放大倍率(×200)下，野生型和纤溶酶原缺陷型小鼠之间的差异就更加明显(下图)。B，骨间隔。N，坏死组织。
图4.未处理的12-16周龄野生型和纤溶酶原缺陷型小鼠颌的形态。12-16周纤溶酶原缺陷型小鼠的自发性牙周病比8-12周的更加严重。注意：在纤溶酶原缺陷型小鼠的牙床组织中存在坏死组织(N，红色)和严重的骨间隔降解(B)，而野生型小鼠的牙床组织则完全正常。在高放大倍率(×200)下，野生型和纤溶酶原缺陷型小鼠之间的差异就更加明显(下图)。B-骨间隔。N-坏死组织。
图5.未处理的16-20周龄野生型和纤溶酶原缺陷型小鼠颌的形态。16-20周纤溶酶原缺陷型小鼠的自发性牙周病比12-16周的更加严重。注意：在纤溶酶原缺陷型小鼠的牙床组织中存在坏死组织(N，红色)和严重的骨间隔降解(B)(右上图)，而野生型小鼠的牙床组织则完全正常(左上图)。在高放大倍率(×200)下，野生型和纤溶酶原缺陷型小鼠之间的差异就更加明显(下图)。B，骨间隔，N，坏死组织。
图6.野生型、纤溶酶原杂合型和纤溶酶原缺陷型小鼠的唾液中的细菌回收。纤溶酶原缺陷型和纤溶酶原杂合型小鼠具有比野生型小鼠显著更高的唾液中细菌数。
图7.补充了人纤溶酶原的纤溶酶原缺陷小鼠、补充了PBS的纤溶酶原缺陷型小鼠和未接受任何处理的野生型小鼠中所拔出牙齿中的细菌回收。
图8.补充了PBS或人纤溶酶原的纤溶酶原缺陷型小鼠的形态。注意：在PBS处理的纤溶酶原缺陷型小鼠中，牙床组织中存在坏死组织，周围的胶原组织开始从牙齿脱落，并且已经发生了骨吸收(左图)。但是，在纤溶酶原缺陷型小鼠中补充人纤溶酶原完全恢复了牙周组织中的细胞和组织结构。放大倍率，×50。
图9.补充了BPS或人纤溶酶原的纤溶酶原缺陷型小鼠在高放大倍率(×50)下的形态。
图10.通过口腔注射补充了PBS或人纤溶酶原的纤溶酶原缺陷型小鼠的形态。注意：在PBS处理的纤溶酶原缺陷型小鼠中，牙床组织中存在坏死组织，周围的胶原组织开始从牙齿脱落，并且已经发生了骨吸收(上图中左边两幅图)。但是，在纤溶酶原缺陷型小鼠中补充人纤溶酶原恢复了牙周组织中的细胞和组织结构。放大倍率，×100。
图11.未治疗的22周龄野生型(左图)和tPA/uPA双缺陷型(右图)小鼠颌的形态。注意：在tPA/uPA双缺陷型小鼠的牙床组织中存在坏死组织(N，红色)和严重骨间隔降解(B)，而野生型小鼠的牙床组织则完全正常。B，骨间隔，N，坏死组织。
图12.在膝关节处接种1×106CFU的金黄色葡萄球菌(S.aureus)Phillips株之后进行不同的局部和全身治疗的plg-/-和plg+/+小鼠膝关节中的细菌数。
图13.在膝关节处接种金黄色葡萄球菌3天后用Plg(实心柱)或PBS(空心柱)进行局部注射后plg+/+小鼠膝关节中的细菌数。注意：在局部注射Plg的野生型小鼠中，细菌数量比局部注射PBS的野生型小鼠的显著低5倍。
定义
在本发明的背景和每个术语所使用的具体上下文中，本说明书中使用的术语通常具有其在本领域中的通常含义。对某些术语在下文或者在说明书的其它地方进行了讨论，以为实施者提供有关描述本发明的组合物和方法以及如何制备和使用它们的另外指导。
“包括纤溶酶原、纤溶酶、纤溶酶原活化途径成员、纤溶酶原类似物例如小纤溶酶、纤溶酶类似物、纤溶酶原活化途径成员类似物、纤溶酶原激活剂的化合物”指分别直接或间接提供纤溶酶原或纤溶酶效应的化合物。
