CN101543625A - Cenp-e结合蛋白及其编码基因在制备抑制肿瘤增殖药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了CENP－E结合蛋白及其编码基因在制备抑制肿瘤增殖药物中的应用。实验证明，CENP－E结合蛋白通过与CENP－E和微管的相互作用参与细胞有丝分裂的纺锤体检查点信号转导途径，可以作为抑制肿瘤细胞增殖药物的药靶，CENP－E结合蛋白及其编码基因将在医学及制药领域发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

CENP-E结合蛋白及其编码基因在制备抑制肿瘤增殖药物中的应用

本申请是申请号为200710063865.2、申请日为2007年2月13日、发明创造名称为“一个CENP-E结合蛋白及其编码基因与应用”的分案申请。

技术领域

本发明涉及CENP-E结合蛋白及其编码基因在制备抑制肿瘤增殖药物中的应用。

背景技术

细胞精确地自我复制是其生活史的重要组成部分，复制的高保真性在生物及物种的繁衍生息过程中举足轻重。在细胞复制的过程中，包含在染色体中的父代遗传信息在经历了诸多复杂的运动之后均等、准确地传递给两个子细胞。细胞周期事件是高度有序进行的，保证细胞周期有条不紊行进的生化调控道路被称为“检验点”(checkpoint)。

动点是位于着丝粒上的多组份蛋白质复合结构，它不仅直接维系纺锤体丝与染色体的衔接，同时要调控染色体运动及染色体分离的时空序列性及保真性，此信号通路被称为“纺锤体检验点”(spindle checkpoint)。纺锤体检验点失控可导致细胞复制过程中非整倍体及染色体不稳定性的产生，并可能参与肿瘤的发生与发展。但迄今为止，纺锤体检验点信号通路的蛋白质作用网络及其信息流传递的分子机制仍不清楚。

动点马达蛋白CENP-E(centromere associated protein E)是一个分子量为312kD的动点蛋白，包含一个位于N端的与驱动蛋白类似的马达域和包含2069个氨基酸残基的coiled-coil结合域。人源CENP-E总长为2701个氨基酸残基(薛宇等，2006.哺乳动物驱动蛋白的计算基因组学分析与鉴定.科学通报，51：1654-1665)。CENP-E是一个直接负责动点对纺锤体微管捕获的马达蛋白，它与其它纺锤体检查点蛋白一起协调细胞有丝分裂的进行(Yao et al.，2000.CENP-E forms a link betweenattachment of spindle microtubules to kinetochores and the mitoticcheckpoint.Nature cell Biology.NCB.2：484-491)。CENP-E的缺失使纺锤体检验点失活，产生染色体不稳定性(Weaver et al.，2007.Aneuploidy acts bothoncogenically and as a tumor suppressor.Cancer Cell.11：25-36.)。因此，寻找纺锤体检验点调控蛋白及CENP-E结合蛋白是一项非常有意义的研究工作。

发明内容

本发明的目的是提供一个调控染色体运动的动点马达蛋白CENP-E的结合蛋白。

本发明所提供的CENP-E结合蛋白，名称为CENP-V，其基因来源于人睾丸细胞，是下述氨基酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与CENP-E蛋白结合对细胞有丝分裂的行进具有调控功能的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO：1由523个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第64-179位氨基酸残基为典型的亮氨酸富集域，自N端第208-342位及第504-517位氨基酸残基为coiled-coil结构域。

所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。

编码上述CENP-E结合蛋白CENP-V的基因(CENP-V)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸序列；

3)与序列表中SEQ ID NO：2限定的DNA序列具有90％以上同源性且与CENP-E蛋白结合对细胞有丝分裂的行进具有调控功能的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％ SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID NO：2由1572个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1569位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’端第192-537位碱基编码亮氨酸富集域，自5’端第624-1026位碱基和第1512-1551位碱基编码Coiled-coil结构域。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增CENP-V中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种抑制CENP-V基因表达的方法。

本发明所提供的抑制CENP-V基因表达的方法，是将抑制CENP-V基因表达的小干扰RNA或其编码基因导入宿主，CENP-V基因的表达被抑制。

所述抑制CENP-V基因表达的小干扰RNA，可为正义链为序列表中的序列3，反义链为序列表中的序列4的双链RNA序列。

将双链RNA序列命名为CENP-V siRNA。CENP-V siRNA的反义链与CENP-V mRNA(GenBank号：BC050665.)距离CENP-V cDNA起始密码子ATG 965-990位置序列5’-gcaagauugccaaauucgaggagaa-3’互补，序列表中SEQ ID NO：3由25个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端，序列表中SEQ ID NO：4由25个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端。

上述抑制CENP-V基因表达的小干扰RNA的编码基因可为：有义链(正义链)(不做模板的DNA链)具有序列表中序列5的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；反义链(做模板的DNA链)具有序列表中序列6的核苷酸序列或在高严谨条件下可与序列表中序列6限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％ SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

