CN101538566B - 一种用于油脂水解的固定化脂肪酶的制备方法 - Google Patents
一种用于油脂水解的固定化脂肪酶的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101538566B CN101538566B CN2009100978969A CN200910097896A CN101538566B CN 101538566 B CN101538566 B CN 101538566B CN 2009100978969 A CN2009100978969 A CN 2009100978969A CN 200910097896 A CN200910097896 A CN 200910097896A CN 101538566 B CN101538566 B CN 101538566B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- cellulose
- fibrous membrane
- lipase
- preparation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 title claims abstract description 62
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 title claims abstract description 62
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 title claims abstract description 62
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 title claims abstract description 62
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 239000004519 grease Substances 0.000 title claims abstract description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 45
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 36
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims abstract description 36
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 30
- 238000009987 spinning Methods 0.000 claims abstract description 29
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 28
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 18
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000010041 electrostatic spinning Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229920006217 cellulose acetate butyrate Polymers 0.000 claims description 34
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 28
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 claims description 15
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 claims description 10
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000003921 oil Substances 0.000 claims description 8
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 claims description 8
- LRWZZZWJMFNZIK-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-3-methyloxirane Chemical group CC1OC1Cl LRWZZZWJMFNZIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 7
- ZEMPKEQAKRGZGQ-AAKVHIHISA-N 2,3-bis[[(z)-12-hydroxyoctadec-9-enoyl]oxy]propyl (z)-12-hydroxyoctadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCC(O)C\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCC\C=C/CC(O)CCCCCC)COC(=O)CCCCCCC\C=C/CC(O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-AAKVHIHISA-N 0.000 claims description 5
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 5
- MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N cyanuric chloride Chemical compound ClC1=NC(Cl)=NC(Cl)=N1 MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims description 5
- 235000019484 Rapeseed oil Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 claims description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000269319 Squalius cephalus Species 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 claims description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 26
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 26
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 5
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 abstract description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 229920000875 Dissolving pulp Polymers 0.000 abstract 1
- 229940113088 dimethylacetamide Drugs 0.000 abstract 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 36
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 12
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 10
- 241001661345 Moesziomyces antarcticus Species 0.000 description 5
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229960004756 ethanol Drugs 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 2-[2,4-di(pentan-2-yl)phenoxy]acetyl chloride Chemical group CCCC(C)C1=CC=C(OCC(Cl)=O)C(C(C)CCC)=C1 NGNBDVOYPDDBFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- 241000222175 Diutina rugosa Species 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000001263 acyl chlorides Chemical class 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229920003043 Cellulose fiber Polymers 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101000925662 Enterobacteria phage PRD1 Endolysin Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 238000006136 alcoholysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 238000011914 asymmetric synthesis Methods 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000000058 esterolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000003595 mist Substances 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- -1 ntarctic