“纤溶酶原活化途径成员”指纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、Glu-纤溶酶原、包含纤溶酶原的一个或多个结构域例如一个或多个三环域和蛋白水解结构域的纤溶酶原变体和类似物(比如小纤溶酶原)；纤溶酶和包含纤溶酶的至少一个或多个结构域例如一个或多个三环域和蛋白水解结构域的纤溶酶变体和类似物(比如小纤溶酶和δ-纤溶酶)；具有活化纤溶酶原的最终作用的纤溶酶原激活剂，例如通过级联事件导致形成或活化纤溶酶原，比如uPA和tPA以及包含uPA和tPA的一个或多个结构域(例如一个或多个三环域和蛋白水解结构域)的tPA和uPA的变体和类似物。纤溶酶原、纤溶酶、tPA和uPA的变体包括这些蛋白的人和其它哺乳动物形式的所有天然遗传变体，以及通过保守氨基酸替换获得的这些蛋白质的突变体。纤溶酶原或纤溶酶的“类似物”是提供分别与纤溶酶原或纤溶酶相类似效应的化合物，其通过酶谱、ELISA(酶联免疫吸附测定)和FACS(荧光活化细胞分选仪)进行测定。还有一种用于测定转化的纤溶酶活性水平的测定法，如之前所描述的：Ny，A.，Leonardsson，G.，Hagglund，A.C.，Hagglof，P.，Ploplis，V.A.，Carmeliet，P.，和Ny，T.(1999)。Ovulation inplasminogen-deficient mice.Endocrinology 140，5030-5035。纤溶酶原活化途径成员的“类似物”是提供基本上与纤溶酶原活化途径成员相类似的效应的化合物，其通过此类似物活化的纤溶酶活性水平进行测定。
“牙周病”是一种由特定牙龈下微生物与宿主免疫和炎性应答之间的相互作用引起的常见炎性疾病。牙周病的范围包括从简单的牙龈炎症到导致支持牙齿的软组织和骨的重大损伤的严重疾病。在最坏的情况下，牙齿丧失。细菌引起被称为“牙龈炎”的牙床炎症。在牙龈炎中，牙龈变红、肿起并且容易出血。牙龈炎是一种轻微形式的牙床疾病，其通常可通过每天刷牙和用牙线清洁以及牙医或牙科卫生师的定期清洁来扭转。此形式的牙床疾病不包括固定牙齿在其位置的骨和组织的任何丧失。当牙龈炎得不到治疗时，它可发展成“牙周炎”(其意为“牙周围的炎症”)。在牙周炎中，牙床与牙齿脱离并形成被感染的“袋”。当菌斑在牙床线以下扩展和生长时，机体免疫系统与细菌抗争。细菌毒素和机体对抗感染的酶实际上开始破坏将牙齿固定在其位置上的骨和结缔组织。如果得不到治疗，那么支持牙齿的骨、牙床和结缔组织将被破坏。最终，所述牙齿可能会松动并不得不被除去。另一种类型的牙周炎-种植体周围炎，作为将异质材料手术植入到颌骨后的生物学并发症而出现。种植体周围炎是一种在功能上影响骨结合植入物周围组织的炎症/感染过程，其导致支持骨的丧失。即使在已针对解决种植体周围感染进行了大量治疗的情况下，种植体周围炎也可导致完全脱落和植入物丧失。种植体周围炎还作为种植体周围软组织的可逆性炎性/感染性变化而发生，而不造成任何骨丧失，有时被称为种植体周围粘膜炎。在本发明中，牙周病的定义至少包括牙周炎、牙龈炎、种植体周围炎和种植体周围粘膜炎。
“感染性牙周病”是由感染引起的牙周病，其是与例如韧部牙周炎(ligneous periodontitis)相对的。例如，感染性牙周炎可以由细菌、病毒或真菌感染而引起。
“细菌性牙周病”是由细菌感染引起的。
“牙周创伤”指发生在口腔牙周组织的外伤性创伤和手术创伤，其包括在牙周区域种植体周围组织处的创伤。
“口腔健康”指在没有活跃性疾病、不适或尴尬的情况下使得个体能够进食、说话和社交的并且有助于总体健康状况的口腔和相关组织的健康标准。口腔健康的主要标志包括唾液和牙床组织中的菌群，以及牙床组织中的组织坏死和炎症。口腔健康是总体健康的组成部分，并且不应被看作是孤立的。
“纤溶酶/纤溶酶原的衍生物”指例如纤溶酶或纤溶酶原的三环域、纤溶酶或纤溶酶原的蛋白片段、小纤溶酶原和小纤溶酶以及纤溶酶或纤溶酶原的合成衍生物。
“小纤溶酶原”指天然纤溶酶原的C端片段，其包括酶活性位点。小纤溶酶原的相对分子量(Mr)是38000。用尿激酶或链激酶活化导致产生底物特异性与纤溶酶原极相似的两条链的酶，其被称为“小纤溶酶”。
“坏死”指机体中组织的死亡。这在没有足够的血液供应给受伤、受幅射或经受化学品的组织时发生。坏死是不可逆的。坏死有许多原因，包括受伤、感染、癌症、梗塞、毒液进入、慢性创伤、溃疡和炎症。
