CN101553503B - α-1,6-岩藻糖基转移酶表达的SHRNA介导的抑制 - Google Patents
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Abstract
本发明包括在哺乳动物细胞中产生具有降低的岩藻糖修饰程度的异源多肽的方法,包括在适于表达所述异源多肽的条件下培养该哺乳动物细胞,并从哺乳动物细胞或培养物回收所述异源多肽,其中在所述哺乳动物细胞中,通过针对α1,6-岩藻糖基转移酶mRNA的shRNA降低了α1,6-岩藻糖基转移酶的酶促活性。
Description
本发明涉及RNAi领域。更精确地,本发明涉及降低酶的翻译的领域,所述酶催化重组产生的蛋白质如诊断或治疗性抗体的修饰。
发明背景
RNAi介导的基因沉默现象首次描述于秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)系统,其中报导了显微注射长的双链RNA分子导致各自基因的失活(US 6,506,559)。后来,公开了在脊椎动物(EP 1 114 784)、哺乳动物,尤其在人类细胞(EP 1 144 623)中的RNAi介导的基因沉默。在这些系统中,如果将19-29bp的短的双链RNA分子转染以便暂时击倒特定目的基因,那么成功地实现了基因失活。
RNA介导的基因失活机理似乎在迄今研究的多种生物中稍微不同。然而,在所有系统中,RNA介导的基因沉默是基于内切核酸酶Argonaute2诱导的靶mRNA的转录后降解,Argonaute2是所称作的RISC复合体的部分(WO 03/93430)。降解的序列特异性通过装入RISC复合体的特定反义RNA链的核苷酸序列决定。
适当的导入可能性包括转染双链RNA分子自身或者DNA载体构建体的体内转录,其直接导致短的双链RNA化合物,该RNA化合物具有与靶RNA分子的部分同一的序列。在许多情况下,所称作的shRNA构建体已经被成功用于基因沉默。这些构建体编码茎环RNA,其特征在于导入细胞后,其被加工成双链RNA化合物,其序列对应于最初RNA分子的茎。
IgG 1型免疫球蛋白具有两个N-连接的寡糖链,其结合到Fc区的Asn297位或者在一些情况下结合到Asn298位。N-连接的寡糖通常为复杂的双触角型,由三甘露糖基核心结构组成,存在或不存在核心岩藻糖(Rademacher,T.W.,等人,Biochem.Soc.Symp.51(1986)131-148;Umana,P.,等人,Nature Biotechnol.17(1999)176-180;Okazaki,A.,等人,J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249;Shinkawa,T.,等人,J.Biol.Chem.278(2003)3466-3473)。
US 2004/0132140和US 2004/0110704报导了用于抑制表达重组抗体的细胞系内α1,6-岩藻糖基转移酶的重组或遗传方法。
发明概述
本发明包括在哺乳动物细胞中产生具有降低的岩藻糖修饰程度的异源多肽的方法,包括
-在适合表达该异源多肽的条件下培养哺乳动物细胞,
-从所述哺乳动物细胞或培养物回收所述异源多肽,
其中所述哺乳动物细胞用SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的核酸和编码异源多肽,优选编码作为异源多肽的免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或免疫球蛋白缀合物的核酸转染,所述SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的核酸被转录为针对α1,6-岩藻糖基转移酶mRNA的shRNA。
在一个实施方案中,shRNA的转录处于Pol III启动子,优选U6启动子的控制下。在一个实施方案中,哺乳动物细胞额外用编码新霉素选择标记的核酸转染。在一个实施方案中,哺乳动物细胞是CHO来源的细胞。在一个实施方案中,哺乳动物细胞用单一核酸转染,该核酸包含SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6的第一核酸、编码新霉素选择标记的第二核酸和编码异源多肽的第三核酸,所述第一核酸被转录为针对α1,6-岩藻糖基转移酶的shRNA。
本发明还包含核酸,其包含选自SEQ ID NO:5和6的核酸的第一核酸、编码新霉素选择标记的第二核酸,和编码异源多肽的第三核酸,所述异源多肽选自包括免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和免疫球蛋白缀合物的异源多肽。
本发明还报导了包含根据本发明的核酸的细胞。
发明详述
本发明包括在哺乳动物细胞中重组产生具有降低的岩藻糖修饰程度的异源多肽的方法,所述哺乳动物细胞包含转录成shRNA的核酸和编码所述异源多肽的核酸,所述方法包括用所述核酸转染哺乳动物细胞,在适于表达该异源多肽的条件下培养转染的哺乳动物细胞,并从哺乳动物细胞或培养物回收所述异源多肽,其中在哺乳动物细胞中,通过所转录的针对α1,6-岩藻糖基转移酶mRNA的shRNA降低了α1,6-岩藻糖基转移酶的酶活性。
令人惊奇地发现使用转录成shRNA的SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的核酸,通过培养包含所述核酸的哺乳动物细胞可以得到与已知方法相比具有降低的岩藻糖修饰程度的免疫球蛋白,或免疫球蛋白片段或免疫球蛋白缀合物。
本发明还包括核酸,其包含用于转录针对α1,6-岩藻糖基转移酶的sh RNA的选自SEQ ID NO:5和6的(第一)表达盒,用于表达新霉素选择标记的(第二)表达盒,和用于表达异源多肽的(第三)表达盒。
本发明还包括包含根据本发明的核酸的哺乳动物细胞。
