CN101547689A - 通过醚键和氨基甲酸酯键四取代的ndga衍生物、它们的合成方法和药学用途 - Google Patents

通过醚键和氨基甲酸酯键四取代的ndga衍生物、它们的合成方法和药学用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了去甲二氢化愈创木酸衍生化合物，所述化合物包括多种通过碳原子或杂原子键合的端基和通过醚键或氨基甲酸酯键键合到各自的羟基残留0基的侧链，公开了药物组合物、它们的制备方法、和它们的使用方法和含有它们的用于治疗疾病和紊乱的药剂盒，特别是那些与病毒感染如HIV感染、HPV感染、或HSV感染有关的疾病、发炎性疾病如各种类型的关节炎和炎症性肠道疾病、代谢性疾病如糖尿病、血管疾病如高血压和黄斑变性、或增殖疾病如各种类型的癌症。

Description

通过醚键和氨基甲酸酯键四取代的NDGA衍生物、它们的合成方法和药学用途
相关申请的交叉引用
本发明申请要求于2006年10月2日提交的美国临时专利申请第60/827776号的权益，其公开内容以引用方式并入本发明。
技术领域
本发明涉及去甲二氢化愈创木酸(nordihydroguaiaretic acid)衍生物、它们的制备方法以及将它们用于治疗病毒感染、发炎性疾病、代谢性疾病、血管(包括心血管)疾病以及增殖疾病如癌症的使用方法。
背景技术
去甲二氢化愈创木酸(NDGA，式I)具有如下的化学结构，
Figure A200780044482D00051
式I
其中有两个邻苯二酚基团，和一个2，3-二甲基丁烷桥。所述丁烷桥通过4位连接两个邻苯二酚基团。NDGA是能够从一种生长于美国西南部和墨西哥的沙漠植物矮橡树(Larrea tridentata)的叶子含有的树脂中分离出来的天然化合物，它有(2S，3R)的内消旋构象，所属构象是对称结构，并且不是旋光活性的。
关于NDGA和它的衍生物的研究最近吸引了不断增长的兴趣。大量NDGA衍生物已经被报道，并且可分类如下：
类型1：醚键键合的NDGA，最普通的NDGA衍生物，在该衍生物中一个取代基与邻苯二酚单元的一个或多个羟基化学键合。
类型2：酯键键合的NDGA衍生物，在所述衍生物中，一个取代基与邻苯二酚单元的一个或多个羟基共价键合。
类型3：端环的NDGA衍生物，在所述衍生物中，邻苯二酚单元上的两个羟基通过醚键或碳酸酯键被连接在一起，形成5-6元环。
类型4：二取代的NDGA衍生物，在所述衍生物中，邻苯二酚单元的一个羟基被甲基化，另一个与一个取代基共价键合。
类型5：苯环修饰，在所述修饰中，取代基化学地连接到所述苯环上。
类型6：丁烷桥修饰，在所述修饰中，桥上的两个甲基基团被去除、或者被取代基修饰。
NDGA及其合成衍生物具有很多特性。作为脂质加氧酶抑制剂，NDGA能够导致大鼠的囊性肾病。1此外，它显示出多种生物活性，包括蛋白激酶C的抑制，2细胞凋亡的诱发，3细胞膜的改变，4细胞Ca2+水平的上升5和平滑肌肉细胞中Ca2+通道的激活，6体外预形成的阿尔茨海默氏病β淀粉纤维(Alzheimer′s beta-amyloid fibrils)的破裂，7抗氧化，8等等。在世界上一些地方，这一天然产物NDGA在商业上作为食品添加剂使用，以使脂肪和黄油防腐。最近，植物木脂素NDGA的衍生物已经被用于通过抑制病毒转录来阻断病毒复制。9-16这些化合物能够通过使下述这些的Sp1-依赖型启动子失活、来抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)、9-13单纯疱疹病毒(HSV)、14，15和人乳头瘤病毒(HPV)转录16的生成。
而且，(四-O-甲基)去甲二氢化愈创木酸(M4N，式II，terameprocol)能够起到抗HIV前病毒转录抑制因子的作用，并且引起对多种在培养物和鼠体内转化的人和大鼠细胞的生长抑制。17-19化合物M4N目前处于治疗人癌症的临床试验中。
虽然M4N(式II)是格外有效并且无毒的抗癌剂，M4N和一些其它甲基化的NDGA都显示出差的水溶性，这多少限制了它们在某些药物作用研究中的应用。为了解决这一问题，NDGA的一种水溶性衍生物，(四-O-二甲基甘氨酸)去甲二氢化愈创木酸(G4N，式III)已经被设计和合成了。
Figure A200780044482D00071
             式II                     式III
G4N是非常有效的、对HIV-1、HSV-1和HSV-2突变不敏感的抑制剂.17然而，它多少是不稳定的，并且在水溶液中有相对短的半衰期，报道称，这是由于连接NDGA主体结构上的二甲基甘氨酸基团的酯键所导致的。18
因此，需要这样的NDGA衍生物，它们中的一些具有改进的水溶性，以及良好的稳定性，作为水溶性化合物和疏水性化合物均具有需要的药学效果。本发明人已开发了新的NDGA衍生物，所述衍生物具有这些优势，并且将能够用于治疗组合物和治疗方法中。
发明内容
本发明涉及去甲二氢化愈创木酸衍生化合物、药物组合物、它们的制备方法、和它们及含有它们的药剂盒的使用方法，以用于治疗疾病和紊乱，特别是那些与病毒感染有关的疾病、发炎性疾病、代谢性疾病、血管疾病或增殖疾病。
本发明的一个方面涉及标为“Sb4N”的去甲二氢化愈创木酸衍生化合物，它具有下面的通式(式IV)，以及它的药学上可用的盐：
Figure A200780044482D00072
式IV
所述化合物有一个去甲二氢化愈创木酸(NDGA)的骨架，该骨架在名称“Sb4N”中被标为“N”。四个X基团取代了NDGA羟基中的H(有时被称为“取代基X”)，它们在“Sb4N”中被标为“Sb4”。X选自由下面基团构成的组：
-A-R；
-(CH2)xHal，其中x是1到10的一个整数，并且Hal是一个卤原子，代表氯、氟、溴或碘的任意一种；
-(CH2CH2O)yH，其中y是1到10的一个整数；和
一个氨基甲酸酯键合的基团，所述基团选自由下列基团构成的组：
Figure A200780044482D00081
和
Figure A200780044482D00082
其中n是1到6的一个整数，Z1是有2-6个碳和任选地有1-3个卤原子的饱和线性烃链，Z2是任选地包括0-3个双键和任选地包括任意O、N和S中1-3个原子一种的5到7元环，和Z3是甲基或乙基。
当X是-A-R时，R是端基，且A是带有任选的杂原子的线性饱和烃侧链，所述侧链在一端通过醚键或氨基甲酸酯键键合在各自的羟基残余的O基团上，并且在另一端键合到R端基的碳或杂原子上。
所述侧链A选自由下面基团构成的组：C2-C16线性饱和烃链，它任选地具有1-5个杂原子，所述杂原子选自O、N和S，并且它通过醚键键合到NDGA的各自羟基残余O基团上；以及1-5个单元的一个聚乙二醇(PEG)链。
所述端基R选自由下列基团构成的组：
一种5到7元碳环，所述碳环选自由下面基团构成的组：有1到3个N、O或S杂原子的完全饱和环；一个环，它含有用于形成一个6或7元环的1到3个双键和用于形成一个5元环的1到2个双键，且所述该5到7元环带有1到3个N、O或S杂原子；一个包含氨基甲酸酯键、脲键、碳酸酯键或酰胺键的环；和一个水溶性基团，它选自由磺酸的一种碱金属盐；膦酸的一种碱金属盐；一种药学上可用的盐；一种糖和多羟基基团构成的组。
其中X是
Figure A200780044482D00091
或
Figure A200780044482D00092
a是3到16的一个整数，并且b是4到16的一个整数。
本发明的另一个方面是一种组合物，所述组合物包括所述Sb4N化合物和一种可药用的载体，任选地含有其它可药用赋形剂。
本发明的另一个方面是制备下文提到的Sb4N化合物的方法。
本发明的另一个方面是以预防或者治疗病毒感染的有效量的Sb4N化合物单独地或作为药物组合物的一部分对一受治疗者给药的方法。
本发明的另一个方面是以预防或者治疗增殖疾病的有效量的所述Sb4N化合物单独地或作为药物组合物的一部分对一受治疗者给药的方法。
本发明的另一个方面是以预防或者治疗发炎性疾病的有效量的所述Sb4N化合物单独地或作为药物组合物的一部分对一受治疗者给药的方法。
本发明的另一个方面是以预防或者治疗代谢性疾病的有效量的所述Sb4N化合物单独地或作为药物组合物的一部分对一受治疗者给药的方法。
本发明的另一个方面是以预防或者治疗血管疾病的有效量的所述Sb4N化合物单独地或作为药物组合物的一部分对一受治疗者给药的方法。
本发明的另一个方面是药剂盒，所述药剂盒包括含有Sb4N化合物的药物组合物和预防或者治疗病毒感染、增殖疾病、发炎性疾病、代谢性疾病或血管疾病的使用说明。
具体实施方式
如上所述，本发明涉及去甲二氢化愈创木酸衍生化合物，含有它们的药物组合物，它们的制备方法，以及它们和含有它们的药剂盒的使用方法，以治疗疾病和紊乱，特别地，病毒感染，例如，举例但不限于，人类免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒(HPV)(所有亚型)、单纯疱疹病毒1和2(HSV-1和HSV-2)、带状疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒(EpsteinBarr virus)、痘病毒(小痘、牛痘(cowpox)、猴痘、牛痘(vaccinia))、正肝去氧核糖核酸病毒(orthohepadnavirus)、JC病毒、和BK病毒；发炎性疾病，例如，举例但不限于，各种类型的关节炎和炎症性肠病；代谢性疾病，例如，举例但不限于，糖尿病；血管疾病，例如，举例但不限于，高血压、心血管疾病和黄斑变性；和增殖疾病，例如各种类型的癌症的方法。
本发明基于如下考虑，包括用于治疗癌症和病毒包括HIV的试剂的使用经验；具有与NDGA相关的化学结构的衍生物；此类衍生物与(四-O-甲基)去甲二氢化愈创木酸(M4N)(terameprocol)相比具有更大的潜力，更好的PD/PK表现和更小或没有副作用，其中至少一些制剂是口服生物可利用的。本发明的NDGA衍生物是没有它们对映异构体的任何可能的混合物的内消旋形式，这使化学和生物学表征更加容易。用于NDGA母体化合物修饰所述取代官能团选自成功用于药物分子修饰的最普通的化学基团。它们能够易于被被合成，并且易于被配制成具有合理的水溶性的HCl或其他盐的形式或游离碱，它们有可观的水溶性。本发明其他NDGA衍生物是疏水的。本发明的NDGA衍生物具有良好的稳定性，无论它们是水溶性化合物还是疏水化合物。所述衍生物已经准备好放大到商业化生产。
开发本发明的NDGA衍生物是基于NDGA是具有广泛生物活性的天然化合物的事实。NDGA有很多副作用，这些副作用已被本发明衍生物所克服。所述衍生物具有改善的生物活性。引导本发明进展的研究同样显示NDGA衍生物的羟基修饰，例如M4N，阻止肿瘤细胞复制并且选择性地导致肿瘤细胞死亡(细胞凋亡)。这通过阻止Sp1-调节的cdc2(p34)和存活蛋白(survivin)生成而实现。存活蛋白是凋亡蛋白(IAP)在癌症前期和癌症细胞中过度表达的抑制剂，并且很少在健康的成人细胞中被发现。M4N也阻止人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)和人乳头瘤病毒(HPV)的增殖。这通过对病毒繁殖非常重要的病毒Sp1依赖型促进因子的去活实现。本发明的NDGA衍生物通过使用合适的官能团修饰NDGA的羟基而显著地改善它们的活性以阻止Sp1-调节的cdc2和存活蛋白的生成。
定义
本发明使用的“缓冲剂”包括本领域任何常规的缓冲剂，例如举例说明，三羟甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸盐、咪唑和重碳酸盐。
本发明使用的“环糊精”是指未改性环糊精或改性环糊精，并且包括但不限于α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精和任何含有额外修饰的改性环糊精，例如羟丙基-β-环糊精(“HP-β-CD”)或磺丁基醚β-环糊精(“SBE-β-CD”)。环糊精典型地有6(α-环糊精)、7(β-环糊精)和8(γ-环糊精)糖，上至三个取代每糖，因而0到24个初级取代是可能的(初级取代被定义为取代直接连接到环糊精环上)。本发明使用的修饰或未修饰环糊精可有任何合适数量和位置的初级取代或其他修饰。
本发明使用的本发明的“NDGA衍生物”是指下文中被标为“Sb4N”的NDGA衍生物。
“可药用的载体”是指非毒性的固体，半固体或液体填充物、稀释剂、胶囊材料或任何常规类型的制剂辅料。“可药用的载体”是在使用的剂量和浓度上对于受试者是非毒性的，并且与制剂的其他配料相容。例如，用于包括本发明的儿茶酚丁烷(catecholic butane)或NDGA衍生物的制剂的载体优选地不包括氧化剂和其他已知的对此类衍生物有害的化合物。合适的载体包括，但不限于，水、葡萄糖、丙三醇、生理盐水、乙醇、缓冲剂、二甲亚砜、聚氧乙烯醚(35)蓖麻油(Cremophor EL)及其组合。所述载体可包括额外的试剂如润湿或乳液化试剂或pH缓冲剂。如需要可加入其他材料如抗氧化剂、保湿剂、黏度稳定剂和类似试剂。
本发明使用的“可药用的盐”包括酸加成盐(与多肽的游离氨基形成)和那些与无机酸举例如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸、苯羟乙酸和乙二酸形成的。与游离羰基形成的盐可同样衍生于无机碱举例如钠、钾、铵、钙或氢氧化铁，以及此类有机碱如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇和组氨酸。本发明的NDGA衍生物可药用盐的非限制性实施例包括例如下列通式的盐：
[Sb4N]·k[酸]
其中N是NDGA，Sb是如下面表1和2所述的取代基X，k是整数或非整数，并且酸是有机或无机酸，如下面非限定性表A所举的实施例。
表A
 
Sb 酸 k
包括一个碱式氮原子 HCl、HBr、HNO3、MeSO3H、H2SO4、天门冬氨酸、柠檬酸、苯磺酸、樟脑酸、樟脑磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、反丁烯二酸、半乳糖二酸、D-葡萄糖酸、乙醇酸、N-苯酰基氨基乙酸、L-乳酸、顺丁烯二酸、苹果酸、丙二酸、烟酸、棕榈酸、扑酸、磷酸、水杨酸、丁二酸、酒石酸、对甲基苯磺酸。       1-4
包括两个碱式氮原子 HCl、HBr、HNO3、MeSO3H、H2SO4、天门冬氨酸、柠檬酸、苯磺酸、樟脑酸、樟脑磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、反丁烯二酸、半乳糖二酸、D-葡萄糖酸、乙醇酸、N-苯酰基氨基乙酸、L-乳酸、顺丁烯二酸、苹果酸、丙二酸、烟酸、棕榈酸、扑酸、磷酸、水杨酸、丁二酸、酒石酸、对甲基苯磺酸。       1-8
本发明使用的“可药用赋形剂”包括运输体、佐剂、或稀释剂或其他辅料物质，例如本领域常规的那些。例如，可药用的辅料物质包括pH调节和缓冲剂，张力调节剂、稳定剂、润湿剂等等。
本发明使用的“环”，除非另有具体说明，如本发明使用的如“5元环”、“6元环”、“7元环”的词是指带有任意表明的杂原子的碳环。