Species 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000012450 pharmaceutical intermediate Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种用于油脂水解的固定化脂肪酶的制备方法，将纤维素溶于二甲基乙酰胺/丙酮混合液中，配成均一溶液，并静置脱除气泡，得到纺丝液；然后进行静电纺丝制备纤维素超细纤维膜；将纤维素超细纤维膜置于氢氧化钾的乙醇溶液中水解生成羟基，用去离子水冲洗数次后再活化羟基；将活化后的纤维素超细纤维膜置于酶液中，反应数小时后即得纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶。所制备的固定化脂肪酶可以用于油脂水解。本发明采用纤维素超细纤维固定化脂肪酶，具有工艺简便快速、重复性好、成本低、操作安全、环境友好、适于大规模工业生产的优点，且制得的固定化脂肪酶载酶量大，油脂水解反应催化效率高。
Description
技术领域
本发明涉及固定化酶技术领域，具体涉及一种用于油脂水解的以纤维素超细纤维膜为固定化载体的固定化脂肪酶的制备方法。
背景技术
脂肪酶又称甘油三酸酯水解酶，来源于动物、植物及微生物体内，其天然底物为甘油三酸酯。它能催化酯的醇解、酯合成、酯交换、内酯合成及酰胺合成等一系列反应。脂肪酶还具有良好的底物专一性、区域选择性以及立体选择性等特征，使其在外消旋混合物的手性拆分以及药物中间体的不对称合成方面有着极大的应用价值。由于固定化酶具有易于连续生产、酶的稳定性高、反应条件容易控制、产物分离纯化容易和能改善产物品质等一系列优点，脂肪酶在实际生产应用中以固定化酶的形式为主。固定化酶技术能有效提高酶的稳定性和重复使用性，然而，固定化酶与载体间的一些非生物特异性相互作用也常常导致酶活性的降低。一些天然物质如多糖、蛋白质、脂类由于具有良好的生物相容性而被广泛地用作酶固定化载体。
纤维素是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，价廉且来源充足，具有较好的稳定性，其作为酶固定化载体已有公开报道。例如，陈秀琳用羧甲基纤维素(CMC)颗粒固定化脂肪酶(陈秀琳，CM-纤维素固定化脂肪酶的研究，《海峡药学》，2005，17(1)：35)；林繁华等人以醋酸纤维素/聚丙烯复合膜为载体固定化脂肪酶，由于活化醋酸纤维素中的羟基较为困难，他们采用物理吸附的方法固定化酶(林繁华等，醋酸纤维素/聚丙烯复合膜固定化脂肪酶的研究，《安徽工程科技学院学报》，2007，22(3)：16)。以纤维素颗粒或上述平板膜为载体时，载酶量过低(只有大约1mg酶/g载体)，由此造成生产效率低，不利于实际生产应用。
纳米或亚微米尺度纤维素材料具有比表面积大、孔隙率高、结构性能易于调控等特点，是一种具有良好应用前景的固定化酶载体。采用静电纺丝技术制备纤维素超细纤维膜具有快速、简便、重复性好以及可大规模制备等优点。Wang和Hsieh用双酰氯端基化聚乙二醇为偶联剂，以纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶(Yuhong Wang，You-Lo Hsieh，EnzymeImmobilization to Ultra-Fine Cellulose Fibers via Amphiphilic PolyethyleneGlycol Spacers，J.Polym.Sci.Part A：Polym.Chem.，2004，42：4289-4299)。如前所述，活化醋酸纤维素中的羟基较为困难，因而偶联剂的选择是关键工艺。现有工艺所用偶联剂双酰氯端基化聚乙二醇价格昂贵，实际生产难以承受；酰氯极易水解产生酸雾，对环境有害，且进一步增加了环境防治成本。
发明内容
本发明提供一种用于油脂水解的以纤维素超细纤维膜为载体的固定化脂肪酶的制备方法。该方法纤维素超细纤维膜载酶量大，酶保留活性高；避免采用酰氯作为固定化酶偶联剂，因而制备过程简单、成本低、操作安全、环境友好。
一种用于油脂水解的固定化脂肪酶的制备方法，包括以下步骤：
1)将纤维素溶于二甲基乙酰胺/丙酮混合液中，配成浓度为20～200g/L的均一溶液，并静置脱除气泡，得到纺丝液；
所述纤维素为醋酸纤维素或醋酸丁酸纤维素；所述的二甲基乙酰胺/丙酮混合液中二甲基乙酰胺与丙酮的体积比为1～2∶1；
2)以步骤1)中制得的纺丝液进行静电纺丝，制得纤维素超细纤维膜；静电纺丝条件优选：纺丝流量0.2～5mL/h，纺丝电压为10～20kV，喷头到接收板的距离为10～20cm；
3)将纤维素超细纤维膜置于氢氧化钾的乙醇溶液中，浸泡1～3小时，反应结束后将膜取出并用去离子水冲洗数次，烘干待用；氢氧化钾的乙醇溶液的浓度优选0.1～1M；
4)将步骤3)得到的纤维素超细纤维膜进行活化，活化过程可以采用的活化剂为环氧氯丙烷、三聚氯氰或对苯醌；采用上述活化剂的基本原理在于每一个活化剂分子均含有至少2个活性基团，其中一个活性基团与纤维素超细纤维膜上的羟基进行反应，另一个活性基团与脂肪酶含有的氨基进行反应，从而将脂肪酶固定于纤维素超细纤维膜表面，具体的活化方法分别如下：
方法一：将步骤3)得到的纤维素超细纤维膜用无水乙醇浸润，然后浸入环氧氯丙烷中，37℃下反应3小时后取出，分别用无水乙醇和磷酸缓冲溶液(0.05M，pH 7.0)冲洗；