可用于实施本发明的本领域技术人员已知的方法和技术描述于例如Ausubel,F.M.,编著,Current Protocols in Molecular Biology,Volumes I toIII(1997);Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989);Glover,N.D.,和Hames,B.D.,编著,DNA Cloning:A PracticalApproach,Volumes I and II(1995),Oxford University Press;Freshney,R.I.(ed.),Animal Cell Culture-a practical approach,IRL Press(1986);Watson,J.D.,等人,Recombinant DNA,Second Edition,CHSL Press(1992);Winnacker,E.L.,From Genes to Clones,N.Y.,VCH Publishers(1987);Celis,J.,编著,Cell Biology,第二版,Academic Press(1998);Freshney,R.I.,Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Techniques,第二版,Alan R.Liss,Inc.,N.Y.(1987)。
重组DNA技术的使用使得可以产生核酸和/或多肽的许多衍生物。此类衍生物可以例如通过替代、改变、交换、缺失或插入在一个或多个位置被修饰。例如,通过位点定向诱变可以进行修饰或衍生化。此类修饰可以由本领域技术人员容易地进行(见,例如,Sambrook,J.,等人,MolecularCloning:A laboratory manual(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York,USA;Hames,B.D.,和Higgins,S.G.,Nucleic acidhybridization-a practical approach(1985)IRL Press,Oxford,英国)。
重组技术的使用可以使得用一种或多种异源核酸转化多数宿主细胞。尽管不同细胞的转录和翻译(即表达)机器使用相同的元件,但是属于不同物种的细胞可以具有不同的所谓的密码子选择等等。从而,相同的多肽(在氨基酸序列方面)可以由不同的核酸编码。而且,由于遗传密码简并性,不同的核酸可以编码相同的多肽。
如本文所用的“核酸”指多核苷酸分子,例如,DNA、RNA或其修饰分子。该多核苷酸分子可以是天然存在的多核苷酸分子或者合成的多核苷酸分子或者一种或多种天然存在的多核苷酸分子与一种或多种合成的多核苷酸分子的组合。该定义还包括天然存在的多核苷酸分子,其中一个或多个核苷酸例如通过诱变而被改变、缺失或添加。核酸可以是分离的,或者整合在另一核酸中,例如,整合在表达盒、质粒或者宿主细胞的染色体中。核酸同样通过其由各个核苷酸组成的核酸序列表征。
对于本领域技术人员,公知的步骤和方法将例如多肽的氨基酸序列转化成编码该氨基酸序列的对应的核酸序列。因此,核酸通过其由各核苷酸组成的核酸序列表征,同样通过其编码的多肽的氨基酸序列表征。
术语“质粒”包括例如穿梭和表达质粒/载体以及转染质粒/载体。术语“质粒”和“载体”在本申请中可互换使用。通常,“质粒”将也包含复制原点(例如,ColE1或oriP复制原点)和选择标记(例如,氨苄青霉素、卡那霉素、四环素或氯霉素选择标记),分别用于细菌中载体/质粒的复制和选择。
“表达盒”指构建体,其含有必要的调节元件,如启动子和多聚腺苷酸化位点,用于在细胞中表达至少所含的核酸,例如,结构基因的核酸。任选地,可以含有额外的元件,其例如能够使得分泌所表达的多肽。如果所含的核酸在转录后没有进一步翻译为多肽而是形成例如shRNA,使用术语表达盒也在本发明的范围内。
“结构基因”指没有信号序列的基因的编码区。
“基因”指例如染色体或质粒上的核酸区段,其是多肽或蛋白质的表达必需的。除了编码区外,基因还包含其他功能元件,包括启动子、内含子、终止子,和任选地前导肽。
“选择标记”是核酸,其允许在对应的选择试剂存在下,携带选择标记的细胞被特异选取或选出。有用的正选择标记是抗生素抗性基因。该选择标记允许用其转化的宿主细胞在对应选择试剂如抗生素存在下被正选择。非转化的细胞不能在培养物中的选择条件下生长或存活。选择标记可以是正的、负的或者双功能的。正选择标记允许选择携带该标记的细胞,而负选择标记允许携带该标记的细胞被选择性消灭。通常,选择标记将在宿主细胞中赋予药物抗性或者弥补代谢或分解代谢缺陷。用于真核细胞的选择标记包括例如,氨基糖苷磷酸转移酶(APH)的基因,例如,潮霉素(hyg)、新霉素(neo)和G418选择标记,二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(tk)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(选择试剂吲哚)、组氨醇脱氢酶(选择试剂组氨醇D)、和赋予对嘌呤霉素、博来霉素、腐草霉素、氯霉素、Zeocin和霉酚酸的抗性的核酸。其他标记基因描述于例如WO 92/08796和WO 94/28143。
如本文所用的术语“表达”指在细胞内发生的转录和/或翻译过程。可以基于存在于细胞中对应mRNA的量确定宿主细胞中所希望的产物的转录水平。例如,通过PCR或者RNA杂交可以定量从目的序列转录的mRNA(见Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989))。通过多种方法可以定量目的核酸编码的多肽,例如,通过ELISA,通过测定多肽的生物活性,或通过使用独立于此类活性的测定法,如蛋白质印迹或者放射免疫测定法,使用识别并结合所述多肽的免疫球蛋白(见Sambrook等人,1989,同上)。
术语“在适于表达异源多肽的条件下”指用于培养哺乳动物细胞以便表达异源多肽的培养条件,所述异源多肽由转染到所述哺乳动物细胞的核酸编码,所述条件是已知的或者可以由本领域技术人员容易地确定。本领域技术人员还已知的是这些条件可以取决于培养的哺乳动物细胞的类型和所表达蛋白质的类型而变。通常,在例如20℃到40℃的温度下培养哺乳动物细胞足够允许有效产生蛋白质的时间,如4到28天。