本发明可替换使用的词“受治疗者”、“宿主”和“患者”是指被用本发明的组合物治疗的动物，包括但不限于，猿、人、猫、犬、马、牛、猪、羊、山羊、哺乳类农场动物、哺乳类运动动物、和哺乳类宠物。
本发明的NDGA衍生物中所提及的“基本上纯化的”化合物是一种基本没有不是本发明的NDGA衍生物的化合物(下文中的“非NDGA衍生物”)。基本上没有是指至少50％、优选地至少70％、更优选地至少80％、和甚至更优选地至少90％没有非NDGA衍生物。
如本发明使用的，“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等词是指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果可是预防性的指完全或者部分防止异常状况或疾病或其症状并/或可是治疗性的指部分或完全治愈异常状况或疾病和/或由该异常状况或疾病引起的不利的影响。“治疗”因此，举例说明，覆盖了动物、优选地哺乳动物、更优选地人的异常状况或疾病的任何治疗，包括：(a)预防受治疗者的异常状况或疾病的发生，所述受治疗者可能是易患该异常状况或疾病，但还未被诊断出患有它；(b)抑制异常状况或疾病，例如抑制它的发展；和(c)摆脱、缓解或改善所述的异常状况或疾病，举例如，引起异常状况或疾病的消退。
本发明仅通过实施例描述但并不以任何方式理解为限制本发明。因此，本发明不受限于描述的特定实施例，并且显而易见的有所变化。同样应被理解的是本发明使用的术语仅是为了描述特定实施例的目的，不理解为是限制性的，因为本发明的范围仅受基于本临时专利申请的非临时专利申请的附加的权利要求的限制。
在有数值范围的情况中，应理解为在所述范围的上限和下限之间每个中间值，除非文字另有明确表示到下限的单位(unit)十分位，和在所述范围的任何其他的表述的或介于其间的值，被包含于本发明。这些更小范围的上限和下限可独立地包括在所述更小范围内，并且在所述范围任何具体地排除的端值也被包含于本发明。在所述范围包括一个或两个端值的情况中，范围不包括那些包括的端值的任一或两个同样也包括在本发明中。
需要注意的是如本发明所用，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数除非文字另有明确表述。因此，例如所提及的“衍生物(aderivative)”包括该衍生物的复数形式以及所提及的“NDGA衍生物(theNDGA derivative)”包括所提及的一个或多个NDGA衍生物及本发明公开为本领域技术人员所知的它的等同物。
本发明提到的所有出版物，包括专利、专利申请和杂志文章以全文作为引文并入本发明，包括它们引用的引文也作为引文并入本发明。本发明讨论的出版物仅为公开日在本发明申请的申请日以前的。本发明没有因现有发明的优势而被理解为本发明有资格早于此出版物的认识。此外，提供的出版日期可能会不同于实际出版日期，这可能要独立地证实
如上所述，本发明的一个方面涉及具有下面通式(式IV)的Sb4N去甲二氢化愈创木酸衍生化合物，以及它的可药用盐：
Figure A200780044482D00141
式IV
所述化合物有去甲二氢化愈创木酸(NDGA)的骨架，在“Sb4N”中被标为“N”。取代NDGA羟基中的H的四个X基团(有时指“取代基X”)在“Sb4N”中被标为“Sb4”。X选自由下面基团构成的组：
-A-R；
-(CH2)xHal，其中x是1到10的整数，并且Hal是卤原子，代表氯、氟、溴或碘的任意一种；
-(CH2CH2O)yH，，其中y是1到10的整数；和
氨基甲酸酯键合的基团，所述基团选自由下列基团构成的组：
Figure A200780044482D00142
和
Figure A200780044482D00143
其中n是1到6的整数，Z1是有2-6个碳和任选地1-3个卤原子的饱和线性烃链，Z2是任选地包括0-3个双键和任选地包括任意O、N和S中1-3个原子的5到7元环，和Z3是甲基或乙基。
当X是-(CH2)xHal时，X优选地是1-3，并且Hal是氯或氟；更优选地，例如在此例中，X是-(CH2)2F。
当X是-(CH2CH2O)yH时，y优选地是1-3，并且更优选地，例如在此例中，X是-(CH2)2OH(当y是1时)；或-(CH2)2-O-(CH2)2-OH(当y是2时)。
一个附带条件是其中X是
Figure A200780044482D00151
或
a是3到16的整数并且b是4到16的整数。
随着上述X的额外定义和所述附带条件，侧链A和端基R可选自在上面发明内容中描述的那些，其中侧链A和端基R以表的形式在下面的表1中提出：
表1
 
侧链A ●C2-C16线性饱和烃链，所述烃链任选地具有1-5个O、N或S杂原子，并且在一端通过醚键键合到NDGA的各自羟基残余O而在另一端键合到R端基的碳或杂原子上●1-5个单元的聚乙二醇(PEG)链                   
R是7元环 ●有1到3个N、O或S杂原子的完全饱和7元环●包含1到3个双键和1到3个N、O或S杂原子的7元环●包含氨基甲酸酯键、脲键、碳酸酯键或氨基键的7元环                                         
R是6元环 ●有1到3个N、O或S杂原子的完全饱和6元环●包含1到3个双键和1到3个N、O或S杂原子的
 
6元环●包含氨基甲酸酯键、脲键、碳酸酯键或氨基键的6元环                                         
R是5元环 ●有1到3个N、O或S杂原子的完全饱和5元环●包含1到2个双键和1到3个N、O或S杂原子的5元环●包含氨基甲酸酯键、脲键、碳酸酯键或氨基键的5元环                                         
R是水溶性基团 ●磺基酸的碱金属盐●膦酸的碱金属盐●表A中的可药用盐●糖●多羟基基团      
合适的侧链A的非限制性实施例是C2-C4线性链，如乙烯、丙烯或丁烯，在一端通过醚键键合到NDGA的各自羟基残余O基团；C2-C4线性链，如乙烯、丙烯或丁烯，并有O或N杂原子，并且所述链在一端通过醚键键合到NDGA的各自羟基残余O基团；1-3个单元的聚乙二醇(PEG)链；或氨基甲酸酯键。所述侧链在另一端键合到R端基的碳或杂原子上。
合适的端基R的非限制性实施例在下面的表2中提出：
表2
Figure A200780044482D00171
用于合成醚键键合的NDGA衍生物的一般方法如下：
一般方法1：卤代烷(X-Halide)和NDGA在碱催化条件的反应：
Figure A200780044482D00172
一般方法2：甲基苯磺酸活化的醇与NDGA的反应：
Figure A200780044482D00173
合成氨基甲酸酯键键合的NDGA衍生物的一般方法如下：
一般方法1：异氰酸酯化合物与NDGA的反应：
Figure A200780044482D00181
一般方法2：N-琥珀酰亚胺基N-取代氨基甲酸酯和NDGA的反应：
Figure A200780044482D00182
根据本发明制备实施例的具体的NDGA衍生化合物的细节将在下面的实验部分提出。
在合适制剂中的本发明的NDGA衍生物，优选地但不专有地在药物组合物中作为活性成分或作为两种或多种活性成分中的一种在合适的情况下伴有可药用的载体或赋形剂，能够被安全给药至需要此类治疗的受治疗者，所述给药是通过鼻腔传输、吸入、通过静脉的举例如输注或注射至中央静脉、动脉内(伴有或没有阻塞)、腹膜内、间隙、皮下、透皮、皮内、眼内、肌肉内、体表、颅内、脑室内、口服、或口腔、或植入给药。
而且，所述NDGA衍生物能够安全地给药至需要此类治疗的受治疗者，所述NDGA是以溶液、悬浮液、半固体或固体的适当形式，或脂质体制剂、纳米颗粒制剂、或胶粒制剂用以通过上述一种或多种途径给药。
更进一步，脂质体制剂、纳米颗粒制剂、或胶粒制剂中的所述NDGA衍生物能够包埋于生物降解高分子材料制剂并且安全地给药，如通过皮下植入。
本发明用于给药的组合物可是任何合适的形式，例如但不限于，溶液，悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末、亲水或疏水的液体、粉末如冷冻干燥生成的粉末、气雾剂、水的或水溶性的组合物、疏水组合物、脂质体组合物、胶粒组合物如基于吐温80或二嵌段共聚物的胶粒组合物、纳米颗粒组合物、聚合体组合物、环糊精配合物组合物、乳液、或基于称为“脂质核(lipocores)”的纳米颗粒的脂质。
本发明进一步包括含有药物组合物的组合物，所述药物组合物包括所述NDGA衍生物和可药用的载体或赋形剂。这些组合物可包括根据所述NDGA衍生物的所需用途选择的缓冲剂，也可包括其他适于预期用途的物质。本领域技术人员已经能够根据本发明所公开的从本领域已知的种类繁多的缓冲剂中选择适用于预期用途的恰当的缓冲剂。在一些实施例中，所述组合物能够包括本领域已知的种类繁多的可药用的赋形剂。在很多出版物中描述了适于本发明使用的可药用的赋形剂，包括：例如，杰纳罗(杰纳罗，A.，雷明顿：《药学的科学与实践》，19版，利平科特，威廉姆斯&威金斯，(1995))；安塞尔等(安塞尔，H.C.等，《药物剂型和药物运输系统》，第7版，利平科特，威廉姆斯&威金斯(1999))；和凯比(凯比，A.H.，《药物赋形剂手册》，第三版，美国药品协会)。
本发明的组合物是根据潜在的给药模式配制的。因此，例如如果所述组合物预期为鼻内或吸入给药，基于本技术领域简便的目的所述组合物可被转化为粉末或者气雾剂形式。其他制剂，例如用于口服或肠胃外运输，因在本技术领域是常规的也可被使用。
适用于口服或注射的组合物或制剂还包括含有儿茶酚丁烷(catecholic butane)的药物组合物用以治疗所述疾病，在所述组合物被与可药用的载体和其他可选的赋形剂配制的情况中，其中所述载体包括溶解剂和赋形剂的至少一种，所述溶解剂和赋形剂选自由(a)水溶性有机溶剂；(b)离子、非离子或两亲表面活性剂；(d)改性纤维素；(e)非水溶性脂质和(a)-(e)的载体的任意组合构成的组。
所述水溶性有机溶剂可优选地但不是必需的，是其他的而非二甲亚砜。非限制性实施例性的水溶性有机溶剂包括聚乙二醇(“PEG”)、例如，PEG300、PEG400或PEG400单月桂酸酯、丙二醇(“PG”)、聚乙烯吡咯烷酮(“PVP”)、乙醇、苯酚或二甲基乙酰胺。
所述环糊精或改性环糊精，不限制于，是α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、HP-β-CD或SBE-β-CD。
所述离子、非离子或两亲表面活性剂可包括例如但不限于表面活性剂如非离子表面活性剂聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯(也已知为聚山梨酯)，如聚山梨酯20和聚山梨酯80，作为吐温20或吐温80商业可得、d-α-聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(“TPGS”)、单油酸甘油酯(也已知为甘油单油酸酯)、酯化脂肪酸(esterified fatty acid)或摩尔比为35:1的环氧乙烷和蓖麻油的反应产物，作为蓖麻油聚氧乙烯35醚(Cremophor EL)商业可得。优选地，对于某些实施方案，当表面活性剂是非离子表面活性剂时，所述非离子表面活性剂在没有黄原胶下存在。
改性纤维素的非限制性实施例包括乙基纤维素(“EC”)、羟丙基甲基纤维素(“HPMC”)、甲基纤维素(“MC”)或羧基甲基纤维素(“CMC”)。在本发明的一个实施例中，所述儿茶酚丁烷(catecholic butane)可溶解于能在使用前被乙醇(“EtOH”)稀释的改性纤维素。
所述非水溶性脂质包括例如一种或多种油，如蓖麻油(castor oil)、芝麻油(Sesame oil)或椒样薄荷油(peppermint oil)，一种或多种蜡，如蜂蜡或棕榈蜡，以及混合的脂肪乳液组合物如英脱利匹特(Intralipid)(法玛西亚普强，现在的辉瑞)，根据每制造商的推荐量使用。例如，推荐的成人剂量不超过2g脂肪/kg体重/天(20mL，10mL和6.7mL/kg的英脱利匹特10％、20％和30％，分别地)。英脱利匹特10％相信在1000mL中含有：纯化的大豆油(Soybean Oil)100g、纯化的蛋黄卵磷酯12g、无水甘油22g、加足够量的注射(injectionq.s.ad)用水到1000mL。用氢氧化钠调节pH至pH大约8。英脱利匹特20％相信在1000mL中含有：纯化的大豆油(Soybean Oil)200g、纯化的蛋黄卵磷酯12g、无水甘油22g、加足够量的注射(injection q.s.ad)用水到1000mL。用氢氧化钠调节pH至pH大约8。英脱利匹特30％相信在1000mL中含有：纯化的大豆油(Soybean Oil)300g、纯化的蛋黄卵磷酯12g、无水甘油16.7g、加足够量的注射(injection q.s.ad)用水到1000mL。用氢氧化钠调节pH至pH大约7.5。这些英脱利匹特产品存储于25℃以下的控温室并且不应被冷冻。
本发明的一个实施方案中，所述NDGA衍生物溶解于或者溶解并稀释于不同载体以形成用于动物包括人口服给药的液体组合物。例如，在所述实施方案的一个方面，所述NDGA衍生物溶解于水溶性有机溶剂如PEG300、PEG400或PEG400单月桂酸酯(所述“PEG化合物”)或PG中。在另一个实施例中，所述NDGA衍生物溶解于改性环糊精，如HP-β-CD或SBE-β-CD。在另一个实施方案中，本发明的NDGA衍生物在含有所述PEG化合物和HP-β-CD的组合制剂中被溶剂化并/或稀释。在另一个实施例中，本发明的NDGA衍生物被溶解于改性纤维素如HMPC、CMC或EC。在另一个实施方案中，本发明的NDGA衍生物被溶解于另一个组合制剂，所述组合制剂含有改性环糊精和改性纤维素，举例如HP-β-CD和HPMC或HP-β-CD和CMC。
在另一个实施方案中，所述NDGA衍生物溶解于离子、非离子或两亲表面活性剂如吐温20、吐温80、TPGS或酯化脂肪酸。例如，本发明的化合物能够溶解于单独的TPGS、或单独的吐温20、或如TPGS和PEG400、或吐温20和PEG400的组合。
在另一个实施方案中，本发明的NDGA衍生物溶解于非水溶性脂质如蜡、脂肪乳液例如英脱利匹特、或油。例如，本发明的化合物能够溶解于单独的椒样薄荷油、或椒样薄荷油和吐温20和PEG400、或椒样薄荷油和PEG400、或椒样薄荷油和吐温20、或椒样薄荷油和芝麻油的组合。
EC可取代HPMC或CMC或添加到上述实施例中；PEG300或PEG400单月桂酸酯能够取代PEG400或添加在上述实施例中；吐温80可取代吐温20或添加到上述实施例中；并且其它油如玉米油、橄榄油、大豆油、矿物油或甘油可取代椒样薄荷油或芝麻油或添加到上述实施例中。
进一步地，可使用加热，例如，在配制这些组合物中的任一的过程中，加热至约30℃到约90℃的温度以实现本发明的化合物的溶解或者获得所述NDGA衍生物均匀分布的悬浮液。