上述具有双链寡核苷酸序列编码基因命名为CENP-V siDNA，编码CENP-V siRNA。序列表中序列5由25个碱基组成，序列的方向从左至右为5′端→3′端；序列表中序列6由25个碱基组成，序列的方向从左至右为3′端→5′端。

本发明提供了一个与CENP-E相互作用的动点蛋白，它在有丝分裂的早期与CENP-E共定位于动点，到中期染色体在赤道板上正确排列后离开动点并移往中心体，末期定位到中体，由于该蛋白和CENP-E直接相互作用于动点，因此将其命名为CENP-V。CENP-V呈细胞周期依赖性表达，在有丝分裂中期表达量最高，此外，电镜观测结果表明CENP-V在核膜破裂后，定位到染色体动点的最外层，在染色体被捕获直到染色体在赤道板上正确排列的过程中，CENP-V分布于纤维冠状层上。CENP-V的coiled-coil区域后200个氨基酸残基负责其动点定位及与CENP-E的相互作用。微管共沉降实验证实CENP-V是一种与微管直接相作用的蛋白，并通过CENP-V的氨基端(N端)与微管相互作用。利用RNAi敲除技术抑制CENP-V基因的表达的实验结果表明，敲除CENP-V基因可以引起染色体的错误分离，并降低姐妹染色体的张力。实时活细胞监测结果表明，敲除CENP-V基因可以引起细胞周期的阻滞。上述实验结果表明，本发明的CENP-V是一个动点蛋白，通过与CENP-E和微管的相互作用参与细胞有丝分裂的纺锤体检查点信号转导途径，可以其作为制备抑制肿瘤细胞增殖药物的药靶，本发明的蛋白及其编码基因将在医学及制药领域发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为CENP-V氨基酸序列的同源性比对结果

图2为CENP-V氨基酸序列的结构域分析结果

图3A为CENP-V的细胞周期性表达方式的Wester Blot检测结果

图3B为流式细胞仪检测各个时期细胞所占的比例

图4A-图4B为CENP-V全长抗体对内源性CENP-V定位的免疫荧光检测结果

图4C为CENP-V抗体对内源性CENP-V结合特异性的Western Blot检测结果

图5A为CENP-V与CENP-E^2132-2701之间的相互作用的体外pull-down检测结果

图5B-图5C为CENP-V的9段deletions与GST-CENP-E^2132-2701融合蛋白相互作用的检测结果

图5D为CENP-V及CENP-E相互作用区域的鉴定结果

图6A-图6B为CENP-V与微管相互作用及区域的鉴定结果

图7为CENP-V基因siRNA对CENP-V基因在细胞内表达的抑制作用的检测结果以及CENP-V敲除后引起细胞周期阻滞的检测结果

图8为敲除CENP-V后对细胞周期影响的活细胞观察结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物及DNA序列均由上海生工合成。

实施例1、CENP-E结合蛋白CENP-V基因的获得

提取人睾丸组织的总RNA，反转录合成其cDNA并以此为模板，在引物CENP-VF(上游引物)：5’-ATGAACCAGCCGTGCAACTCGATGGAG-3’和CENP-VR(下游引物)：5’-CTAGTCTAGGATGTCGCCACATTCCAG-3’的引导下，PCR扩增野生型人CENP-E结合蛋白CENP-V基因。反应结束后，将PCR扩增产物连接入载体pMD 18-T(TaKaRa公司)中，再将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，得到含有目的片段的重组质粒，命名为pGEM-CENP-V，对其进行测序，测序结果表明野生型人CENP-V基因具有序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列，序列表中的SEQ IDNO：2由1572个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1569位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’端第192-537位碱基编码亮氨酸富集域，自5’端第624-1026位碱基和第1512-1551位碱基编码Coiled-coil结构域。对上述来源于人的CENP-E结合蛋白CENP-V的氨基酸残基序列分别与来源于果蝇、小鼠和大鼠的CENP-V的氨基酸残基序列进行序列比对分析，结果如图1所示(Hs为本发明的CENP-V序列，Mm为小鼠的CENP-V序列，Rn为的大鼠的CENP-V序列，Dm为果蝇的CENP-V序列)，表明CENP-V是一个高度保守的蛋白质。同时，对本发明CENP-E的结合蛋白CENP-V的氨基酸残基序列进行结构域分析，分析结果如图2所示，自氨基端(N端)第64-179位氨基酸残基为典型的亮氨酸富集域，自N端第208-342位及第504-517位氨基酸残基为coiled-coil结构域。

实施例2、CENP-V在细胞内周期性表达的检测

一、野生型CENP-V基因真核表达载体的构建

用限制性内切酶EcoR I和Xho I对含有野生型CENP-V基因的重组质粒pGEM-CENP-V进行双酶切，回收并纯化1572bp的目的基因片段，再将其连入载体pEGF-C1(Clontech公司)中，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，得到野生型CENP-V基因的真核表达载体，命名为pEGF-CENP-V。