术语“细胞”或“宿主细胞”指细胞,其中可以或者已经导入/转染了例如编码异源多肽或构成shRNA的核酸。宿主细胞包括用于载体/质粒增殖的原核细胞,和用于表达核酸的真核细胞。优选地,所述真核细胞是哺乳动物细胞。优选地,哺乳动物(宿主)细胞选自哺乳动物细胞,像CHO细胞(例如,CHO K1或CHO DG44)、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK 293细胞、HEK 293 EBNA细胞、PER.C6细胞、或COS细胞。优选地,哺乳动物细胞选自杂交瘤、骨髓瘤,和啮齿动物细胞。骨髓瘤细胞包括大鼠骨髓瘤细胞(例如,YB2),和小鼠骨髓瘤细胞(例如,NS0,SP2/0)。
“多肽”是天然产生的或合成的由肽链连接的氨基酸组成的聚合物。少于约20个氨基酸残基的多肽可以被称作“肽”,而由两个或多个多肽组成或包含100个氨基酸残基以上的多肽的分子被称作“蛋白质”。多肽也可以包含非氨基酸组分,如糖基、金属离子,或羧酸酯。非氨基酸组分可以由细胞加入,其中在细胞中产生所述多肽,并且可以随着细胞的类型改变。如糖基的加入通常不是特定的,但是仍然可以存在。
用于本申请的术语“氨基酸”指羧基α-氨基酸基团,其直接或者以前体形式由核酸编码,包括丙氨酸(三字母代码:ala,单字母代码:A)、精氨酸(arg,R)、天冬酰胺(asn,N)、天冬氨酸(asp,D)、半胱氨酸(cys,C)、谷氨酰胺(gln,Q)、谷氨酸(glu,E)、甘氨酸(gly,G)、组氨酸(his,H)、异亮氨酸(ile,I)、亮氨酸(leu,L)、赖氨酸(lys,K)、甲硫氨酸(met,M)、苯丙氨酸(phe,F)、脯氨酸(pro,P)、丝氨酸(ser,S)、苏氨酸(thr,T)、色氨酸(trp,W)、酪氨酸(tyr,Y)、和缬氨酸(val,V)。
如本文所用,术语“免疫球蛋白”指由基本上由免疫球蛋白基因编码的一个或多个多肽组成的蛋白质。该定义包括变体,如突变形式,即具有一个或多个氨基酸的替代、缺失和插入的形式、截短形式、融合形式、嵌合形式,以及人源化形式。公知的免疫球蛋白基因包括来自例如灵长类和啮齿动物的不同恒定区基因以及无数免疫球蛋白可变区基因。免疫球蛋白可以以多种形式存在,包括例如,Fv、Fab和(Fab)2,以及单链(scFv)(例如,Huston,J.S.,等人,Proc.Natal.Acad.Sci.USA 85(1988)5879-5883;Bird,R.E.,等人,Science 242(1988)423-426;和一般地,Hood等人,Immunology,Benjamin N.Y.,第二版(1984)和Hunkapiller,T.,和Hood,L.,Nature 323(1986)15-16)。单克隆免疫球蛋白是优选的。
免疫球蛋白的每条重和轻多肽链(如果存在)可以包含恒定区(通常羧基末端部分)。免疫球蛋白的每条重和轻多肽链(如果存在)可以包含可变结构域(通常氨基末端部分)。免疫球蛋白的轻链或重链的可变结构域可以包含不同的区域,如,四个构架区(FR)和三个可变区(CDR)。
如本文所用的术语“单克隆免疫球蛋白”指从基本上均匀的免疫球蛋白群体得到的免疫球蛋白,即除了以少量存在的可能的天然存在的突变外,该群体中包含的各免疫球蛋白是相同的。单克隆免疫球蛋白是高度特异的,抗单个抗原位点(表位)。此外,与包括针对不同的抗原位点(决定簇或表位)的不同免疫球蛋白的多克隆免疫球蛋白制剂相比,每个单克隆免疫球蛋白针对该抗原上的单个抗原位点。除了它们的特异性外,单克隆免疫球蛋白是有利的,因为它们可以被合成而不受其他免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指出免疫球蛋白的特征为从免疫球蛋白的基本上均匀的群体得到并且不应被理解为需要通过任何具体方法产生该免疫球蛋白。
非人(例如,啮齿动物)免疫球蛋白的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白,其含有来自非人免疫球蛋白和来自人免疫球蛋白的部分序列。多数情况下,人源化免疫球蛋白来自人免疫球蛋白(受体免疫球蛋白),其中来自高变区的残基被来自非人物种(供体免疫球蛋白)(如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)的高变区的残基替代,所述来自非人物种的高变区残基具有希望的特异性和亲和性(见例如,Morrison,S.L.,等人,Proc.Natal.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855;US 5,202,238;US 5,204,244)。在一些情况下,人免疫球蛋白的构架区(FR)残基被对应的非人残基替换。此外,人源化的免疫球蛋白可以包含进一步的修饰,例如,在受体免疫球蛋白或供体免疫球蛋白中没有发现的氨基酸残基。此类修饰导致此类受体或供体免疫球蛋白的变体,其与对应的亲本序列是同源的但不是相同的。进行这些修饰以进一步改良免疫球蛋白性能。
通常,人源化免疫球蛋白将基本上包含至少一个,通常至少两个可变区的全部,其中所有或基本上所有高变环对应于非人供体免疫球蛋白的那些并且所有或基本上所有FR为人受体免疫球蛋白的那些。人源化免疫球蛋白将也包含至少部分免疫球蛋白恒定区,通常人免疫球蛋白的恒定区。
本领域已经描述了人源化非人免疫球蛋白的方法。优选地,人源化免疫球蛋白具有导入其中的来自非人来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称作“输入”残基,其通常来自“输出”可变结构域。基本上如下面Winter的同事的方法(Jones,P.T.,等人,Nature 321(1986)522-525;Riechmann,L.,等人,Nature 332(1988)323-327;Verhoeyen,M.,等人,Science 239(1988)1534-1536;Presta,L.G.,Curr.Op.Struct.Biol.2(1992)593-596),通过用高变区序列代替人免疫球蛋白的对应序列进行人源化。因此,此类“人源化”免疫球蛋白是嵌合免疫球蛋白(见例如,US4,816,567),其中基本上少于完整人可变结构域已经被来自非人物种的对应序列代替。实际上,人源化免疫球蛋白通常是人免疫球蛋白,其中一些高变区残基和可能一些构架区残基被来自啮齿类或非人灵长类免疫球蛋白中类似位点的残基替代。