在另一个实施方案中，所述的NDGA衍生物可作为固体口服给药，有或没有任何相伴的载体。在一个实施方案中，所述NDGA衍生物如前述的实施例首先溶解于液体载体，然后制成固体组合物作为口服组合物给药。例如，所述NDGA衍生物溶解于改性环糊精如HP-β-CD，并且所述组合物被冷冻干燥生成适合口服给药的粉末。
在进一步的实施方案中，所述NDGA衍生物溶解于或者悬浮于TPGS溶液，适当加热以获得均匀分布的溶液或者悬浮液。冷却后，所述组合物变成乳霜状并且适合口服给药。
在另一个实施方案中，所述NDGA衍生物溶解于油并且添加蜂蜡以产生蜡状固体组合物。
通常，在制备口服制剂时，在添加其它赋形剂以产生更稳定的组合物前，本发明的NDGA衍生物首先被溶剂化。不稳定的制剂是不利的。不稳定的液体制剂往往形成晶体析出物或者两相溶液。不稳定的固体制剂往往出现颗粒和结块并且有时含有流质的液体。优化的固体制剂光滑、均一并且有窄的熔化温度范围。通常，制剂中赋形剂的比例可影响稳定性。例如，太少的硬化剂如蜂蜡可使所述制剂对于上乘的口服制剂而言过于流质。
因此，通常，对于本发明的液体制剂，使用的赋形剂应当是本发明的NDGA衍生物的良好溶剂。换句话说，无需加热所述赋形剂应该能够溶解所述NDGA衍生物。所述赋形剂除了与NDGA衍生物彼此也应该相容以使它们能够形成稳定的溶液、悬浮液或乳液。同样地，通常，对于本发明的固体制剂，使用的赋形剂也应当是所述NDGA衍生物的良好溶剂以避免结块和不均匀的制剂。为了避免固体制剂在质地上不利地太流质或不均一，所述赋形剂应该彼此相容以使它们形成光滑均一的固体，甚至在没有所述NDGA衍生物存在的情况下。
本发明进一步涉及制造本发明的药物组合物的方法，所述方法涉及生产或提供优选地基本纯化的所述NDGA衍生物，将所述组合物与可药用的载体或赋形剂组合，并且用适合预期给药模式的方法配制所述组合物。
发现了本发明的化合物和组合物作为各种情况的治疗试剂的用途，例如，希望对有如恶性的、癌变前的或良性的肿瘤的增殖疾病、病毒疾病、发炎性疾病、代谢性疾病或血管疾病的受治疗者提供治疗的情况。
本发明的化合物和组合物能够用于治疗多种肿瘤和癌症，包括但不限于，血液恶性肿瘤如白血病、例如急性或慢性淋巴细胞白血病、急性或慢性髓性白血病、急性或慢性粒细胞白血病、儿童急性白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、恶性皮肤T细胞、蕈样肉芽肿、非恶性纤维化皮肤T细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹、T细胞富集皮肤淋巴增生、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、大疱性类天疱疮、盘状红斑狼疮、扁平苔藓、肾上腺皮质癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨/软组织恶性纤维组织细胞瘤、神经瘤和恶性肿瘤如神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、脑干胶质瘤、脑肿瘤室管膜瘤、髓母细胞瘤、男性和女性乳腺癌、胃肠道类阑尾癌(carcinoid tumorgastrointestinal)、肾上腺皮质癌、胰岛细胞癌、透明细胞癌、肌腱鞘透明细胞肉瘤、大肠癌、肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、食道癌、尤文家族肿瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管肿瘤、眼癌、眼内恶性黑色素瘤、导管癌、眼癌视网膜母细胞瘤、口腔黏膜增生、侵润口腔肿瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类肿瘤、性腺外生殖细胞瘤，生殖细胞瘤，妊娠滋养细胞肿瘤、肝癌、下咽癌、眼内恶性黑色素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西氏肉瘤、喉癌、肝癌、肺肿瘤和癌症如非小细胞肺癌和小细胞肺癌、恶性间皮瘤、黑色素瘤、梅克尔(Merkel)细胞癌、多发性内分泌肿瘤综合征、蕈样肉芽肿、多发性骨髓瘤、鼻腔肿瘤、副鼻窦癌、鼻咽癌、口腔和唇癌、口咽癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、松果体和幕上原始神经瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、肾癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺肿瘤、成人软组织肉瘤、赛扎里(Sezary)综合征、皮肤癌、小肠肿瘤、睾丸肿瘤和癌症、胸腺、甲状腺癌、尿道癌、移行和鳞状细胞泌尿系肿瘤、妇科肿瘤和癌症如子宫颈癌、卵巢肿瘤和癌症、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、子宫癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、原发性巨球蛋白血症、肾母细胞瘤、肝肿瘤包括肝癌(“HCC”)和胆管肿瘤、其他肺肿瘤包括小细胞和透明细胞癌、不同器官的肉瘤；以及其他癌症和肿瘤。
本发明的NDGA衍生物可有效治疗的病毒疾病的非限制性实施例其中举例包括但不限于由人类免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒(HPV)(所有亚型)、单纯疱疹病毒1和2(HSV-1和HSV-2)、带状疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒(Epstein Barrvirus)、痘病毒(小痘、牛痘(cowpox)、猴痘、牛痘(vaccinia))、正肝去氧核糖核酸病毒(orthohepadnavirus)、JC病毒、和BK病毒引起的病毒感染。
本发明的NDGA衍生物可有效治疗的发炎性疾病的非限制性实施例其中举例包括但不限于类风湿关节炎、骨关节炎、牛皮癣、肉状瘤病、系统性红斑狼疮、斯蒂尔病、囊性纤维化、慢性阻塞性肺病和炎症性肠疾病如溃疡性结肠炎和克罗恩病。
发明的NDGA衍生物可有效治疗的代谢性疾病的非限制性实施例其中举例包括但不限于糖尿病(幼年型和成人型)、尿崩症、X综合征、高脂血症、高胆固醇血症、低血糖、动脉粥样硬化、酮症酸中毒、艾迪生病、库欣综合征、甲状旁腺功能亢进、甲状腺功能亢进症、白细胞无力症和卟啉症。
发明的NDGA衍生物可有效治疗的血管疾病的非限制性实施例其中举例包括但不限于肺动脉高压、肺动脉高压、心血管病和黄斑变性。
如上所述，有效剂量的所述NDGA衍生物给药至宿主，其中“有效剂量”是指足以产生预期效果的剂量。在一些实施方案中，所述的预期效果是至少减少所述病毒感染或发炎、代谢、增殖或血管疾病的一种或多种症状。典型地，本发明的组合物含有从少于约0.1％上至约99％的活性成分，也就是本发明的NDGA衍生物；任选地，本发明含有约5％到约90％的所述活性成分。给药的合适剂量取决于被治疗的受治疗者、举例如受治疗者的基本健康状况、受治疗者的年龄、疾病或异常状况的状态、受治疗者的体重。通常，约0.1mg到约500mg可给药至儿童并且约0.1mg到约5g可给药至成人。所述NDGA能够以单剂量，或更典型地多剂量以一定频率并经过治疗疾病所需的时间周期进行给药。本领域技术人员已经可根据本发明所公开的通过各种方法确定特定药剂的优选剂量。本领域普通技术人员根据本发明所公开的通过路径试验建立剂量响应曲线能够容易地确定其他有效剂量。NDGA衍生物的量当然根据使用的特定的NDGA衍生物以及含有所述NDGA衍生物的制剂的本质和给药路径、受治疗者的体积和状态、疾病的本质和程度等而变化。
所述NDGA的给药频率和剂量将由照顾者根据年龄、体重、疾病状态、健康状态和病人的反应决定。因此，所述药剂可每天一次或多次或简便地决定的合适的所需时长给药。
本发明包括有多剂量或单位剂量所述NDGA衍生物的药剂盒。在该药剂盒中，除了装有多剂量或单剂量含有所述NDGA衍生物的组合物的容器还有它用于特定适应症的使用说明如信息单或描述药品使用和治疗感兴趣的病理学状态如任何各种发炎、代谢、血管或增殖疾病或病毒感染的相伴效果的包装插入物。
除了被注明是预测实施例的那些，本发明现在还被用下面具体的非限制性实施例进行更多细节描述。
一般步骤
除非另有说明，所有反应于烤箱干燥(120℃)的玻璃器皿中在氮气下进行。丙酮、二氯甲烷、1，4-二噁烷、乙酸乙酯、正己烷和四氢呋喃从迈克卡落迪特化工厂(Mallinckrodt Chemical Co.)购得。丙酮用4
Figure A200780044482D0025143752QIETU
分子筛干燥并蒸馏。二氯甲烷、乙酸乙酯和正己烷用CaH2干燥并蒸馏。1，4-二噁烷和四氢呋喃在氮气氛下用钠和二苯甲酮蒸馏干燥。去甲二氢化愈创木酸从Fluka Chemical Co.购得。盐酸4-(2-氯乙基)吗啉、盐酸4-(3-氯丙基)吗啉、单盐酸1-(3-氯丙基)哌啶、单盐酸1-(2-氯乙基)哌啶、2-氯乙醇、(2-氯乙氧基)乙烯、盐酸1-(2-氯乙基)吡咯烷、N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)和碳酸钾从AldrichChemical Co.购得。
熔点由瑞士步琪公司(BUCHI Labortechnik AG)535熔点仪测得。分析薄板色谱(TLC)在从默克公司(Merck Inc.)购得的预涂板(硅胶60F-254)上进行。气相色谱分析在装有25米交联甲基硅橡胶毛细管柱(0.32mm直径)的惠普5890系列II仪器上进行。氮气作为载气使用并且流速在14.0mL/分钟保持恒定。保留时间tR在下列条件下测量：注射器温度260℃，恒温柱温度280℃。气相色谱和低分辨质谱分析在装有安捷伦5973网络质量选择检测器和毛细HP-1柱的安捷伦科技6890N网络GC系统上进行。用重力柱色谱的纯化通过使用默克试剂硅胶60(颗粒尺寸0.063-0.200mm，70-230目ASTM)进行。所有化合物的纯度由HPLC或GC检测大于99.5％。
紫外(UV)光谱在日立U3300UV/VIS光谱仪上测量。红外(IR)光谱在Jasco FT-IR-5300傅立叶变换红外光谱仪上测量。报道的波数参照聚苯乙烯1601cm-1的吸收。吸收强度按照下列简写记录：s，强；m，中；w，弱。荧光强度在日立F-4500荧光光谱仪上测量。质子NMR谱使用氘代氯仿作为溶剂和3-(三甲基硅基)丙酸钠作为内标在VarianMercury-400(400MHz)谱仪上测得。C13-NMR谱使用氘代氯仿或重水作为溶剂在Varian Mercury-400(400MHz)谱仪上测得。C13化学位移参照CDCl3的三重峰的中心(δ77.0ppm)。多重性按照下列简写记录：s，单峰；d，二重峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰；J，耦合常数(hertz)。高分辨质谱由JEOL JMS-HX110质谱仪测得。电喷雾离子化质谱(ESI-MS)分析在装有菲尼根-MAT公司菲尼根LCQ的电喷雾离子化源的四级杆离子阱质量分析仪上进行。
计算机计算在硅谷图形公司02+工作站上进行。软件ChemofficeUltra10.0被用于画化学结构和合成线路。软件PCModel7.5被用于用一致的价力场(CVFF)最小化能量直到最大衍生物小于1.0kca lmol-1
Figure A200780044482D0025143752QIETU
-1。
实施例1
1，4-二{3，4-二[3-(哌啶-1-基)丙氧基]苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷游离碱(C50H82N4O4，FW＝803.21)“化合物A”；和四盐酸盐(C50H86N4O4Cl4，FW＝949.05)“化合物B”的合成
步骤1：N-(3-氯丙基)-哌啶的合成
Figure A200780044482D00261
盐酸N-(3-氯丙基)-哌啶(97％纯度，Aldrich Chemicals)(100g)溶于水(150mL)并且缓慢加入碳酸钾饱和水溶液(250mL)。同样地，加入10N氢氧化钠(25mL)和二乙基乙醚(250mL)并且该混合物搅拌一小时。分层；有机层用无水碳酸钾干燥并且用瑞士步琪公司旋转蒸发仪(Biichi Labortechnik AG Rotavapor)浓缩为所示产物(77.2g，94.4％)，该产物没有纯化直接用于下步反应。
步骤2：1，4-二{3，4-二[3-(哌啶-1-基)丙氧基]苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷“化合物A”的合成
Figure A200780044482D00271
向NDGA(15.0g，48.0mmol)的无水DMF(1L)溶液中添加于石蜡中的氢化钠(10.4g，260mmol，5.4当量)的60％悬浮液并且该混合物在65℃加热一小时。然后该混合物冷却至室温，化合物N-(3-氯丙基)-哌啶(39.0g，241mmol，5.0当量)和碘化钠(7.2g，48mmol，1.0当量)被加入并且该混合物在室温下搅拌120小时。TLC显示完全转化至产物。
反应的后续操作通过将该反应混合物缓慢加入水(3L)和二乙基乙醚(2.5L)中进行。水层再次用二乙基乙醚(2L)萃取。合并的有机萃取物用浓盐水(750mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥并且减压浓缩。粗产物用硅胶柱色谱纯化。该柱用硅胶(500g)和混合溶剂乙酸乙酯:甲醇:三乙胺(93:2:5)填柱并用乙酸乙酯:甲醇:三乙胺(93:2:5到91:4:5)梯度洗脱以产生白色固体的产物(28.1g，产率76.6％)。该产物用乙酸乙酯:正己烷结晶以产生晶体化合物(22.5g)。
熔点：84-86℃。HPLC纯度：99.47％
1H NMR(CDCl3，300MHz)，δ＝0.81(d，J＝6.6Hz，6H)、1.35-1.50(m，8H)、1.53-1.65(m，16H)、1.67-1.80(m，2H)、1.90-2.2.03(m，8H)、2.40-2.60(m，26H)、2.72(m，2H)、3.99(t，J＝6.5Hz，4H)、4.00(t，J＝6.5Hz，4H)、6.65(dd，J＝1.9，8.0Hz，2H)、6.67(d，J＝1.9Hz，2H)、6.79(d，J＝8.0Hz，2H)；与所示结构一致。
13C NMR(CDCl3，75MHz)：δ＝16.1、24.5、26.0、27.0、38.9、39.4、54.7、56.2、67.8、68.0、114.1、115.2、121.3、134.9、147.0、148.8；与所示结构一致。
分析：C50H82N4O4计算值C：74.76，H：10.29，N：6.98，实验值C：75.07，H：10.59，N：6.91
