CN101542269A - 生物测定中分子的多元检测 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及例如生物测定等测定中目标分子的检测，特别是目标分子的多元检测。公开了一个检测系统，该检测系统包括用于引导发光辐射(7)从相关样品到多元元件(8)的光导元件(16)。样品包括与目标分子特定性结合的探针分子；用于空间分离发光辐射(7；14；15)来产生多个光谱模式的多元元件(8)；以及用于检测一组光谱模式强度的检测器(13)，以便于确定样品中探针分子和目标分子的结合复合物的存在。
Description
技术领域
本发明涉及测定中目标分子的检测，特别涉及目标分子的多元检测。
背景技术
用于特定生物分子(生物分子)的检测方法是多种多样的，目前技术人员可以使用许多不同的方法。特定生物分子的检测具有多种重要的实际应用，包括用于诊断目的的基因识别。
一般而言，生物样本(“目标”)(例如多聚核苷酸、DNA、RNA，细胞和抗体)的检测尤其可以在例如所谓的生物阵列(或微阵列)的阵列上进行，在该阵列上，相应的探针分子附着在阵列的不同的部位处。目标探针的例子包括DNA/RNA-寡核苷酸、抗体-抗原、细胞抗体/蛋白、荷尔蒙受体-荷尔蒙等。当目标与相应的探针分子相结合或混成时，可以通过多种光学的、电子的、甚至于微机械的方法来进行目标生物分子的检测。
用于检测生物阵列上的分子结合所普遍使用的技术为荧光标记目标的光学检测，该荧光标记目标还被称为“标记”或“标志”。一般而言，就标记的物理分布和/或其给出的外发信号的强度而言，标记可以是任何可以被检测到的试剂。虽然荧光试剂被广泛应用，但是替代物包括磷光试剂、电致发光试剂、化学发光试剂、生物发光试剂等。
在荧光检测中，通过向带有荧光团的样品引导激发光束来激发荧光团，然后检测所产生的荧光辐射。荧光辐射的波长通常与用来诱导荧光的激发光束的波长不同。因此，通常使用阻止激发波长和传送荧光波长的干涉滤光片来确定荧光强度。
当几个不同的荧光团存在于被研究的样品时，这些光谱有可能部分地重叠在一起，使用干涉滤光片通常很难分离来自不同荧光团的信号。为了区分这些荧光团，人们通常需要使用分光计来观察光谱信息。
已经公开的国际专利申请WO 03/038413公开了一种用于分析生物芯片的荧光图像的装置，该装置包括用于产生激发光的光源、用于扩散激发光的扩散滤光片，用于在激发光中过滤掉波长在第一光谱范围内的光的激发滤光片、用于过滤掉将会辐射在样品上的激发光并在样品发射的光中过滤掉波长在第二光谱范围内的光的分束器。
现有技术中这样的装置和其它的一些装置都存在一些问题和局限。一个问题涉及由非被研究的荧光团造成的背景信号。在生物传感器型装置中，背景信号可以从例如玻璃板的设置材料中发出，当以激发光束照射时，还可以发射荧光。背景信号还可以从存在于被研究的样品中的其他无关荧光团中发出。这样的背景信号可以造成荧光检测的较低的精确性。在另一个问题中，当存在几种不同的荧光团时，多路复用是受局限的。多路复用是指一种生物传感器测定使用几个不同的荧光团，以便同时测量几个不同的目标分子或同时测量相同目标分子的互补特征。当荧光光谱重叠时，能够被用于多路复用的不同荧光团的最大数量是有限的，尽管多路复用是可行的，但其精确性下降。
为了提高被检测荧光信号的精确性，以及/或者为了使多路复用可行或者改进多路复用，必须通过光谱上可控的方式来测量荧光信号，使得可以识别总光谱的特征和量化不同荧光团的贡献。上述公开的装置或现有技术中的其它装置可以装备有多通道检测器，例如：例如借助于曲线拟合来识别不同荧光团贡献的分光计。但是由于宽光谱的重叠，这个方法仍然有点不够精确，所得到的多路复用也是有限的，而且分光计价格昂贵，其昂贵的价格以及有限的附加改进使得分光计在许多应用中不具有吸引力。
本发明的发明者已经意识到用于发光检测的改进的方式将会是有益的，并且已经设计出了本发明。
发明内容