免疫球蛋白的重组产生是本领域中公知的并且例如在Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999)183-202;Geisse,S.,等人,Protein Expr.Purif.8(1996)271-282;Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-160;Werner,R.G.,Drug Research 48(1998)870-880的综述文章中报导。
优选地,异源多肽选自免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、免疫球蛋白缀合物。优选地,所述免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、或免疫球蛋白缀合物是单克隆免疫球蛋白、单克隆免疫球蛋白片段,或单克隆免疫球蛋白缀合物。
如本文所用,术语“免疫球蛋白片段”指免疫球蛋白的部分。免疫球蛋白片段包括Fv、Fab、(Fab)2、单链(scFv),以及单个重链和单个轻链,以及其中已经缺失了至少一个区域和/或结构域的免疫球蛋白,所述区域和/或结构域选自:构架区1、构架区2、构架区3、构架区4、高变区1、高变区2、高变区3、每个轻链和重链、Fab区、铰链区、可变区、重链恒定结构域1、重链恒定结构域2、重链恒定结构域3,和轻链恒定结构域。
如本文所用,术语“免疫球蛋白缀合物”指免疫球蛋白和多肽的融合物。术语免疫球蛋白缀合物包括免疫球蛋白或免疫球蛋白片段与一个到八个,优选二到四个多肽的融合蛋白,其中每个多肽使用或不使用间插接头多肽融合到不同的N-或C-末端氨基酸。如果免疫球蛋白缀合物包含一个以上的非免疫球蛋白多肽,那么每个缀合的非免疫球蛋白多肽可以具有相同或不同的氨基酸序列和/或长度。
如本文所用,表达“细胞”包括主题细胞和其后代。从而,词语“转化体”和“转化细胞”包括原代主题细胞和从其衍生的培养物(不考虑传代次数)。还理解由于故意或非故意的突变,所有后代在DNA含量中不是精确地相同的。具有与最初转化细胞中所筛选的相同功能或生物活性的变异后代被包括在内。
通过重组方法产生本发明的异源多肽。此类方法是本领域公知的并且包括在原核和真核细胞中表达蛋白质并随后回收和分离异源多肽,并通常纯化至药学上可接受的纯度。对于异源多肽为免疫球蛋白的情况,通过标准方法将编码轻链和重链或其片段或其缀合物的核酸插入表达盒中。使用常规方法容易分离编码免疫球蛋白的核酸并对其测序。杂交瘤细胞可以作为此类核酸的来源。可以将表达盒插入一个或多个表达载体中,其然后转染到(宿主)细胞中,该细胞否则不产生免疫球蛋白。在合适的真核(宿主)细胞中进行表达并在裂解后从细胞或从上清液回收免疫球蛋白。
抗体的重组产生是本领域公知的并且例如在Makrides,S.C.,ProteinExpr.Purif.17(1999)183-202;Geisse,S.,等人,Protein Expr.Purif.8(1996)271-282;Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-160;Werner,R.G.,Drug Research 48(1998)870-880的综述文章中描述。
不同的方法已经建立并且广泛用于蛋白质回收和纯化,如用微生物蛋白质亲和层析(例如,A蛋白或G蛋白亲和层析)、离子交换层析(例如,阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合方式交换)、亲硫吸附(例如,用β巯基乙醇和其他SH配体)、疏水相互作用或芳族吸附层析(例如,用苯基-sepharose、氮杂-arenophilic树脂,或者间-氨基苯基硼酸)、金属螯合物亲和层析(例如,用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)、大小排阻层析,和电泳方法(如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。
本发明一般可应用于表达所称作的双链RNA核酸酶切酶和RISC复合体的所有活细胞,或者换句话说,应用于其中可以观察到RNA介导的基因沉默的所有细胞。从而,本发明可主要应用于哺乳动物细胞系,而且也可应用于所有类型的真核细胞。然而,优选常用于产生重组多肽的细胞系,如中国仓鼠卵巢细胞,例如,CHO K1(Jones,C.,等人,Cytogenet.CellGenet.16(1976)387-390),或CHO DG44(Urlaub,G,等人,Cell 33(1983)405-412;Urlaub,G.,等人,Somat.Cell.Mol.Genet.12(1986)555-566),人胚肾细胞,如HEK293细胞(Graham,F.L.,等人,J.Gen.Virol.36(1977)59-74),或HEK293 EBNA细胞、NS0细胞(Barnes L.M.,等人,Cytotechnology 32(2000)109-123;Barnes,L.M.,等人,Biotech.Bioeng.73(2001)261-270),和/或SP2/0细胞(Shulman,M.,等人,Nature 276(1978)269-270)。
在本发明的上下文中,术语“降低α1,6-岩藻糖基转移酶的酶活性”和其语法等同语指用于表达用于异源多肽的细胞中编码所述α1,6-岩藻糖基转移酶的特定靶标mRNA的降解,其通过shRNA化合物介导。shRNA化合物自身在用合适的表达盒转染(宿主)细胞后合成,构成所述shRNA化合物。备选地,用RNAi化合物的前体(其随后被加工成RNAi化合物)转染是可能的。
根据本发明的RNAi化合物是针对编码α1,6-岩藻糖基转移酶的mRNA(靶定mRNA)的shRNA。迄今,已经出现了两种主要的基因沉默策略用于体外研究:小干扰RNA(siRNAs)和小发夹RNAs(shRNAs)(Tuschl,T.,Nature Biotechnol.20(2002)446-448)。根据本发明的质粒来源的shRNA为与报道基因或选择标记组合并通过病毒载体递送提供了选择(Brummelkamp,T.R.,and Bernards,R.,Nat.Rev.Cancer 3(2003)781-789)。用RNAi化合物转染细胞导致具有降低水平的靶标mRNA,从而具有降低水平的对应多肽,当前为降低水平的对应的酶活性的细胞。mRNA水平为对应的野生型细胞的mRNA水平的5%到20%,优选5%到15%,更优选5%到10%。野生型细胞是在导入编码RNAi化合物的核酸之前的细胞,其中靶定mRNA没有被RNAi化合物降解。