方法二：将步骤3)得到的纤维素超细纤维膜用磷酸缓冲溶液(0.05M，pH 7.0)冲洗，然后浸入三聚氯氰的二氧六环溶液中，25℃下反应0.5小时后取出，依次用二氧六环、无水乙醇、去离子水和磷酸缓冲溶液(0.05M，pH 7.0)冲洗；
方法三：将步骤3)得到的纤维素超细纤维膜用磷酸缓冲溶液(0.05M，pH 7.0)冲洗，然后浸入对苯醌溶液中，溶剂为体积比1∶4的乙醇和磷酸缓冲溶液(0.05M，pH 7.0)，25℃下反应2小时后取出，依次用体积分数20％的乙醇、1M的NaCl水溶液、去离子水和磷酸缓冲溶液(0.05M，pH7.0)冲洗；
5)将脂肪酶溶解于磷酸缓冲溶液(0.05M，pH 7.0)中，制成1～20mg/mL的脂肪酶溶液，离心后取上清液，然后将步骤4)中活化的纤维素超细纤维膜浸入脂肪酶溶液中，室温下固定化1～3小时后用磷酸缓冲溶液(0.05M，pH 7.0)充分洗涤即得纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶；
所述脂肪酶为可以用于催化酯水解的脂肪酶，常用的例如来源于皱褶假丝酵母Candida rugosa或南极假丝酵母Candida antarctica的脂肪酶。
固定化脂肪酶催化油脂水解的活性按照下述方法测定：将纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶加入油脂溶液，催化反应一定时间后用高效液相色谱检测油脂溶液中脂肪酸的含量，并据此计算固定化脂肪酶的活性，所述油脂为大豆油、蓖麻油、菜籽油、花生油、玉米油、棉籽油、米糠油和藻类油脂中的一种或混合物。
本发明的优点在于：1)静电纺纤维素超细纤维膜具有制备过程快速、简便、重复性好、可大规模生产的优点，用作脂肪酶固定化载体时载酶量、催化效率高；2)选用环氧氯丙烷、三聚氯氰或对苯醌作为偶联剂，在纤维素超细纤维膜表面固定化脂肪酶过程简单、成本低、操作安全、环境友好，有利于实际生产应用；3)纤维素价廉且来源充足，具有较好的稳定性，作为酶固定化载体有利于降低生产成本。
附图说明
图1是醋酸纤维素超细纤维膜的电镜照片；
图2是醋酸丁酸纤维素超细纤维膜的电镜照片。
具体实施方式
以下实施实例对本发明做更详细的描述，但所述实例不构成对本发明的限制。
实施例1
1)将醋酸纤维素溶于体积比为3∶2的二甲基乙酰胺/丙酮混合液中，于室温下搅拌溶解，配成浓度为130g/L的均一溶液，并静置脱除气泡，得到纺丝液；
2)以步骤1)中制得的纺丝液进行静电纺丝，纺丝流量1mL/h，纺丝电压为17kV，喷头到接收板的距离为15cm，制得醋酸纤维素超细纤维膜，电镜照片见图1；
3)将醋酸纤维素超细纤维膜置于浓度为0.5M的氢氧化钾的乙醇溶液中，浸泡3小时，反应结束后将膜取出并用去离子水冲洗数次，烘干待用；
4)将步骤3)得到的醋酸纤维素超细纤维膜用无水乙醇浸润，然后浸入环氧氯丙烷中，37℃下反应3小时后取出，分别用无水乙醇和磷酸缓冲溶液(0.05M，pH 7.0)冲洗；
5)将来源于Candida rugosa的脂肪酶粉溶解于磷酸缓冲溶液(0.05M，pH 7.0)中，制成5mg/mL的脂肪酶溶液，离心后取上清液，然后将步骤4)中活化的醋酸纤维素超细纤维膜浸入脂肪酶溶液中，室温下固定化3小时后用磷酸缓冲溶液(0.05M，pH 7.0)充分洗涤即得醋酸纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶，载酶量为22mg酶/g膜。
将制得的醋酸纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶用于大豆油水解，活性为228U/g固定化酶。
实施例2
步骤同实施例1，但在步骤1)中使用醋酸丁酸纤维素代替醋酸纤维素，载酶量为17mg酶/g膜。醋酸丁酸纤维素超细纤维膜的电镜照片见图2。
将制得的醋酸丁酸纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶用于大豆油水解，活性为267U/g固定化酶；用于蓖麻油水解，活性为256U/g固定化酶；用于菜籽油水解，活性为268U/g固定化酶；用于花生油水解，活性为264U/g固定化酶；用于棉籽油水解，活性为237U/g固定化酶；用于米糠油水解，活性为248U/g固定化酶；用于藻类油脂水解，活性为249U/g固定化酶；用于体积比1∶1的大豆油和蓖麻油的混合油水解，活性为265U/g固定化酶；用于体积比为1∶1∶1的大豆油、菜籽油和蓖麻油的混合油水解，活性为258U/g固定化酶。
实施例3
1)将醋酸丁酸纤维素溶于体积比为1∶1的二甲基乙酰胺/丙酮混合液中，于室温下搅拌溶解，配成浓度为20g/L的均一溶液，并静置脱除气泡，得到纺丝液；
2)以步骤1)中制得的纺丝液进行静电纺丝，纺丝流量5mL/h，纺丝电压为10kV，喷头到接收板的距离为10cm，制得醋酸丁酸纤维素超细纤维膜；
3)将醋酸丁酸纤维素超细纤维膜置于浓度为1M的氢氧化钾的乙醇溶液中，浸泡1小时，反应结束后将膜取出并用去离子水冲洗数次，烘干待用；
4)将步骤3)得到的醋酸丁酸纤维素超细纤维膜用无水乙醇浸润，然后浸入环氧氯丙烷中，37℃下反应3小时后取出，分别用无水乙醇和磷酸缓冲溶液(0.05M，pH 7.0)冲洗；
5)将来源于Candida antarctica的脂肪酶粉溶解于磷酸缓冲溶液(0.05M，pH 7.0)中，制成20mg/mL的脂肪酶溶液，离心后取上清液，然后将步骤4)中活化的醋酸丁酸纤维素超细纤维膜浸入脂肪酶溶液中，室温下固定化1小时后用磷酸缓冲溶液(0.05M，pH 7.0)充分洗涤即得醋酸丁酸纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶，载酶量为23mg酶/g。