“表面(topical)”和“表面施用(topical application)”指活性成分的非全身性局部施用。因此，表明施用可指将活性成分施用到创伤外表面。
蛋白质或化合物的“活性”指所述蛋白质或化合物具有的对特定反应的作用，是其影响、调节、参与或促进所述反应的能力的量度。通常，可测量蛋白质或其它化合物的活性。例如，就酶(例如纤溶酶、PA和MMP)和调节剂来说，酶活性可表示为产生反应产物的速率，例如表示为每单位时间每单位酶所产生的产物的量(例如浓度或重量)。在调节剂(例如PA)的情况下，活性可以指调节剂抑制或促进、提高或降低、上调或下调反应速率或由所述反应形成的产物量的能力。
“创伤”是由外部物质造成的器官或组织(包括上皮、结缔组织和肌肉组织)之结构的破坏。创伤的实例包括但不限于：挫伤、擦伤、撕裂、切开、刺伤和烧伤。另一些特定类型的创伤是作为整形手术过程后果的那些创伤。
“治疗/处理”对象或者“治疗/处理”对象的疾病或病症在本文中指减少或缓解所述疾病或病症的临床症状例如妨碍或延缓创伤愈合。
“增强”创伤愈合指增加创伤愈合的速度。或者，“增强”创伤愈合指减少愈合过程中或愈合后瘢痕组织的形成。
在本文中“对象”包括人和非人动物。非人动物包括但不限于：实验动物例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠等；家养动物例如狗和猫；以及农场动物例如绵羊、山羊、猪、马和牛。本发明的非人动物可以是哺乳动物或非哺乳动物；脊椎动物或非脊椎动物。
测定中的“对照”、“对照值”或“参考值”是用于检查在例如牙周病治疗、牙周创伤愈合和促进口腔健康或本文所述任何其它测定中的变化的值。
“具有(疾病或病症)风险”、“易患”或“易感”疾病或病症的对象指所述个体感染或发生所述疾病或病症的风险高于平均人群。
化合物“缺陷/缺乏”指所述化合物的量、水平或浓度明显低于对照值。例如，在纤溶酶原缺陷型动物中，纤溶酶原的体液和组织水平明显低于野生型动物。
本文所使用的“约”或“大约”应指在给定值或范围的50％以内，优选20％以内，更优选5％以内。
与另一值“基本上不同”的值可指两个值之间有统计学显著性差异。本领域已知的任何合适的统计方法均可用于评价是否具有显著差异。“统计学显著性”差异指在至少90％的置信区间、更优选95％的置信区间上确定显著性。
缩写
本发明公开内容中所使用的缩写包括下列：
uPA＝尿激酶型纤溶酶原激活剂；
PA＝纤溶酶原激活剂；
MMP＝基质金属蛋白酶；
TIMP＝金属蛋白酶组织抑制剂；
tPA＝组织型纤溶酶原激活剂；
Plg＝纤溶酶原
ECM＝细胞外基质
实施例
通过下列实施例进一步描述本发明。然而，这些实施例仅仅是对本发明的举例说明，而不以任何方式限制本发明的范围和含义。事实上，在阅读了本说明书后，本发明的许多变化和改变对于本领域普通技术人员来说是显而易见的，可在不脱离本发明精神和范围的情况下做出这些变化和改变。
实施例1
体外角质形成细胞迁移依赖于纤溶酶原的相对量
因为创伤愈合涉及大量不同的因素、细胞和过程，所以引入了简化的体外模型来描述纤溶酶原对细胞迁移的可能作用。
方法：
在细胞培养基中孵育DOK(早期肿瘤/发育异常的人口腔角质形成细胞)细胞。饥饿之后，将DOK细胞在存在或不存在人纤溶酶原、含有氢化可的松、谷氨酰胺、青霉素/链霉素、10％去除纤溶酶原的胎牛血清的DMEM细胞培养基中孵育。在第0h，在角质形成细胞层上形成标准刮伤，以诱导体外创伤愈合模型。在不同时间点(0h、12h和24h)在ZEISS显微镜下记录角质形成细胞迁移。
结果：