稳定细胞克隆的产生通常是沉闷和冗长的过程。从而,在一个实施方案中,用重组表达的细胞表面标记进行选择被用于分离转染子。使用任一类型的基因在本发明的范围内,所述基因的表达产物位于细胞表面作为富集和选择表达高水平shRNA化合物的转染子的标记。l-NGFR在细胞表面表达并且已经被证明对于细胞生物学分析是高度有用的标记,l-NGFR是低亲和力神经生长因子受体的截短形式,从而对于信号转导是无活性的(Phillips,K.,等人,Nat.Med.2(1996)1154-1156 and Machl,A.W.,等人,Cytometry 29(1997)371-374)。
在本发明范围内,用本领域已知的基本上任何转染方法可以得到细胞转化体。例如,通过电穿孔或显微注射可以将载体DNA导入细胞中。备选地,可以使用转染试剂,如FuGENE 6(Roche Diagnostics GmbH)、X-tremeGENE(Roche Diagnostics GmbH)、LipofectAmine(InvitrogenCorp.)或nucleofection(AMAXA AG,cologne,德国)。还备选地,通过基于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺伴随病毒的合适的病毒载体系统可以向细胞中导入包含细胞表面蛋白和shRNA化合物的表达盒的载体DNA(Singer,O.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)5313-5314)。
在一个实施方案中,用编码选择标记的核酸转染哺乳动物细胞。优选地,选择标记选自潮霉素、嘌呤霉素和/或新霉素选择标记。在该实施方案中,选择压力,即在选择试剂存在下培养导致稳定转染的细胞系的选择/生长。在一个实施方案中,选择压力是通过加入兵豆(Lens culinaris)凝集素(LCA)。
在一个实施方案中,本发明包括在哺乳动物细胞中重组产生具有降低的岩藻糖修饰程度的异源多肽的方法,其包括
-在适于表达异源多肽的条件下培养哺乳动物细胞,
-从哺乳动物细胞或培养物回收所述异源多肽,
其中所述哺乳动物细胞用核酸转染,所述核酸包含SEQ ID NO:5或6的第一核酸(其转录成针对α1,6-岩藻糖基转移酶mRNA的shRNA)、编码新霉素选择标记的第三核酸,和编码异源多肽的第二核酸。在一个实施方案中是用单一核酸转染的哺乳动物细胞。术语“单一核酸”在本申请内指核酸混合物,其除了从核酸的产生和生产出现的单个核苷酸改变外具有同一的核酸序列,其中这些改变对所编码的mRNA没有影响。术语“同一的核酸序列”在本申请内指用于转染所述哺乳动物细胞的各核酸具有至少90%、或至少95,或至少98%或以上的核苷酸同一性。
来自构成shRNA化合物的核酸的转录物可以从Pol II启动子如CMV启动子或从Pol III启动子像H1、U6或7SK启动子转录(Zhou,H.,等人,Nucleic Acids Res.33(2005)e62;Brummelkamp,T.R.和Bernards,R.,Nat.Rev.Cancer 3(2003)781-789;Czauderna,F.,等人,Nucleic AcidsRes.31(2003)e127)。
对于Pol III介导的转录的情况,在转录的RNA的3’末端必须具有TTTT,优选TTTTTT的Pol III终止序列用于前体RNA产物的合适的3’加工(Dykxhoorn,D.M.,等人,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.4(2003)457-467)。
RNAi化合物是具有发夹构象的RNA,即shRNA。作为活性RNAi化合物,由于从H1和U6启动子转录通常以G开始这一事实,所以这种分子可以在其5’末端以G核苷酸开始。该分子的茎是由于反向重复序列并且长度为19到29,优选19到23个碱基对。优选地,这些反向重复序列相互完全互补并且可以形成没有任何内部错配的双链杂交分子。
分子的内部环为4到40、优选4到9个核苷酸的单链。对于该环,重要的是避免任何反向重复序列以便防止分子自身折叠成不能作为shRNA分子的备选的二级结构。
在shRNA的3’末端,可以有突出端。对于使用Pol III启动子的情况,由于Pol III启动子的终止信号化,突出端可以为2到4个U残基。当在细胞内表达时,这些发夹构建体被快速加工为能够介导基因沉默的活性双链分子(Dykxhoorn,D.M.,等人,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.4(2003)457-467)。
核酸(DNA)由四种核碱基或核苷酸碱基A、C、T和G组成。A表示腺苷,C表示胞苷,T表示胸苷,G表示鸟苷。在RNA中,胸苷被尿苷(U)代替。
针对α1,6-岩藻糖基转移酶mRNA的shRNA化合物从合适的表达盒转录。它包含长为19到29个核苷酸,优选19到23个核苷酸的茎,其序列与被失活的靶标mRNA相同/互补。
在一个实施方案中,针对α1,6-岩藻糖基转移酶mRNA的shRNA的茎的核酸选自包含SEQ ID NO:1(CCAGAAGGCCCTATTGATC),SEQ IDNO:2(GCCAGAAGGCCCTATTGATC),和SEQ ID NO:3(GATCAATAGGGCCTTCTGGTA)的核酸。
在一个实施方案中,针对α1,6-岩藻糖基转移酶mRNA的shRNA的茎的核酸是核酸TTCAAGAGA(SEQ ID NO:4)。
在一个实施方案中,转录成shRNA的核酸选自包含SEQ ID NO:5和6的核酸,即,转录成shRNA的核酸具有SEQ ID NO:5的核酸序列,或SEQ ID NO:6的核酸序列。
使用本发明的方法,可以实现靶标mRNA减少到约1/50。这种程度的减少足够以合理的高产率产生具有降低的岩藻糖化程度的异源多肽。