本发明寻求提供一种处理发光检测的改进方式，例如联合进行生物测定，优选地，本发明逐一地减轻、缓和或者消除了一种或多种上述或其它缺点、或这些缺点的任一种组合。
根据本发明的第一个方面，提供了用于在测定中检测一个或多个目标分子的检测系统，该检测系统包括：
-用于引导发光辐射从相关样品到多元元件的光导元件，该样品包含与目标分子特定性结合的探针分子；
-用于空间分离发光辐射来产生多个光谱模式的多元元件；
-用于检测一组光谱模式强度的检测器，以便于确定样品中探针分子与目标分子间结合复合物的存在。
目标分子可以是与荧光团共轭的生物分子，例如与PCR反应的引物共轭的荧光团。样品可以是生物样品，例如用于医学和生物研究及应用的样品。
本发明提供了一个检测系统，例如用于检测一个或多个生物目标的存在、(可选地)数量、浓度或类似参数的生物传感器。生物检测系统通常是高度复杂的，本发明的优点在于提供了具有收集的数据的高可靠性的系统。
在一个实施例中，目标分子是通过使用辐射光束(还被称为激发辐射)照射样品、随后再检测样品中产生的发光光束(即目标分子的发光或者激发辐射和目标分子间相互作用产生的发光)来进行检测的。所检测的辐射的发光部分可以是光致发光，特别是荧光或磷光。典型的辐射光束是可见光或近可见光、红外线(IR)或紫外线(UV)范围内的电磁辐射。用于照射样品的辐射源可以是检测系统的整体部分，或者也可以是外部元件。
本发明的内容中，术语“荧光”和“磷光”在广义上可被理解为在一个过程中产生的发射光，在此过程中，光在某一波长处被分子或原子吸收，随后在讨论中的被激发分子/原子存在期之后以相同的或其它波长发射。发射的光通常是、但不需要局限于可见光光谱(VIS)、UV光谱和IR光谱。
在本发明的内容中，术语“多元元件”在广义上可被理解为能够每次在辐射光谱的多于一个波长或等价参数处处理辐射的元件。
通过使用多元元件，由于多通道检测器成为多余的了，并且可以用光电倍增器(在低强度的情况下)或光电二极管来代替，通过在多波长处测量辐射可以提高荧光检测的精确性，而并不显著增加设备成本。
此外，通过空间分离发光辐射，人们可以在发光光谱的多个部分灵活地测量波长，因此能够测量一组光谱模式的强度。该组可以包括在两个或多个波长处、或者部分光谱处的测量。该组可以涉及来自两个或多个荧光团的发光，或者是来自结合所研究的一个或多个荧光团引起背景信号的无关的荧光团的发光，或者该组可以涉及因所研究的两个或更多个荧光团的存在而产生的一组光谱模式。由此可以获得更多的信息，导致了荧光信号的更高的精确性。此外，空间分离还能够提取其它荧光团的光谱信息，由此能够同时测量多个荧光团(多路复用)。由于多元分析的存在，在使用更多不同的荧光团的测定中也有可能实现与只使用一个荧光团的测定中相同的精确性和灵敏性。
在有益的实施例中，多元元件可以由标准光学元件构成，由此提供了一种空间分离发光辐射的经济有效的方式，以便产生多个光谱模式，由此避免了使用昂贵的分光计。多元元件可以包括空间光调制器(SLM)、衍射光栅以及一个或多个用于引导和/或聚集与光谱模式相关的辐射的辐射引导元件，例如透镜。
在有益的实施例中，该组光谱模式中的一种光谱模式可以通过设置空间光调制器的像素的灰度级来进行选择。这样是有益的，因为SLM的像素可以被电驱动，由此在选择光谱模式的时候就避免了任何移动的部件。
能够设置空间光调制器的像素的灰度级的进一步优势在于：通过根据权重因子来设置像素，可以进行多元元件的多元校准，由此最大化那些从光谱中得到的信息。
在有益的实施例中，样品被固定于例如为了生物目标分析而布置的生物阵列的基底上。
在有益的实施例中，样品以液体的形式被置于容器中，例如通常与聚合酶链式反应(PCR)(例如实时PCR)联合使用。优势在于，在多路复用特别困难的场合，本发明可以结合实时PCR来使用。
在有益的实施例中，检测系统进一步包括用于接收相关样品的处理单元，在接收样品之前，该相关样品可以制备成包括一个或多个目标分子，或者该处理单元还可以进一步包括用于制备样品的制备单元。
通过给检测系统提供用于接收相关样品的处理单元，可以提供一种至少部分自动化的系统。