步骤3：1，4-二{3，4-二[3-(哌啶-1-基)丙氧基]苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷四盐酸盐“化合物B”的合成
Figure A200780044482D00281
向冰冷却的(0-5℃)的浓缩HCl水溶液(7.2mL 11N HCl，79mmol，24mol当量)的95％乙醇(21mL)溶液滴加1，4-二{3，4-二[3-(哌啶-1-基)丙氧基]苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷(2.658，3.30mmol)的95％乙醇(21mL)的溶液。该溶液在0-5℃搅拌三小时，并在水浴温度为45℃的旋转蒸发器上除去溶剂。所得盐酸盐真空干燥48小时。所得粗产品用乙醇：乙醚结晶，在72小时真空干燥后得2.20g产品(70.3％产率)。该产品的分析数据如下。
熔点：265-270℃(分解)
HPLC纯度：99.2％(％峰面积)；卡尔·费休库仑法测定的水分含量(Moisture content by Karl Fisher method)：2.3938％。元素分析C50H86N4O4Cl4，计算值：C：63.27；H：9.13；N：5.90。实验值：C：63.60；H：9.59；N：5.73。滴定法测定氯元素(无水基底)：理论值：14.94％；实验值：14.97％(理论值的100.3％)。
1H NMR(D2O，300MHz)：δ＝0.65-0.80(ss，6H)、1.40-2.0(m，26H)、2.10-2.15(m，8H)、2.18-2.24(m，2H)、2.56-2.61(m，2H)、2.70-3.05(m，8H)、3.05-3.20(m，8H)、3.20-3.60(m，8H)、4.05(t，J＝4.2Hz，8H)、6.71(dd，J＝1.8，8.4Hz，2H)、6.89(d，J＝1.8Hz，2H)、6.92(d，J＝8.4Hz，2H)。
13C NMR(CDCl3，75MHz)δ＝16.0(CH3)、23.4(CH2)、24.5(CH2)、27.5(CH2)、38.8(Ar-CH2)、39.4(CH)、54.6(NCH2)、54.9(NCH2)、68.1(OCH2)、113.4(Ar)、114.1(Ar)、121.4(Ar)、135.0(Ar)、146.8(Ar)、148.5(Ar)ppm；与所示结构一致。
LC-MS，m/e＝839(M+K)，803(M+)与游离碱C50H82N4O4一致。
实施例2
1，4-二{3，4-二[4-(N-哌啶基)丁氧基]苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷游离碱(C54H90O4N4，FW＝859.32)-“化合物C”；和四盐酸盐(C54H90O4N4·4HCl，FW＝1005.16)-“化合物D”的合成
步骤1：N-(4-氯丁基)哌啶的合成
Figure A200780044482D00291
在2L的三颈圆底烧瓶中加入哌啶(85.15g，1.0mol)丙酮(1000mL)和无水碳酸钾(276.42g，2.0mol，2.0当量)。所述烧瓶加装机械搅拌和冷凝管。在室温持续搅拌下30分钟内滴加4-氯-1-溴-丁烷(188.6g，1.1mol，1.1当量)。该悬浮混合物随后在40℃下搅拌。反应进程由TLC监测，确认该反应在4小时后完成。所得混合物冷却至室温并且不溶材料过滤除去并且用二氯甲烷(2 X 100mL)洗涤两次。合并的滤液真空浓缩直至干燥。然后残留物与二氯甲烷(500mL)混合。不溶材料过滤除去并且用二氯甲烷(2 X 100mL)洗涤。合并的滤液和洗涤液被浓缩并且通过快速硅胶柱纯化，产生浅黄色油状预期产物(98.39g，56％产率)。
1H NMR(CDCl3，300MHz)，δ＝1.37(m，2H，CH2)、1.60(m，8H，4CH2)、2.46(t，J＝6.5Hz，4H，2CH2N)、2.89(t，J＝6.8Hz，2H，CH2N)、3.56(t，J＝7.2Hz，CH2Cl)ppm；与所示结构一致。
13C NMR(CDCl3，75MHz)，δ＝24.5、25.1、25.5、26.1、44.1(CH2NCl)、53.1(CH2N)、55.4(CH2N)ppm；与所示结构一致。
MS(EI)，m/e＝176(M+1)；与所示结构一致。
步骤2：1，4-二{3，4-二[4-(N-哌啶基)丁氧基]苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷“化合物C”的合成
Figure A200780044482D00301
向含有去甲二氢化愈创木酸(NDGA，602mg，2.0mmol)和单水氢氧化锂(1.0g，24.0mmol，12当量)的叔丁醇(100mL)溶液中添加N-(4-氯丁基)哌啶(2.11g，12.0mmol，6.0当量)。该溶液在50℃下加热并持续搅拌。该反应由TLC监测(CH2Cl2:MeOH:Et3N＝95:3:2，V/V/V)，该方法确认所述反应在20小时后完成。反应悬浮液冷却至室温，并且用二氯甲烷(200mL)和水(100mL)分离。振摇该混合物以充分混合。分离所得有机相并且用二氯甲烷(2 X 100mL)萃取所得水相。合并所得有机相和萃取液并且用饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)和浓盐水(10mL)洗涤。用无水硫酸钠干燥后，所述溶液减压浓缩。所得残留物用二氯甲烷、甲醇和三乙胺(95:3:2，V/V/V)作为洗脱液的硅胶柱纯化，产生白色半固体的预期产物(704.6mg，产率41％)。
HPLC纯度-98.5％。
1H NMR(CDCl3，300MHz)，δ＝0.81(d，J＝6.6Hz，6H，2CH3)、1.35-1.50(m，8H，4CH2)、1.53-1.65(m，24H，12CH2)、1.67-1.80(m，2H)、1.90-2.2.03(m，8H)、2.40-2.60(m，26H)、2.72(m，2H)、3.99(t，J＝6.5Hz，4H)、4.00(t，J＝6.5Hz，4H)、6.65(dd，J＝1.9，8.0Hz，2H)、6.67(d，J＝1.9Hz，2H)、6.79(d，J＝8.0Hz，2H)ppm；与所示结构一致。
13C NMR(CDCl3)16.1、24.5、25.4、26.0、27.0、38.9、39.4、54.7、56.2、67.8、68.0、114.1、115.2、121.3、134.9、147.0、148.8ppm；与所示结构一致。
分析：C54H90N4O4(859.32)计算值C：75.48，H：10.56，N：6.52，实验值C：75.07、H：10.59、N：6.91；与所示结构一致。
步骤3：1，4-二{3，4-二[4-(N-哌啶基)丁氧基]苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷四盐酸盐“化合物D”的合成
Figure A200780044482D00311
向冰冷却的(0-5℃)的浓HCl水溶液(2.2mL 11N HCl，24mmol，24mol当量)的95％乙醇(7mL)溶液滴加1，4-二{3，4-二[4-(N-哌啶基)丁氧基]苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷(859.32mg，1.0mmol)的95％乙醇(7mL)的溶液。该溶液在0-5℃搅拌三小时，并在水浴温度为45℃的旋转蒸发器上除去溶剂。所得盐酸盐高真空干燥48小时。所得粗产品用乙醇：乙醚结晶在72小时真空干燥后得736.9mg产品(73.3％产率)。该产品的分析数据如下。
熔点：225-230℃(分解)。
HPLC纯度：99.2％(％峰面积)。元素分析C54H90O4N44HCl，FW＝1005.16，计算值：C：64.53；H：9.43；N：5.57。实验值：C：64.23；H：9.21；N：5.43。滴定法测定氯元素(无水基底)：理论值：14.11％；实验值：14.21％(理论值的100.7％)。
1H NMR(D2O，400MHz)：δ＝0.76(d，J＝6.4Hz，6H，2×CH3)、1.28-1.37(m，8H)、1.36-1.46(m，8H，4×哌啶CH2)、1.43-2.56(m，16H，8×哌啶CH2)、1.55-1.68(m，2H，2×CH)、2.36-2.51(m，16H，8×哌啶CH2N)、2.64(dd，J＝13.2，1.2Hz，2H，2×ArCH)、2.71(t，J＝6.0Hz，8H，4×CH2N)、4.03(t，8H，4×CH2O)、6.60-6.75(m，6H，6×ArH)ppm；与所示结构一致。
13C NMR(D2O，100MHz)，δ＝15.93、23.85、24.00、25.06、25.72、38.92、39.31、54.87、54.97、57.87、67.13、67.28、113.90、114.96、121.38、134.71、146.75、148.48ppm；与所示结构一致。
MS(EI)，m/e＝859(M+)，与游离碱C54H90N4O4一致。
实施例3
1，4-二{3，4-二(2-甲基-噻唑-4-基-甲氧基)苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷游离碱(C38H46N4O4S4，FW＝747.02)“化合物E”；和四盐酸盐(C38H46N4O4S4·4HCl，FW＝892.87)“化合物F”的合成
步骤1：1，4-二{3，4-二(2-甲基-噻唑-4-基-甲氧基)苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷“化合物E”的合成
Figure A200780044482D00321
由其盐酸盐制备4-氯甲基-2-甲基噻唑：将4-氯甲基-2-甲基噻唑盐酸盐(25g，135mmol)加入50％碳酸钾水溶液(100mL)和乙醚(400mL)中。该混合物在室温搅拌15分钟。分离所述有机层，用无水碳酸钾干燥，25℃减压(30-40mmHg)浓缩至干。所得残留物室温下在高真空(0.1-0.5mmHg)过夜干燥以得到4-氯甲基-2-甲基噻唑(20g，99.5％产率)。
1，4-二{3，4-二(2-甲基-噻唑-4-基-甲氧基)苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷的制备：
向冰冷却的NDGA(1.50g，4.96mol)的DMF(50mL)溶液中添加石蜡中的氢化钠(1.98g＝1.19g NaH，49.6mmol，10mol当量)的60％悬浮液。该混合物在0℃下搅拌30分钟然后在室温下搅拌30分钟。然后4-氯甲基-2-甲基噻唑(5.86g，39.69mmol，8.0mol当量)的DMF(20mL)溶液被加入并且该反应混合物在室温搅拌16小时。将该反应混合物加入到饱和氯化铝水溶液(300mL)和乙醚(600mL)中。振摇后，分离有机层，并且用乙醚(2×200mL)萃取水层。合并的有机层和萃取液用水(100mL)和浓盐水(100mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥并且在25℃下减压(30-40mm Hg)浓缩至干。所得残留物用最少量的二氯甲烷溶解并且以正己烷:乙酸乙酯(50:50到0:100)作为洗脱液用硅胶快速色谱柱纯化以产生白色固体的预期产物(1.56g，42.09％产率)。该产物进一步用乙酸乙酯-正己烷结晶纯化。
Mp85-87℃，HPLC纯度：98.9％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ＝0.84(d，J＝6.4Hz，6H，2×CH3)、2.01(m，2H，2×CH)、2.65-2.70(m，4H，2×Ar-CH2)、2.81(s，6H，2×CH3)、5.23(d，J＝20.7Hz，8H，4×OCH2)、6.70-6.84(m，6H，6×Ar-H)、7.07(s，4H，4-Ar-H)ppm；与所示结构一致。
13C NMR(75MHz，CDCl3)：δ＝16.5(CH3)、19.5(CH3)、38.6(Ar-CH2)、39.4(CH)、72.6(OCH2)、112.1(Ar)、113.8(Ar)、115.4(Ar)、122.8(Ar)、131.1(Ar)、135.0(Ar)、147.4(Ar)、149.5(Ar)、159.8(Ar)、165.3(Ar)ppm；与所示结构一致。
LC-MS，m/e＝770(M+Na+)，747(M+)。
分析：C38H42N4O4S4，FW＝747.02，计算值C：61.10，H：5.67，N：7.50，实验值：C：60.86，H：5.86，N：7.31。
步骤2：1，4-二{3，4-二(2-甲基-噻唑-4-基-甲氧基)苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷四盐酸盐“化合物F”的合成
Figure A200780044482D00331
室温持续搅拌下向1，4-二{3，4-二(2-甲基-噻唑-4-基-甲氧基)苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷(0.50g，0.6mmol)的丙酮(20mL)溶液中缓慢充入氯化氢气体鼓泡10分钟。所得沉淀物通过抽滤收集。所收集的材料溶于最少量的甲醇并且用无水乙醚沉淀。然后所得固体材料通过抽滤收集，并且在真空下干燥过夜以得到0.51g(85％产率)的白色固体的预期的四盐酸盐。
熔点：91-92℃。HPLC纯度：98.9％(峰面积纯度)
1H NMR(300MHz，甲醇-d4)：δ＝0.74(d，J＝6.4Hz，6H，2×CH3)、2.11(m，2H，2×CH)、2.55-2.60(m，4H，2×Ar-CH2)、2.75(s，6H，2×CH3)、5.28(d，J＝20.7Hz，8H，4×OCH2)、6.77-6.87(m，6H，6×Ar-H)、7.09(s，4H，4-Ar-H)、10.56(br s，NH)ppm；与所示结构一致。
13C NMR(75MHz，甲醇-d4)：δ＝16.7(CH3)、19.5(CH3)、38.6(Ar-CH2)、39.4(CH)、72.6(OCH2)、112.1(Ar)、113.8(Ar)、115.4(Ar)、122.8(Ar)、131.1(Ar)、135.0(Ar)、147.4(Ar)、149.5(Ar)、159.8(Ar)、165.3(Ar)ppm；与所示结构一致。
LC-MS，m/e＝770(M+Na+)，747(M+)与母体结构一致。
分析：C38H42N4O4S4·4HCl，FW＝892.87，计算值：C：51.12、H：5.19、N：6.27，实验值C：50.86、H：5.06、N：6.01。
实施例4