在实验过程中，在培养基中不存在纤溶酶原时，DOK(早期肿瘤/发育异常的人口腔角质形成细胞)细胞迁移看起来几乎停滞(图2A上图)。但是，在培养基中存在纤溶酶原时，角质形成细胞迁移相比于缺乏纤溶酶原的培养基显得增强(图2A下图)。在暴露于纤溶酶原(4μM)24小时后，这些体外创伤的边缘趋于融合(图2B)。另外，细胞迁移速率看上去呈纤溶酶原浓度依赖性。此实验清楚地表明，纤溶酶原对于体外快速创伤闭合以及加快损伤组织愈合速率是重要的。
实施例2
纤溶酶原缺陷型小鼠中牙周病的自发发生
方法：
此实验通过分析不同年龄的野生型和纤溶酶原缺陷型小鼠来研究纤溶酶原在牙周病发生中的重要性。
将纤溶酶原缺陷(plg缺陷)型和野生型(wt)小鼠分为三个年龄组(每组每个基因型5-8只小鼠)：组I：8-12周龄；组II：12-16周龄；组III：16-20周龄。牙通过分析每个基因型和年龄组的组织样本来跟踪牙周病的发生。
为了分析组织样本，将上下颌与颅骨分离，从总体软组织(例如舌)上剥离肉，在4％多聚甲醛(PFA)中固定24小时。之后，将样本转移到脱钙溶液中以从骨组织中除去钙。在四周的脱钙过程之后，将样本包埋于石蜡中并切片成5μm厚用于形态学染色。使用Safranin O染色用于形态学分析，因此软骨和粘蛋白被染成深红色，骨结构和牙齿是蓝色，细胞核被染成深蓝色。
结果：
8-12周龄时围绕牙齿的牙床组织的形态学分析显示，野生型小鼠没有炎症或胶原组织从牙齿表面脱离。相反地，所有plg缺陷小鼠均显示牙龈炎最初阶段的明显标志-炎症、胶原组织从牙齿脱离、在牙齿之间形成坏死组织以及骨间隔和下颌骨的降解(图3)。直至20周龄时野生型小鼠具有健康的口腔(图3、4、5)；而在纤溶酶原缺陷型小鼠中，牙龈炎随着年龄发展成牙周炎：牙龈组织严重发炎，在软组织深处形成坏死组织以及明显的骨间隔破坏(图4、5)。这些数据明确证明纤溶酶原缺陷型小鼠自发发生严重牙周病并且疾病严重程度随年龄增加而发展。
实施例3
纤溶酶原缺陷型小鼠比野生型小鼠在唾液中含有明显更高的细菌数量
方法：
将16-20周龄的野生型、纤溶酶原杂合型和纤溶酶原缺陷型小鼠用于此研究(表1)。通过用无菌移液器枪头从口中收集唾液并转移到用于立即培养的厌氧培养基中完成小鼠唾液取样。
结果：
从野生型和纤溶酶原杂合型小鼠中成功收集5微升唾液样本。但是，由于纤溶酶原缺陷型小鼠口腔中的普遍干燥条件，唾液样本的可能量在在1.0微升至5.0微升之间变化。细菌回收显示纤溶酶原缺陷型小鼠唾液中含有几乎9.0×106/ml的细菌，是三个组中最高的，显著高于野生型小鼠。重要的是，纤溶酶原杂合型小鼠也具有显著高于野生型小鼠的细菌数量(图6)。这些数据清楚地表明，纤溶酶原在保持对口腔细菌的抵抗性上起到了重要作用。另外，细菌的数量看上去非常依赖于纤溶酶原的相对量，这提示纤溶酶原作为新药促进口腔健康的治疗重要性。
实施例4
在纤溶酶原缺陷型小鼠中补充人纤溶酶原成功改善这些小鼠中的自发性 牙周病的临床状况
方法：
将10只纤溶酶原缺陷(8-12周龄)型小鼠随机分入纤溶酶原和PBS处理组(5只小鼠/组)中。从第0天至第9天，每天给小鼠静脉内注射100微升人纤溶酶原(10mg/ml)或PBS。在第10天，处死小鼠。对于左侧颌而言，拔出臼齿以回收细菌。对右侧颌进行脱钙处理、石蜡包埋以及形态学染色。在实验中包含了相同年龄的三只未处理野生型小鼠作为对照。
结果：
拔出牙齿样本的细菌回收显示补充了人纤溶酶原的纤溶酶原缺陷型小鼠相比于补充了PBS的纤溶酶原缺陷型小鼠具有显著降低的细菌数(图7)。这些数据表明纤溶酶原在对抗细菌定殖于牙齿的宿主防御中是必不可少的。
如所预期的，在所有5个PBS处理的纤溶酶原缺陷型小鼠中均发生了严重的牙周病：牙齿组织中存在坏死组织，周围胶原组织开始从牙齿脱落以及已经发生骨吸收(图8和图9，左图)。补充了人纤溶酶原的纤溶酶原缺陷型小鼠已完全恢复了细胞和组织结构：在牙齿组织中没有观察到炎症，坏死组织已被除去以及已发生胶原组织重建(图8和图9，右图)。对于3只未处理的野生型小鼠，形态学分析显示了如图3所示类似的正常组织结构。此数据清楚地显示，纤溶酶原在维持正常组织结构和对抗牙周病功能中起到了关键作用。