术语“具有降低的岩藻糖修饰程度的异源多肽”和其语法等同语指在已经用转录为针对α1,6-岩藻糖基转移酶mRNA的shRNA的核酸和用编码所述异源多肽的核酸转染的哺乳动物细胞中表达的异源多肽,其在天冬酰胺连接的N-乙酰葡糖胺的6位的岩藻糖基化与在相同类型的哺乳动物细胞(该哺乳动物细胞用编码所述异源多肽的核酸转染但是没有用转录为针对α1,6-岩藻糖基转移酶mRNA的shRNA的核酸转染)中表达的异源多肽相比降低。在一个实施方案中,在用转录为针对α1,6-岩藻糖基转移酶mRNA的shRNA的核酸和用编码所述异源多肽的核酸转染的哺乳动物细胞中表达的异源多肽的岩藻糖基化与用编码所述异源多肽的核酸转染但是没有用转录为针对α1,6-岩藻糖基转移酶mRNA的shRNA的核酸转染的相同类型的哺乳动物细胞中表达的所述异源多肽的岩藻糖基化的比例为15%或以下。这表示异源多肽被岩藻糖基化至15%或以下。优选地,非岩藻糖基化的异源多肽与岩藻糖基化的异源多肽的比例为0.15或以下,例如0.12。
“异源DNA”或“异源多肽”指不天然存在于给定宿主细胞中的DNA分子或多肽,或DNA分子群体,或者多肽群体。具体宿主细胞异源的DNA分子可以含有来自该宿主细胞物种的DNA(即,内源DNA),只要宿主DNA与非宿主DNA(即外源DNA)组合。例如,含有与包含启动子的宿主DNA区段有效连接的编码多肽的非宿主DNA区段的DNA分子被认为是异源DNA分子。相反地,异源DNA分子可以包含与外源启动子有效连接的内源结构基因。非宿主DNA分子编码的多肽是“异源”多肽。
“有效连接”指两个或多个组分的并置,其中所述各组分处于允许它们以它们预期的方式发挥功能的关系中。例如,如果启动子和/或增强子顺式作用以控制或调节连接的编码序列的转录,那么该启动子和/或增强子有效连接该编码序列。通常,但不是必须的是,“有效连接”的DNA序列是连续的,并且其中必要时连接两个蛋白质编码区,如连续的并符合读框的分泌性前导/信号序列和多肽。如果多聚腺苷酸化位点位于编码序列的下游末端使得转录通过编码序列进入多聚腺苷酸化位点,那么多聚腺苷酸化位点有效连接编码序列。通过本领域已知的重组方法,如使用PCR技术和/或通过在方便的限制性位点连接完成连接。如果不存在方便的限制性位点,那么根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
提供下面的实施例、序列表和附图以帮助理解本发明,其真实范围在所附的权利要求书中给出。可以理解可以对所给出的方法进行修改而不背离本发明的精神。
附图简述
图1:用于转录shRNAFuT8的本发明载体。
图2:质谱,其指出从CHO细胞分离的大量(上面小图)和少量(下面小图)量的不同岩藻糖基化的抗体,所述CHO细胞用shRNAFuT8转染并随后用新霉素、l-NGFR富集或LCA-选择(上面小图)或者仅用新霉素选择进行选择,如实施例4公开。
图3:连接到抗体的天冬酰胺的糖结构的图示(GlcNAc=N-乙酰葡糖胺,Man=甘露糖,Gal=半乳糖,Fuc=岩藻糖,NeuAc=N-乙酰神经氨酸)。
实施例
实施例1
载体克隆
在载体pSilencer2.1_U6neo(Ambion Inc.,cat.no.5764)的184位,通过位点定向诱变导入XhoI位点。随后将l-NGFR(低亲和力神经生长因子;见例如,Phillips,K.,等人,Nat.Med.2(1996)1154-1156和Machl,A.W.,等人,Cytometry 29(1997)371-374)表达盒克隆到XhoI/HindIII限制性位点中。为了产生FuT8 shRNA,使用下面的寡核苷酸:
F8shRNA4top
GATCCGCCAGAAGGCCCTATTGATCTTCAAGAGAGATCAATAGGG
CCTTCTGGTATTTTTTGGAAA(SEQ ID NO:5)
F8shRNA4bot
AGCTTTTCCAAAAAATACCAGAAGGCCCTATTGATCTCTCTTGAA
GATCAATAGGGCCTTCTGGCG(SEQ ID NO:6)
将退火的FuT8shRNA连接到对应的载体片段(BamHI/HindIII消化的)中。将完成的载体称作pSilencer2.1_U6neo_l-NGFR_shRNAFuT8(pSilencer)。
实施例2
单个克隆的选择和分离
用表达抗体的质粒转染CHO-DG44细胞。作为示例性抗体,使用结合人胰岛素样生长因子受体1的抗体(序列见例如WO 2005/005635)。
用FuGENE试剂(Roche Diagnostics GmbH)根据生产商的手册用pSilencer2.1_U6neo_l-NGFR_shRNAFuT8转染产生抗体的CHO-DG44克隆(野生型,没有pSilencer)。在补充1%200mM L-谷氨酰胺(Gibco)和10%透析的γ射线照射的胎牛血清(目录号1060-017;Invitrogen GmbH,德国)的MEM Alpha培养基(目录号22561-021;Invitrogen GmbH,德国)中培养稳定转染的细胞。用400μg/ml新霉素选择转染的细胞一周。用MACSelect-l-NGFR系统根据生产商手册(Miltenyi Biotec;Cat.130-091-879)对存活细胞进行l-NGFR富集。用0.5mg/ml LCA(兵豆凝集素)选择l-NGFR-富集的细胞。通过稀释LCA-选择库至每96孔1个细胞回收LCA选择的细胞的克隆。
实施例3
RNA分离和cDNA合成和定量RT-PCR
使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen GmbH,德国)分离总RNA,包括DNA酶消化。用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis试剂盒(RocheDiagnostics GmbH,德国)用锚定寡聚(dT)18引物反转录等量的总RNA(400ng)。cDNA合成后用LightCycler FastStart DNA Master SYBR GreenI试剂盒(Roche Diagnostics GmbH,德国)通过实时PCR分析样品。为了扩增和检测FuT8(岩藻糖基转移酶8)和ALAS(5-氨基酮戊酸合酶)cDNA,使用如下的序列特异性引物:
FuT8正向:5′-GGCGTTGGATTATGCTCATT-3′(SEQ ID NO:7)