1，4-二{3，4-二(2-(N，N’-二甲氨基)-乙氧基)苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷游离碱(C34H58N4O4，FW＝586.85)“化合物G”；和四盐酸盐(C34H58N4O4·4HCl，FW＝732.69)“化合物H”的合成
步骤1：1，4-二{3，4-二(2-(N，N’-二甲氨基)-乙氧基)苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷“化合物G”的合成
Figure A200780044482D00341
向NDGA(1.50g，4.96mmol)的丙酮(150mL)溶液中添加无水碳酸钾(6.84g，49.6mmol，10mol当量)和盐酸N，N-二甲基-N-(2-氯乙基)胺(4.28g，29.7mmol，6mol当量)。该混合物回流下搅拌12小时。反应进程由TLC(二氯甲烷:甲醇＝95:5，v:v)监测，并且显示大量的NDGA未反应。因此，额外的无水碳酸钾(6.84g，49.6mmol，10mol当量)和盐酸N，N-二甲基-N-(2-氯乙基)胺(4.28g，29.7mmol，6mol当量)被加入，并且该混合物回流下再搅拌64小时。TLC监测显示反应完成。该混合物冷却至室温。不溶材料通过抽滤除去，并且用丙酮(2×50mL)洗涤。合并滤液和洗涤液并在25℃减压真空(30-40mm Hg)下浓缩至干。所得残留物用最少量的二氯甲烷溶解。不溶材料通过抽滤除去。所得滤液在硅胶快速色谱柱上用二氯甲烷:甲醇:三乙胺(94:1:5到85:10:5)梯度液洗脱纯化以产生白色固体的预期产物(1.56g，产率53.6％)。该产物进一步用乙酸乙酯-正己烷结晶纯化。
熔点：98-100℃，HPLC纯度：99.1％(峰面积纯度)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ＝0.81(d，J＝6.4Hz，6H，2×CH3)、1.95(m，2H，2×CH)、2.60-2.65(m，4H，2×Ar-CH2)、2.72(t，J＝6.1Hz，8H，4×NCH2)、2.86(s，6H，2×NCH3)、4.08(t，J＝6.1Hz，8H，4×OCH2)、6.60-6.75(m，6H，6×Ar-H)ppm；与所示结构一致。
13C NMR(75MHz，CDCl3)：δ＝15.2(CH3)、36.6(Ar-CH2)、38.7(CH)、45.5(NCH3)、56.7(NCH3)、65.4(OCH2)、112.8(Ar)、114.4(Ar)、121.8(Ar)、132.8(Ar)、146.4(Ar)、147.5(Ar)ppm；与所示结构一致。
LC-MS，m/e＝609(M+Na+)，586(M+)；与所示结构一致。
分析：C34H58N4O4，FW＝586.85，计算值：C：69.59，H：9.96，N：9.55，实验值：C：69.86，H：9.76，N：9.31。
步骤2：1，4-二{3，4-二(2-(N，N’-二甲氨基)-乙氧基)苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷四盐酸盐“化合物H”的合成
Figure A200780044482D00361
室温持续搅拌下向1，4-二{3，4-二(2-(N，N’-二甲氨基)-乙氧基)苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷(0.50g，0.85mmol)的丙酮(20mL)溶液中缓慢充入氯化氢气体鼓泡10分钟。所得沉淀物通过抽滤收集。所收集的材料溶于最少量的甲醇并且用无水乙醚沉淀。然后所得固体材料通过抽滤收集，并且在真空下干燥过夜以得到0.44g(70％产率)的白色固体的预期的四盐酸盐。
熔点：78-80℃。HPLC纯度：99.2％(峰面积纯度)。
1H NMR(300MHz，甲醇-d4)：δ＝0.76(d，J＝6.4Hz，6H，2×CH3)、1.85(m，2H，2×CH)、2.63-2.69(m，4H，2×Ar-CH2)、2.75(t，J＝6.1Hz，8H，4×NCH2)、2.96(s，6H，2×NCH3)、4.01(t，J＝6.1Hz，8H，4×OCH2)、6.65-6.77(m，6H，6×Ar-H)、10.55(brs，NH)ppm；与所示结构一致。
13C NMR(75MHz，甲醇-d4)：δ＝16.2(CH3)、35.6(Ar-CH2)、37.9(CH)、46.6(NCH3)、55.9(NCH3)、64.7(OCH2)、112.5(Ar)、115.4(Ar)、122.8(Ar)、131.7(Ar)、145.4(Ar)、146.5(Ar)ppm；与所示结构一致。
LC-MS，m/e＝609(M+Na+)，586(M+)与所示结构一致。分析：C34H58N4O4·4HCl，FW＝732.69，计算值C：55.73，H：8.53，N：7.65，实验值C：55.38，H：8.36，N：7.31。
实施例5
1，4-二{3，4-二(2-羟基乙氧基)苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷游离碱(C26H38O8，FW＝478.58)“化合物I”的合成
方法1：(对于类似的合成路线参看：《化学学会杂志化学通讯》(J.Chem.Soc.Chem.Commun.)1987，(3)，223-224；《美国化学学会杂志》(J.Am.Chem.Soc.)1981，103，2361)
向NDGA(2.0g，6.61mmol)的无水二甲基甲酰胺(DMF)(20mL)溶液中添加碳酸乙烯酯(3.49g，39.69mmol，6.0mol当量)和四乙基溴化铵(69mg，0.33mmol，0.05mol当量)。该混合物在140℃下搅拌。该反应由TLC(二氯甲烷:甲醇＝9:1，V:V)监测，并且该监测显示所述反应在36小时后完成。在80-90℃减压真空(30-40mm Hg)下除去DMF至干。然后所得残留物用二氯甲烷(200mL)溶解并用无水碳酸氢钠(50mL)和浓盐水(brine，2×50mL)洗涤。用无水硫酸钠干燥后，在30-40℃减压真空(30-40mm Hg)下除去溶剂至干。所得残留物用最少量的二氯甲烷溶解并在硅胶快速色谱柱上用二氯甲烷:甲醇(10:0到9:1，V/V)梯度溶液洗脱纯化以得到预期产物，进一步用二氯甲烷-乙醚重结晶纯化产生纯的产物0.88g(产率27.8％)。
熔点：120-122℃并且HPLC纯度99.4％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ＝0.73(d，J＝6.4Hz，6H，2×CH3)、1.85(m，2H，2×CH)、2.35，2.65(mm，4H，2×Ar-CH2)、3.74(t，J＝6.1Hz，8H，4×OCH2)、3.93(t，J＝6.1Hz，8H，4×OCH2)、6.56-6.72(m，6H，6×Ar-H)ppm；与所示结构一致。
13C NMR(75MHz，CDCl3)：δ＝15.4(CH3)、35.2(Ar-CH2)、37.9(CH)、61.8(OCH2)、68.7(OCH2)、112.3(Ar)、115.4(Ar)、122.9(Ar)、132.8(Ar)、146.4(Ar)、148.1(Ar)ppm；与所示结构一致。
LC-MS，m/e＝501(M+Na+)，478(M+)；与所示结构一致。
分析：C26H38O8，FW＝478.58，计算值：C：65.25，H：8.00，实验值：C：65.01，H：8.34。
方法2：(类似的合成路线参看《合成通讯》(Synth.Commun.)2002，32(12)，1909-1915)
Figure A200780044482D00381
向NDGA(1.5g，4.96mmol)的n-丁醇(150mL)溶液中添加氢氧化钠(4.0g，99.20mmol，20mol当量)的水(20mL)和2-氯乙醇(8.0g，99.22mmol，20mol当量)的溶液。该混合物在回流下搅拌。该反应由TLC(二氯甲烷:甲醇＝9:1，V/V)监测，并且该监测显示所述反应在36小时后完成。该混合物冷却至0℃并且用浓盐酸小心地中和至pH7.0。该混合物在70-80℃减压真空(30-40mm Hg)下浓缩至干。所得残留物与乙酸乙酯(200mL)混合并搅拌。不溶材料通过过滤移除并且用乙酸乙酯(2×50mL)洗涤。合并滤液和洗涤液，并用浓盐水(2×100mL)洗涤。用无水硫酸钠干燥后，该混合物在30-40℃减压真空(30-40mm Hg)下浓缩至干。所得残留物用最少量的二氯甲烷溶解并在硅胶快速色谱柱上用二氯甲烷:甲醇(95:5到80:20，V/V)梯度洗脱溶液进行纯化以产生白色固体的预期产物，该产物用二氯甲烷-乙醚重结晶以产生纯的产物1.32g(55.6％)，熔点：120-122℃并且HPLC纯度98.5％。分析数据与方法1的样品相同。
方法3：(类似实验步骤参看《韩国化学学会会刊》(Bull.Korean Chem.Soc.)2004，25(12)，1941-1944)。
Figure A200780044482D00382
向NDGA(1.5g，4.96mmol)的DMF(150mL)溶液中添加无水碳酸钾(13.70g，99.20mmol，20mol当量)和(2-氯乙氧基)乙烷(10.57g，99.22mmol，20mol当量)。该混合物在130℃下搅拌。该反应由TLC(二氯甲烷∶甲醇＝9∶1，V/V)监测，并且该监测显示所述反应在48小时后完成。该混合物在50-60℃减压真空(5-10mm Hg)下浓缩至干。所得残留物与乙酸乙酯(200mL)混合并搅拌。不溶材料通过过滤移除并且用乙酸乙酯(2×50mL)洗涤。合并滤液和洗涤液，并用浓盐水(2×100mL)洗涤。用无水硫酸钠干燥后，该混合物在30-40℃减压真空(30-40mm Hg)下浓缩至干。所得残留物用最少量的二氯甲烷溶解并在硅胶快速色谱柱上用二氯甲烷:甲醇(95:5到80:20，V/V)梯度洗脱溶液纯化以产生白色固体的预期产物，该产物进一步用二氯甲烷-乙醚重结晶纯化以产生纯的产物1.50g(63.1％产率)，熔点：120-122℃并且HPLC纯度98.5％。分析数据与方法1的样品相同。
实施例6
1，4-二{3，4-二[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷游离碱(C34H54N4O12，FW＝654.79)“化合物J”的合成
Figure A200780044482D00391
向NDGA(1.5g，4.96mmol)的DMF(150mL)溶液中添加无水碳酸钾(13.70g，99.20mmol，20mol当量)和(2-氯乙氧基)乙醇(12.36g，99.22mmol，20mol当量)。该混合物在130℃下搅拌。该反应由TLC(二氯甲烷:甲醇＝9:1，V/V)监测，并且该监测显示所述反应在72小时后完成。该混合物在50-60℃减压真空(5-10mmHg)下浓缩至干。所得残留物与乙酸乙酯(200mL)混合并搅拌。不溶材料通过过滤移除并且用乙酸乙酯(2×50mL)洗涤。合并滤液和洗涤液，并用浓盐水(2×100mL)洗涤。用无水硫酸钠干燥后，该混合物在30-40℃减压真空(30-40mmHg)下浓缩至干。所得残留物用最少量的二氯甲烷溶解并在硅胶快速色谱柱上用二氯甲烷:甲醇(95:5到80:20，V/V)梯度洗脱溶液进行纯化以产生白色固体的预期产物，该产物进一步用二氯甲烷-乙醚重结晶纯化以产生浅黄色半固体的纯的产物1.25g(38.5％产率)，并且HPLC纯度98.5％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ＝0.74(d，J＝6.4Hz，6H，2×CH3)、1.88(m，2H，2×CH)、2.38，2.68(mm，4H，2×Ar-CH2)、3.60-4.01(m，32H，16×OCH2)、6.58-6.74(m，6H，6×Ar-H)ppm；与所示结构一致。
13C NMR(75MHz，CDCl3)：δ＝15.4(CH3)、36.3(Ar-CH2)、38.5(CH)、61.3(OCH2)、69.7(OCH2)、70.7(OCH2)、71.2(OCH2)、112.4(Ar)、114.1(Ar)、123.4(Ar)、131.6(Ar)、145.9(Ar)、149.5(Ar)ppm；与所示结构一致。
LC-MS，m/e＝677(M+Na+)，672(M+H20)，655(M+)；与所示结构一致。
分析：C34H54O12，FW＝654.79，计算值C：62.37，H：8.31，实验值C：62.01，H：8.14。
实施例7
1，4-二{3，4-二(2-氟-乙氧基)苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷(C25H34O4F4，FW＝486.54)“化合物K”的合成
Figure A200780044482D00401
向冰水浴冷却的化合物I(479mg，1.0mmol)的二氯甲烷(10mL)悬浮液中加入三氟化二乙氨基硫(DAST，805mg，5mmol)。在生成的黄色溶液在室温搅拌10小时后，冷却下用饱和碳酸氢钠(2mL)淬灭该反应。有机层用饱和饱和盐水洗涤，用MgSO4(s)干燥，过滤，减压浓缩。所得残留物用快速硅胶柱色谱(10％甲醇的二氯甲烷作为洗脱液)纯化，并且需要的部分被浓缩以产生灰白色固体的期望的化合物(277mg，0.47mmol，产率57％)。
熔点：98-102℃，HPLC纯度：97.5％(峰面积纯度)。
1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ＝0.76(d，J＝6.4Hz，6H，2×CH3)、1.63-1.70(m，2H，2×CH)、2.18(dd，J＝13Hz，2H，2×ArCH)、2.76(dd，J＝13.2，4.6Hz，2H，2×ArCH)、4.09(t，J＝5.6Hz，8H，4×CH2O)、4.66(m，J＝47Hz，8H，4×CH2F)、6.55-6.72(m，6H，6×ArH)；与所示结构一致。
13C NMR(CDCl3，100MHz)：δ＝15.90、38.68、39.23、64.23、64.50、66.49、66.86、113.75、114.80、121.56、134.96、146.63、148.38；与所示结构一致。
MS(EI)m/e：486(M+)，496(M+)，525(M+K)；与所示结构一致。
分析：C25H34O4F4，FW＝486.54，计算值C：64.18；H：7.04。实验值C：63.95；H：6.85。
实施例8
1，4-二{3，4-二[4-(N-吗啉)丁氧基]苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷游离碱(C50H82N4O8，FW＝867.21)“化合物L”和四盐酸盐(C50H82N4O8·4HCl，FW＝1013.05)“化合物M”的合成
步骤1：N-(4-氯丁基)吗啡的合成
Figure A200780044482D00421