实施例5
在纤溶酶原缺陷型小鼠中牙床组织局部补充人纤溶酶原成功改善这些小 鼠中自发性牙周病的临床状况
方法：
将10只纤溶酶原缺陷(16-20周龄)小鼠随机分入纤溶酶原和PBS处理组(5只小鼠/组)中。从第0天至第9天，每天向纤溶酶原缺陷型小鼠下颌两侧的牙床组织局部注射10微升人纤溶酶原(10mg/ml)。对于对照的PBS处理组，每天向纤溶酶原缺陷型小鼠下颌两侧的牙床组织局部注射10微升PBS。在第10天，处死小鼠，进行形态学研究。将三只未处理的野生型小鼠和三只未处理的纤溶酶原缺陷型小鼠用作未处理对照。
为了分析组织样本，将上下颌与颅骨分离，从总体软组织(例如舌)上剥离肉，在4％PFA中固定24小时。之后，将样本转移到脱钙溶液中以从骨组织中除去钙。在四周的脱钙过程之后，将样本包埋于石蜡中并切片成5μm厚用于形态学染色。将Safranin O染色用于形态学分析，因此软骨和粘蛋白被染成深红色，骨结构和牙齿是蓝色，细胞核被染成深蓝色。
结果
在牙床组织局部注射纤溶酶原成功地减轻了在纤溶酶原缺陷型小鼠中牙周病的严重程度。如所预期的，在所有5只PBS处理的纤溶酶原缺陷型小鼠中都发生严重牙周病：在牙床组织中存在坏死组织(N)，周围胶原组织开始从牙齿脱落以及已发生骨吸收(图10，左侧上面两幅图)。局部补充了人纤溶酶原的纤溶酶原缺陷型小鼠已在很大程度上恢复正常细胞和组织结构：在牙床组织中观察到低水平的炎症，坏死组织已被除去并且已经发生了胶原组织重建(图10，右侧上面两幅图)。对于3只未处理的野生型和纤溶酶原缺陷型小鼠而言，形态学分析分别显示与图3中类似的组织结构。此数据清楚地显示局部补充纤溶酶原为治疗牙周病提供了一种有效且有力的方式。
实施例6
在uPA和tPA双缺陷小鼠中自发发生牙周病
方法：
此实验通过分析野生型和tPA/uPA双缺陷小鼠中的牙周组织来研究纤溶酶在牙周病发生中的重要性。在我们实验室中制造tPA/uPA双缺陷小鼠以制造缺少纤溶酶原活化的小鼠。尽管在这些小鼠体内含有纤溶酶原，但是它们无法将此纤溶酶前体转化成活性纤溶酶。因此，来自这些小鼠的数据可直接得出活性纤溶酶在宿主对抗自发牙周病的防御中的重要性。
通过分析每个基因型的组织样品进行跟踪，在tPA/uPA双缺陷小鼠和它们的野生型同系鼠中在22周龄时发生了牙周病，。
为了分析组织样品，将上下颌与颅骨分离，从粗的软组织(例如舌)上剥离肉，在4％多聚甲醛(PFA)中固定24小时。之后，将样本转移到脱钙溶液中以从骨组织中除去钙。在四周的脱钙过程之后，将样本包埋于石蜡中并切片成5μm厚用于形态学染色。将Safranin O染色用于形态学分析，因此软骨和粘蛋白被染成深红色，骨结构和牙齿是蓝色，细胞核被染成深蓝色。
结果：
22周龄野生型以及tPA和uPA双缺陷小鼠的形态学分析显示，野生型小鼠没有炎症或胶原组织从牙齿脱离(图11，左图)，所有四只tPA和uPA双缺陷小鼠均显示严重的牙周病：牙床组织严重发炎，在软组织深处形成坏死组织(N)以及已发生了明显的骨间隔破坏(B)(图11)。这些数据明确证明tPA和uPA双缺陷小鼠自发发生了严重的牙周病，表明活性纤溶酶在正常牙周健康的维持上也是至关重要的。
在下述实施例中，我们将要描述我们在细菌性关节炎研究中的发现以及我们将进行的研究。我们相信我们会得到如我们在细菌性关节炎研究中获得的类似的前瞻性数据。尽管我们已有的数据来自细菌性关节炎的研究，但我们认为这些结果强烈提示在牙周区域进行类似研究时也会有这种期望的结果。因此，这些结果提示在牙周区域局部注射人纤溶酶原也可恢复plg-/-小鼠中抗牙周病的正常宿主防御。此结论基于下述原因的考虑：
1、膝关节区域和牙周区域的宿主防御机制在很大程度上相似，在两种情况中，通过宿主防御过程，炎症细胞被活化并迁移到感染区域，细菌被活化的炎性细胞及其它分子杀死，细胞因子网络表达增强，坏死组织被除去以及发生组织重建。