将制得的醋酸丁酸纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶用于大豆油水解，活性为274U/g固定化酶。
实施例4
1)将醋酸丁酸纤维素溶于体积比为2∶1的二甲基乙酰胺/丙酮混合液中，于室温下搅拌溶解，配成浓度为200g/L的均一溶液，并静置脱除气泡，得到纺丝液；
2)以步骤1)中制得的纺丝液进行静电纺丝，纺丝流量0.2mL/h，纺丝电压为20kV，喷头到接收板的距离为20cm，制得醋酸丁酸纤维素超细纤维膜；
3)将醋酸丁酸纤维素超细纤维膜置于浓度为0.1M的氢氧化钾的乙醇溶液中，浸泡3小时，反应结束后将膜取出并用去离子水冲洗数次，烘干待用；
4)将步骤3)得到的醋酸丁酸纤维素超细纤维膜用无水乙醇浸润，然后浸入环氧氯丙烷中，37℃下反应3小时后取出，分别用无水乙醇和磷酸缓冲溶液(0.05M，pH 7.0)冲洗；
5)将来源于Candida antarctica的脂肪酶粉溶解于磷酸缓冲溶液(0.05M，pH 7.0)中，制成1mg/mL的脂肪酶溶液，离心后取上清液，然后将步骤4)中活化的醋酸丁酸纤维素超细纤维膜浸入脂肪酶溶液中，室温下固定化3小时后用磷酸缓冲溶液(0.05M，pH 7.0)充分洗涤即得醋酸丁酸纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶，载酶量为15mg酶/g。
将制得的醋酸丁酸纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶用于大豆油水解，活性为240U/g固定化酶。
实施例5
1)将醋酸丁酸纤维素溶于体积比为3∶2的二甲基乙酰胺/丙酮混合液中，于室温下搅拌溶解，配成浓度为130g/L的均一溶液，并静置脱除气泡，得到纺丝液；
2)以步骤1)中制得的纺丝液进行静电纺丝，纺丝流量1mL/h，纺丝电压为17kV，喷头到接收板的距离为15cm，制得醋酸丁酸纤维素超细纤维膜；
3)将醋酸丁酸纤维素超细纤维膜置于浓度为0.5M的氢氧化钾的乙醇溶液中，浸泡3小时，反应结束后将膜取出并用去离子水冲洗数次，烘干待用；
4)将步骤3)得到的醋酸丁酸纤维素超细纤维膜用磷酸缓冲溶液(0.05M，pH 7.0)冲洗，然后浸入三聚氯氰的二氧六环溶液中，25℃下反应0.5小时后取出，依次用二氧六环、无水乙醇、去离子水和磷酸缓冲溶液(0.05M，pH 7.0)冲洗；
5)将来源于Candida antarctica的脂肪酶粉溶解于磷酸缓冲溶液(0.05M，pH 7.0)中，制成5mg/mL的脂肪酶溶液，离心后取上清液，然后将步骤4)中活化的醋酸丁酸纤维素超细纤维膜浸入脂肪酶溶液中，室温下固定化3小时后用磷酸缓冲溶液(0.05M，pH 7.0)充分洗涤即得醋酸丁酸纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶，载酶量为17mg酶/g。
将制得的醋酸丁酸纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶用于大豆油水解，活性为246U/g固定化酶。
实施例6
1)将醋酸丁酸纤维素溶于体积比为3∶2的二甲基乙酰胺/丙酮混合液中，于室温下搅拌溶解，配成浓度为130g/L的均一溶液，并静置脱除气泡，得到纺丝液；
2)以步骤1)中制得的纺丝液进行静电纺丝，纺丝流量1mL/h，纺丝电压为17kV，喷头到接收板的距离为15cm，制得醋酸丁酸纤维素超细纤维膜；
3)将醋酸丁酸纤维素超细纤维膜置于浓度为0.5M的氢氧化钾的乙醇溶液中，浸泡3小时，反应结束后将膜取出并用去离子水冲洗数次，烘干待用；
4)将步骤3)得到的醋酸丁酸纤维素超细纤维膜用磷酸缓冲溶液(0.05M，pH 7.0)冲洗，然后浸入对苯醌溶液中，溶剂为体积比1∶4的乙醇和磷酸缓冲溶液(0.05M，pH 7.0)，25℃下反应2小时后取出，依次用体积分数20％的乙醇、1M的NaCl水溶液、去离子水和磷酸缓冲溶液(0.05M，pH 7.0)冲洗；
5)将来源于Candida antarctica的脂肪酶粉溶解于磷酸缓冲溶液(0.05M，pH 7.0)中，制成5mg/mL的脂肪酶溶液，离心后取上清液，然后将步骤4)中活化的醋酸丁酸纤维素超细纤维膜浸入脂肪酶溶液中，室温下固定化3小时后用磷酸缓冲溶液(0.05M，pH 7.0)充分洗涤即得醋酸丁酸纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶，载酶量为18mg酶/g。
将制得的醋酸丁酸纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶用于大豆油水解，活性为251U/g固定化酶。
Claims (6)
1.一种用于油脂水解的固定化脂肪酶的制备方法，包括以下步骤：
1)将纤维素溶于二甲基乙酰胺与丙酮的混合液中，配成浓度为20～200g/L的均一溶液，并静置脱除气泡，得到纺丝液；
2)以步骤1)制得的纺丝液进行静电纺丝，制得纤维素超细纤维膜；
3)将纤维素超细纤维膜置于氢氧化钾的乙醇溶液中，浸泡1～3小时，反应结束后将膜取出并用去离子水冲洗，烘干待用；
4)将步骤3)得到的纤维素超细纤维膜用活化剂进行活化；所述的活化剂为环氧氯丙烷、三聚氯氰或对苯醌；