在2L的三颈圆底烧瓶中加入吗啉(87.12g，1.0mol)丙酮(1000mL)和无水碳酸钾(276.42g，2.0mol，2.0当量)。所述烧瓶加装机械搅拌和冷凝管。在室温持续搅拌下30分钟内滴加4-氯-1-溴-丁烷(188.6g，1.1mol，1.1当量)。该悬浮混合物随后在40℃下搅拌。反应进程由TLC监测，确认该反应在4小时后完成。所得混合物冷却至室温，并将不溶材料过滤除去并且用二氯甲烷(2×100mL)洗涤。合并的滤液真空浓缩直至干燥。然后残留物与二氯甲烷(500mL)混合。将不容材料过滤除去并且用二氯甲烷(2×100mL)洗涤。合并的滤液和洗涤液被浓缩并且通过快速硅胶柱纯化，产生浅黄色油状产物(80.83g，45.5％产率)。
1H NMR(CDCl3，300MHz)，δ＝1.35(m，2H，CH2)、1.75(m，2H，CH2)、2.41(t，J＝6.5Hz，4H，2CH2N)、2.97(t，J＝6.8Hz，2H，CH2N)、3.65(m，6H，2OCH2，CH2Cl)ppm；与所示结构一致。
13C NMR(CDCl3，75MHz)，δ＝25.4、25.8、45.4、53.2、60.2、65.5ppm；与所示结构一致。
MS(EI)，m/e＝178(M+1)；与所示结构一致。
步骤2：1，4-二{3，4-二[4-(N-吗啡)丁氧基]苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷“化合物L”
向含有NDGA(602mg，2.0mmol)和单水氢氧化锂(1.0g，24.0mmol，12当量)的叔丁醇(100mL)溶液中添加N-(4-氯丁基)吗啡(2.13g，12.0mmol，6.0当量)。该溶液在50℃下持续搅拌。该反应由TLC监测(CH2Cl2:MeOH:Et3N＝92:6:2，V/V/V)，该方法确认所述反应在20小时后完成。反应悬浮液冷却至室温，并且用二氯甲烷(200mL)和水(100mL)分离。该混合物被振摇以充分混合。分离所得有机相，并且用二氯甲烷(2×100mL)萃取所得水相。合并所得有机相和萃取液并且用饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)和浓盐水(10mL)洗涤。用无水硫酸钠干燥后，所述溶液减压浓缩。所得残留物用二氯甲烷、甲醇和三乙胺(92:6:2，V/V/V)作为洗脱液的通过硅胶柱纯化，产生白色半固体的预期产物(667.75mg，产率38.5％)。
HPLC纯度99.2％。元素分析C50H82N4O8，FW＝867.21，计算值：C：69.25；H：9.53；N：6.46。实验值：C：69.05；H：9.21；N：6.43；与所示结构一致。
1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ＝0.74(d，J＝6.4Hz，6H，2×CH3)、1.32-1.46(m，16H)、1.62-1.71(m，2H，2×CH)、2.26(dd，J＝13.4，9.2Hz，2H，2×ArCH)、2.75(dd，J＝13.2，4.6Hz，2H，2×ArCH)、2.51-2.79(m，16H，8×吗啉CH2)、2.89(t，J＝12.2Hz，8H，4×CH2N)、3.56-3.76(m，16H，8×吗啉CH2)、4.11(t，J＝5.6Hz，8H，4×CH2O)、6.47-6.69(m，6H，6×ArH)ppm；与所示结构一致。
13C NMR(CDCl3，100MHz)：δ＝16.96、24.31、24.91、38.77、40.18、54.31、55.79、56.46、60.59、65.60、67.58、67.70、115.68、116.09、122.39、135.75、145.39、149.29ppm；与所示结构一致。
MS(FAB)m/e：867(M+)，434(1/2M+)，与所示结构(C54H82O8N4)一致。
分析：C50H82N4O8(867.21)C：69.25、H：9.53、N：6.46，实验值C：68.94、H：9.39、N：6.91；与所示结构一致。
步骤3：1，4-二{3，4-二[4-(N-吗啡)丁氧基]苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷四盐酸盐“化合物M”的合成
Figure A200780044482D00441
向冰冷却的(0-5℃)的浓HCl水溶液(2.2mL 11N HCl，24mmol，24mol当量)的95％乙醇(7mL)溶液滴加1，4-二{3，4-二[4-(N-吗啉)丁氧基]苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷(867.21mg，1.0mmol)的95％乙醇(7mL)的溶液。该溶液在0-5℃搅拌三小时，并且在水浴温度保持在45℃的旋转蒸发器中除去溶剂。所得盐酸盐真空干燥48小时。所得粗产品用乙醇：乙醚结晶，真空干燥72小时后得691.9mg产品(68.3％产率)。该产品的分析数据如下。
熔点：215-220℃(分解)。
HPLC纯度：98.2％(％峰面积)。元素分析C50H82N4O8·4HCl，FW＝1013.05，计算值：C：59.28；H：8.56；N：5.53。实验值：C：58.94；H：8.21；N：5.43。滴定法测定氯元素(无水基底)：理论值：14.00％；实验值：14.05％。
1H NMR(D2O，400MHz)：δ＝0.72(d，J＝6.4Hz，6H，2×CH3)、1.32-1.42(m，16H)、1.62-1.68(m，2H，2×CH)、2.16(dd，J＝13.4，9.2Hz，2H，2×ArCH)、2.72(dd，J＝13.2，4.6Hz，2H，2×ArCH)、2.41-2.59(m，16H，8×吗啉CH2)、2.70(t，J＝12.2Hz，8H，4×CH2N)、3.46-3.72(m，16H，8×吗啉CH2)、4.01(t，J＝5.6Hz，8H，4×CH2O)、6.57-6.70(m，6H，6×ArH)ppm；与所示结构一致。
13C NMR(D2O，100MHz)：δ＝15.96、23.91、24.89、38.57、39.08、53.31、53.79、57.46、59.79、66.50、66.58、66.70、113.68、114.69、121.39、134.75、146.39、148.29ppm；与所示结构一致。
MS(FAB)m/e：867(M+)，434(1/2M+)；与所示结构(C54H82N4O8)一致。
实施例9
1，4-二{3，4-二[4-(N-甲基-哌嗪-N’-基)丁氧基]苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷游离碱(C54H94N8O4，FW＝919.38)“化合物N”和八盐酸盐(C54H94N8O4·8HCl，FW＝1211.06)“化合物O”的合成
步骤1：N-甲基-N’-(4-氯丁基)哌嗪的合成
Figure A200780044482D00451
在2L的三颈圆底烧瓶中加入N-甲基-哌嗪(100.16g，1.0mol)丙酮(1000mL)和无水碳酸钾(276.42g，2.0mol，2.0当量)。所述烧瓶加装机械搅拌和冷凝管。在室温持续搅拌下30分钟内滴加4-氯-1-溴-丁烷(188.6g，1.1mol，1.1当量)。该悬浮混合物随后在40℃下搅拌。反应进程由TLC监测，确认该反应在4小时后完成。所得混合物冷却至室温并且不溶材料过滤除去并且用二氯甲烷(2×100mL)洗涤。合并的滤液真空浓缩直至干燥。然后残留物与二氯甲烷(500mL)混合。不容材料过滤除去并且用二氯甲烷(2×100mL)洗涤。合并的滤液和洗涤液被浓缩并且通过快速硅胶柱纯化，产生浅黄色油状产物(92.5g，48.5％产率)。
1H NMR(CDCl3，300MHz)，δ＝1.37(m，2H，CH2)、1.81(m，2H，CH2)、2.25(s，3H，NCH3)、2.33(m，8H，4NCH2)、3.10(t，J＝6.5Hz，2H，2CH2N)、3.65(t，J＝6.8Hz，2H，CH2Cl)ppm；与所示结构一致。
13C NMR(CDCl3，75MHz)，δ＝25.4、25.9、44.1、45.8、52.1、53.1、55.8ppm；与所示结构一致。
MS(EI)，m/e＝191(M+1)；与所示结构一致。
步骤2：1，4-二{3，4-二[4-(N-甲基-哌嗪-N’-基)丁氧基]苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷“化合物N”的合成
Figure A200780044482D00461
向含有NDGA(602mg，2.0mmol)和单水氢氧化锂(1.0g，24.0mmol，12当量)的叔丁醇(100mL)溶液中添加N-甲基-N’-(4-氯丁基)哌嗪(2.29g，12.0mmol，6.0当量)。该溶液在50℃下持续搅拌。该反应由TLC监测(CH2Cl2:MeOH:Et3N＝92:6:2，V/V/V)，该方法确认所述反应在20小时后完成。反应悬浮液冷却至室温，并且用二氯甲烷(200mL)和水(100mL)分离。该混合物被振摇以充分混合。分离所得有机相并且用二氯甲烷(2×100mL)萃取所得水相。合并所得有机相和萃取液并且用饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)和浓盐水(10mL)洗涤。用无水硫酸钠干燥后，所述溶液减压浓缩。所得残留物用二氯甲烷、甲醇和三乙胺(92:6:2，V/V/V)作为洗脱液的硅胶柱纯化，产生白色半固体的预期产物(855.02mg，产率46.5％)。
HPLC纯度：98.2％(％峰面积)。元素分析：C54H94O8N4，FW＝919.38，计算值：C：70.55；H：10.31；N：12.19。实验值：C：70.65；H：10.11；N：12.43；与所示结构一致。
1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ＝0.76(d，J＝6Hz，6H，2×CH3)、1.36-1.56(m，16H)、1.65-1.71(m，4H)、2.42(s，6H)、2.45-2.65(m，22H)、2.85(t，J＝6.0Hz，4H)、2.95(t，J＝6.0Hz，4H)、4.23(q，J＝6.0Hz，8H)、6.65-6.78(m，6H，6×ArH)ppm；与所示结构一致。
13C NMR(CDCl3，100MHz)：δ＝15.61、23.55、24.56、32.26、35.58、46.27、53.13、55.05、56.36、66.44、66.86、113.77、115.63、121.15、145.66、147.97、150.02ppm；与所示结构一致。
MS(FAB)m/e：920(M+)，460(M+)；与所示结构一致。
步骤3：1，4-二{3，4-二[4-(N-甲基-哌嗪-N’-基)丁氧基]苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷八盐酸盐“化合物O”的合成
Figure A200780044482D00471
向冰冷却的(0-5℃)的浓HCl水溶液(2.2mL 11N HCl，24mmol，24mol当量)的95％乙醇(7mL)溶液滴加1，4-二{3，4-二[4-(N-甲基-哌嗪-N’-基)丁氧基]苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷(919.38mg，1.0mmol)的95％乙醇(7mL)的溶液。该溶液在0-5℃搅拌三小时并且在水浴温度保持在45℃的旋转蒸发器上除去溶剂。所得盐酸盐高真空干燥48小时。所得粗产品用乙醇：乙醚结晶在高真空干燥72小时后得914.35mg产品(75.5％产率)。该产品的分析数据如下。
熔点：215-220℃(分解)。
HPLC纯化：98.2％(％峰面积)。元素分析：C54H94N8O4·8HCl，FW＝1211.06，计算值：C：53.55；H：8.49；N：9.25。实验值：C：53.24；H：8.21；N：9.43。滴定法测定氯元素(无水基底)：理论值：23.42％；实验值：23.35％；与所示结构一致。
1H NMR(D2O，400MHz)：δ＝0.75(d，J＝6Hz，6H，2×CH3)、1.33-1.46(m，16H)、1.55-1.64(m，4H)、2.32(s，6H)、2.35(s，6H)、2.45-2.65(m，16H)、2.83(t，J＝6.0Hz，4H)、2.82(t，J＝6.0Hz，4H)、4.10(q，J＝6.0Hz，8H)、6.65-6.78(m，6H，6×ArH)ppm；与所示结构一致。.9(Ar)、132.8(Ar)、146.4(Ar)、148.1(Ar)ppm；与所示结构一致。
13C NMR(D2O，100MHz)：δ＝15.91、23.85、25.06、31.26、35.38、46.17、53.73、55.15、57.36、67.34、67.46、114.47、114.73、120.95、146.06、148.77、149.92ppm；与所示结构一致。
MS(FAB)m/e：920(M+)，460(M+)；与所示结构一致。
下列预测实施例1-5显示反应路线相信可以有效制备显示的化合物。
预测实施例A
1，4-二{3，4-二[2-(1-甲基-哌嗪-4-基)乙氧基]苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷游离碱(C46H78N8O4，FW＝807.16)和四盐酸盐(C46H78N8O4·4HCl，FW＝953.01)的合成
预测实施例B
1，4-二{3，4-二[2-(哌啶-1-基)乙基氨基甲酰基氧]苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷游离碱(C50H78N8O8，FW＝919.20)和四盐酸盐(C50H78N8O8·4HCl，FW＝1065.5)的合成
方法1
Figure A200780044482D00491
方法2
Figure A200780044482D00492
预测实施例C
1，4-二{3，4-二[2-(吗啉-1-基)乙基氨基甲酰基氧]苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷游离碱(C46H70N8O12，FW＝927.09)和四盐酸盐(C46H70N8O12·4HCl，FW＝1072.94)的合成
Figure A200780044482D00501
预测实施例D
1，4-二{3，4-二[(2-N，N-二甲氨基乙基)氨甲酰氧]苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷游离碱(C38H62N8O8，FW＝758.95)的合成
预测实施例E