2、在牙周炎和细菌性关节炎中，金黄色葡萄球菌都是在感染过程中起重要作用的临床病原体。因此，从金黄色葡萄球菌诱导的细菌性关节炎的研究中所获得的这些数据最有可能代表一般性现象，而不论具体的感染组织位置如何。
3、用于细菌性关节炎模型的局部注射方法也已经用于牙周炎研究(参见实施例5)，并且在plg-/-小鼠中局部注射纤溶酶原减少自发性牙周炎的情况下已显示阳性结果。这些相似性还表明从细菌性关节炎获得的结果代表了也作为牙周病发病基础的一般性机制。
因此，我们使用来自我们对细菌性关节炎研究的数据(实施例7和8)来支持我们在本专利申请中的权利要求。来自细菌性关节炎研究数据的重要性在于：首先，实施例7的结果表明在plg-/-小鼠诱导感染模型中局部注射纤溶酶原恢复了宿主防御能力(例如杀死细菌)；另外，实施例8的结果表明在诱导感染模型中局部注射纤溶酶原还增强了正常野生型小鼠的正常宿主防御能力(例如杀死细菌)。另外，基于这些原因，我们在本专利申请中还包括了另一个我们要进行的实施例(实施例9)。在该实施例中，我们描述了诱导牙周病的临床模型，我们相信纤溶酶原的应用可恢复plg-/-小鼠的宿主防御并进一步增强野生型小鼠或其它物种中的正常宿主防御。
实施例7
对plg - / - 小鼠局部补充人纤溶酶原(hPlg)恢复膝关节中正常的抗细菌感染 宿主防御
方法
在小鼠的两个膝关节中，通过局部接种10微升无菌PBS中的1×106CFU的金黄色葡萄球菌Phillips株来诱导细菌性关节炎。细菌接种后15分钟，通过在膝关节组织周围局部注射来对6只plg-/-小鼠的一侧膝关节补充40微升的人纤溶酶原(PBS中10μg/μl，Biopool，
Figure G200780032092XD00241
Sweden)。之后，以24小时的间隔补充人纤溶酶原7天。作为局部注射的对照，在细菌接种后15分钟，向2只plg-/-小鼠的膝关节组织周围仅局部注射40微升无菌PBS，之后在7天实验期间以24小时的间隔注射。作为野生型小鼠对照，在细菌接种后15分钟，给2只plg+/+小鼠单独局部注射40微升无菌PBS，之后以24小时的间隔注射7天。作为全身注射的plg-/-小鼠对照，在细菌接种前1小时对2只plg-/-小鼠静脉给予100微升人纤溶酶原(10μg/μl)，之后每24小时给药，共7天。
在细菌接种后第7天处死小鼠，取下膝关节并在1毫升无菌PBS中匀浆。在系列稀释后，将匀浆液涂布在LB琼脂平板上，在37℃孵育过夜。然后对活细菌菌落计数，以评价每种匀浆液中的金黄色葡萄球菌数。
结果
与用PBS局部处理的这些小鼠相比，持续7天对接种了金黄色葡萄球菌的plg-/-小鼠局部注射纤溶酶原成功并且显著地将细菌量降低了100倍。全身注射人纤溶酶原的plg-/-小鼠或者局部注射PBS的plg+/+小鼠也成功地杀死了它们膝关节中的细菌。这些数据(表1)清楚地表明局部注射人纤溶酶原可恢复plg-/-小鼠的正常细菌杀伤能力。
表1、在接种1×106CFU的金黄色葡萄球菌Phillips株后第3天用不同的局部和全身处理的plg-/-小鼠和plg+/+小鼠中的细菌数
  分组   样品数   细菌平均数(平均值±SD，×106CFU)
  局部注射hPlg的Plg-/-   6   0.019±0.044*
  局部注射PBS的Plg-/-   6   1.09±0.55
  全身注射hPlg的Plg-/-   2   0.00075±0.0011*
  局部注射PBS的Plg+/+   2   0.00065±0.00092*
＊，P＜0.05，相比于用局部注射PBS的plg-/-小鼠组。
实施例8
对plg + / + 小鼠局部补充人纤溶酶原增强膝关节中的抗细菌感染宿主防御
方法