在第二个方面，本发明涉及在测定中检测一个或多个目标分子的方法，该方法包括：
-向相关样品发射辐射光束；该样品包含与目标分子特定地结合的探针分子；
-引导发光辐射从相关样品到多元元件；
-空间分离发光辐射来产生多个光谱模式；
-检测一组光谱模式的强度，以便于确定相关样品中探针分子和目标分子的结合复合物的存在。
一般而言，本发明的不同方面可以在本发明的范围之内以任意可能的方式进行联合和结合。本发明的这些和其它的一些方面、特征和/或优势将会被显示和例举出来，请参照下述实施方式。
附图说明
本发明的实施例将仅通过例子的方式参考附图进行描述，附图中：
图1示出了三个不同荧光团的荧光光谱的例子；
图2示出了荧光生物传感器的示意图；
图3示出了说明在测定中检测一个或多个目标分子的方法的示意流程图；
图4图示了包括处理单元的检测系统的示意性实施例。
具体实施方式
在生物研究和医学诊断中，许多生物标志是通过其所附着的荧光标记的帮助被检测出来的。通常使用的装置是荧光扫描仪或显微镜，通常也叫做荧光生物传感器，但是为了用于特定的应用，基于相同检测原理，人们制造了专用的装备。
生物标志的检测是结合生物测定进行的。一种典型的生物测定包括在微阵列(通常也叫做基底)上的不连续位置固定探针分子。在足以促进溶液中的目标与基底上互补探针相结合而形成结合在基底表面上的结合复合物的条件下，包含结合着被附着探针的目标分子的溶液与结合的探针相接触。生物阵列的尺寸可以在微米范围或甚至于在毫米范围内。生物阵列上的具有独特的混成特征的不同点的数量可以在现有阵列上在每平方毫米大约1-1000个点内进行变化，甚至多达例如每平方毫米106个点。典型相同的探针分子在阵列的点内被固定。在上下文中，点可以理解为有一定扩展的面积。该点可以是2D或3D构型。生物阵列可以包括硅晶片、玻璃片、多孔渗水膜，例如尼龙、硝基纤维素等。
在另一类型生物测定中，目标分子并不与表面相结合，相反地，目标分子自由漂浮在置于容器中的液体(例如水)中。尤其是在使用实时PCR时更是如此。在实时PCR中，引物自由漂浮在液体中，但是由于它们的性质，它们的标记并未被激活。标记只有在引物参与PCR反应之后才会被激活。同样地，未使用的引物不会产生背景荧光，因此只有目标分子才会产生荧光。
如上文所详细描述的，当几个不同的荧光团存在于被研究的样品中时，这些光谱可能发生部分重叠，使用干涉滤光片从这些荧光团中分离信号通常是非常困难的。
图1示出了曲线100，例举了三个不同荧光团的荧光光谱。在图中，示出了荧光团Alexa Fluor 514(表示为101)、Sytox Green(表示为102)和Bodipy FL(表示为103)的以波长(以纳米为单位，范围为约505nm到约580nm)的函数进行变化的荧光强度，这些荧光团例如可以从Invitrogen公司购得。本发明不仅仅局限于这些或其它荧光团，示出该图来图示不同荧光团的宽光谱的重叠。
本发明的实施例可以用于分离这些或其它不同荧光团的光谱。
图2示出了荧光生物传感器或测定中用于检测一个或多个目标分子的检测系统的示意图。该检测系统包括用于向相关基底6发射辐射光束2的辐射源1。在另一个实施例中，辐射源有可能向置于液体容器中的样品或液体容器的阵列进行发射。辐射源还指产生激发光束的激发源1。辐射或激发光束2穿过二向色分束器3、穿过透镜组4，然后使用高NA透镜5聚焦在基底6上。
在基底6上存在的荧光团将会被激发光束激发，这将会使这些荧光团发射发光辐射或荧光光束7，通过高NA透镜5进行收集，再通过透镜组4进行整形。使用二向色分束器3来分离剩余激发光束2和发光辐射7的路径。二向色分束器3、透镜组4和高NA透镜5一起称为光导元件16，该元件用于向多元元件8引导发光辐射。在所例举的实施例中，光导元件由给定的一组光学元件构成，但是在其它的实施例中，只要满足向多元元件引导发光辐射的目的，就可以使用其它光学元件。