FUT8反向:5′-CCCTGATCAATAGGGCCTTC-3′(SEQ ID NO:8)
ALAS正向:5′-CCGATGCTGCTAAGAACACA-3′(SEQ ID NO:9)
ALAS反向:5′-CTTCAGTTCCAGCCCAACTC-3′(SEQ ID NO:10)。
在下面条件下进行扩增:95℃下10分钟预温育步骤,接着是45个循环的:95℃下10秒、52℃下10秒和72℃下8秒(温度升高20℃/秒)。使用LightCycler相对定量软件(LightCycler Relative QuantificationSoftware)将FuT8 cDNA水平对持家基因ALAS的cDNA水平归一化。
结果在下面的表1中显示。
表1:FuT8 mRNA表达的Light Cycler RT-PCR分析
克隆: | %FuT8-表达mRNA |
野生型 | 100(参照) |
对照shRNA | 69 |
LCA,克隆1 | 2 |
LCA,克隆2 | 34 |
LCA,克隆3 | 16 |
LCA,克隆4 | 23 |
LCA,克隆5 | 6 |
LCA,克隆6 | 5 |
LCA,克隆7 | 15 |
LCA,克隆8 | 127 |
LCA,克隆9 | 3 |
克隆: | %FuT8-表达mRNA |
LCA,克隆10 | 23 |
LCA,克隆11 | 14 |
LCA,克隆1和LCA,克隆9表达残留量的α1,6-岩藻糖基转移酶mRNA,其降低约50到40倍。
实施例4
抗体糖结构的质谱分析
通过质谱法测定糖基化的完整抗体重链(HC)中抗体分别在Asn297和Asn298处糖链同种型的相对含量,如下文所述:
A)从表达抗体和FuT8 shRNA的细胞的培养上清液纯化抗体
将含有也表达针对FuT8的shRNA的细胞产生的抗体(浓度~5-20μg/ml)的约5-10ml培养上清液与约100μl A蛋白SepharoseTM CL-4B(30mg/100μl;Amersham Pharmacia Biotech AB)的悬浮液在倒置瓶子下在4℃过夜温育。之后,在Eppendorf离心机5810R中以约400xg离心样品15分钟以沉降抗体结合的A蛋白Sepharose。完全除去培养上清液并用约50μl双蒸水洗涤沉淀物三次。第三次洗涤后,完全除去溶液,向沉淀物加入约30-50μl 100mM柠檬酸盐缓冲液(pH 2.8),并摇动下在室温下温育15分钟以便释放结合到A蛋白的抗体。温育后,在Eppendorf离心机中以14,000rpm(转/分钟)离心悬浮液5分钟,并小心除去得到的上清液。通过加入约30-50μl 100mM柠檬酸盐缓冲液(pH 2.8),在室温下摇动约15分钟并通过在Eppendorf离心机中以14,000rpm离心以沉淀Eppendorf离心机中以14,000rpm(转/分钟)离心悬浮液5分钟以沉降A蛋白-Sepharose来洗涤A蛋白沉淀物一次。小心除去上清液并与第一次释放步骤的各自溶液合并。丢弃A蛋白沉淀物。
B)通过ESI质谱法分析寡糖结构同种型
步骤A)中得到的抗体样品(~60μl,各含20-50μg)通过如下方法变性并还原成单链(LC)和糖基化的重链(HC):加入100μl 6M盐酸胍溶液和60μl TCEP-胍溶液(6M盐酸胍中1M三(2-羧基乙基)膦盐酸盐)以调节抗体溶液至3-4M盐酸胍和250mM TCEP。将样品在37℃温育1.5小时。通过G25凝胶过滤对还原和变性的样品脱盐,用2%甲酸(v/v)和40%乙腈(v/v)作为运行缓冲液,之后在来自Waters的Q-Tof2-或LCT-质谱仪中在约10000的分辨率下用纳米喷雾针(Proxeon Cat#ES 387)进行离线的静态ESI-MS分析。该仪器根据生产商的说明书调节并用500-2000质量范围内的碘化钠用一阶多项式拟合进行校准。结果在图2中显示。
在样品测量期间,常规地记录质量范围为700-2000的30-40次单次扫描并加入10-30次单次扫描以产生用于评估的最终m/z-谱。
从所得到的m/z谱进行结合到HC的糖类结构的鉴定和各糖结构同种型的相对含量的计算。用waters的mass lynx软件的解卷积工具计算所检测的各糖基化的HC种类的质量。
通过计算为各糖基化的HC种类得到的质量和如从DNA序列推导的非糖基化的HC的质量之间的质量差异,并将这些质量差异与抗体已知的N-连接的二醇结构的理论质量进行比较,分配连接到HC的各糖类结构。
为了确定寡糖同种型的比例,从几个选择的单电荷(m/z)-状态确定各个不同糖基化的HC种类的峰高度,所述选择的单电荷(m/z)-状态不与其他分子种类像LC等等的其他信号重叠。为了确定寡糖同种型的比例,从所选的单电荷(m/z)-状态(实例见图2)确定G0+Fuc和G0的峰高度(见图3)。仅从含有G0-结构+岩藻糖(G0+Fuc;缺少末端半乳糖残基并且携带核心岩藻糖基化的双触角结构)和含有G0-结构-岩藻糖(G0-Fuc;见图3a)的HC种类推导具有不同岩藻糖基化的糖结构的相对含量。使用相同电荷(m/z)-态内的对应的峰(例如,m/z 45的G0+岩藻糖和G0无岩藻糖的峰)用于该确定。定量结果在表2中显示。
表2:如通过质谱法测定的岩藻糖基化百分比
克隆 | 100-岩藻糖基化的量[%] |
LCA,克隆1 | 88 |
LCA,克隆9 | 83 |
实施例5
ADCC-测定法(依赖抗体的细胞毒性)
根据生产商的手册(PerkinElmer,USA)进行ADCC测定用于检测加入LCA克隆1和9产生的抗体所诱导的肿瘤细胞裂解,野生型细胞作为对照。新鲜分离的外周血细胞用作效应细胞,DU145细胞用作靶细胞。结果在表3中显示。
表3:ADCC测定,显示了释放的细胞相对于0.5%Triton-处理的细胞(100%释放)的百分数
ng/ml抗体: | %释放,相对于0.5% TritonLCA,克隆1 | %释放,相对于0.5% TritonLCA,克隆9 | %释放,相对于0.5% Triton野生型 |
50 | 142.79 | 141.33 | 10.36 |
25 | 133.13 | 136.01 | 14.35 |
12.5 | 135.57 | 123.93 | 12.27 |
6.25 | 104.8 | 105.99 | 0.53 |