通过向小鼠膝关节中局部接种10微升无菌PBS中的1×106CFU的金黄色葡萄球菌Phillips株来诱导细菌性关节炎。细菌接种后15分钟，通过在膝部皮肤下和膝关节组织周围局部注射对7只plg+/+小鼠的一侧膝关节补充50微升的人纤溶酶原(hPlg，PBS中10μg/μl，Biopool，
Figure G200780032092XD00251
Sweden)。之后，以相同方式和24小时的间隔从第0天到第2天补充人纤溶酶原。作为局部注射的对照，在细菌接种后15分钟时对7只plg+/+小鼠在膝部皮肤下和膝关节组织周围局部注射单独50微升无菌PBS，之后，在实验期间的第0天到第2天以24小时的间隔进行同样的局部注射。
在细菌接种后第3天处死小鼠，取下膝关节并在1毫升无菌PBS中匀浆。在系列稀释后，将匀浆液涂布在LB琼脂平板上，在37℃孵育过夜。然后对活细菌菌落计数，以评价每种匀浆液中的金黄色葡萄球菌数。
结果
相比于PBS处理的对照plg+/+小鼠组而言，持续3天在plg+/+小鼠中膝关节处局部注射人纤溶酶原成功且显著地将活金黄色葡萄球菌数减少了5倍。这些数据清楚地证明了人纤溶酶原是强力的促炎症因子，其甚至在野生型动物中增强抗细菌感染的宿主防御。这些数据(表2)还表明纤溶酶原是用于临床应用的新型抗感染候选药物。
表2、在接种1×106CFU的金黄色葡萄球菌Phillips株后第3天局部注射人纤溶酶原或PBS的野生型(plg+/+)小鼠中的细菌数。注意：在局部注射了Plg的野生型小鼠中，细菌数比局部注射了PBS的野生型小鼠中显著降低了5倍。
  分组   样品数   细菌平均数(平均值±SE，×106CFU)
  局部注射hPlg的Plg+/+   7   0.031±0.011*
  局部注射PBS的Plg+/+   7   0.14±0.047
＊ ，P＜0.05，相比于用局部注射PBS的plg+/+小鼠组。
实施例9
在实验动物中补充纤溶酶原恢复/增强抗金黄色葡萄球菌诱导牙周病的宿主防御
方法
在此实施例中使用的实验模型大部分如之前所述(31)，并根据我们的研究情况进行了必要修改。因为金黄色葡萄球菌是牙周病的主要致病原之一，所以我们将首先使用金黄色葡萄球菌作为此模型中的感染菌。但是，因为我们相信纤溶酶原在增强宿主抗感染防御中起到一般性作用，取决于实验条件，我们有可能使用牙龈卟啉单胞菌作为另一种感染性细菌，进行与利用金黄色葡萄球菌类似的研究。
将三十六只8周龄小鼠随机分为三组：结扎感染组、结扎假感染组和对照组。以12小时光照/12小时黑暗的周期常规饲养小鼠，随意喂饲食物和水。
用于口腔感染的粘附有金黄色葡萄球菌的结扎线
对于牙周感染，通过将无菌结扎线的7mm片段浸入LB培养液中并在37℃培养到晚对数期-早平台期来制备粘附有金黄色葡萄球菌的结扎线。对于假组(sham group)，通过上述步骤处理结扎线但没有微生物。对于结扎线上的细菌计数，将结扎线悬于1毫升LB培养液中并涡旋混匀30秒。之后，将悬液系列稀释并涂布在LB琼脂平板上，在37℃孵育过夜。然后对活细菌菌落计数以评价金黄色葡萄球菌数目。
牙周感染
通过将结扎线放置在麻醉动物上颌的臼齿周围并打结来进行实验组和假感染组中的牙周感染。借助于无菌器械，将金黄色葡萄球菌粘附的结扎线或假处理的结扎线在左上颌第一上颌臼齿(M1)上打结。在收紧结之后，将结扎线按进缝隙中。对照动物既未结扎也未被微生物感染。
检测和鉴定金黄色葡萄球菌
在处死时，通过在结扎臼齿区域取生物膜样品或者通过以无菌方式小心拔出臼齿来检测细菌的存在。将样本立即转移到LB肉汤中，剧烈涡旋混匀，系列稀释并置于LB琼脂平板上，在37℃孵育过夜。之后对LB琼脂平板上的总CFU进行计数以确定细菌数。
用纤溶酶原治疗