1，4-二{3，4-二[(呋喃-2-基)甲基-氨甲酰氧]苯基}-2，3-二甲基-(2R，3S)-丁烷游离碱(C42H42N4O12，FW＝794.80)的合成
Figure A200780044482D00503
根据进行的一般实验，下面涉及体外细胞毒性和有效性研究的具体的非限定性实施例将进一步描述本发明。
细胞毒性和有效性研究
本发明的某些化合物已经进行体外研究。所述的体外研究已表明本发明的各种类型的NDGA衍生物能安全有效地用于病毒感染或增值、发炎、代谢或血管疾病的预防或患后治疗。下列实施例解释该测试涉及的所述研究。
细胞毒性研究
针对细胞毒性进行的研究包括已知的MTS、台盼蓝(Trypan Blue)和MTT实验。MTS实验使用CellTi ter96AQueous单溶液细胞增殖检测(普洛麦格生物技术有限公司，麦迪逊，威斯康星，美国)完成。有代谢活性即存活的细胞使MTS，四唑化合物(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑，内盐)变为可溶于组织培养基的有色甲暨。所述甲暨的吸收的测量在490nm读取。待用试剂被直接加至96孔板的基质中的细胞，培养1-4小时并且通过板读器记录结果。IC50通过对采集数据作图获得。IC50是与空白实验比较能够抑制测试材料的生长或存活的50％的测试材料的浓度。
在台盼蓝测试中，细胞被胰蛋白酶化并且样品被添加到台盼蓝染料和生理盐水的溶液中。存活的细胞能够保持该染料在它们的细胞膜外，而受损或者死亡的细胞则不能。计数存活和非存活(蓝色)的细胞，并且计算存活百分比。增殖率使用来自安慰剂处理过的细胞的值计算，并且比较处理过的细胞和未处理过的细胞的存活率。
MTT测试是用以测定存活细胞数目的比色法。有代谢活性的细胞使MTT试剂，(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯四唑溴化物)变为可溶于二甲亚砜(DMSO)的紫色甲暨晶体。所述MTT试剂被添加到MTT(无色)介质中。将该介质加到细胞并且培养4小时。将DMSO加到细胞并混合。然后有色溶液在540nm读值，在630nm处校正。IC50通过采集的数据作图获得。
抗病毒活性SEAP测试
抗病毒活性使用SEAP(分泌型碱性磷酸酶)测试决定，所述测试中细胞与SEAP和TAT质粒共转染。TAT是人类免疫缺陷病毒(HIV)基因表达的反式激活因子并且是两个或者多个对于HIV基因表达必需的病毒调节因子(TAT和REV)之一。TAT通过结合TAR RNA元件并且激活长末端重复序列(LTR)启动子的转录来起作用。TAT蛋白稳定转录延伸并且也已显示与转录开启有关。之前的研究已经显示TAT是抗体-依赖型T细胞增殖减少的媒介，基本上导致免疫反应的失败。TAT也直接刺激卡波希细胞(Kaposi′s cell)生长。
因为TAT没有明显的细胞同系物，这一强正性调节因子已经成为用于抗AIDS药物发展的非常有吸引力的目标。与现有HIV逆转录抑制因子(AZT，DDI)或阻止新一轮感染的潜在蛋白酶抑制因子相比，遏制病毒基因TAT调节的完整前病毒DNA表达的抑制因子将在早期抑制病毒(苏(Hsu)等，《科学》(Science)254：1799-1802，1991)。意于阐明在宿主真核细胞内转录和转录后水平控制基因表达的因子的努力最近已经使TAT功能的定量评估成为可能(山姆，《纽约科学学院年报》(Ann.N.Y.Acad.Sci.)616：64-70，1990)。为了筛选TAT调节的转录激活(TAT-TRS)的抑制因子，SEAP报告基因被置于质粒pBC12/HIV/SEAP中HIV-1LTR启动子的控制下。TAT-编码的活性通过第二质粒构建pBC12/CMV/t2提供。COS-7细胞和这两种质粒的瞬间共转染导致碱性磷酸酶分泌到通过简单比色测试分析的培养基中(伯格等，《基因》(Gene)66：1-10，1988)。因此，SEAP测试提供了TAT转录激活的间接测定。
在SEAP测试中，抑制因子应当通过TAT蛋白(TAT-TRS)引起通过HIV-1LTR启动子的转录激活的SEAP报告基因表达的减弱。TAT蛋白在巨细胞病毒启动子的控制下表达，并且诱导非内源性的抗热型的分泌型碱性磷酸酶的表达。如果TAT转录激活被药物阻止，SEAP报告因子将不会分泌到基质。由对硝基苯磷酸底物在405nm对SEAP进行比色检测。参看Gnabre13。由MTT测试分析细胞以比较对于SEAP抑制作用的细胞毒性。目的是所述药物能够抑制SEAP，而没有太大的毒性。
抗增殖活性
使用涉及基于DNA片段的细胞凋亡的TiterTACS凋亡检测试剂盒(安迪生物科技有限公司(R&D Systems Inc.)，明尼阿波利斯，明尼苏达，美国)并通过ELISA VEGF(血管上皮生长因子)和凋亡抑制蛋白(survivin)测试来测定抗增殖活性。
在DNA片段测试中，细胞凋亡原位检测特别地由批次号为TA600的TiterTACS96-孔凋亡检测试剂盒(R&D Systems Inc.)完成。TiterTACS测试在无需使用比色检测直接计数标记细胞下提供培养的细胞的凋亡的量。细胞经测试化合物处理，未处理的作为实验阴性对照，或者经TACS核酸酶处理作为阳性对照。TACS核酸酶允许对每个实验系统产生阳性对照：在标记前用TACS核酸酶简要处理细胞在每个细胞内产生DNA分裂，以提供特别针对所研究体系的适当的阳性对照。催化dNTPs添加到DNA片断的TdT酶允许使用辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(streptavidin-HRP)溶液及随后的TACS-蓝宝(TACS-Sapphire)底物在450nm的比色检测。在450nm的强吸收表明细胞的凋亡。处理过的细胞与未处理的细胞和核酸切开的细胞相比较以判断凋亡的程度。
ELISA(酶联免疫吸附试验)VEGF研究按照制造商的使用Endogen人VEGF ELISA试剂盒，批号EHVEGF(皮尔斯生物科技公司(PierceBiotechnology，Inc.)，罗克福德，伊利诺伊，美国)的说明来完成。通过用去铁敏(DFO)处理细胞创造用于该细胞的低氧状态，该状态螯合离子并引起细胞分泌VEGF到基质。上清液(基质)被移除并且冷冻用以测试，并且细胞被用台盼蓝试验计数以致所得结果能够被正态化到细胞数。VEGF由三明治ELISA测量，所述三明治ELISA能够捕获抗体覆盖的微板上基质中的蛋白，然后使用生物素化的抗体试剂检测该蛋白。由标准曲线获得的结果能够使使用者量化每个样品中蛋白的数量。
ELISA-凋亡抑制蛋白测试
凋亡抑制蛋白是在很多人的癌中但不在正常成人组织中大量表达的凋亡抑制因子，并且被认为是可能的细胞死亡/存活的终结效应期的调节因子。凋亡抑制蛋白以细胞循环依赖方式在G2-M中表达，直接与有丝分裂纺锤体微管结合。已显示的是在细胞分裂阶段保持细胞存活可能需要Thr34的凋亡抑制蛋白磷酸化作用，磷酸化作用缺陷的凋亡抑制蛋白突变体的表达已经显示出在几种人黑色素细胞系中引起凋亡。磷酸化的凋亡抑制蛋白对半胱天冬酶通路径起作用以抑制半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-9的形成，因而抑制凋亡。因此，减少凋亡抑制蛋白表达的化合物预期将提高凋亡和细胞死亡率。
按照制造商的使用Surveyor IC人全凋亡抑制蛋白免疫测试，批号SUV647(R&D Systems，Inc.)的说明研究测试的化合物对凋亡抑制蛋白的效果。为了凋亡抑制蛋白蛋白含量分析细胞溶胞产物。所述试剂盒包括覆有特别针对凋亡抑制蛋白的抗体的板和可识别结合到板上的凋亡抑制蛋白的生物素化的抗体试剂。所述板在板读取器设定的450nm读取和540nm校正。根据布拉德福德(Bradford)方法(布拉德福德，M.1976，《分析生物化学》(Anal Biochem)72：248-254)的蛋白实验被用于根据全蛋白含量量化和正态化样品。由标准曲线获得的结果能够使使用者量化每个样品中凋亡抑制蛋白蛋白的数量。
抗发炎活性
基于测试的化合物对初级人表皮细胞(PHKs)的效果测定抗发炎活性。PHKs在发炎过程中发挥重要的作用，合成大量细胞因子、粘合分子和生长因子。进行研究以测定测试的化合物是否能够抑制表皮细胞从而阻止或减少γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1，也是CD54)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的产生。PHKs首先由TNF-α处理以诱导前炎症状态和前炎症细胞因子的释放。随后按照制造商的使用R&D Systems，Inc.的蛋白测试(Quantikine ELISA试剂盒；批号MCP-I试剂盒：DCPOO，GM-CSF试剂盒：DGMOO，和IFN-γ：DIF50)的说明测试特异性细胞因子。
涉及抗病毒和抗增殖活性的细胞毒性研究的一般实验
测试从ATCC获得并且根据ATCC指示保存的三个细胞系：HeLa(宫颈腺癌)、A549(肺癌)、和COS-7(SV40移植的猴肾)。这些细胞系的研究被认为是测试的物质对哺乳动物包括人的疾病的效果的指示物。
所有化合物溶解于DMSO并且DMSO作为安慰剂使用。所述样品首先溶于DMSO成为10mM稀释液，然后进一步稀释为5、1、0.5、0.1、0.05、和0.01mM溶液。这些溶液以1％浓度(1μl比100μl基质)被加到基质用以以100、50、10、5、1、0.5和0.1μM化合物来处理细胞。被发现有低IC50的化合物进一步用DMSO稀释。溶液特别是10mM溶液在使用前检查沉淀。如果有沉淀物，所述溶液被加热到65℃并且加到加热的基质。
100μl基质的1.5-8×104细胞被种植在96-孔板的孔中，并且过夜培养。所述板的外侧孔填有200μl无菌去离子(DI)水以抑制基质挥发。24小时后，测试化学品在基质中以1％基质体积的浓度制备。所述测试样品基质在加入100μl每孔前被用移液管混合。基质被加到“仅基质”孔。所述孔板和它的内容物被培养24-72小时，取决于所进行的研究。在MTS测试的日子，MTS试剂被从冷藏柜取出并且放至室温。使用多通道移液管，20μl的MTS试剂被加到每个孔并且培养一到四小时。从培养器内一小时后直到空白孔是约0.2OD，该板参照690nm波长在490nm读取。所得结果随后扫描到设计用于在数据输入后进行所有需要的计算的Microsoft Excel模板。检查所得数据的统计错误；包括在所该组数据点的中间值的10％以内数据点。空白(“仅基质”)的平均值被扣除并且所得数据插入代表处理/未处理的生长响应的表格。
SEAP实验
下述SEAP实验作为报告系统用以测量HIV转录的TAT-介导转录激活的活性。MTT测试测量细胞增殖并且用于证实SEAP活性的水平不单取决于细胞毒性。这些测试被用于筛选可作为抗病毒剂尤其是抗HIV候选物的潜在的药物化合物。
COS-7(绿猴肾)细胞使用Fugene 6试剂(罗氏应用科学，批号11815091001，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国)和两种质粒共转染：pHIVSEAP(在HIV LTR启动子控制下SEAP表达媒介)和pCTAT(在CMV(巨细胞病毒)促进因子控制下HIV TAT转录因子表达媒介)。在测试化合物处理48小时后，在添加对-硝基苯磷酸底物后在405nm测试样品SEAP活性。SEAP活性抑制的百分比根据安慰剂对照进行计算。
实施例10
SEAP/MTT和MTS研究-细胞毒性和抗病毒有效性
对于基于上面提到的一般实验的上述实施例指示的化合物SEAP/MTT和MTS研究结果在下面的表3中给出，其中左边的一栏是测试的化合物并且EC50显示有对照的效果的50％的该化合物的浓度。IC50如前述定义。
表3
 
化合物 SEAP EC50 COS-7 IC50 A549 IC50 HeLa IC50
A 0.5-1μM 0.7-0.9μM 0.8-0.9μM 2-3μM
B 1-5μM
D 1-5μM 5-10μM
M 1-5μM 5-10μM
0 8-9μM 10-30μM
F 多种响应 多种响应 >100μM >100μM
G在水中 15-20μM 15-20μM
H在水中 15-20μM 15-20μM
I 60-80μM 70-80μM 65-70μM 20-30μM
K >100μM >100μM
J 80-90μM 80-90μM 80-90μM >100μM
表3显示了作为细胞存活性指示物化合物在两个细胞系使用MTS测试测试生物活性的结果。IC50浓度显示这些化合物对细胞存活的抑制作用的不同程度。以剂量依赖型方式所有化合物能够减少细胞存活性因而诱导凋亡。化合物A在A549细胞中显示最强的细胞存活性抑制作用，而它的盐酸盐(化合物B)在HeLa细胞中显示最强的抑制作用。
由SEAP测试测定的TAT转录激活的抑制作用的程度同样在化合物间变化，如表3所示。，化合物A在EC50为0.5-1μM之间还显示出了明显的抗病毒活性。在测试细胞(COS-7)中由MTT测试决定的细胞存活性的抑制性浓度通常与TAT-转录激活的有效浓度类似。
实施例11
基于TiterTACS，VEGA和凋亡抑制蛋白凋亡研究的抗增殖活性基于上面的一般实验，关于上面实施例指示的化合物的
Figure A200780044482D00571
片断，ELISA VEGA和ELISA凋亡抑制蛋白凋亡研究的结果在表4中给出。
表4
 
化合物 DNA片断 凋亡抑制蛋白IC50         VEGF IC50
B 阴性 2μM
D 阳性 4μM 9μM
M 阳性 5μM 9μM
0 阳性 14μM 18μM
G在水中 25μM
H在水中 阳性 10μM 23μM
阳性＝诱导凋亡
阴性＝未诱导凋亡
测试的化合物在低的微摩浓度下已经显示出能够显著降低凋亡抑制蛋白蛋白的水平。所以，它们在DNA片段实验中也显示出强凋亡诱导作用。化合物D、M、O和H减少凋亡抑制蛋白蛋白表达因而能够诱导凋亡。这些化合物能够以剂量依赖型方式减少凋亡抑制蛋白并且诱导凋亡。化合物D是凋亡抑制蛋白蛋白生产的最强蛋白抑制剂，其用于凋亡抑制蛋白生成的IC50为4μM左右。
VEGF蛋白的释放同样被这些化合物减弱。化合物B、D、M、O、G和H在低的微摩浓度范围内能够抑制VEGF蛋白生成。观察到所有化合物以剂量依赖型方式的抑制作用。已显示化合物B用于VEGF生成的IC50为约2μM，而显示化合物D和M用于VEGF生成的IC50均为约9μM。
表4的结果表明本发明的化合物在测试的细胞系中在抑制病毒活性和导致细胞死亡(凋亡)方面是有效的。在测试的化合物中，化合物A、B、D、G、H、M和O由于它们更低的EC50和IC50值显示出比其他化合物更为有效。化合物A表现的最为有效。
实施例12
美国国家癌症中心DTP人肿瘤细胞系筛选