3.125 | 86.16 | 98.47 | 11.60 |
1.5625 | 61.82 | 55.3 | 14.07 |
0.78125 | 39.93 | 38.53 | 5.07 |
0.390625 | 14.11 | 20.2 | 5.77 |
实施例6
沉默效应的稳定性
CHO-DG44/野生型和CHO-DG44/LCA-克隆9已经在没有选择压力的条件下培养了四周。每周将1×106个细胞接种在6cm培养皿上。24小时后,收获细胞。如实施例3所述进行RNA分离、cDNA合成、定量RT-PCR和数据分析。结果在表4显示。
表4:沉默效应的稳定性
克隆/周,其中收获了细胞 | %FuT8 mRNA表达 |
野生型 | 100(参照) |
LCA,克隆9,第1周 | 8 |
LCA,克隆9,第2周 | 9 |
LCA,克隆9,第3周 | 9 |
LCA,克隆9,第4周 | 9 |
序列表
<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司
<120>蛋白质表达
<130>24067 FT
<150>EP06026653.3
<151>2006-12-22
<160>10
<170>PatentIn版本3.2
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码shRNA的茎的序列
<400>1
ccagaaggccctattgatc 19
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码shRNA的茎的序列
<400>2
gccagaaggc cctattgatc 20
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码shRNA的茎的序列
<400>3
gatcaatagg gccttctggt a 21
<210>4
<211>9
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码shRNA的环的序列
<400>4
ttcaagaga 9
<210>5
<211>66
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>F8shRNA4top
<400>5
gatccgccag aaggccctat tgatcttcaa gagagatcaa tagggccttc tggtattttt 60
tggaaa 66
<210>6
<211>66
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>F8shRNA4bot
<400>6
agcttttcca aaaaatacca gaaggcccta ttgatctctc ttgaagatca atagggcctt 60
ctggcg 66
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>FuT8正向
<400>7
ggcgttggat tatgctcatt 20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>FUT8反向
<400>8
ccctgatcaa tagggccttc 20
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>ALAS正向
<400>9
ccgatgctgc taagaacaca 20
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>ALAS反向
<400>10
cttcagttcc agcccaactc 20
Claims (7)
1.在哺乳动物细胞中重组产生具有降低的岩藻糖修饰程度的异源多肽的方法,该方法包括以下步骤:
-在适合表达所述异源多肽的条件下培养所述哺乳动物细胞,
-从所述哺乳动物细胞或培养物回收所述异源多肽,并从而产生所述异源多肽,
其中所述哺乳动物细胞用以下核酸转染:
i)SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的第一核酸,其被转录为针对α1,6-岩藻糖基转移酶mRNA的shRNA,和
ii)第二核酸,其编码异源免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或免疫球蛋白缀合物。
2.权利要求1的方法,其特征在于所述培养所述哺乳动物细胞在LCA的存在下进行。
3.权利要求1或2的方法,其特征在于所述哺乳动物细胞用
iii)编码新霉素选择标记或l-NGFR的第三核酸转染,其中l-NGFR是低亲和力神经生长因子受体的截短形式。
4.权利要求1或2的方法,其特征在于所述哺乳动物细胞用一个核酸转染,该核酸包含:
-SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的第一核酸,其被转录为针对α1,6-岩藻糖基转移酶mRNA的shRNA,
-编码新霉素选择标记或l-NGFR的第二核酸,其中l-NGFR是低亲和力神经生长因子受体的截短形式,和
-编码所述异源多肽的第三核酸。
5.权利要求1或2的方法,其特征在于所述哺乳动物细胞选自包括CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK 293细胞、HEK 293EBNA细胞、PER.C6细胞和COS细胞的哺乳动物细胞组。
6.核酸,其包含
-选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的核酸组的第一核酸,
-编码新霉素选择标记或l-NGFR的第二核酸,其中l-NGFR是低亲和力神经生长因子受体的截短形式,和
-编码异源多肽的第三核酸,所述异源多肽选自包含免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和免疫球蛋白缀合物的异源多肽组。
7.包含权利要求6的核酸的哺乳动物细胞。
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