二、稳定表达CENP-V的细胞株的构建及其周期性表达检测

1、稳定表达CENP-V的细胞株的构建

将步骤一获得的野生型CENP-V基因的真核表达质粒用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染Hela细胞，再将转染细胞在37℃、5％ CO₂下培养于添加10％ FBS的DMEM培养基(美国Gibco公司)中，然后加入0.5mg/mL G418进行筛选，待细胞形成克隆以后，挑取带有荧光的单克隆进行培养，从而得到稳定表达CENP-V的细胞株。为收集G1、S、G2、M各个不同时期的细胞，向细胞密度为50％的培养基中加入thymidine(购自Sigma公司)至终浓度为2.5mM，12小时后弃去培养基，用PBS洗3遍，然后加入新鲜的培养基，10小时后，再次向培养基中加入同样浓度的thymidine，继续培养12小时收集G1/S期细胞。为了收集G1/S释放后不同时期的细胞，将G1/S期的细胞用PBS洗3遍，以洗去thymidine，然后加入新鲜的培养基继续培养不同时间后收集细胞，得到处于不同时期的转染细胞。

2、稳定表达CENP-V细胞株的周期性表达检测

用细胞裂解液(150mM NaCl，40mM HEPES[pH7.4]，1％ triton X-100，1mM MgCl₂，1mM EGTA，1mM PMSF，10μg/mL亮抑霉肽，胃蛋白酶A，抑肽酶)裂解步骤1获得的不同时期的转染细胞，然后用4℃离心机12000rpm离心15分钟，将不同时期(0、2、4、8、12小时)的转染细胞的裂解液上清和纯化的GST-CENP-E融合蛋白(购自Sigma公司)在4℃下孵育4小时，然后用细胞裂解液冲洗GST亲和树脂4次后使用加样缓冲液(2×加样缓冲液：100mM Tris·HCl(pH6.8)，200mM二硫苏糖醇，4％SDS(电泳级)，0.2％溴酚蓝，20％甘油)重悬树脂，将样品在100℃下煮10分钟后进行10％SDS-PAGE分离蛋白样品，并转移至硝酸纤维素膜上，然后分别使用GFP的单克隆抗体(BD Bioscience公司)、tubulin单克隆抗体(Sigma公司)和CyclinB(Sigma公司)进行Westen Blot检测，检测结果图3A所示(Iner表示：有丝分裂间期，Meta至Meta+12表示：从有丝分裂中期开始0、2、4、8、12小时不同时期的转染细胞)，结果显示CENP-V在有丝分裂中期表达量最高，表明CENP-V的表达是细胞周期依赖性的，图3B(2N代表：单倍体细胞，4N代表：双倍体细胞)为用流式细胞仪检测图3A中不同时期所取样品对应的细胞周期分布情况，表明CENP-V蛋白的表达规律呈细胞周期依赖性并在有丝分裂中期表达量最高。

实施例3、CENP-V的细胞周期性定位及CENP-V的抗体检测

一、CENP-V抗体的制备

1、制备抗原

将CENP-V全长氨基酸残基的编码序列连接入HIS表达载体pET28a(Invitrogen公司)中，将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将转化细胞接种于含100mg/L卡那霉素的LB抗性平板上进行筛选，挑取长出的单克隆，将其接种到5mL LB液体培养基中，在37℃下摇菌12-18小时，然后按1：100的比例接种于500mL LB液体培养基中，在37℃、250rpm下振荡培养，待其600nm的OD值达0.6时，加入0.2mg/LIPTG，于37℃诱导3小时。培养结束后，离心收集菌体，重悬于PBS后，使用压力破碎仪裂解细胞，同时加入蛋白酶抑制剂PMSF(购自Bio Basic Inc.公司)，然后使用高速低温冷冻离心机，12000rpm离心30分钟，弃沉淀，对上清进行纯化，得到CENP-V的全长蛋白。

2、CENP-V抗体的制备

使用步骤1表达的CENP-V全长蛋白和含CENP-V末端13个氨基酸残基(第446-458位)的多肽分别作为抗原免疫云南昆明小鼠及Balb/C小鼠制备抗体，免疫方案为：每次10μg，分三次进行免疫，每次间隔21天。

3、CENP-V抗体的检测

末次免疫后20天，取上述步骤2中经免疫的云南昆明小鼠的血清用Western Blot法检测其对实施例2获得的转染细胞内表达的CENP-V的识别情况，以GFP的单克隆抗体为对照，检测结果如图4C所示(泳道1：用CENP-V抗体检测转染的Hela细胞裂解液；泳道2：用CENP-V抗体检测CENP-V-GFP转染的Hela细胞裂解液；泳道3：用GFP抗体检测Hela细胞裂解液；泳道4：用GFP抗体检测CENP-V-GFP转染的Hela细胞裂解液。)，表明免疫血清能特异的识别大约57KD的CENP-V条带。对血清进行纯化，得到CENP-V多肽抗体和CENP-V重组蛋白抗体血清。