5)将脂肪酶溶解于磷酸缓冲溶液中，制成1～20mg/mL的脂肪酶溶液，离心后取上清液，然后将步骤4)中活化的纤维素超细纤维膜浸入脂肪酶溶液中，室温下固定化1～3小时后用磷酸缓冲溶液充分洗涤即得纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述纤维素为醋酸纤维素或醋酸丁酸纤维素。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的二甲基乙酰胺与丙酮的混合液中二甲基乙酰胺与丙酮的体积比为1～2∶1。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的氢氧化钾的乙醇溶液的浓度为0.1～1M。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)的静电纺丝，纺丝流量0.2～5mL/h，纺丝电压为10～20kV，喷头到接收板的距离为10～20cm。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述油脂为蓖麻油、菜籽油、大豆油、花生油、玉米油、棉籽油、米糠油和藻类油脂中的一种或混合物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2009100978969A CN101538566B (zh) | 2009-04-22 | 2009-04-22 | 一种用于油脂水解的固定化脂肪酶的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2009100978969A CN101538566B (zh) | 2009-04-22 | 2009-04-22 | 一种用于油脂水解的固定化脂肪酶的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101538566A CN101538566A (zh) | 2009-09-23 |
| CN101538566B true CN101538566B (zh) | 2011-02-16 |
Family
ID=41121953
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2009100978969A Expired - Fee Related CN101538566B (zh) | 2009-04-22 | 2009-04-22 | 一种用于油脂水解的固定化脂肪酶的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101538566B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102246946B (zh) * | 2011-07-25 | 2013-03-06 | 江南大学 | 一种通过脂肪控制酶解-温和加热氧化制备肉味香精前体物的方法 |
| CN107779445B (zh) * | 2016-08-25 | 2021-02-19 | 上海凯赛生物技术股份有限公司 | 固定化赖氨酸脱羧酶、其制备、1,5-戊二胺制备方法及产品 |
| CN113930899B (zh) * | 2021-10-22 | 2023-06-23 | 北京工商大学 | 一种脂肪酶膜及其制备方法和应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1800341A (zh) * | 2005-12-09 | 2006-07-12 | 清华大学 | 利用亲水/疏水复合膜中的微结构固定化脂肪酶的方法 |
-
2009
- 2009-04-22 CN CN2009100978969A patent/CN101538566B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1800341A (zh) * | 2005-12-09 | 2006-07-12 | 清华大学 | 利用亲水/疏水复合膜中的微结构固定化脂肪酶的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| YUHONG WANG et al.Enzyme Immobilization to Ultra-Fine Cellulose Fibers via Amphiphilic Polyethylene Glycol Spacers.《Journal of Polymer Science Part A:Polymer Chemistry》.2004,第42卷(第17期),4289-4299. * |
| 陈秀琳.CM-纤维素固定化脂肪酶的研究.《海峡药学》.2005,第17卷(第1期),35-37. * |
| 陈秀琳.脂肪酶固定化的研究概况.《海峡药学》.2007,第19卷(第12期),114-116. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101538566A (zh) | 2009-09-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Huang et al. | Immobilization of Candida rugosa lipase on electrospun cellulose nanofiber membrane | |