美国国家癌症中心(NCI)提供发展治疗项目(DTP)(http://dtp.nci.mh.gov/branches/btb/ivclsp.himl)来筛选提交的物质以支持癌症药物发现。体外细胞系筛选项目(IVCLSP)是为DTP抗癌药物发现项目提供直接支持的专门服务并且被设计用于筛选上至每年3000化合物的潜在抗癌活性。这一筛选的运作利用60中不同的人肿瘤细胞系，代表白血病、黑瘤、肺癌、结肠癌、脑癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和肾癌。目的在于为了进一步评估优先考虑显示出选择性生长抑制作用或特定肿瘤细胞系的细胞杀死的合成化合物或天然产物样品。这一筛选独特于由给定化合物产生的60细胞系剂量响应的复杂性导致能够用于模式识别算法的生物学响应模式(COMPARE项目，参看：http://dtp.nci.nih.gov/docs/compare/compare.html)。使用这些算法，可能将推定的作用机制赋予测试化合物，或者确定响应模式是独特的并与包含在NCI数据库里的任何标准原型化合物不相似。此外，按照各种细胞分子靶在60细胞系的表征，选择最可能与特定分子靶作用的化合物是可能的。
所述筛选是两阶段过程，始于所有化合物以10μM单剂量对抗60细胞系的评估。从该单剂量筛选的结果被报告作为中间值图并且可用于使用COMPARE项目的分析。显示明显生长抑制作用的化合物被以五个浓度水平对抗60细胞系进行评估。
体外癌症筛选方法学
癌症筛选板的人肿瘤细胞系在含有5％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的RPMI1640基质中生长。对于典型的筛选试验，根据每个细胞系的倍增时间，细胞以5000到40000细胞每孔范围的平板密度被接种到100μL的96孔微升板。在细胞接种后，该微升板在加入试验药物前在37℃、5％CO2、95％空气和100％相对湿度下培养24小时。
在24小时后，每个细胞系的两个板被用三氯乙酸(TCA)原位固定，以进行在药物添加时间(Tz)对每个细胞系的细胞数目的测量。试验药物以需要的最终最大测试浓度的400倍溶于DMSO并且使用前冷冻存储。在添加药物的时候，一等份的冷冻浓缩液被解冻并且用含有50μg/ml庆大霉素(gentamicin)的完全基质稀释到两倍于需要的最终最大测试浓度。额外四倍、10倍或者1/2log的系列稀释液被制造以提供完全的五种药物浓度还有对照。这些不同药物稀释液的100μl等份被加到适当的已经含有100μl的基质的微升孔，产生需要的最终药物浓度。
随着药物的加入，所述板在37℃、5％CO2、95％空气和100％相对湿度下再培养48小时。对于贴壁细胞，测试通过添加冷的CTA终止。细胞通过温和的添加50μl冷的50％(w/v)TCA(最终浓度，10％TCA)被原位固定并且在4℃培养60分钟。除去上清液，所述板用自来水洗涤五次并且空气干燥。以0.4％(w/v)在1％乙酸中的磺酰罗丹明B(SulforhodamineB)(SRB)溶液(100μl)被添加到每个孔，并且所述板在室温培养10分钟。染色后，用1％乙酸洗涤五次移除未结合的染料并且空气干燥所述板。结合染料随后溶解于10mM的三(羟甲基)氨基甲烷，并且吸收值在515nm波长由自动板读取器读取。对于悬浮细胞，方法学是一样的除了通过温和添加50μl 80％TCA(最终浓度，16％TCA)将固定细胞固定在孔底部终止测试。使用七个吸收测量[时间0、(Tz)、控制生长、(C)、和在五种浓度水平的药物存在下的测试生长(Ti)]计算在每个药物浓度水平的生长百分比。生长抑制作用百分比如下计算：
[(Ti-Tz)/(C-Tz)]×100对于Ti>/＝Tz的浓度
[(Ti-Tz)/Tz]×100对于Ti<Tz的浓度。
对于每种实验试剂计算三种剂量响应参数。50％(GI50)的生长抑制由[(Ti-Tz)/(C-Tz)]×100＝50计算，这是导致在药物培养期间对照细胞在净蛋白增加上50％的降低(由SRB染色测得)的药物浓度。导致全生长抑制(TGI)的药物浓度由Ti＝Tz计算。LC50(与药物处理初期比较，导致在药物处理末期测量的蛋白的50％的降低的药物浓度)表示由[(Ti-Tz)/Tz]×100＝-50计算得出的在处理后细胞的净损失。如果达到活性的水平计算这三个参数的每个的值；然而，如果效果没有达到或者超过，该参数的值被表达为大于或小于最大或最小测试浓度。
对10μM化合物A的上述NCI DTP研究结果的总结在表5中给出。
表5
Figure A200780044482D00601
所述结果表明化合物A在10μM浓度对抗所述60细胞系的许多类型有广泛基础活性。显示最强抑制效果是对抗肾癌细胞系，紧随其后是前列腺癌细胞系，最弱抑制效果是对抗乳腺癌。
实施例13
抗发炎和抗血管疾病活性PHK研究
基于测试化合物对上述人原代角质形成细胞(PHKs)的效果并且按照制造商的各种研究使用的试剂盒的使用说明测定之前描述的实施例的一些化合物的抗发炎活性。虽然这些研究更典型地用于抗发炎研究，但它们同样适用于血管疾病，因为由角质形成细胞的测试结果可推断到血管内皮。
仅PHKs的MCP-1数据是剂量依赖型的，所以MCP-1的IC50能够被计算，但其他细胞因子则不能。多种化合物的MCP-1的研究结果在下面的表6中显示。
表6
 
化合物 MCP-1 IC50
 
B 2μM
F >100μM
I 25μM
J 70μM
通过MCP-1蛋白生成所测试的化合物在TNF-α-处理的PHK中的抗发炎活性的结果在表6中显示。MCP-1蛋白的IC50浓度显示出不同程度的发炎细胞因子的抑制作用。在这些测试的其他结果中，所有被测试的化合物均能以剂量依赖型的方式减少MCP-1蛋白生成。化合物B在TNF-α-处理的PHK中显示出最强的MCP-1抑制作用。
实施例14
口腔生物利用度指示性的渗透性研究
渗透性研究由本发明和申请的受让人的外界合同商完成以通过Caco-2细胞单层测定化合物A的渗透性。口服生物利用度的重要因素是化合物在小肠被吸收的能力。通过细胞单层的药物表观渗透性(Papp)的测量与人肠吸收具有很好的相关性，并且几个哺乳动物细胞系包括Caco-2、LLC-PK1和MDCK适于这一测量(阿特森，P.等，在人肠上皮(Caco-2)细胞中人口服药物吸收和表观药物渗透系数的相互关系。《生物化学和生物物理研究通讯》(Biochem Biophys Res Comm)175：880-885(1991)；斯图尔特，B.H.等，在体外和原位模型中多种肠渗透的比较：与人的吸收的关系。《药物研究》(Pharm Res)12：693(1995))。P-糖蛋白(P-gp，由MDR1编码)是ABC转运体超级家族的一员并且在人肠、肝和其他组织中表达。P-gp的肠表达可影响作为该转运体底物的药物分子的口服生物利用度。与P-gp的相互作用能够使用极化细胞系统如Caco-2细胞单层和人P-gp cDNA-表达LLC-PK1和MDCK细胞单层中药物运输的直接测试法进行研究。
Caco-2细胞(人腺癌结肠细胞系Caco-2，ATCC批号HTB-37，在段落18和45之间使用)被植于BD Falcon HTS 24-Multiwell上，1μM培养插入物(BD批号351180)(BD生物科学发现实验设备，渥本，MA，USA)。伴随每3-4天替换基质，所述细胞培养21到25天。单层完整性通过预实验跨上皮细胞电阻(TEER)测量法和实验后萤黄(LuciferYellow)A到B通量测定法进行评定。
转运缓冲剂是加入10mM HEPES(N-[-2-羟乙基]哌嗪-N’-[-2-乙磺酸])缓冲的HBSS(汉克斯平衡盐溶液)并且用NaOH调pH值至7.4。受体溶液通过将1％DMSO加至转运缓冲剂制成。测试溶液是在转运缓冲液中1％的最终DMSO浓度的化合物A的DMSO溶液。对于两种渗透性比较物化合物(50μM作为“高”的[3H]-普萘洛尔(propranolol)和50μM作为“低”的[14C]-甘露醇)以及阳性对照P-dp底物(5μM[3H]-地高辛(digoxin))的供体溶液通过稀释等份的辐射标记和非辐射标记的存储液至1％最终DMSO浓度的转运缓冲剂来制备。
测试物品以单浓度(1μM)在A到B和B到A方向测试。供体和受体溶液被添加到单层的顶点或基底腔(取决于被测量的转运的方向)。所述单层在37℃环境湿度和CO2下在环形摇床(50rpm)上培养。90分钟后，供体和受体腔的样品被取出用于分析。
为了决定样品和实验样品盘的非特异性结合的程度，所述样品溶液在上述条件下在一个24孔测试板的单孔中培养。90分钟后，样品从每个孔中取出用于分析。所有样品采集后，萤黄溶液以100μM的最终浓度被加到每个单层。插入物被置于含有转运缓冲剂的新受体板。30分钟在37℃环境湿度和CO2下在环形摇床(50rpm)上的培养后，样品被从受体腔取出用于测量萤黄通量百分数。
两种渗透性比较物化合物代表高渗透性(50μM[3H]-普萘洛尔)和低渗透性(50μM[14C]-甘露醇)在A到B的方向测试，伴随样品从供体和受体腔在90分钟的一个时间点取出。对照P-gp底物是5μM[3H]-地高辛(digoxin)在A到B和B到A方向测试，伴随样品从供体和受体腔在90分钟的一个时间点取出。复制单层在每个培养中使用。
使用与内标的峰面积比由LC/MS/MS分析样品。测试物品浓度基于峰面积比计算，所述峰面积由在转运缓冲剂中含有标称浓度的测试物品的供体溶液的适当的稀释液获得。样品适当地稀释以保证响应在质量检测器的线性范围内。比较物和对照样品由液相闪烁计数分析。萤黄浓度使用荧光板读取器测定。
预实验跨上皮细胞电阻(TEER)测量(中间值411Ωcm2)和实验后萤黄A到B通量(中间值0.1％)确认了单层完整性。阳性对照地高辛的极化确认了功能性P-gp转运模型。渗透比较物甘露醇和普萘洛尔的Papp值(中间值，对于甘露醇4.1×10-7±SD2.4×10-7，对于普萘洛尔1.5×10-5±4.2×10-5)在该测试系统的测试设施中观察到的历史范围内，这表明合适的功能模式。
渗透比较物甘露醇和普萘洛尔以及阳性对照P-gp底物地高辛的结果在下面表7中报道。
表7
Figure A200780044482D00631
n.d.-未检测
获得的在Caco-2细胞单层中测试化合物的双向渗透数据以及极化比在表8中报道。
表8
化合物A从顶点和基底腔(质量平衡)以及在培养的最后从没有细胞(非特异性结合)的24孔培养板的单孔的回收在表9中报道。
表9
Figure A200780044482D00641
*>100％的质量平衡/回收值典型地归结于在培养过程中升高的溶解性。
结论
结果非常具有鼓舞性。在Caco-2细胞单层的透过性研究作为肠吸收体外模型证明了化合物A属于由BCS透过性分类体系测定的中等级别。
单层TEER结果以及实验后萤黄通量结果表明通过整个实验功能型细胞单层的存在。P-gp转运阳性对照，地高辛，显示极化转运(极化率5.4，表7)表明合适的功能性测试体系。
质量平衡和非特异性结合测定实验显示化合物A被结合在塑料板和/或细胞到可能已经减少可用于扩散和转运的化合物的数量的程度。结果，表观Papp值和导致的极化率(表8)可低估化合物A的渗透性并且在将它划至BCS渗透性等级如表10所示时应该伴有警告使用。
表10
 
渗透性等级 人体吸收[4] Papp(cm/sec)
低 <50％ ≤甘露醇
中 50-89％ >甘露醇并且<普萘洛尔
高 ≥90％ ≥普萘洛尔
观察到的化合物A的A-B渗透性在那些观察到的甘露醇和普萘洛尔的A-B渗透性之间。基于BCS渗透性等级(表10)，化合物A应被视为中度渗透性的化合物。
化合物A显示出0.1-0.2的极化比，表明该化合物A-B渗透性超过B-A渗透性。这一发现与P-gp介导的B-A外向通量相悖，并且表明涉及了由转运体而非P-gp的主动的A-B通量。
上述研究证明了本发明的NDGA衍生物的代表性化合物是有用的药用化合物。
本领域的技术人员可以意识到在未离开本发明广泛的发明概念下能够做出对上述实施例的改变。因此，应被理解的是本发明不限于公开的特定实施例而应覆盖附加的权利要求限定的本发明的主旨和范围内的变化。
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Claims (8)

1.一种去甲二氢化愈创木酸(NDGA)衍生化合物，它具有下面的通式结构(式IV)，以及它的药学上可用的盐：
Figure A200780044482C00021
式IV
其中X选自由下面基团构成的组：
-A-R；
-(CH2)xHal，其中x是1到10的整数，并且Hal是卤原子，和
-(CH2CH2O)yH，，其中y是1到10的整数；和
一种氨基甲酸酯键合的基团，所述基团选自由下列基团构成的组：
Figure A200780044482C00022
和
Figure A200780044482C00023
其中n是1到6的整数，Z1是有2-6个碳和任选地有1-3个卤原子的饱和线性烃链，Z2是一个5到7元环，它任选地包括0-3个双键并且任选地包括1-3个O、N和S中任意一种原子，和Z3是甲基或乙基；
当X是-A-R时，R是端基并且A是线性饱和烃侧链，所述侧链在一端通过一个醚键或氨基甲酸酯键键合在各自的羟基残余的O基团上，并且在另一端键合到R端基的一个碳或杂原子上；
其中所述侧链A选自由下列基团构成的组：
C2-C16线性饱和烃链，它任选地具有1-5个杂原子，所述杂原子选自O、N和S，并且它通过一个醚键键合到NDGA的各自羟基残余O基团上；以及
1-5个单元的聚乙二醇(PEG)链；
其中R选自由下列基团构成的组：
一个5到7元碳环，所述碳环选自由下列基团构成的组：有1到3个N、O或S杂原子的一个完全饱和环；一个含有1到3个N、O或S杂原子的具有1到3个双键的环；包含一个氨基甲酸酯键、脲键、碳酸酯键或酰胺键的环；和一个水溶性基团，所述基团选自由下列基团构成的组：磺酸的一种碱金属盐；膦酸的一种碱金属盐；一种药学上可用的盐；一种糖和一种多羟基基团；并且
其中当X是
Figure A200780044482C00031
或
Figure A200780044482C00032
时，a是3到16的一个整数，并且b是4到16的一个整数。
2.一种组合物，包括权利要求1的NDGA衍生物和一种药学上可用的载体，任选地包括其它药学上可用的赋形剂。
3.一种向受治疗者给药的方法，用预防或者治疗病毒感染的有效量的权利要求1的NDGA衍生物单独地或者作为一种药物组合物的一部分给药。
4.一种向受治疗者给药的方法，用预防或者治疗增殖疾病的有效量的权利要求1的NDGA衍生物单独地或者作为一种药物组合物的一部分给药。
5.一种向受治疗者给药的方法，用预防或者治疗发炎性疾病的有效量的权利要求1的NDGA衍生物单独地或者作为一种药物组合物的一部分给药。
6.一种向受治疗者给药的方法，用预防或者治疗代谢性疾病的有效量的权利要求1的NDGA衍生物单独地或者作为一种药物组合物的一部分给药。
7.一种向受治疗者给药的方法，用预防或者治疗血管疾病的有效量的权利要求1的NDGA衍生物单独地或者作为一种药物组合物的一部分给药。
8.一种药剂盒，所述药剂盒包括含有权利要求1的NDGA衍生物的一种药物组合物和关于它的预防性地或治疗性地用于病毒感染、增殖性疾病、发炎性疾病、代谢性疾病和血管疾病的至少一种的使用说明。
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