二、CENP-V抗体对内源性CENP-V定位的免疫荧光检测

弃去实施例2培养有稳定表达CENP-V细胞株的培养皿中的培养基，用PBS缓冲液洗一遍，弃去溶液，用PHEM缓冲液洗一分钟。然后用含有0.1％ Triton X-100的PHEM缓冲液处理一分钟以使细胞膜穿孔将细胞质内可溶性的蛋白质渗透出来。在有些情况下，溶液中包含5μM Taxol(Sigma Chemical Co.)以减少在抽提过程中的微管解聚。PHEM(100mM PIPES，20mM HEPES(pH6.9)，5mM EGTA，2mM MgCl₂，4M glycerol)。用4％新鲜配制的多聚甲醛(溶解于PHEM或PBS中)固定细胞，然后用PBS缓冲液洗三遍。用1％ BSA(溶解于TBST缓冲液)在室温下封闭盖玻片30分钟。用适当稀释的一抗(CENP-V重组蛋白抗体血清)在室温孵育细胞/盖玻片90分钟。加200μl 1％ BSA(溶解于TBST缓冲液)至盖玻片上以洗去非特异性结合的抗体，每次5分钟。将带有FITC标记的抗鼠抗体作为二抗(购自Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.)加在盖玻片上，室温孵育45分钟。滴加200μl 1％ BSA(溶解于TBST缓冲液)至盖玻片上以洗去非特异性结合的第二抗体，每次5分钟。用DAPI染盖玻片一分钟。用200μl PBS洗涤两次，每次5分钟在载玻片上加适量(5μl)的荧光抗淬灭封片剂，封片。在荧光倒置显微镜下观察，并拍照(Axiovert 200荧光倒置显微镜为Zeiss公司产品；相机为AxioCam CCD相机，采集图象的软件为AxioVision 3.0)。结果如图4A和图4B所示(图中，CENP-E表示马达动点蛋白CENP-E，CENP-V表示用步骤2所得到的CENP-V抗体染色的CENP-V，DAPI表示细胞的染色体，Merge表示将上述三种颜色的通道融合结果)，图4A说明CENP-V与CENP-E有共定位且定位于动点，表明CENP-V是一个动点蛋白；图4B说明到有丝分裂中后期姐妹染色体分离时，CENP-V从动点上下来。

实施例4、CENP-V及CENP-E相互作用区域的鉴定

一、CENP-E^2132-2701基因的原核表达及表达产物的纯化

人工合成野生型CENP-E基因自5’端第2132-2701位碱基序列(简称CENP-E^2132-2701基因)，先用限制性内切酶BamH I对CENP-E^2132-2701基因进行单酶切，然后将其连接入载体pGEX-6P-1(Amershanm.Biosciences公司)中，将连接产物转染大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将转化细胞接种于含100mg/L氨苄青霉素的LB抗性平板上进行筛选，挑取长出的单克隆，将其接种到5mL LB液体培养基中，在37℃下摇菌12-24小时，然后按1：100的比例接种于500mL LB液体培养基中，在37℃、250rpm下振荡培养，待其560nm的OD值达0.6时，加入0.2mg/L IPTG，于37℃诱导3小时。培养结束后，离心收集菌体，重悬于PBS(J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，1998，科学出版社，p927)后，使用压力破碎仪裂解细胞，同时加入蛋白酶抑制剂PMSF(BioBasic Inc.公司)，然后使用高速低温冷冻离心机，12000rpm离心30分钟，弃沉淀，将上清与GST亲和树脂(Novagen公司)在4℃下孵育1小时后，用PBS冲洗树脂。取上清，树脂及沉淀用10％ SDS-PAGE检测表达蛋白的纯化效果，检测结果表明获得了纯度较高的约90KD的GST-CENP-E^2132-2701融合蛋白。