将发光光束7引导到多元元件8，以便空间分离发光辐射来产生多个光谱模式。在所例举的实施例中，多元元件8包括许多元件，这些元件的功能将会在下面进行描述。可以在其它的实施例中使用为了获得相同目的的其它元件，即用于空间分离发光辐射来产生多个光谱模式。
在如图2所示的实施例中，联合使用空间光调制器(SLM)11和衍射光栅9。SLM可以例如为液晶面板、数字镜面显示器，或硅显示器上面的液晶。在多元检测设置8中，发光光束7首先通过衍射光栅9，造成了荧光光谱的空间分离。在图2中示出了波长为λ1的光束14和波长为λn的光束15。多元元件包括两个用于引导和/或聚焦与光谱模式相关的辐射的辐射引导元件10和12。作为特定的辐射引导元件，第一透镜10用于通过SLM 11聚焦不同的光束，第二透镜12用于将光聚焦在检测器13上，以便检测一组光谱模式的强度，从而确定相关基底上探针分子和目标分子之间的结合复合物的存在。图2图示了单个的检测器。通过使用单个的检测器，可以连续测量不同的光谱模式。在可以选择的一个实施例中，可以使用多于一个检测器或检测器阵列，因此可以同时测量例如多光谱模式的信号。在低强度或光电二极管的情况下，检测器或检测器阵列可以是光电倍增器。
通过在SLM的不同像素处施加或设置灰度值，可以从光谱模式组中选择特定的光谱模式。
在一个实施例中，SLM的像素被驱动成黑色和白色状态(此处的黑色和白色状态的应用可以被理解为两个水平的灰度等级)，因此结果就是部分光谱被传送，其它光谱被阻止。这样，可以选择性地测量特定的荧光光谱带和用于参照测量的光谱带。
在一个实施例中，执行多元校准方法，例如基于偏最小二乘回归的校准。这样的方法考虑了整个光谱中的信号变量，这样可以最大化地从光谱中获得信息。
多元校准程序产生了兴趣分析物(例如某一荧光团)的所谓的回归矢量r＝[r(λ1)，......，r(λn)]。波长λ1至λn覆盖了所测量的光谱。取回归矢量与所测量的光谱(或“信号矢量”)的内积，于是s＝[s(λ1)，......，s(λn)]给出兴趣分析物的浓度。
通过显示SLM的像素上的权重因子r(λ1)至r(λn)，随后在检测器上聚焦被传送的信号，可以在光学域中取内积。通过随后在SLM上显示其它的回归矢量，可以从光谱中提取其它想要的信号模式。SLM可以作为所谓的多元光学元件(MOE)使用。实施例包括：固定的零件；选择光谱区域或改变回归矢量全部都通过电子学方式完成。
在一个实施例中，使用静态MOE。SLM所具有的优势是可以以电子学方式调节权重因子r(λ1)至r(λn)。当只需一个信号分量来确定荧光信号时，MOE不需要是可调节的，例如可以将具有变化的灰度等级的掩模(mask)用作为MOE。可以想到，基于静态MOE的实施例生产起来更加便宜。
在一个实施例中，通过阻止SLM的适当的像素，多元检测设置可被用于抑制激发信号。因此，在这个实施例中，可以去掉二向色分束器，或者用例如偏振分束器或反射例如50％的光的分束器来取代二向色分束器。
本文结合图3说明了操作检测系统的方法，图3是说明测定中检测一个或多个目标分子的方法的示意性流程图。30是朝向相关样品发射辐射光束。31是朝向多元元件引导发光辐射。32是通过多元元件空间分离发光辐射来产生多个光谱模式。33是指检测一组光谱模式的强度，以便于在相关样品中确定探针分子和目标分子之间的结合复合物的存在。
在一个更加特定的用于操作检测系统的实施例中，可以进行下述步骤或可能的附加步骤。
在进行生物测定之前确定回归矢量。针对目标分子的特定组成确定回归矢量。在进行实验之前先要完成确定过程，并且只需要进行一次，除非目标分子的组成发生改变，改变之后回归矢量需要重新确定。
生物测定的第一个步骤是制备目标分子。例如，首先应该从血液样品中分离要测量的组分。在DNA的情况下，可以进行细胞溶解、DNA收集等，之后需要进行一个扩增步骤，例如使用与标记相结合的引物的PCR。由此，产生的DNA拷贝也将会具有附着其上的标记。然后DNA可以通过使用俘获探针与基底进行混成，或者可以在液体容器中进行检测。