| Huang et al. | Covalent immobilization of lipase from Candida rugosa onto poly (acrylonitrile-co-2-hydroxyethyl methacrylate) electrospun fibrous membranes for potential bioreactor application | |
| Piacentini et al. | Development of enzyme-loaded PVA microspheres by membrane emulsification | |
| Wu et al. | Electrospun blend nanofiber membrane consisting of polyurethane, amidoxime polyarcylonitrile, and β-cyclodextrin as high-performance carrier/support for efficient and reusable immobilization of laccase | |
| CN102260662B (zh) | 用于固定化酶的载体及其用途和固定有酶的载体 | |
| Yuce-Dursun et al. | Preparation and characterization of sol–gel hybrid coating films for covalent immobilization of lipase enzyme | |
| Li et al. | Lipase-immobilized electrospun PAN nanofibrous membranes for soybean oil hydrolysis | |
| Bhushan et al. | Immobilization of lipase by entrapment in Ca-alginate beads | |
| Hung et al. | Immobilization of cellulase onto electrospun polyacrylonitrile (PAN) nanofibrous membranes and its application to the reducing sugar production from microalgae | |
| CN101538566B (zh) | 一种用于油脂水解的固定化脂肪酶的制备方法 | |
| CN101182507A (zh) | 一种载体和固定化脂肪酶的制备及应用 | |
| CN110241107A (zh) | 一种使用氨基树脂固定化脂肪酶的方法及由该方法制得的固定化脂肪酶 | |
| CN103756992B (zh) | 一种巧克力微杆菌磁性细胞及其制备方法和应用 | |
| Li et al. | Comparative study of the properties of lipase immobilized on nonwoven fabric membranes by six methods | |
| CN101265448B (zh) | 油酯催化分离两相酶-膜生物反应器及其制备和应用 | |
| CN100457899C (zh) | 壳聚糖/聚乙烯醇纳米纤维复合膜用于固定化酶的方法 | |
| CN101746766B (zh) | 一种以蓝藻为模板制备单分散二氧化硅球体的方法 | |
| CN100371372C (zh) | 磷脂改性腈纶纳米纤维复合膜及其制备和固定化酶的方法 | |
| Cheng et al. | Preparation of bromomethylated poly (2, 6-dimethyl-1, 4-phenylene oxide) hollow fiber cation-exchange membranes and immobilization of cellulase thereon | |
| Chen et al. | Kinetics-bolstered catalytic study of a high performance lipase-immobilized nanofiber membrane bioreactor | |
| CN105274157B (zh) | 一种静态乳液法固定化脂肪酶生产生物柴油的方法 | |
| CN108421366B (zh) | 水解明胶与硅藻土共价键合的除醛复合材料及其制备方法 | |
| Moentamaria et al. | Heterogeneous biocatalyst: Polyurethane foam coating technique with co-immobilized lipase for bio-flavor production | |
| CN105441507A (zh) | 非水相条件下使用酶催化对纳米纤维素表面进行酯化改性的方法 | |
| CN102776170A (zh) | 一种核壳结构的纳米纤维固定化酶的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20110216 Termination date: 20120422 |