二、CENP-V基因的原核表达及表达产物的纯化

先用限制性内切酶EcoR I和Xho I对含有野生型CENP-V基因的质粒pGEM-CENP-V进行双酶切，回收并纯化约1572bp的CENP-V基因片段，然后将其连接入载体pET28a(Novagen公司)中，将连接产物转染大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将转化细胞接种于含100mg/L卡那霉素的LB抗性平板上进行筛选，挑取长出的单克隆，将其接种到5mL LB液体培养基中，在37℃下摇菌12-24小时，然后按1：100的比例接种于500mL LB液体培养基中，在37℃、250rpm下振荡培养，待其560nm的OD值达0.6时，加入0.2mg/L IPTG，于37℃诱导3小时。培养结束后，离心收集菌体，重悬于PBS(J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，1998，科学出版社，p927)后，使用压力破碎仪裂解细胞，同时加入蛋白酶抑制剂PMSF(Bio Basic Inc.公司)，然后使用高速低温冷冻离心机，12000rpm离心30分钟，弃沉淀，将上清与与Bio-Rad柱中的镍树脂4℃孵育1h。用5倍体积的Wash buffer I(50mM NaH₂PO₄，pH8.0；300mMNaCl；20mM咪唑)和II(50mM NaH₂PO₄，pH8.0；300mM NaCl；40mM咪唑)分别洗柱子并收集。用0.5mL Elution buffer(50mM NaH₂PO₄，pH8.0；300mM NaCl；200mM咪唑)洗四次并收集，再重复四次，得到纯度较高的HIS-CENP-V融合蛋白。

三、体外pull-down检测CENP-V与CENP-E^2132-2701之间的相互作用

在两个Eppendorf管中分别加入10μl结合GST蛋白GST树脂和等量的结合GST-CENP-E^2132-2701融合蛋白的GST树脂，再在两个Eppendorf管中加入等量的步骤二中纯化的HIS-CENP-V融合蛋白，4℃混匀仪2h，然后4℃、12000rpm离心0.5min，将上清转移到新的Eppendorf管中，待做电泳分析。用1mL冰预冷的裂解液(50mM NaH₂PO₄，pH8.0；300mM NaCl)悬浮树脂，4℃、12000rpm离心0.5min，重复三次，加入2×电泳上样缓冲液50μl，100℃煮样品3分钟，进行电泳并用考马斯亮蓝染色，电泳图谱如图5A所示(泳道1：纯化的GST-CENP-E^2132-2701；泳道2：pull-down前HIS-CENP-V；泳道3：pull-down后反应体系中的HIS-CENP-V；泳道4：pull-down的电泳条带；泳道5：用GST蛋白进行pull-down的结果)，表明CENP-V可以和CENP-E^2132-2701在体外直接相互作用。

四、CENP-V的9段deletions的真核表达

根据CENP-V基因，构建9段不同长度的缺失突变体基因(deletions)，分别为自5’端第1-900位碱基(编码自N端第1-300位氨基酸残基，将该片段命名为D1)、第900-1569位碱基(编码自N端第300-523位氨基酸残基，命名为D2)、第1-726位碱基(编码自N端第1-242位氨基酸残基，命名为D3)、第624-726位碱基(编码自N端第208-242位氨基酸残基，命名为D4)、第624-1326位碱基(编码自N端第208-442位氨基酸残基，命名为D5)、第726-1326位碱基(编码自N端第242-442位氨基酸残基，命名为D6)、第624-1374位碱基(编码自N端第208-458位氨基酸残基，命名为D7)、第624-1569位碱基(编码自N端第208-523位氨基酸残基，命名为D8)、第1-624位碱基(编码自N端第1-208位氨基酸残基，命名为D9)，构建方法为：以CENP-V基因为模板，分别在下述引物的引导下进行PCR扩增，得到上述9个缺失片段。

D1：5’-ATGGCCAGCCGTGCAACTCGATGGAG-3’

    5’-TGTTTTCCGCTTCTCCTGCTGTTTCAG-3’；

D2：5’-ATGGAGAAGCGGAAAACAGAGCTTGACACC-3’

    5’-CTAGTCTAGGATGTCGCCACATTCCAG-3’；

D3：5’-ATGAACCAGCCGTGCAACTCGATGGAG-3’

    5’-TTCCACAAACGCAGTCTTGTGCTTCT-3’；

D4：5’-ATGGACCACACAAAAAAGCTTGCGGAG-3’

    5’-TTCCACAAACGCAGTCTTGTGCTTCT-3’；

D5：5’-ATGGACCACACAAAAAAGCTTGCGGAG-3’

    5’-CGCGCGCAGGTCGTTAGG-3’；

D6：5’-ATGCACCTGAATGGCTCCTTCCTG-3’

    5’-CGCGCGCAGGTCGTTAGG-3’；

D7：5’-ATGGACCACACAAAAAAGCTTGCGGAG-3’

    5’-GATGTCGTGCGATGCCCCGAC-3’；

D8：5’-ATGGACCACACAAAAAAGCTTGCGGAG-3’

    5’-TGTTTTCCGCTTCTCCTGCTGTTTCAG-3’

D9：5’-ATGGCCAGCCGTGCAACTCGATGGAG-3’

    5’-GCTGTACTGGTGCTTAGCCTCCGC-3’。

然后将9段deletions分别构建到带有GFP标签的载体pEGF-C1(Clontech公司)中，将连接产物转染大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性单克隆，提质粒，将9种质粒分别用Lipofectamine 2000试剂转染人胚肾成纤维293T细胞，在37℃下培养于添加10％ FCS的DMEM培养基中使缺失基因在细胞内表达。