在测量步骤中，使用多元分析来确定荧光团的量(以及所含DNA的量)，其中目标分子的回归矢量的正负成分在SLM上被设置为灰度等级，检测信号的总和(即正负检测信号的总和)将会给出荧光团的浓度。由于在灰度等级上无法显示负的数字，上述过程在正步骤和负步骤中完成。
针对被研究的每个目标分子重复所述程序。
在检测系统中，可能通过自动化或半自动化的方式进行图3中的步骤和可选的附加步骤。这样的装置和系统可以包括用于接收相关样品的处理单元。图4图示了包括处理单元41的检测系统40的示意实施例。在接收样品之前，可以用包括一个或多个目标分子的样品制备所述相关样品，或者处理单元可以进一步包括在制备单元中用于制备样品的制备单元42。检测系统包括光学系统43，如结合图2所示。可以通过与检测器连接的计算机系统44记录和处理所测量到的强度。还可以使用计算机系统控制SLM和检测器系统40的其它部件。此外，计算机系统可以进行目标分子的存在、数量、浓度等的计算或确定，以及操作系统，从而进行多元校准等的必要步骤。
尽管本发明是结合特定的实施方式一起描述的，但并不意于局限于此处所阐明的特定的形式。相反，本发明的范围仅仅由下述权利要求所限制。在权利要求中，术语“包括”并不排除其它元件或步骤的存在。此外，尽管不同的权利要求可能包括各自的特征，但是这些特征有可能有利地合并起来，它们被包括在不同权利要求中并不意味着它们的组合是不可行的和/或不是有益的。此外，单数引用并不排除复数含义。因此“一个”、“一”、“第一个”、“第二个”等并不排除复数含义。此外，权利要求中的附图标记不应该解释为限制范围。
Claims (15)
1.用于在生物测定中检测一个或多个目标分子的检测系统，该检测系统包括：
-用于引导发光辐射(7)从相关样品到多元元件(8)的光导元件(16)，该样品包含与目标分子特定地结合的探针分子；
-用于空间分离发光辐射(7；14；15)来产生多个光谱模式的多元元件(8)；
-用于检测一组光谱模式强度的检测器(13)，以便确定样品中探针分子与目标分子之间的结合复合物的存在。
2.如权利要求1所述的检测系统，其中多元元件包括空间光调制器(11)。
3.如权利要求2所述的检测系统，其中多元元件包括用于空间分离发光辐射的衍射光栅(9)。
4.如权利要求2所述的检测系统，其中空间光调制器(11)选自由液晶显示器、数字镜面显示器和硅显示器上面的液晶构成的组。
5.如权利要求2所述的检测系统，其中多元元件进一步包括一个或多个用于引导和/或聚焦与光谱模式相关的辐射的辐射引导元件(10；12)。
6.如权利要求1所述的检测系统，其中检测器包括检测器阵列。
7.如权利要求2所述的检测系统，其中光谱模式组中的一种光谱模式是通过设置空间光调制器的像素的灰度级来进行选择的。
8.如权利要求7所述的检测系统，其中多元元件的多元校准通过根据权重因子设置空间光调制器的像素来完成。
9.如权利要求1所述的检测系统，进一步包括用于向相关样品发射辐射光束的辐射源。
10.如权利要求1所述的检测系统，其中目标分子是与一个或多个荧光团共轭的生物分子。
11.如权利要求1所述的检测系统，其中样品被固定在基底(6)上。
12.如权利要求1所述的检测系统，其中样品被保持液体形式，置于容器中。
13.如权利要求1所述的检测系统，进一步包括用于接收相关样品的处理单元(41)，在接收样品之前，制备相关样品使其包括一个或多个目标分子，或者处理单元进一步包括用于制备样品的制备单元(42)。
14.用于在测定中检测一个或多个目标分子的方法，该方法包括：
-向相关样品发射(30)辐射光束；该样品包括与目标分子特定地结合的探针分子；
-引导(31)发光辐射从相关样品到多元元件；
-空间分离(32)发光辐射来产生多个光谱模式；
-检测(33)一组光谱模式的强度，以便确定相关样品中探针分子和目标分子之间的结合复合物的存在。
15.如权利要求14所述的方法，其中顺序地或同时检测一组光谱模式。
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