在对小鼠模型的建立进行验证之后，开始通过静脉内全身性注射或者在左上颌M1边缘牙龈处局部每日注射人plg(10μg/μl)。注射的起始点可以是实验开始的时间，或者在实验的感染阶段期间。在实验结束时，处死每个组的动物以进行最终的细菌学取样和分析。将上颌与颅骨分离，从总体软组织(例如舌)剥离下肉，在4％多聚甲醛(PFA)中固定24小时。之后，将样本转移到脱钙溶液中以从骨组织中除去钙。在四周的脱钙过程之后，将样本包埋于石蜡中并切片成5μm厚用于形态学染色。将SafraninO染色用于形态学分析，因此软骨和粘蛋白被染成深红色，骨结构和牙齿是蓝色，细胞核被染成深蓝色。
结果
基于我们之前来自纤溶酶原治疗plg-/-小鼠的经验，在这些具有自发性牙周病的动物中全身注射和局部注射都已重建牙龈炎症、正常宿主防御(例如杀死细菌)和适当的牙周重附着，我们强烈预测在如上所述诱导牙周病模型中纤溶酶原治疗plg-/-小鼠也有相似的反应。另外，基于我们之前对另一个感染模型(细菌性关节炎模型)的研究数据，在plg+/+小鼠中纤溶酶原的局部注射增强抵抗感染性细菌的正常宿主防御时，我们强烈预测在如上所述诱导牙周病模型过程中在plg+/+小鼠中的局部纤溶酶原治疗也会增强plg+/+小鼠的正常宿主防御。并且因此，所有这些数据会明显表明纤溶酶原是一种预防和治疗牙周病、改善牙周创伤愈合以及促进口腔健康的新型候选药物。
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Claims (23)

1.纤溶酶原在制备包含有效量的用于在需要治疗的对象中预防、防止和/或治疗金黄色葡萄球菌感染性牙周病的所述化合物的药物组合物中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中所述金黄色葡萄球菌感染性牙周病选自：牙周炎、牙龈炎和种植体周围炎。
3.根据权利要求1的用途，其中所述金黄色葡萄球菌感染性牙周病选自：坏死性牙龈炎和种植体周围粘膜炎。
4.根据权利要求1的用途，其还促进角质形成细胞迁移、减少金黄色葡萄球菌生长、去除坏死组织和/或改善胶原组织重建。
5.纤溶酶原在制备包含有效量的用于在需要治疗的对象中促进金黄色葡萄球菌感染性牙周创伤愈合的所述化合物的药物组合物中的用途。
6.权利要求5的用途，其中所述金黄色葡萄球菌感染性牙周创伤是由外伤引起的创伤或者由牙周手术或整形手术引起的创伤。
7.权利要求5的用途，其还促进角质形成细胞迁移、去除坏死组织和/或改善胶原组织重建。
8.权利要求6的用途，其还促进角质形成细胞迁移、去除坏死组织和/或改善胶原组织重建。
9.根据权利要求1-8中任一项的用途，其中所述对象是人，所述化合物是人纤溶酶原。
10.根据权利要求1-8中任一项的用途，其中所述对象是非人哺乳动物。
11.根据权利要求1-8中任一项的用途，其中所述组合物还包含可药用载体。
12.根据权利要求1-8中任一项的用途，其中所述组合物选自水溶液、凝胶、粉末、膏或创伤敷料。
13.根据权利要求1-8中任一项的用途，其中所述组合物选自含漱溶液、洗剂、香膏、牙膏或绷带。
14.根据权利要求1-8中任一项的用途，其中所述组合物通过表面或口服进行施用。
15.根据权利要求1-8中任一项的用途，其中所述组合物通过局部或全身施用进行施用。
16.根据权利要求1-8中任一项的用途，其中所述组合物通过喷雾进行施用。
17.根据权利要求15的用途，其中用于局部施用的所述组合物在每平方厘米施用面积上包含1微克至500毫克纤溶酶原。
18.根据权利要求14的用途，其中所述施用重复至少一次。
19.根据权利要求15的用途，其中所述施用重复至少一次。
20.根据权利要求16的用途，其中所述施用重复至少一次。
21.根据权利要求14的用途，其中所述施用至少每天重复。
22.根据权利要求15的用途，其中所述施用至少每天重复。
23.根据权利要求16的用途，其中所述施用至少每天重复。
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