五、表达蛋白的相互作用的检测

将步骤四的9种转染细胞培养24小时后，收集培养细胞，用细胞裂解液在冰上裂解转染的293T细胞，4℃、12000rpm离心15分钟，收集上清。同时将它们分别与步骤一中表达的GST-CENP-E^2132-2701融合蛋白树脂在4℃下50rpm振荡孵育4小时后，用细胞裂解液洗三次，用预冷的PBS洗二次，随后，加入2×电泳上样缓冲液50μl，100℃煮样品3分钟，进行10％SDS-PAGE电泳并用考马斯亮蓝染色，电泳图谱如图5B(泳道D1-D9分别代表带有GFP-tagged的D1-D9转染Hela细胞以后的细胞裂解液用GFP的抗体进行检测的结果)和图5C(泳道D1-D9分别为带有GFP-tagged的D1-D9转染Hela细胞以后的细胞裂解液用GST-CENP-E^2132-2701融合蛋白树脂行pull-down用GFP抗体进行检测的结果)所示，表明D6与GST-CENP-E^2132-2701相互作用最强，表明D6即CENP-V的第242-442位氨基酸残基负责与CENP-E的相互作用。

六、酵母双杂交检测CENP-E与CENP-V作用的最小区域

根据CENP-E基因自5’端第2132-2701位碱基(CENP-E^2132-2701)，构建6段不同长度的缺失突变体基因(deletions)，分别为自5’端第6393-8103位碱基(编码自N端第2131-2701位氨基酸残基，将该片段命名为CENP-E570aa)、第6474-8103位碱基(编码自N端第2158-2701位氨基酸残基，命名为CENP-E534aa)、第7293-8103位碱基(编码自N端第2431-2701位氨基酸残基，命名为CENP-E5270aa)、第7593-8103位碱基编码自N端第2531-2701位氨基酸残基，命名为CENP-E170aa)、第7893-8103位碱基(编码自N端第2631-2701位氨基酸残基，命名为CENP-E70aa)和第6474-7893位碱基(编码自N端第2158-2631位氨基酸残基，命名为CENP-E^2158-2631aa)，构建方法为：以CENP-E基因为模板，分别在下述引物的引导下进行PCR扩增，得到上述6个缺失片段。

CENP-E570aa：

   5’-ATGAAAGAGCTTTCAATGAGAGTTAAA-3’

   5’-CTACTGAGTTTTGCACTCAGGCACACC-3’；

CENP-E534aa：

   5’-ATGAGAATCATGAAGAAACTGAAG-3’

   5’-CTACTGAGTTTTGCACTCAGGCACACC-3’；

CENP-E270aa：

   5’-ATGATTCAAGTACTTCAGGACAAAGTT-3’

   5’-CTACTGAGTTTTGCACTCAGGCACACC-3’；

CENP-E170aa：

   5’-ATGGGTGGCAGCGGCATTGTACAAAAC-3’

   5’-CTACTGAGTTTTGCACTCAGGCACACC-3’；

CENP-E70aa：

   5’-ATGTCAAAGTCTTTACCATCACCT-3’

   5’-CTACTGAGTTTTGCACTCAGGCACACC-3’；

CENP-E^2158-2631aa：

   5’-ATGAGAATCATGAAGAAACTGAAG-3’

   5’-TCGGCTATCAAAAAAACAAGATT-3’。

然后将上述缺失片段分别连接入酵母表达载体pGBKT7(Clontech公司)中，得到含有上述CENP-E^2132-2701不同缺失片段的重组酵母表达载体，同时，将CENP-V基因也连接入载体pGAKT7中，得到含有CENP-V基因的重组酵母表达载体，再将上述CENP-E^2132-2701不同缺失片段的重组酵母表达载体分别与含有CENP-V基因的重组酵母表达载体共同转化酵母菌株AH109，在30℃下培养于Leu^-/Trp^-/His^-/Ade^-培养基(购自Sigma公司)上，结果如图5D所示(1为CENP-E570aa-pGBKT7与CENP-V-pGAKT7共转酵母菌株AH109，2为CENP-E534aa-pGBKT7与CENP-V-pGAKT7共转酵母菌株AH109，3为CENP-E5270aa-pGBKT7与CENP-V-pGAKT7共转酵母菌株AH109，4为CENP-E170aa-pGBKT7与CENP-V-pGAKT7共转酵母菌株AH109，5为CENP-E70aa-pGBKT7与CENP-V-pGAKT7共转酵母菌株AH109，6为CENP-E^2158-2631aa-pGBKT7与CENP-V-pGAKT7共转酵母菌株AH109)，转化有CENP-E基因自5’端第2131-2701位和第2158-2701位碱基的缺失突变体基因的重组酵母可以生长，且Lac Z Pheno染色结果为蓝色，表明CENP-E与CENP-V相互作用的具体区域为CENP-V的coiled-coil区域后200个氨基酸残基，该区域负责其动点定位及与CENP-E的相互作用。

实施例6、CENP-V与微管相互作用及区域鉴定

一、CENP-E结合蛋白CENP-V及其三段deletions的原核表达载体的构建

用限制性内切酶EcoR I和Xho I对含有野生型人CENP-V基因的重组质粒pGEM-CENP-V进行双酶切，回收并纯化1572bp的目的基因片段，再将其连入载体pGEX-6P-1(Amershanm.Biosciences公司)中，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化细胞接种于含100mg/L卡那霉素的LB抗性平板上进行筛选，挑取长出的阳性单克隆，提质粒，测序，测序结果表明得到了序列及插入位置均正确的野生型CENP-V基因的原核表达载体，命名为pGEX-CENP-V。同时，将CENP-V基因的3段不同长度的缺失突变体基因(deletions)，分别为自5’端第1-900位碱基(编码自N端第1-300位氨基酸残基)、第900-1569位碱基(编码自N端第300-523位氨基酸残基)和第624-900位碱基(编码自N端第208-300位氨基酸残基)也连入载体体pGEX-6P-1中，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化细胞接种于含100mg/L卡那霉素的LB抗性平板上进行筛选，挑取长出的阳性单克隆，提质粒，测序，测序结果表明得到了序列及插入位置均正确的含有三个不同CENP-V缺失突变体基因的原核表达载体，分别命名为NO-300、C301-523和M208-300。

二、CENP-E结合蛋白CENP-V及其三段deletions的原核表达及表达产物的纯化

将步骤一获得的分别转化有CENP-V基因及其三段deletions基因的重组菌接种到5mL LB液体培养基中，在37℃下摇菌12-18小时，然后按1：100的比例接种于500mL LB液体培养基中，在37℃、250rpm下振荡培养，待其560nm的OD值达0.6时，加入0.2mg/L IPTG，于37℃诱导3小时。培养结束后，离心收集菌体，重悬于PBS(J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，1998，科学出版社，p927)后，使用压力破碎仪裂解细胞，同时加入蛋白酶抑制剂PMSF(Bio Basic Inc.公司)，然后使用高速低温冷冻离心机，12000rpm离心30分钟，弃沉淀，将上清与与Bio-Rad柱中的镍树脂4℃孵育1h，再用5倍体积的Wash buffer I(50mM NaH₂PO₄，pH8.0；300mM NaCl；20mM咪唑)和II(50mM NaH₂PO₄，pH8.0；300mM NaCl；40mM咪唑)分别洗柱子并收集，最后用0.5mL Elution buffer(50mM NaH₂PO₄，pH8.0；300mM NaCl；200mM咪唑)洗四次并收集，重复四次，得到纯化的CENP-V蛋白及其三段deletions重组蛋白。

二、体外微管共沉淀试验

取出冻存在-80℃的微管蛋白tubulin，冰上融化，4℃、90Krpm(Beckman，TLA-100)超高速离心5min，以去除聚集、变性的Tubulin，再将2ug Tubulin融解在10ul PEMGbuffer(80mM Pipes，1mM EGTA，1mM MgCl₂，20％ Glycerol)中并加入GTP、DTT使终浓度均为1mM，然后37℃水浴孵育15min，再在以上聚合好的微管体系中分别加入待分析的步骤一获得的CENP-V蛋白(以用带有His-tagged的prc1蛋白和带有His-tagged的GFP蛋白为对照)及其三段deletions重组蛋白，在32℃下水浴15min，然后32℃、90Krpm(Beckman，TLA-100)超高速离心5min，分别取出上清以及沉淀进行电泳检测，电泳图谱如图6A(His-Prc表示带有His-tagged的prc1蛋白，His-CENP-V表示带有His-tagged的CENP-V蛋白，His-GFP表示带有His-tagged的GFP蛋白；S表示微管共沉淀反应的上清，P表示微管共沉淀反应的沉淀)和图6B(N1-300表示CENP-V的1-300aa的一段缺失突变体，C301-523表示CENP-V的301-523aa的一段缺失突变体，M208-300表示CENP-V的208-300aa的一段缺失突变体；S表示微管共沉淀反应的上清，P表示微管共沉淀反应的沉淀；“+”号表示反应体系中加入微管，“—”号表示反应体系中不加微管)所示，CENP-V与阳性对照prc1一样可以被微管共沉淀；而阴性对照His-GFP不能被微管共沉淀下来，并且负责与微管直接相互作用的区域是CENP-V的1-300aa，表明CENP-V是一个直接与微管相互作用的蛋白。

实施例7、CENP-V基因siRNA的合成及其对CENP-V基因在细胞内表达的抑制作用的检测

一、抑制CENP-V基因表达的siRNA及其编码基因的设计及合成

根据CENP-V基因的mRNA序列，借助Ambion公司在网上提供的siRNA工具软件设计其siRNA序列，得到一条双链RNA序列，命名为CENP-V siRNA，再设计一条作为阴性对照的双链RNA序列，命名为Control siRNA，序列如下：

CENP-V siRNA：

正义链：5’-gcaagauugccaaauucgaggagaa-3’(序列表中SEQ ID NO：3)

反义链：5’-uucuccucgaauuuggcaaucuugc-3’(序列表中SEQ ID NO：4)；

Control siRNA：

正义链：5’-aauccuuaggcaacagccaccug-3’

反义链：5’-cagguggcuguugccuaaggauu-3’。

然后根据上述siRNA序列再人工合成其编码基因siDNA序列，序列如下：

CENP-V siDNA：

正义链：5’-gcaagattgccaaattcgaggagaa-3’(序列表中SEQ ID NO：5)

反义链：3’-cgttctaacggtttaagctcctctt-5’(序列表中SEQ ID NO：6)；

Controls iDNA：

正义链：5’-aatccttaggcaacagccacctg-3’

反义链：3’-ttaggaatccgttgtcggtggac-5’。

二、检测CENP-V基因的siRNA对C基因在细胞内表达的抑制作用

用美国Invitrogen公司的Lipofectamine^TM 2000试剂盒并参照试剂盒操作指南将化学合成的CENP-V siRNA和Control siRNA分别转染24孔板内的Hela细胞中，转染36小时后收集转染细胞，使用裂解缓冲液裂解细胞，4℃、12000rpm离心15分钟，收集上清，加入加样缓冲液(2×加样缓冲液：100mmol/L Tris·HCl(pH6.8)，200mmol/L二硫苏糖醇，4％SDS(电泳级)，0.2％溴酚蓝，20％甘油)后在100℃下煮10分钟，然后进行10％ SDS-PAGE分离细胞中的蛋白，并将其转移至硝酸纤维素膜上，然后分别使用实施例3制备的CENP-V抗体血清、α-tubulin(Sigma公司，对照)与膜在25℃下孵育1小时，再分别与辣根过氧化酶标记的二抗羊抗鼠抗体和羊抗兔抗体在25℃下孵育1小时。使用胶片进行显影，检测CENP-V在分别转染CENP-V siRNA和Control siRNA条件下蛋白的表达水平差异，检测结果如图7中的图A所示(1表示阴性对照siRNA转染细胞，2表示CENP-V siRNA转染细胞)，与阴性对照相比，表明本发明的CENP-V siRNA能特异地抑制CENP-V基因在细胞内的表达。

此外，还将步骤一合成的CENP-V siDNA和阴性对照Control siDNA用上述相同方法分别转染Hela细胞，结果与阴性对照siDNA相比，表明本发明的CENP-V siRNA的编码基因CENP-V siDNA也能特异地抑制CENP-V基因在细胞内的表达。

三、CENP-V敲除后引起细胞周期阻滞的检测

用美国Invitrogen公司的Lipofectamine^TM 2000试剂盒并参照试剂盒操作指南将化学合成的CENP-V siRNA和Control siRNA分别转染24孔板内的Hela细胞中，转染18小时和20小时在显微镜下观察，结果如图7中的图B所示，发现CENP-V基因的表达被抑制后，有丝分裂期细胞明显增多(圆形的细胞代表有丝分裂期的Hela细胞)，表明CENP-V缺失可以引起细胞周期的阻滞。

四、活细胞观察敲除CENP-V后对细胞周期的影响

将CENP-V siRNA和Control siRNA分别转染24孔板内的稳定表达H2B-GFP的Hela细胞，使用激光扫描共聚焦显微镜检测CENP-V敲除后的稳定表达H2B-GFP的Hela稳定细胞株，以核膜破裂记为有丝分裂开始到染色体分离作为后期的开始，结果如图8所示(Prometaphase为前中期，Metaphase为中期，Anaphase为后期)，转染ControlsiRNA的细胞一般需要50-60分钟就可完成有丝分裂，而转染CENP-V siRNA的细胞完成有丝分裂的时间大大增加，从2小时到4小时不等，活细胞观察统计结果表明，约有80％转染有CENP-V siRNA的细胞出现染色体排列滞后的现象，表明CENP-V对细胞有丝分裂的行进具有重要的调控作用，可用于制备抑制肿瘤增殖的药物。

序列表

<160>6

<210>1

<211>523

<212>PRT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>1

<210>2

<211>1572

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>2

<210>3

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

<210>4

<211>25

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

Claims (2)

1、CENP-E结合蛋白在制备抑制肿瘤增殖药物中的应用，所述CENP-E结合蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

2、CENP-E结合蛋白基因在制备抑制肿瘤增殖药物中的应用，所述CENP-E结合蛋白基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

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